UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

Laboratório de Cromatografia Instrumental

(Disciplina Cromatografia Instrumental)

CADERNO DE LABORATÓRIO
DE CROMATOGRAFIA
Prof. Alexandre Schuler

RECIFE, FEVEREIRO DE 2009

 NOTA IMPORTANTE

Este Caderno destina-se ao registro dos trabalhos práticos da disciplina Cromatografia

Instrumental, de responsabilidade do Laboratório de Cromatografia Instrumental, do
Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de Pernambuco e destinada aos
Cursos de Graduação. Os mapas são auto-explicativos. Entretanto, o aluno deve acompanhar as
aulas teóricas e a explanação a ser dada no início de cada prática, de modo a dirimir dúvidas.

Nome do aluno: ____________________________________________________

Matricula UFPE: ________________________

Disciplina: __________________________________________ Período: _____

Turma: ______ Horário: __________________________ Data: / /

JULGO:_________________

___________________________
Prof. Alexandre Ricardo Pereira Schuler
 SUMÁRIO

Prática No 1 - Determinação da Vazão Ideal de uma coluna.

Prática No 2 - Determinação de outros parâmetros da coluna.

Prática No 3 - Identificação dos componentes de uma mistura.

Prática No 4 - Determinação da composição quantitativa de uma mistura.

Prática No 5 - Avaliação do erro de injeção e do erro de medição de área.

Prática No 6 - Comparação da precisão entre métodos de cálculo.

Prática No 7 - Determinação da Faixa de Linearidade Dinâmica (FLD).

Prática No 8 - Determinação do Limite de Detecção (LD).

Prática No 9 - Estudo do Efeito da Temperatura da Coluna sobre a Separação – PLT.

Prática No 10 - Estudo do Efeito da Polaridade da Fase Móvel sobre a Separação – Gradiente de Polaridade.
 INTRODUÇÃO

Antes de realizar os trabalhos constantes desta relação, o estudante certamente necessita saber operar
o cromatógrafo. Para tanto, é apresentada abaixo uma seqüência lógica (comentada) para ligar o equipamento:

1. Ligar o estabilizador e a Chave Geral.

2. Ligar o aquecimento do Detector e do Vaporizador.

- Em alguns equipamentos, isto é automático.

- A temperatura do Vaporizador deve ser igual ou maior que a temperatura de ebulição do componente menos volátil.
- A temperatura do Detector deve ser superior à do Vaporizador em pelo menos 10oC.
- Não aquecer a coluna acima de 50oC sem haver fluxo de fase móvel pela mesma.

AGUARDAR AS TEMPERATURAS ESTABILIZAREM !

3. Abrir as Válvulas dos cilindros dos gases e conferir as pressões (lbf/pol2):

GÁS CP1 CP2

NITROGÊNIO 100 80
HIDROGÊNIO 100 80
AR SINTÉTICO 60 40

ATENÇÃO: SÓ PROSSEGUIR SE FOR ANALISAR AGORA!

4. Abrir a válvula de passagem (on/off) da Fase Móvel e ajustar a vazão.

5. Ligar o aquecimento do Forno das Colunas.

- a temperatura do Forno das Colunas deve ser definida em função da AMOSTRA .

- a temperatura do Vaporizador deve ser pelo menos 10oC maior que a do Forno das Colunas.

6. Ligar o Integrador/Microcomputador.
7. Ligar o Sistema de Detecção:

7.1. Detector de Condutividade Térmica

a) Ligar a Fonte de Corrente e ajustar a corrente (mA) em função da temperatura do Detector:

TEMPERATURA FASE MÓVEL

(oC) H2 ou He N2 ou Ar
AMBIENTE a 100 200 80
100 a 150 175 70
150 a 200 160 65
200 a 250 145 55
250 a 300 125 45

b) Ajustar o Zero Eletrônico do Detector.

Obs.: alguns equipamentos possuem um ajuste grosso e um ajuste fino.

7.2. Detector de Ionização por Chama

a) Ligar o Amplificador Eletrométrico. Selecionar o Canal de análise.

b) Abrir a válvula de passagem dos gases auxiliares (H2 e ar sintético)
Obs.: A vazão do hidrogênio deve ser de 30 mL/min e a do ar sintético deve ser de 8 a 10 vezes maior.

c) Colocar a Válvula de Reversão dos gases auxiliares na posição "para dentro".

e) Acionar a ignição e observar o deslocamento do sinal ou qualquer outro sinal de acendimento da chama.
f) Reajustar o Zero Eletrônico.
 PARA DESLIGAR O
CROMATÓGRAFO

1. Desligar o Integrador/Microcomputador.
2. Desligar a Corrente e o módulo eletrônico do Detector de Condutividade Térmica ou o Amplificador Eletrométrico do
Detector de Ionização de Chama.
3. Apagar a chama do Detector de Ionização por Chama, colocando a Válvula de Reversão na posição "para fora".
4. Fechar as válvulas de passagem dos gases auxiliares.
5. Desligar o aquecimento do Forno das Colunas.
6. Fechar a válvula de passagem da Fase Móvel, quando a temperatura do Forno estiver abaixo de 50oC.
7. Desligar o aquecimento do Detector e do Vaporizador.
8. Desligar a Chave Geral.
9. Desligar o Estabilizador.
10. Fechar as Válvulas dos cilindros dos gases.
 TRABALHO PRÁTICO No 1

Objetivo: Avaliação do efeito da vazão da fase móvel sobre a eficiência de uma coluna.
o
Modelo do Cromatógrafo: Temperatura do Forno: C
2 o
Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm Temperatura do Detector: C
o
Tipo de Detector: Temperatura Vaporizador/Injetor: C
Coluna: Fase Móvel:

Padrão de teste: ___________________________________________________________________________________________.

Procedimento: Injetar três vezes a mesma solução (Padrão de teste) em cada vazão. Calcular os valores médios de n para cada
componente da solução e a resolução (Rs) média das três injeções. Interpretar os resultados.

1. Cálculo do número de pratos teóricos (n):

a) Componente A:

Vazão Injeção 1 Injeção 1 Injeção 1 Inj. 1 Inj. 2 Inj. 3

Média
(mL/min) Dr (mm) L (mm) Dr (mm) L (mm) Dr (mm) L (mm) n1 n2 n3

b) Componente B:

Vazão Injeção 1 Injeção 1 Injeção 1 Inj. 1 Inj. 2 Inj. 3

Média
(mL/min) Dr (mm) L (mm) Dr (mm) L (mm) Dr (mm) L (mm) n1 n2 n3

2. Cálculo da Resolução (Rs):

Vazão Inj. 1 Inj. 2 Inj. 3
Média
(mL/min) Rs1 Rs2 Rs3

Equações:

D 
2
2(t r (B) − t r (A) )
n = 16  r  Rs =
 L  (L(A) + L (B) )

Conclusões: ___________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________

Data: / /

________________________________
assinatura do aluno
 TRABALHO PRÁTICO No 2

Objetivo: Determinação de outros parâmetros da coluna.

o
Modelo do Cromatógrafo: Temperatura do Forno: C
o
Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm2 Temperatura do Detector: C
o
Tipo de Detector: Condutividade Térmica Temperatura do Vaporizador/Injetor: C
Coluna: Fase Móvel: ; Vazão: mL/min

Padrão de teste: ____________________________________________________________________________________________.

Parâmetros:
Número de pratos efetivos (Nef), fator capacidade (k), retenção relativa (RR), seletividade (α) e fator de assimetria (TF).

Dados do Cromatograma pico do ar Componente A Componente B Parâmetro Componente A Componente B

tr t’r
L k’
AB RR
BC α
Nef
TF

Equações:
tr − to t r (B) t'r (B)  t' 
2
BC
'
t = tr − to
r
k' = RR = α= n ef = 16  r  TF =
to t r (A) t'r (A) L AB

Observação: A linha AC é traçada a 10% da altura do pico (linha DE).

Conclusões: ___________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________

Data: / /

________________________________
assinatura do aluno
 TRABALHO PRÁTICO No 3

Objetivo: Identificação dos componentes de uma mistura.

o
Modelo do Cromatógrafo: Temperatura do forno: C
2
Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm Fase Móvel: Vazão: mL/min
o
Tipo de Detector: Temperatura do Vaporizador/ Injetor: C
Coluna: Amostra:

Padrões disponíveis:
______________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________

Dados Experimentais:

TEMPOS DE RETENÇÃO TEMPOS DE RETENÇÃO

PADRÃO NO PADRÃO NA AMOSTRA
COLUNA 1 COLUNA 2 COLUNA 1 COLUNA 2

Coluna 1: _______________________________________________________________
Coluna 2: _______________________________________________________________

Conclusões: ___________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

Data: / /

________________________________
assinatura do aluno
 TRABALHO PRÁTICO No 4

Objetivo: Determinação da composição quantitativa de uma mistura.

o
Modelo do Cromatógrafo: Temperatura do forno: C
2
Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm Fase Móvel: Vazão: mL/min
o
Tipo de Detector: Temperatura do Vaporizador/ Injetor: C
Coluna: Amostra:

Método de Cálculo: Normalização de Área com Fator de Resposta

Dados do Padrão:

COMPONENTE CONCENTRAÇÃO ÁREA FATOR

Pergunta-se: há necessidade do cálculo de fatores, para esta amostra? SIM ; NÃO

Dados da Amostra:

COMPONENTE ÁREA % ÁREA ÁREA CORRIGIDA CONCENTRAÇÃO

TOTAIS

Equações:
C pi A ci
Fi = Área corrigida = A ci = A i × Fi Ca (i) = × 100
A pi  A ci

Data: / /

________________________________________
assinatura do aluno
 TRABALHO PRÁTICO No 5

Objetivo: Avaliação do erro de injeção, do erro de medição de área (integração) e do erro de identificação.
o
Modelo do Cromatógrafo: Temperatura do forno: C
2
Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm Fase Móvel: Vazão: mL/min
o
Tipo de Detector: Temperatura do Vaporizador/ Injetor: C
Coluna: Amostra:

Dados obtidos:

INJEÇÃO No h(mm) L(mm) L’ (mm) Massa (mg) Área do Integrador

01
02
03
04
05

Cálculos:

Injeção No Pesagem Triangulação Meia-Altura Altura Medição do Volume (1) Tempo de retenção
01
02
03
04
05
MÉDIA
ERRO % (2)
(1) Considere desprezível o erro do integrador. Nesse caso, a variação na área medida por ele é provocada exclusivamente pela
medição do volume. Nos demais casos, o erro calculado é global (medição de volume + integração).
(2) Aplicar a relação ε = 100 x (VALOR MAIOR – VALOR MENOR) / (2 x Média Aritmética)

Conclusões: ___________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

Data: / /

_________________________________________
assinatura do aluno
 TRABALHO PRÁTICO No 6

Objetivo: Comparação da precisão entre métodos de cálculo.

o
Modelo do Cromatógrafo: Temperatura do forno: C
2
Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm Fase Móvel: Vazão: mL/min
o
Tipo de Detector: Temperatura do Vaporizador/ Injetor: C
Coluna: Amostra:

Dados do Padrão:
COMPONENTE CONC. ÁREA FATOR
Padrão Interno
Componente 1
Componente 2

Dados da Amostra:

Primeira Injeção
COMPONENTE ÁREA ÁREA CORRIGIDA A ppi / A api
Padrão Interno
Componente 1
Componente 2

Segunda Injeção
COMPONENTE ÁREA ÁREA CORRIGIDA A ppi / A api
Padrão Interno
Componente 1
Componente 2

Terceira Injeção
COMPONENTE ÁREA ÁREA CORRIGIDA A ppi / A api
Padrão Interno
Componente 1
Componente 2

CÁLCULO DAS CONCENTRAÇÕES

Método 3: Padronização Externa (Concentração = Área corrigida)

COMPONENTE INJEÇÃO 1 INJEÇÃO 2 INJEÇÃO 3 CONC. MÉDIA ERRO %

Componente 1
Componente 2

Método 4: Padronização Interna (Concentração = Área corrigida × A ppi / A api )

COMPONENTE INJEÇÃO 1 INJEÇÃO 2 INJEÇÃO 3 CONC. MÉDIA ERRO %

Componente 1
Componente 2

Conclusões: ___________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________

Data: / / __________________________
assinatura do aluno
 TRABALHO PRÁTICO No 7

Objetivo: Determinação da Faixa de Linearidade Dinâmica (FLD).

o
Modelo do Cromatógrafo: Temperatura do forno: C
2
Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm Fase Móvel: Vazão: mL/min
o
Tipo de Detector: Temperatura do Vaporizador/ Injetor: C
Coluna: Solução padrão:

Metodologia: Preparar a solução padrão em 6 diferentes concentrações, variando de 0,01 % até 20 %, injetando em duplicata
um volume de 5 µL, se for uma coluna empacotada ou 2 µL, se for uma coluna capilar/megabore. Construir um Gráfico
concentração X área. Determinar o ponto, correspondente à maior massa, (limite superior da FLD), em que ainda é possível
identificar uma correlação linear (por eliminação sucessiva de pontos).

PONTO No CONCENTRAÇÃO ÁREA 1 ÁREA 2 ÁREA MÉDIA

01 0,01%
02 0,05%
03 1,00%
04 5,00%
05 10,00%
06 20,00%

Conclusões: ___________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

Data: / /

__________________________
assinatura do aluno
 TRABALHO PRÁTICO No 8

Objetivo: Determinação do Limite de Detecção (LD) e do Limite de Quantificação (LQ)

o
Modelo do Cromatógrafo: Temperatura do forno: C
2
Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm Fase Móvel: Vazão: mL/min
o
Tipo de Detector: Temperatura do Vaporizador/ Injetor: C
Coluna: Amostra:

Metodologia: Injetar a solução mais diluída da prática no 7 em triplicata e determinar a altura média (hP). Anotar a atenuação
utilizada no cromatógrafo (atpc) e no integrador (atpi). Diminuir a atenuação até observar um ruído com pelo menos 3 mm de
altura média (hR). Anotar a atenuação utilizada no cromatógrafo (atRc) e no integrador (atRi). O LD é uma concentração que
corresponde a uma altura de pico equivalente ao dobro da altura média do ruído e o LQ corresponde a uma altura dez vezes
maior que a do ruído. Portanto,

LD = 2.CP . hR . atRc . atRi / hP . atpc . atpi

LQ = 5 × LD

Conclusão: ___________________________________________________________________________

Data: / /

___________________________________
assinatura do aluno
 TRABALHO PRÁTICO No 9

Objetivo: Estudo do Efeito da Temperatura da Coluna sobre a Separação – PLT

Modelo do Cromatógrafo: Amostra:

Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm2 Fase Móvel: Vazão: mL/min
o
Tipo de Detector: Temperatura do Vaporizador/ Injetor: C
Coluna:

Dados da amostra:

ORDEM DE ELUIÇÃO COMPONENTE

1 hexanoato de metila; C7H14O2; C6:0
2 octanoato de metila; C9H18O2; C8:0
3 decanoato de metila; C11H22O2; C10:0
4 dodecanoato de metila; C13H26O2; C12:0
5 tetradecanoato de metila; C15H30O2; C14:0
6 hexadecanoato de metila; C17H34O2; C16:0

1. Injetar a amostra em várias temperaturas, anotando os tempos de retenção:

# TEMP (oC) tr1 tr2 tr3 tr4 tr5 tr6

1
2
3
4
5

2. Propor uma Programação de Temperatura que resolva totalmente a amostra no menor espaço de tempo.

Conclusão: ___________________________________________________________________________

Data: / /

___________________________________
assinatura do aluno
 TRABALHO PRÁTICO No 10

Objetivo: Estudo do Efeito da Polaridade da Fase Móvel sobre a Separação – Gradiente de Polaridade

Modelo do Cromatógrafo: CG480-E Amostra:

Pressão de Trabalho: psi bar kgf/cm2 Fase Móvel: ver abaixo.
Tipo de Detector: Vazão: 1 mL/min.
Coluna: C18, 300 mm × 4,2 mm × 10 µm. Volume injetado: 20 µL (Válvula Rheodyne).

Injetar a amostra com fases móveis de diferentes polaridades, anotando os tempos de retenção e calculando os valores de
Retenção Relativa (RR):

RR = tri / tr1

tri RR
# Fase Móvel
Subst1 Subst2 Subst3 Subst4 Subst5 RR1 RR2 RR3 RR4 RR5
1 A 1
2 B 1
3 C 1
4 D 1
A = 20% Acetonitrila + 80% Água;
B = 40% Acetonitrila + 60% Água;
C = 60% Acetonitrila + 40% Água;
D = 80% Acetonitrila + 20% Água.

Propor um Gradiente de Polaridade que resolva a amostra.

Conclusão: ___________________________________________________________________________

Data: / /

___________________________________
assinatura do aluno