Unidad No. 2. Microscopía y El Estudio de Los Microorganismos

Km. 7 Antigua Vía Puerto Colombia PBX: (5) 319 7010 Ext.: 1115 rectoria@mail.uniatlantico.edu.
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Unidad No. 2
Microscopía y el estudio de los
Microorganismos
Facultad de Ciencias de la Educación
Programa de Licenciatura en Biología y Química
Microbiología
20533
Biólogo. Marlon M. Ardila Chávez
Km. 7 Antigua Vía Puerto Colombia PBX: (5) 319 7010 Ext.: 1115 rectoria@mail.uniatlantico.edu.co
The microbe will have the
last word
Louis Pasteur
Principal REFERENCIA
BIBLIOGRÁFICA
Michael T. Madigan,
John M. Martinko,
Jack Parker
Brock. Biología de los
microorganismos
Décima edición
Pearson Educación,
S.A.
Madrid, 2004
1.096 páginas
IMPORTANCIA DEL USO DEL MICROSCOPIO EN EL
ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS
Thiomargarita namibiensis (0,2 mm de ancho), vive en el lodo

de las costas africana y consume H2S, lo cual sería tóxico para
los animales que residen en el lodo. (Heide Schulz, 1997)
Descubriendo los Microorganismos
• Antony van
Leeuwenhoek
(1632-1723)
Óptica geométrica
• Teoría de los rayos de luz: Considera que cualquier
objeto visible emite rayos rectos de luz en cada
punto de él y en todas las direcciones a su
alrededor.
• Cuando los rayos inciden sobre otros cuerpos,
pueden ser absorbidos, reflejados o desviados.
• Si penetran en el ojo estimulan el sentido de la
vista
Algunas interacciones en Microscopía
REFLEXIÓN REFRACCIÓN
• Un rayo de luz golpea una • La luz pasa de un medio a
superficie lisa o rugosa. otro que tiene un índice de
• Lisa=reflexión especular refracción diferente.
• Rugosa=muchos ángulos de • Pasar de aire a vidrio, o
reflexión e imagen difusa viceversa.
Propiedades del Microscopio
1. Poder de aumento:
• Capacidad que presenta el microscopio de aumentar, en
forma aparente el tamaño real de un objeto que se
observa en él.
• Se designa con una “X” el valor del aumento
• At=(Aob)(Aoc)
Donde,
At: Aumento total
Aob: Aumento del objetivo
Aoc: Aumento del ocular
Propiedades del Microscopio
2. Poder de resolución:
• Habilidad de los lentes para separar o distinguir
objetos pequeños, que están muy cercanos entre
si.
• La longitud de onda de luz es el mayor factor en la
resolución
Entre mas corta sea la longitud de onda  mayor es la

resolución
• Distancia de trabajo
— distancia entre la superficie de los lentes y la superficie del portaobjetos o
lo que se este observando
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El Microscopio de luz
• Tipos
• Microscopio de Campo brillante
• Microscopio de Campo oscuro
• Microscopio de Contraste de fases
• Microscopio Fluorescente
• Son microscopios compuestos

• Donde la imagen se forma por la acción de dos sistemas
de lentes (el objetivo y el ocular)
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• Genera una imagen brillante del objeto sobre un
fondo oscuro.
• Usado para observar especímenes vivos o
preparaciones sin teñir.
Microscopio de contraste de fases
• Alcanza el contraste entre estructuras
intracelulares con ligeras diferencias en el índice
refractivo.
• Excelente forma de observar células vivas.
Microscopio de Fluorescencia
 Se expone el especímen
a la luz ultravioleta,
violeta, o azul visible
 Los especímenes
usualmente son teñidos
con fluorocromos
 Muestran una imagen
brillante del objeto a
partir de la florescencia
de luz emitida por el
especímen.
Microscopio Electrónico
 Haces de electrones
son usados para
producir las imágenes
 Como la longitud de
los haces de
electrones es menos
que la de la Luz, esto
resulta en una
resolución mayor.
TEM Microscopía
• Los electrones de dispersión pasan a través de
las zonas delgadas del espécimen.
• Los trasmitidos (los que no pasan) son usados
para producir la imagen
• Regiones mas densas en el espécimen,
aparecen como zonas oscuras.
Figura 9. TEM microfotografias das células SF-9. A. controle. B. células tratadas com BEA 10 µM. M.
Mitocôndria. Cyto. Citoplasma. Nuc. Núcleo. NM. Membrana nuclear. PM. Membrana plasmática. V.
vacúolos.
SEM Microscopia
• Usa electrones que se reflejan de una superficie de la
muestra para crear la imagen.
• Produce una imagen 3D de las características de la

superficie.
A B
x 5000 8 kV WD 10 mm 5 µm x 100 8 kV WD 10 mm 200 µm
C D
x 1000 8 kV WD 10 mm 20 µm x 450 8 kV WD 10 mm 50 µm
Figura 19. A: esporo germinado. B: corte infectado. C e D: distribuição micelial na planta.

Ébola
Fly head
TINCIONES Y SU IMPORTANCIA EN
LA DETECCIÓN DE
MICROORGANISMOS Y
ESTRUCTURAS MICROBIANAS
Tinciones en Microbiología
• La tinción es una de las técnicas más utilizadas
en los laboratorios de microbiología para
clasificar M.O.
• Una tinción es definida como el resultado de la
interacción de un tinte con una superficie.
• El tinte es una molécula orgánica natural o
sintética que imparte color a las sustancias con
las que entra en contacto.
Químicamente, un colorante puede ser definido como un
compuesto orgánico que contiene un anillo bencénico
unido a un grupo cromóforo y un grupo auxócromo
Tinte Carga Descripción Ejemplo
Básicos Catiónica La porción del cromógeno tiene carga Azul de

positiva y poseen gran afinidad por metileno, cristal
los compuestos celulares negativos. violeta, rojo
Estos son los más utilizados debido a carbolfucsina
que las bacterias tienen una
superficie con carga negativa
Acídicos Aniónica La porción del cromógeno es negativa Safranina

y tiene gran afinidad por los
componentes celulares positivos
Tinciones Simples
• Un solo tinte, tiene en cuenta la afinidad por
carga con componentes se la superficie de la
célula
Ejemplo: Azul de metileno
Tinciones Diferenciales
• Permite detectar diferentes tipos de células y se
fundamenta en el uso de más de un tinte
Tinción de Gram
Permite clasificar las bacterias
en Gram positivas y Gram
negativas
Tinción de Ácido-Alcohol
Resistencia (Ziehl-Neelsen)
• Utilizada para bacterias que poseen ceras en las
paredes celulares.
• Mycobacterium (M. tuberculosis y M. leprae)
• Cepas patogénicas de Nocardia (Neumonía)
• Tinte primario: Rojo carbolfucsina
• Decolorante: Ácido-alcohol
• Tinte contraste: Azul de metileno
Tinción para Ziehl-Neelsen
1. Aplicar el colorante Rojo carbolfucsina a un extendido
2. Calentar suavemente el portaobjetos durante varios
minutos
3. Enfriar el portaobjetos y lavar con agua
4. Tratar el extendido con ácido-alcohol
5. Utilizar azul de metileno y observar al microscopio
Tinciones Especiales
• Se utilizan para colorear y aislar partes
específicas de M.O., como endosporas y
flagelos, y para detectar la presencia de
cápsulas.
Tinción para cápsulas
• Tinte primario: Cristal violeta 1%, tiñe todo el
frotis color oscuro
• Decolorante y contratinte: CuSO4 20%, se usa
para enjuagar el tinte primario
• No se enjuaga con agua porque la cápsula es
soluble en agua-función decolorante
• El CuSO4 es absorbido en el material de la
cápsula que ha sido decolorada-función de
contratinte
• La cápsula aparece azul clara en un fondo
oscuro
Tinción para cápsulas
1. Preparación de un frotis cargado (heavy)
2. Dejar secar a temperatura ambiente
3. Cristal violeta 1% (5-7 minutos)
4. Enjuagar con CuSO4
5. Secar con papel absorbente
Tinción negativa para cápsulas
• La tinción se logra mediante una mezcla del
cultivo de bacterias y del tinte (nigrosina o
tinta china) que proporcione un fondo que
contraste y luego teñir las bacterias con un tinte
simple como la safranina.
• Debido a su composición química las cápsulas
no aceptan la mayoría de los colorantes
biológicos, y así aparecen halos que rodean
cada célula bacteriana teñida
Tinción para Endosporas
• No se tiñen con los métodos comunes (tinción
simple y Gram), porque estos colorantes no
atraviesan sus paredes
• Se utiliza la tinción de Schaeffer-Fulton
• Tinte primario: Verde de Malaquita, requiere
calor para la penetración de este tinte
• Agente decolorante: Agua, remueve el exceso
de tinte, decolora la célula vegetativa
(metabolicamente activa)
• Contratinte: Safranina, tiñe las células
vegetativas
1. Cubrir el frotis con el tinte Verde
Malaquita y permita que el
colorante humee, pero no hierva
2. Espere cinco minutos. Si durante
los cinco minutos el tinte se seca
añada más tinte
3. Enjuague la laminilla con agua
destilada
4. Coloque tinte Safranina (30
segundos)
5. Seque la laminilla en papel
absorbente
6. Observe bajo el microscopio
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Tinción para Flagelos
• Se puede visualizar el (los) flagelo (s)
• Utiliza dos tintes:
1. Ácido tánico: Engruesa los flagelos (agente
mordante)
2. Carbolfucsina: Colorante que los define
Otras tinciones
• Tinción de Wright
• Tinción de Azul algodón de Lactofenol
Tinción de Wright
• Tinción policromática (tiñe compuestos ácidos y
básicos presentes en una célula)
• Se emplea para la diferenciación de elementos
celulares de la sangre
• Se emplea más que todo en la parasitología
(hematozoarios)
• Eosina y azul de metileno
Tinción de Azul algodón de lactofenol
• Permite la tinción entre la pared y el citoplasma
de las células fúngicas.
• No es considerada una tinción diferencial
• Posee características tintoriales que permiten
observar cada uno de los componentes fúngicos
y apreciar fácilmente las estructuras para una
adecuada identificación
Componentes del Azul algodón de
lactofenol
Fenol: 1. Inactiva las enzimas líticas de la célula e
impide que ésta se rompa
2. Destruye la flora acompañante
3. Inactiva a la célula quitándole el grado de
patogenecidad
4. Actúa como mordiente cuando se utiliza en
combinación con otros colorantes
Ácido láctico: Preserva las estructuras fúngicas al
provocar un cambio de gradiente osmótico con
relación al interior fúngico (genera una película
protectora)
Componentes del Azul algodón de
lactofenol
Azul de algodón: Es un colorante ácido, que tiñe
el citoplasma y la quitina presente en las células
fúngicas.
Glicerol: Mantiene húmeda la preparación
Esporangio Conidióforo Micelios
Quíz
• ¿Cuál es la diferencia entre una tinción simple y
una diferencial?
• ¿Qué tipo de tinción es la Gram?
• ¿Cuáles son los reactivos utilizados en la Tinción de
Gram? (en orden)
• ¿Qué otro tipo de tinción puede mencionar?
(Mencione solo dos, bien escrita y que no sea la de
gram?

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x 5000 8 kV WD 10 mm 5 µm x 100 8 kV WD 10 mm 200 µm

Figura 19. A: esporo germinado. B: corte infectado. C e D: distribuição micelial na planta.

Básicos Catiónica La porción del cromógeno tiene carga Azul de

Acídicos Aniónica La porción del cromógeno es negativa Safranina

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