Alexandre Schuler

CROMATOGRAFIA
AG
A GÁÁSS EE AA L
LÍÍQ
QUUIID
DOO

(detetores,aquisição de dados,validação e avaliação estatística)

Volume 1

O itava Edição

2004
 Alexandre Schuler
Professor Adjunto 4
Departamento de Engenharia Química
Universidade Federal de Pernambuco

CROMATOGRAFIA
AG
A GÁÁSS EE AA L
LÍÍQ
QUUIID
DOO

(detetores,aquisição de dados,validação e avaliação estatística)

Volume 1

O itava Edição

2004
Alexandre Schuler - Cromatografia

SUMÁRIO

1 - Introdução, 1

1.1. Histórico, 1
1.2. Classificação, 1

2 - Tipos de Processos Cromatográficos, 3

2.1. Cromatografia de adsorção, 3

2.2. Cromatografia de partição, 4
2.3. Distribuição em contracorrente, 6
2.4. Cromatografia em fase líquida, 7
2.5. Fatores que influem na separação, 8
2.6. Cromatografia em fase gasosa, 12

3 - Tratamento teórico da Cromatografia, 16

3.1. A equação de Van Deemter, 16

3.2. Fase estacionária, 16
3.3. Suporte, 17
3.4. Coluna, 18
3.5. Fase móvel, 18

4 - O Cromatógrafo, 20

4.1. O Cromatógrafo a Gás, 20

4.2. O Cromatógrafo a Líquido, 23
4.3. Detetores, 24

5 - Análise Qualitativa, 32

6 - Análise Quantitativa, 33

6.1. Introdução, 33
6.2. Medição de área, 33
6.3. Métodos de cálculo, 35
6.4. Seleção do melhor método de cálculo, 40

7. Otimização do processo analítico, 41

7.1. Parâmetros analíticos, 41

7.2. Projetando um método analítico, 43
Alexandre Schuler - Cromatografia 2

7.3. Validação de um método analítico, 45

8. Técnicas adicionais de identificação, 52

8.1 Tempo de retenção e retenção relativa, 52

8.2. Índice de retenção, 52
8.3. Equivalência entre fases estacionárias, 53

Bibliografia, 54

Apêndice 1 (Túnel do Tempo), 55

Apêndice 2 (Características Básicas dos Detetores), 59

A2.1. Sensibilidade, 59
A2.2. Nível de ruído, 59
A2.3. Limite de Detecção, 59
A2.4. Faixa de Linearidade Dinâmica, 60

Apêndice 3 (Técnicas de introdução da amostra), 61

Apêndice 4 (Sistemas de aquisição de dados), 63

Apêndice 5 (O desenvolvimento cromatográfico), 64

Apêndice 6 (Outros detetores utilizados em Cromatografia), 66

Apêndice 7 (Estatística), 70
Alexandre Schuler - Cromatografia

1 - INTRODUÇÃO

1.1. Histórico1

Cromatografia é um termo genérico, aplicado a um processo de separação físico-

químico, o qual é baseado nos fenômenos de adsorção e partição. Este termo foi escolhido porque as
primeiras separações foram realizadas com substâncias coloridas. Entretanto, o processo
cromatográfico não é restrito a essa classe de substâncias, constituindo-se na atualidade no método
mais eficiente de separação, com aplicações na Química Analítica Qualitativa e Quantitativa, para
compostos orgânicos e inorgânicos, independentemente de seu estado físico.

1.2. Classificação

Um processo cromatográfico envolve uma fase móvel e uma fase estacionária.

A fase estacionária é um sólido ou um líquido (Figura 1.1). No segundo caso, este fica
impregnado em um sólido (suporte) e o fenômeno mais atuante é a partição. No primeiro caso,
tem predominância a adsorção. Assim, pode-se classificar a Cromatografia em dois tipos gerais:
Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.

Figura 1.1 - O Processo Cromatográfico. A Fase Móvel transporta a amostra através da Fase
Estacionária. A velocidade média das partículas da amostra depende da sua natureza. Desse
modo, cada componente atingirá o final da coluna em um instante diferente.

A fase móvel pode ser um líquido ou um gás. No primeiro caso, denomina-se o

processo de Cromatografia em Fase Líquida e no segundo caso de Cromatografia em Fase
Gasosa, ou simplesmente Cromatografia a Líquido e Cromatografia a Gás.

A Cromatografia pode ainda ser classificada em função da técnica empregada:

↑ Cromatografia em Papel
↑ Cromatografia em Camada Delgada
↑ Cromatografia em Coluna Clássica

1
É sugerida a leitura do Apêndice 1 (Túnel do Tempo), para um breve histórico do desenvolvimento da Cromatografia.
Alexandre Schuler - Cromatografia 2

↑ Cromatografia em Fase Gasosa

↑ Cromatografia em Fase Líquida de Alto Desempenho

Esta última é mais conhecida pelas iniciais de seu nome em inglês (High
Performance Liquid Chromatography - HPLC) e constituem-se variantes suas as seguintes
técnicas:

• Cromatografia de Permeação∗ em Gel (GPC)

• Cromatografia de Troca Iônica (IEC)

GPC (do inglês Gel Permeation Chromatography) é empregada na análise de

polímeros, enquanto a IEC (do inglês Ion Exchange Chromatography) é empregada na análise de
íons (cátions e ânions).

∗
Na realidade, este termo é empregado quando a fase móvel é um solvente orgânico. Quando a fase móvel é água ou
solução aquosa, emprega-se o termo Cromatografia de Filtração em Gel. O termo Cromatografia por Exclusão de
Tamanho (em inglês Size Exclusion Chromatography) é mais genérico e abrange as duas técnicas.
Alexandre Schuler - Cromatografia 3

2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS

2.1. Cromatografia de Adsorção

Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido

(adsorvente) fixa em sua superfície um líquido ou um gás, por meio de interações semelhantes às
“forças de Van Der Waals”. Chama-se coeficiente de adsorção à relação

Na
ka =
Nn
onde Na e Nn são respectivamente o número de moles adsorvidos e não adsorvidos de uma
determinada substância. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka, estes variando
com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vários componentes é
forçada a passar através de um tubo contendo um adsorvente (coluna cromatográfica), cada
componente necessitará de um intervalo de tempo diferente para transpor a coluna. Esse
intervalo de tempo é denominado tempo de retenção (Tr). A Figura 2.1a ilustra um processo de
Cromatografia por Adsorção. A substância mais fortemente adsorvida é mais dificilmente
arrastada pela Fase Móvel.

a) Cromatografia de Adsorção b) Cromatografia de Partição

Figura 2.1 - Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.

2.2. Cromatografia de Partição

Alexandre Schuler - Cromatografia 4

Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos não

miscíveis, ela se dissolverá parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a relação C1
/ C2, onde C1 e C2 são as concentrações da substância em cada um dos dois líquidos. Denomina-
se coeficiente de partição à relação

C1
kp =
C2
Se M0 é a massa total da substância e M1 é a massa dissolvida no solvente 1,
podemos escrever
M1 M1 V2
kp = V1 = ⋅
( M 0 − M 1) V1 M0 − M1
V2

kpV 1
logo, M 1 = M 0. (eq. 1)
V 2 + kpV 1

Se a substância estava inicialmente dissolvida no solvente 1, M1 é a massa que

permanece neste solvente após adição do solvente 2, o qual extraiu a massa (M0 - M1). Se as duas fases
forem separadas (com auxílio de um funil de separação, por exemplo), a adição de outra quantidade do
solvente 2 vai extrair a massa (M1 - M2), onde

k pV 1
M 2 = M 1. (eq. 2)
V 2 + k pV 1
Substituindo na eq. 2 o valor de M1 (eq. 1), fica

M2 = Mo [kpV1/(V2 + kpV1)] 2 (eq. 3)

É possível generalizar a eq. 3 para

Mn = Mo [kpV1/(V2 + kpV1)] n (eq. 4)

que dá a massa Mn que permanece no solvente 1 após n extrações com o solvente 2. Dá-se ao processo
agora descrito o nome de extração. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de, por exemplo, 2
componentes, com kp ≠ kp , um dos componentes ficará preferencialmente no solvente 1 e o outro
'

no solvente 2. Assim sendo, à medida que n cresce, cada fase ficará mais rica (mais pura) em um dos
componentes. No caso anterior (extração), a porção de líquido 1 era sempre a mesma,
renovando-se apenas o líquido 2. Agora, ambos são renovados. O Esquema 2.1, onde o líquido 1
Alexandre Schuler - Cromatografia 5

é o superior, ilustra o processo, que pode ser visualizado em nível molecular na Figura 2.1.b.
Sejam duas substâncias A e B, onde kA é maior que kB. Isto significa que o líquido 1 vai se
enriquecendo de A e o líquido 2, relativamente, vai se enriquecendo de B, a cada etapa do
processo. Os números da esquerda, em cada quadrícula 1, indicam a fração de A e os da direita
indicam a fração de B. Do mesmo modo, os números superiores indicam a fração de A e de B no
líquido 1 e os inferiores indicam a fração de A e de B no líquido 2. No exemplo, foi utilizada
uma mistura com quantidades iguais de A e de B, cujos coeficientes de partição valem,
respectivamente, 3 e 1/3. Para este segundo tipo de procedimento, a equação 4 não é válida. Em
seu lugar, pode ser deduzida, de modo semelhante, a eq. 5, onde Mn é a massa extraída após n
etapas. A partir dos valores de MAn e MBn, pode-se calcular a composição da mistura (ou o grau
de pureza de cada componente) em cada solvente, após n etapas (n partições) 2.

ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3

Esquema 2.1 - Distribuição (partição) de duas substâncias (A e B), em dois líquidos (1 e 2)

não miscíveis. Algumas frações se juntam por terem mesma composição.

Mn = Mo [V2/(V2 + kpV1)] n (eq. 5)

A partição, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo

cromatográfico. O número de “equilíbrios” (etapas) que ocorrem dentro de uma coluna (n) é
conhecido como o “número de pratos teóricos”, prato teórico sendo um ponto de equilíbrio
(entre uma fase e outra). A distância entre dois pontos de equilíbrio consecutivos chama-se
“altura equivalente a um prato teórico” (H). Os parâmetros n e H serão novamente
discutidos mais adiante. Observe-se que se partindo de uma mistura contendo 50% de A e 50%

1
Cada quadrícula corresponde a um frasco de extração (ex.: funil de separação).
2
No exemplo apresentado no esquema 2.1, as massas correspondentes a A e B, respectivamente, no solvente 1 do
frasco superior da ETAPA 3, são 0,422 g e 0,016 g, que correspondem a 96,35% de A e 3,65% de B.
Alexandre Schuler - Cromatografia 6

de B, obtém-se, respectivamente, nas etapas 1, 2 e 3, os seguintes percentuais (em massa) de A,

nas frações superiores (solvente 1): 75%, 90% e 96,4%. Como o coeficiente de partição de B é o
inverso do coeficiente de partição de A, os correspondentes percentuais de B (nas frações
inferiores, solvente 2) serão exatamente os mesmos. É possível inclusive calcular quantas etapas
serão necessárias para obter-se, por exemplo, uma pureza igual ou maior a 99%, bastando aplicar
a eq. 5. No caso, encontra-se n = 5.

IMPORTANTE ! Se kB também for maior que a unidade, a perda de B será muito grande e também a
purificação de A será muito demorada (exigirá maior número de etapas).

2.3. Distribuição em contracorrente

O procedimento descrito a seguir é um exemplo típico de extração líquido-

líquido. Na seção anterior foi demonstrado que uma substância inicialmente dissolvida em um
líquido 1 pode ser extraída por um líquido 2, desde que os dois líquidos sejam imiscíveis. Trata-
se de uma operação que é feita manualmente, com auxílio de um funil de separação, e que pode
ser repetida até a exaustão (literalmente !). O instrumento de Craig (ver Apêndice 1), é
constituído de um conjunto de um grande número de tubos de distribuição de Craig, cada um
contendo uma certa porção do líquido mais denso (em azul escuro na Figura 2.2), a um nível tal
que não passe para a câmara D através de C. Os diversos tubos são fixados, na mesma posição, a
um eixo (perpendicular ao papel, na figura). Adiciona-se então a amostra (contendo, por
exemplo, duas substâncias, como exemplificado na seção anterior) e o líquido menos denso (em
azul claro) ao primeiro tubo da seqüência (identificado com o no 1), estando os tubos na posição
mostrada em (a). Por rotação desse eixo (cerca de 45o), num movimento de vai-e-vem, promove-
se agitação da mistura (como se faria com um funil de separação) e em seguida deixa-se em
repouso por alguns instantes, para separarem-se de novo as duas fases. Finalmente, gira-se 90o,
de modo a colocar os tubos na posição (b). Nessa posição, o líquido menos denso flui através de
C para a câmara D. Após alguns instantes, retorna-se à posição (a), quando então o líquido
menos denso, através de E, passa para B do tubo seguinte, atingindo a câmara A. Então, começa
outro ciclo. A fração Fm,n do soluto contido no m-ésimo tubo depois de n transferências é dada
pela seguinte expansão binomial:

onde D é o fator de distribuição, V1 é o volume do líquido menos denso e V2 é o volume do

líquido mais denso.
Alexandre Schuler - Cromatografia 7

Figura 2.2 – Esquema do Aparelho de Craig para distribuição em contra-corrente.

2.4. Cromatografia em Fase Líquida

O exemplo mais simples de cromatografia a líquido é a separação em uma

camada delgada de sílica-gel depositada sobre uma placa de vidro (Cromatografia em Camada
Delgada). A Figura 2.3 ilustra o processo.

O líquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os componentes

de uma mistura binária (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicação). Quando o solvente se
aproxima da outra extremidade da placa (2), esta é removida da cuba que contém o solvente e na
qual estava parcialmente mergulhada, na posição vertical e a um nível abaixo do ponto de
aplicação. As razões de frente, RfA = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 são características de cada substância,
dependendo da natureza da fase móvel e da fase estacionária. A Cromatografia em Camada
Delgada é a mais empregada em Análise Qualitativa ou semi-Quantitativa. Em virtude da
pequena quantidade de amostra utilizada, é menos indicada para fins preparativos, quando então
se emprega a Cromatografia em Coluna Clássica. Neste segundo tipo de processo, a fase
estacionária é colocada em um tubo de vidro (coluna cromatográfica) colocado na posição
vertical. A coluna é dotada de uma torneira na extremidade inferior (Fig. 2.4), que é utilizada
para controlar a vazão da fase móvel, que desce por gravidade.

Fig. 2.3 - Cromatografia em Camada

Delgada.

Neste exemplo, a amostra contém

dois componentes, A e B, que são
identificados pelos respectivos valores de
R f, por comparação com padrões puros.

A necessidade de se controlar a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna, além da

impossibilidade (naquela época - anos 50) de se bombear um líquido com fluxo
Alexandre Schuler - Cromatografia 8

constante e contínuo, levaram os projetistas a abandonar essa técnica, passando a utilizar um gás
como fase móvel (1956).

O ponto A’ indica o nível da fase estacionária e o ponto A

indica o nível da fase móvel. A diferença (A’ – A) deve ser
mínima, para evitar a diluição do material a ser cromatografado,
o que resultaria em zonas (na Fig. 2.4, as faixas 1, 2 e 3) mais
largas. Ao se fazer a eluição (passagem da fase móvel), os
componentes afastam-se do ponto de aplicação (topo da coluna) a
uma distância d tal que d/λ = Rf (λ é o comprimento da coluna),
obtendo-se assim uma coluna desenvolvida. A partir daí,
continuando-se a eluição, cada componente pode ser coletado
isoladamente, quando atingir o final da coluna. Denomina-se
Volume de Retenção (V r ) o volume de fase móvel necessário para
a eluição completa de um componente. Desse modo, tem-se V r =
V 1 / Rf, onde V 1 é o volume ocupado pela fase móvel dentro da
Figura 2.4 coluna. Finalmente, pode ser calculado o volume total de solvente
necessário para a eluição completa de todos os componentes da
Cromatografia amostra, que é essencialmente igual ao Vr do componente que sai
em Coluna por último (menor Rf). No Apêndice 4, são discutidos mais
detalhes sobre o desenvolvimento da coluna.

2.5. Fatores que influem na separação

Independentemente do processo envolvido na separação cromatográfica

(adsorção ou partição), esta é função de uma série de fatores, a saber:

Natureza da fase estacionária Vazão da fase móvel

Concentração da fase estacionária Temperatura
Natureza da fase móvel Granulometria e geometria do suporte

A polaridade da fase estacionária é um fator importante a se considerar. Em

princípio, quando se tem uma fase estacionária não polar, os diversos componentes da
amostra eluem na ordem crescente de seus pontos de ebulição (Figura 2.5) e o processo
assemelha-se bastante a uma destilação. Quando a fase estacionária apresenta alguma
polaridade, essa ordem de eluição em função do ponto de ebulição fica alterada (Figura
2.6) e só é obedecida quando os componentes apresentam polaridade de mesma ordem de
grandeza (componentes A-C e D-G da Figura 2.7). Em alguns casos, a diferença de
polaridade pode ser equilibrada com a diferença de ponto de ebulição, fazendo com que
dois componentes distintos eluam juntos (Figura 2.8). Nesses casos, outros fatores podem
auxiliar na separação, como a ponte de hidrogênio entre os componentes D-G da Figura 2.7.

FE: Esqualano (hidrocarboneto de baixíssima polaridade) FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)

Alexandre Schuler - Cromatografia 9

B ⇒ ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)

A ⇒ Benzeno (ponto de ebulição = 80,2oC)

Figura 2.5 – Separação em função da diferença Figura 2.6 - Efeito da polaridade sobre a
no ponto de ebulição separação cromatográfica

A concentração da fase estacionária líquida também influi na separação, como

pode ser observado na Figura 2.9. Aliás, com o uso, é normal diminuir a concentração, por
arraste pela fase móvel, mesmo à temperatura ambiente, de modo que colunas com fase
estacionária líquida possuem um tempo de vida útil finito, que pode ser bastante curto, na
medida em que a temperatura da análise se aproxima da temperatura limite, que por definição
situa-se 150oC abaixo da temperatura de ebulição da fase estacionária. Essa perda de fase
estacionária também acontece em HPLC, apesar de quase nunca se aquecer a coluna, porque a
imiscibilidade entre fase estacionária e fase móvel (agora um líquido) não é infinita. Atualmente,
têm sido desenvolvidas fases quimicamente ligadas (ver Seção 3.2 - Fase Estacionária; p. 16).

Coluna: diglicerol, 20%, 6 metros

A) n-nonano (154oC) D) etanol (78oC) H) água (100oC) A- n-nonano (154oC)

B) n-decano (174oC) E) n-propanol (94oC)
C) n-undecano (194oC) F) n-butanol (118oC)
G)n-pentanol (132oC)
não polar, não forma ponte polar, ponte de hidrogênio polar, ponte de hidrogênio fortíssima
média

Figura 2.7 – Efeito da ponte de hidrogênio sobre a separação cromatográfica

Outro fator importante, principalmente em HPLC, é a polaridade da fase

móvel. Aliás, esse é o principal recurso para implementar uma separação (ver Gradiente de
Polaridade, na Seção 4.2; p. 24). Também a vazão da fase móvel é muito importante na
separação. A Figura 2.10 ilustra a situação, que foi alvo de um estudo semi-teórico realizado por
Alexandre Schuler - Cromatografia 10

van Deemter (Capítulo 3). A temperatura (a que está submetida a coluna) é outro fator
determinante na separação, particularmente em CFG, conforme resume o quadro anexo à Figura
2.11. Finalmente, a granulometria da fase estacionária sólida (ou do suporte sólido da fase
estacionária líquida), conforme mostrado na Tabela 2.1, também influi na separação.

FE: Apiezon (um hidrocarboneto)

A ⇒ Benzeno (ponto de ebulição = 80,2oC)

B ⇒ ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)

Figura 2.8 - Uma separação mal-sucedida

Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte ou da FE sólida sobre a separação cromatográfica

malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min)

60-80 4300 0,93 20
80-100 4600 0,87 20
100-120 5700 0,70 24
Diâmetro externo = 1/8”; comprimento = 4 m.
Alexandre Schuler - Cromatografia 11

Figura 2.9 - Efeito da concentração da fase estacionária sobre

a separação cromatográfica.

onde: V1 < V2 < V3 < V4

Figura 2.10 - Efeito da vazão da fase móvel sobre a separação
cromatográfica.
Alexandre Schuler - Cromatografia 12

Figura 2.11 - Efeito da temperatura sobre a separação cromatográfica.

O quadro apresentado a seguir sumariza a relação entre o efeito e o tipo de processo:

TIPO FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA EFEITO SOBRE TR

ADSORÇÃO G S DIMINUI
L S DIMINUI
PARTIÇÃO G L DIMINUI
L L NÃO ALTERA

2.6. Cromatografia Em Fase Gasosa (CFG)

Na Cromatografia a Gás empregam-se colunas bem mais longas que aquelas

usadas em Cromatografia a Líquido. O princípio é o mesmo, mas a força motora é a pressão do
gás e não a força da gravidade, de modo que as colunas normalmente são dobradas em espiral, a
fim de ocupar menos espaço dentro do cromatógrafo. A Fig. 2.12 esquematiza um cromatógrafo
a gás e a Fig. 2.13 apresenta a fotografia de um cromatógrafo a gás moderno.

A amostra (gás, líquido ou sólido em solução) é injetada (ver Apêndice 2),

com auxílio de uma microseringa ou válvula apropriada, no Injetor, que também é o
Vaporizador (V) e os seus vapores são arrastados para o interior da coluna pela fase móvel
(gás de arraste). Na saída da coluna, a amostra passa pelo Detetor (D), que envia um sinal
para o Registrador (R). Como será visto adiante (Detetores, p. 24), este sinal é proporcional
à quantidade de cada componente, o que permitirá uma análise quantitativa. Vale
acrescentar que a Cromatografia a Gás é talvez o método de análise mais preciso. O sinal
Alexandre Schuler - Cromatografia 13

eletrônico captado pelo registrador é transformado num movimento da pena do mesmo.

Como o papel de registro está em movimento, obtém-se um gráfico (Fig. 2.14) denominado
cromatograma.

Fig. 2.12 – Esquema de um cromatógrafo a gás Figura 2.13 – Cromatógrafo a gás.

Fig. 2.14 - Cromatograma de uma amostra com dois componentes.

As áreas A1 e A2 sob as duas curvas do cromatograma da Fig. 2.14 são

proporcionais às quantidades dos dois componentes na mistura. Distância de Retenção (Dr)
é a distância, no papel, entre o ponto registrado no momento da injeção (Início) e o ponto
correspondente ao máximo de cada curva (pico). Dr varia com a velocidade do papel (z),
mas o tempo de retenção (Tr = Dr/z) é uma característica da substância que varia com a
vazão da fase móvel, a natureza e a concentração da fase estacionária e com a temperatura.
Por isso, o cromatógrafo possui controladores de vazão da fase móvel e da temperatura do
forno da coluna. A coluna (e conseqüentemente a fase estacionária) pode ser substituída, até
encontrar-se a coluna ideal para uma dada amostra. Além disso, existe uma vazão ideal para
cada coluna, independentemente da natureza da amostra (ver Fig. 2.15). Assim sendo, a
temperatura da coluna é o principal recurso disponível para obter-se um máximo de separação
entre os diversos componentes da amostra.

Outro parâmetro usado em CFG é a Retenção Relativa (RR), que é também

usado na identificação:
Alexandre Schuler - Cromatografia 14

Tr 2 Vr 2 Dr 2
RR = = =
Tr 1 Vr 1 Dr 1
Essas relações são equivalentes, desde que Vr2 = F.Tr e F e z são constantes
(F = vazão da fase móvel).

Fig. 2.15 - Relação entre F e n ou H. Fi é a Vazão Ideal (os parâmetros A, B e C são descritos na Seção 3.1).

Obs.: Experimentalmente determina-se H por medição da distância de retenção e aplicação das equações:

n = (4Dr/L)2 e H = λ/n,

onde λ é o comprimento da coluna e L é a largura do pico na base. A Figura 2.16 ilustra o

procedimento. O parâmetro n mede a eficiência de uma coluna cromatográfica (ver Capítulo 3).

Figura 2.16 - Procedimento para determinação

do número de pratos teóricos.
As duas grandezas devem ser
medidas em milímetros (ou em
minutos ou segundos).

n = (4Dr/L)2
Alexandre Schuler - Cromatografia 15

3 - TRATAMENTO TEÓRICO DA CFG

3.1. a equação de Van Deemter

Van Deemter estabeleceu uma equação empírica (eq. 6) que relaciona as

diversas variáveis da Cromatografia a Gás com H (altura equivalente a um prato teórico). Como
H é igual a l/n e n mede a eficiência do processo, buscam-se condições em que o valor de H é
mínimo:

(eq. 6)

λ= parâmetro adimensional que mede as irregularidades no empacotamento da coluna.

dp = diâmetro médio das partículas do suporte.
Dg = coeficiente de difusão da amostra na fase móvel.
γ= fator de correção para a tortuosidade dos canais entre partículas.
K’ = k.Nl /Ng ; k = coeficiente de partição.
N= fração de fase estacionária (l) ou da fase móvel (g) dentro da coluna.
df = espessura efetiva do filme líquido (película de fase estacionária na superfície do suporte).
Dl = coeficiente de difusão da amostra na fase estacionária.
v= velocidade linear da fase móvel.

A equação de Van Deemter pode ser escrita sob a forma geral

H = A + B/v + C.v (eq. 7)

que é a equação de uma hipérbole (Fig. 2.15). Como pode ser visto na eq. 6, o modo de
empacotamento, o dimensionamento do suporte e o coeficiente de difusão da amostra em cada fase são
fatores que devem ser seriamente considerados, quando é projetada uma coluna. Temperatura é talvez
o fator mais importante, embora não apareça explicitamente na eq. 6. É que K’ e D são altamente
dependentes da temperatura. Realmente, observa-se na prática que esta é a variável que mais influi na
resolução, em Cromatografia a Gás, variando drasticamente a retenção relativa. De um modo geral,
o tempo de retenção depende da natureza da fase estacionária, da temperatura de operação e da vazão
da fase móvel.

3.2. Fase estacionária

A fase estacionária é um sólido (Cromatografia de Adsorção) altamente poroso

(mais de 150 m2/g), ou, mais comumente, um líquido (Cromatografia de Partição). No segundo caso, o
líquido é depositado sobre um sólido (suporte), que será discutido mais adiante.
Interações entre dipolos, polaridade e pontes de hidrogênio são os principais
fatores, na fase estacionária, que determinam a separação cromatográfica. Esses fatores são
Alexandre Schuler - Cromatografia 16

dependentes da temperatura, daí também a necessidade de um controle dessa variável. Os

Cromatogramas 3.1.a e 3.1.b ilustram a influência da polaridade e da ponte de hidrogênio sobre
a separação. Em ambos, como são usadas fases estacionárias polares, os picos aparecem na
ordem crescente de polaridade dos componentes. Mas, no Cromatograma 3.1.b, como a fase
estacionária (diglicerol) interage com o etanol (ponte de hidrogênio), o tempo de retenção deste
é bastante aumentado (ver também Seção 2.5; p. 8).

Alto ponto de ebulição e inércia química e catalítica (em relação à amostra, à

fase móvel e ao material de que é constituído o tubo da coluna) são os principais requisitos para
uma fase estacionária. Em relação a ponto de ebulição (PE) deve ser lembrado que a temperatura
limite para operação com uma dada coluna é 1500C abaixo do PE da fase estacionária. Acima
dessa temperatura, a perda por volatilização é excessiva. Em anos recentes tem sido utilizada a
FQL (Fase Quimicamente Ligada), onde a FE une-se ao suporte mediante uma reação química.
As fases estacionárias mais freqüentemente utilizadas, com um amplo espectro de aplicações, são
polímeros derivados de silício, as polisiloxanas (ou siliconas), como a SE-30, por exemplo.
Outra fase também bastante utilizada é o polietilenoglicol (ex.: Carbowax 20M).

3.3. Suporte

O suporte tem a função de fixar dentro da coluna a fase estacionária. É

necessário que o suporte seja quimicamente e também cataliticamente inerte. O material a ser
empregado também não pode exibir área superficial maior que 50 m2/g, alta porosidade, nem
grande poder de adsorção. Centros ativos (ácidos ou básicos) podem provocar modificações
estruturais na amostra, devendo ser removidos. Terras diatomáceas, graças à sua baixa
capacidade de adsorção e à sua baixa porosidade, são ainda bastante empregadas como suporte.
Um excelente suporte à base de diatomácea é comercializado com um nome constituído da
palavra Chromosorb seguida de uma ou mais letras (ex.: Chr WHP). Atualmente, têm sido
desenvolvidos materiais sintéticos, copolímeros do etilvinilbenzeno com divinilbenzeno. Outros
monômeros, como cianovinilbenzeno, também são empregados, para modificar a polaridade da FE. A
depender do processo de fabricação, esses polímeros também podem ser empregados como fase
estacionária (Ex.: Porapak Q, Chromosorb 101, etc). Permitem um bom empacotamento, graças
à uniformidade na granulometria e na própria geometria das partículas. Também a porosidade
pode ser controlada na fabricação.

Figura 3.1 - Ausência (a) e presença (b) de ponte de hidrogênio entre FE e etanol
Alexandre Schuler - Cromatografia 17

3.4. Coluna

O material de que é constituída a coluna (tubo) pode ser aço inox 316,
alumínio, níquel, vidro ou teflon. Quando não se conhece o material a ser analisado, dá-se
preferência às colunas de vidro (trata-se de um vidro especialmente tratado, para remover centros
ácidos de sua superfície) ou de teflon, sendo que esta última tem emprego mais restrito, devido à
sensibilidade ao calor e à pressão. As colunas são classificadas quanto ao diâmetro externo:

- Coluna microanalítica (capilar) ............ 0,1 a 0,5 mm

- Coluna analítica .................................. 1/8”, 3/16” e 1/4”
- Coluna semipreparativa ..................... 3/8”, 1/2” e 5/8”
- Coluna preparativa .............................. 5, 7 e 10 cm

As colunas analíticas mais comumente empregadas possuem 2 a 3 m de comprimento,

com 1.000 a 10.000 pratos teóricos. Colunas capilares são bem mais longas. As primeiras capilares
fabricadas possuíam mais de 100 m. Com o avanço da tecnologia, o comprimento atual situa-se entre 20 e
40 m, embora com cerca de 100.000 pratos teóricos. Tem-se notícia de uma coluna capilar com cerca de
1600 m de comprimento e 1 milhão de pratos teóricos.

Atualmente foram desenvolvidas colunas com 0,53 mm (colunas “megabore”)

com excelentes resultados. Mais simples de instalar, reúnem as qualidades das colunas analíticas
e das capilares.

As colunas usadas em CLAD (seção 4.2, p. 22) são bem mais curtas (10 a 40 cm) e
os diâmetros encontrados mais comumente no comércio especializado variam entre 3 e 7 mm.

3.5. Fase móvel

Em CFG, a fase móvel é um gás inerte, devendo apresentar-se bastante puro,

principalmente quando se tratar da análise de traços. Os gases mais empregados são H2, N2, He,
Ar e Ne, podendo também serem utilizados outros, em casos especiais.
Na escolha da fase móvel (ou gás de arraste), devem ser considerados os
seguintes fatores:
- Disponibilidade/custo.
- Eficiência na separação.
- Efeito sobre o tempo de análise.
- Segurança.
- Efeito sobre o sistema de detecção.
OBS.:
1 - A equação de Van Deemter simplificada (eq. 7), aplicada aos gases N2 e H2, apresenta os
seguintes coeficientes (amostra: Propano), com uma dada coluna:
Alexandre Schuler - Cromatografia 18

Ha = 0,1 + 0,07/v + 0,05v (N2)

Hb = 0,1 + 0,28/v + 0,05v (H2)

Esses dados comprovam a influência da natureza do gás de arraste sobre a eficiência.

2 - A velocidade relativa de eluição aumenta na ordem H2 < N2 < He < Ar, fato que
demonstra a influência da natureza do gás de arraste sobre o tempo de análise.

A Tabela 3.1 resume a aplicação dos critérios acima mencionados, para seleção
da fase móvel em função do detetor empregado.

Tabela 3.1 - Gases mais recomendados para CFG, por tipo de detetor.

TIPO DE DETETOR GASES MAIS USADOS

(Ordem de prioridade)
Condutividade Térmica H2 > He >> N2
Ionização de Chama N2 > Ne > He
Captura Eletrônica N2 > He

Em Cromatografia a Líquido empregam-se como Fase Móvel principalmente

água deionizada, metanol, acetonitrila, etc. A seleção depende do detetor a ser empregado e a
fase móvel deve ser imiscível com a fase estacionária liquida.
Alexandre Schuler - Cromatografia 19

4 - O CROMATÓGRAFO

4.1. O Cromatógrafo a Gás

A Fig. 2.12 (p. 13) representa esquematicamente um Cromatógrafo a Gás. É

possível agora descrever mais detalhadamente o instrumento.

a) Controles de Temperatura

O cromatógrafo dispõe de termostatos para controle independente do

aquecimento dos três principais setores: câmara de vaporização (é o próprio injetor), forno
da coluna e bloco do detetor. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistência
elétrica localizada na base do forno, é homogeneizado por um ventilador, que pode
permanecer ligado após o final do aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse
caso, o compartimento do forno deve permanecer aberto, exceto nos equipamentos que
possuam dispositivo de resfriamento automático.

Figura 4.1 - Fluxímetro de bolha Figura 4.2 - Divisor de fluxo para coletor

b) Controles Pneumáticos

Os cromatógrafos a gás normalmente possuem uma válvula controladora

de pressão e outra para ajuste da vazão da fase móvel. Idênticos sistemas existem para o
controle da vazão dos gases auxiliares (ver seção 4.3.2.b; p. 25). A vazão é medida com o
auxílio de um fluxímetro de bolha, ou bolhômetro (Fig. 4.1). A “pêra” (parte inferior)
contém uma solução de sabão líquido. Comprimindo-se a “pêra”, o nível do líquido sobe e
o gás forma uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazão, é suficiente
marcar com um cronômetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na
atualidade, existem no mercado alguns equipamentos totalmente microprocessados,
tornando obsoletos esses acessórios.
Alexandre Schuler - Cromatografia 20

c) Coletor de Frações

O coletor de frações é um acessório utilizado em Cromatografia preparativa. O

material efluente da coluna pode passar por um divisor de fluxo (Fig. 4.2), de modo que uma
parte é desviada para o coletor, onde cada componente, isoladamente, é condensado. Colunas de
maiores dimensões permitem a injeção de uma maior quantidade de amostra, permitindo assim a
produção de pequenas quantidades de um material com alta pureza (maior que 99,9999%), que
pode ser empregado como padrão, por exemplo.

d) Detetores

Por ser necessário um estudo mais detalhado, serão discutidos mais adiante.

e) Eletrômetro

O eletrômetro é um amplificador de sinal. Este módulo pode ser controlado a

qualquer instante, de modo que um sinal fraco (componente menor) pode ser ampliado
independentemente dos outros, enquanto que um sinal muito forte (componente maior) pode ser
atenuado o suficiente para que seu pico fique contido no papel do registrador. Os
Cromatogramas 4.1 e 4.2 ilustram, respectivamente, a relação real de áreas e outro registro da
mesma amostra, com ampliação do primeiro sinal e atenuação do terceiro, ou mais exatamente,
atenuação menor para o primeiro e atenuação maior para o terceiro, em relação à atenuação do
segundo. Logicamente, as áreas medidas no segundo cromatograma, multiplicadas pelos
respectivos fatores de atenuação, fornecem os valores reais das áreas relativas.

Cromatograma 4.1 - Mesma atenuação Cromatograma 4.2 - Atenuações diferentes

f) Registrador

O registrador é um instrumento acessório, que transforma o sinal emitido pelo

detetor e amplificado pelo eletrômetro, em um sinal mecânico. Na extremidade do sistema
Alexandre Schuler - Cromatografia 21

mecânico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da linha de
base, é proporcional à quantidade do componente na amostra. Como o papel está em
movimento, obtém-se uma curva (cromatograma), onde a distância do início da análise
(ponto de injeção) ao máximo de cada pico é a distância de retenção (Dr). Dividindo Dr
por z (velocidade do papel), obtém-se o tempo de retenção, Tr. Idealmente, com
separação completa e condições ótimas (incluindo seleção perfeita da fase estacionária),
obtém-se uma curva simétrica. No Apêndice 3 são discutidas outras técnicas de aquisição
de dados.

g) Programador Linear de Temperatura

Quando a retenção relativa (RR) de alguns componentes é próxima

da unidade (baixa resolução); entretanto a temperatura de ebulição dos componentes
menos voláteis é muito alta (Cromatograma 4.3), um aumento na temperatura da
análise (temperatura da coluna), com o objetivo de reduzir o tempo de análise e
obter um pico mais agudo para os últimos componentes (o que inclusive diminuiria o
erro na determinação de Dr), acarretaria uma diminuição na já pequena retenção
relativa dos primeiros componentes. Em situações como essa, pode-se aplicar um
gradiente de temperatura, com o auxílio de um Programador Linear de
Temperatura (PLT). A velocidade de aquecimento pode ser controlada, sendo
possível também promover um aquecimento isotérmico em algumas regiões. Em
operações desse tipo deve-se indicar no cromatograma a temperatura inicial (T i ), a
temperatura final (T f ), que não deve diferir da temperatura de ebulição da fase
estacionária em menos de 150 0 C, e a velocidade de aquecimento, para que o
cromatograma possa ser reproduzido posteriormente (Cromatograma 4.4).

Cromatograma 4.3 - Análise Isotérmica. Cromatograma 4.4 - Análise com PLT.

Tempos de Retenção: 1 (1,25 min), 2 (1,43 min), 3 Tempos de Retenção: 1 (1,25 min), 2 (1,43 min), 3
(1,54 min), 4 (3,2 min) e 5 (4,1 min). (1,54 min), 4 (2,9 min) e 5 (3,3 min).
Alexandre Schuler - Cromatografia 22

4.2. O Cromatógrafo a Líquido

O cromatógrafo a líquido, mais comumente conhecido pela sigla inglesa da

técnica, HPLC (High Performance Liquid Chromatography; em português: Cromatografia
Líquida de Alto Desempenho), é um instrumento mais simples que o cromatógrafo a gás nos
seguintes aspectos (ver Figura 4.3a):

a) só possui um canal analítico, enquanto CG’s podem ter até quatro c anais;
b) é modulado, isto é, o sistema de bombeamento e o detetor são independentes, o que
facilita a substituição de detetores;
c) opera geralmente à temperatura ambiente;

A Figura 4.3b é um diagrama de um CL típico. Cada bloco é descrito a seguir:

Figura 4.3a – Cromatógrafo a Líquido Figura 4.3b - Diagrama em blocos de um HPLC.

(HPLC).

a) Reservatório de Fase Móvel

A Fase Móvel (um líquido puro ou uma mistura de composição definida) deve ser
filtrada em membranas com 0,46 µm de diâmetro de poros e desgaseificada (ver próximo item).

b) Sistema de desgaseificação

A Fase Móvel deve ser desgaseificada, para evitar a formação de bolhas, as

quais podem provocar cavitação (com conseqüente dano à bomba) ou gerar picos falsos, ao
passarem pela célula do detetor. São conhecidas várias técnicas de desgaseificação:

- aquecimento com agitação;

- borbulhamento de gás hélio;
- ultra-som;
Alexandre Schuler - Cromatografia 23

- vácuo
c) Bomba
O bombeamento da Fase Móvel é realizado por uma bomba controlada por um
microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de sucção (para evitar vaporização de fase móvel
mais volátil) e a vazão (importante quando a análise é realizada com Gradiente de Polaridade, em cujo
caso há necessidade de uma segunda bomba; ver mais adiante).

d) Válvula de injeção

A amostra é sempre introduzida com auxílio de uma válvula, porquanto a

pressão de trabalho raramente é menor que 50 atmosferas (Apêndice 2).

e) Coluna

As colunas empregadas em CL são retas, uma vez que seu comprimento raramente
ultrapassa 30 cm, ocupando portanto muito pouco espaço no equipamento.

f) Detetor

Os detetores utilizados em CL serão descritos na próxima seção.

g) Sistema de aquisição de dados.

Os sistemas de aquisição de dados empregados em CL são os mesmos

empregados em CG, ou seja, registradores, integradores ou microcomputadores (Apêndice 3).

Gradiente de Polaridade

Quando o CL dispõe de apenas uma bomba, é evidente que a fase móvel tem uma
composição constante, do início ao fim da análise. Nessa situação, a polaridade da mesma também é
constante. Diz-se então que o processo é isocrático. Quando se dispõe de duas bombas (ou mais), é
possível variar a composição da fase móvel, colocando-se em cada reservatório um líquido de
polaridade diferente. O microprocessador altera a vazão de cada linha de líquido, de modo que a partir
do ponto de confluência a vazão seja constante. Nesse caso, diz-se que o processo ocorre com
gradiente de polaridade. Substituindo-se temperatura por polaridade, pode-se utilizar os
Cromatogramas 4.3 e 4.4 (p. 22) como ilustração de um processo isocrático de um processo com
gradiente de polaridade, respectivamente.