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Instituto Adolfo Lutz

METROALIMENTOS

Validação de Métodos Analíticos

São Paulo, 25 de setembro de 2008

1 ALICE M. SAKUMA
Instituto Adolfo Lutz
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Validação (NBR ISO IEC 17025 item 5.4.5.1)

“É a confirmação por fornecimento de evidência


objetiva, que os requisitos específicos do método
para um determinado uso foram satisfeitos para o
uso pretendido”

2 ALICE M. SAKUMA
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NORMAS/GUIAS/MANUAIS PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS

 INMETRO
 ANVISA
 AOAC
 FDA
 IUPAC
 EURACHEM
 CODEX
 NATA
 EUROPEAN COMMUNITIES
 PERIÓDICOS EM GERAL

3 ALICE M. SAKUMA
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Validação de um método analítico

Características de desempenho
Limitações de um método
Identificação das influências que podem alterar
essas características e qual extensão

4 ALICE M. SAKUMA
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Quando deve ser validado:

 Modificações no método normalizado


 Novo método desenvolvido para um problema
específico
 Método estabelecido utilizado em laboratórios
diferentes, equipamentos diferentes ou equipes
distintas
 Situações fora do controle interno da qualidade
 Desempenho insatisfatório em PEP
 Demonstração de equivalência entre dois
métodos (ex: um método novo rápido x método
normalizado)

5 ALICE M. SAKUMA
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Verificação de um método analítico

 É a confirmação, por fornecimento de evidência


objetiva, que os dados das características analíticas
fornecidos por um produtor, um laboratório ou instituição
de referência foram alcançados

 As ferramentas são as mesmas da validação


 O laboratório só precisa verificar se as características
de desempenho documentadas podem ser cumpridas
(ex: acurácia)

6 ALICE M. SAKUMA
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Critérios de decisão para a extensão de uma validação

 Condições técnicas e pessoal capacitado


Ponto de vista
 Complexidade do método
analítico
 Nível de concentração

 Risco potencial para o cliente/empresa


Ponto de vista  Objetivo real da validação
político  Considerações sobre legislação ou
outros requisitos

7 ALICE M. SAKUMA
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Classificação de um método

 Análise de contaminantes (resíduos de


pesticidas, metais pesados)
 Análise de composição dos alimentos
 Medidas físicas (pH, condutividade)
 Determinações qualitativas
 Métodos microbiológicos

8 ALICE M. SAKUMA
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Parâmetros da validação para cada tipo de método


Parâmetro Análise de Análise de Métodos Métodos Métodos Métodos Métodos
contaminan Constituin- convencio- sem Físicos Qualita- Bacterio-
-tes tes nais calibra- tivos lógicos
ção
Descrição X X X X X X X
do método
Calibração X X X X

Faixa de X X X X X X X
trabalho
Limite de X X X X
Detecção
Limite de X X
Quantificação
X X X
Recuperação

Repetitividade X X X X X X

Acurácia X X X X

Epecificidade X X X X X

Reprodutibilid Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível


ade
9 ALICE M. SAKUMA
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Necessidades comuns de validação para métodos


conhecidos
Método Acurácia Precisão Seletividade Linearidade Limites Detecção e Robustez
Quantificação

AAS,AES,ICP, x X X X X X
UV-VIS
Polarografia X X X X X

Titulação X X X

Umidade X X X X

Comatografia X X X X X X

Espectroscopi X X X X X X
a
TOC X X X X

Eletroforese X X X X X X
Capilar
Imuno ensaio X X X X X X

10 ALICE M. SAKUMA
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Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Limite de detecção Veracidade


Linearidade Limite de Precisão
Sensibilidade quantificação Repetitividade
Reprodutibilidade

Robustez Seletividade

11 ALICE M. SAKUMA
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Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Limite de detecção
Precisão
Linearidade Limite de
Repetitividade
Sensibilidade quantificação
Reprodutibilidade

Robustez Seletividade

12 ALICE M. SAKUMA
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Determinação das características do método

Características da
calibração: Coeficiente de Correlação
 Linearidade R2>0,99
 Sensibilidade

Linearidade é determinada pelo


coeficiente de correlação da curva

Sensibilidade é determinada pelo


coeficiente da curva de calibração
13 ALICE M. SAKUMA
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Linearidade

 Detrminada com o uso de padrões com diferentes


concentrações e cálculo da regressão

 Cinco concentrações de padrão, se a linearidade é


satisfeita; caso contrário, usar mais padrões

14 ALICE M. SAKUMA
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Calibração

 Valores de calibração devem ser aplicados dentro da


faixa de trabalho
 Menor concentração da curva deve ser o limite de
quantificação
 Usar soluções padrão, ou curva de adição de padrão
 Usar pelo menos cinco concentrações do padrão

Sensibilidade (resolução)

Pode ser determinada:

 A meio da curva de calibração


 Pelo uso de amostras com diferentes concentrações

15 ALICE M. SAKUMA
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Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Limite de detecção Veracidade


Linearidade Limite de Precisão
Sensibilidade quantificação Repetitividade
Reprodutibilidade

Robustez Seletividade

16 ALICE M. SAKUMA
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Faixa de trabalho

Faixa de concentração do analito no qual o


método pode ser aplicado com acurácia e precisão

 Determinação do intervalo de trabalho:


– Diferentes matrizes
– Variando as concentrações

17 ALICE M. SAKUMA
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Características da Faixa

Limite de detecção

XLOD=3.sL/b ( Método do Branco)

XLOD=3.sxo (Método da Curva de Calibração)


LOD
XLOD : limite de detecção
sL : Desvio padrão do branco
Sxo : Desvio padrão da curva de calibração
b: coeficiente angular da curva de calibração

Convenção XLOD = média branco + 3.sL

18 ALICE M. SAKUMA
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Características da Faixa

Limite de quantificação

XLOQ=9.sL/b ( Método do Branco)

XLOQ=11.sxo (Método da Curva de Calibração)

LOQ
XLOQ : limite de quantificação
sL : Desvio padrão do branco
Sxo : Desvio padrão da curva de calibração
b: coeficiente angular da curva de calibração

Várias
XLOD = 5 ou 6 ou 10.sL
convenções
19 ALICE M. SAKUMA
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Técnicas X Limite de Quantificação X Legislação

Técnica Limite de Limite para água


quantificação mgL-1 de diálise mgL-1
Alumínio Alumínio
AAS Chama 1,1

AAS Forno 0,002


0,01
ICP OES 0,040

ICP MS 0,001

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Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Limite de detecção Veracidade


Linearidade Limite de Precisão
Sensibilidade quantificação Repetitividade
Reprodutibilidade

Robustez Seletividade

21 ALICE M. SAKUMA
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Acurácia = Precisão + veracidade Instituto Adolfo Lutz

Acurácia

Grau de concordância dos resultados experimentais com o valor


de referência aceito ou valor verdadeiro convencional = exatidão
do método analítico

a) Precisão

Grau de concordância entre resultados de ensaios independentes


obtidos sob condições específicas

Recuperação/
Repetitividade Reprodutibilidade Incerteza
Bias

b) Veracidade

Erro sistemático/Valor correto


22 ALICE M. SAKUMA
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Desvios aleatórios e sistemáticos

Preciso e Correto Impreciso mas correto

Preciso mas incorreto Impreciso e errado

23 ALICE M. SAKUMA
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Características da Acurácia

Medida da veracidade, incluindo erros


a) Veracidade sistemáticos e aleatórios (uso de MRC,
comparação com método de referência)

Medida do grau de repetitividade, incluindo


b) Precisão
erros sistemáticos

Repetitividade:
um laboratório Reprodutibilidade
ou : mais que um
Reprodutibilidade laboratório
interna

24 ALICE M. SAKUMA
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Veracidade

Utiliza um dos seguintes métodos para assegurar


veracidade:
 Análise de MRC
Participação em PI
Comparação com método de refer6encia

Se não disponível:
Documente qualquer dado que prove veracidade
Providencie MRC
Use um método similar em paralelo

25 ALICE M. SAKUMA
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Precisão

 Grau de concordância entre resultados de ensaios


independentes obtidos sob condições específicas
 Geralmente expressa como desvio-padrão ou desvio-padrão
relativo;
 As medições mais comuns de precisão são: repetitividade,
precisão intermediária e reprodutibilidade

 Depende da concentração do analito


 Repetitividade:
 Mesma amostra
 Mesmo método
 Mesmo analista
 Mesmo laboratório
 Curto espaço de tempo
26 ALICE M. SAKUMA
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Recuperação

 Determinada com a adição do analito à matriz


 Matriz deve ser homogenea, livre do analito ou em
concentração abaixo do LOQ, ou preparar uma matriz
de composição similar
 Recuperação só poderá ser feita se o analito estiver
disponível na forma pura e na mesma forma que
ocorre na natureza

27 ALICE M. SAKUMA
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Concentração analito versus RSD e recuperação
Conc. analito Razão analito% Unidade RSD % Recuperação
%

100 1 100% 1,3 98-102

10 10-1 10% 2,8 98-102

1 10-2 1% 2,7 97-103


0,1 10-3 0,1% 3,7 95-105

0,01 10-4 100 ppm 5,3 90-107

0,001 10-5 10 ppm 7,3 80-110

0,0001 10-6 1 ppm 11 80-110

0,00001 10-7 100 ppb 15 80-110

0,000001 10-8 10 ppb 21 60-115

0,0000001 10-9 1 ppb 30 40-120

28 Fonte: Huber, L, 1998


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Correção pela Recuperação

Análise de uma amostra X


% Recuperação do método=70%
Limite da legislação: 5 µg/kg

Laboratório Resultado Recuperação Conclusão


(µg/kg)
A 4,0 Sem correção Satisfatório

B 6,8 Corrigido Insatisfatório

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Reprodutibilidade

Comparação de Desvio padrão


Interna
Desvio padrão de replicatas

 Participação em PEP
Externa
 Participação em PI

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CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO DE REPETITIVIDADE E


REPRODUTIBILIDADE

Conc. Repetitividade CV Reprodutibilidade CV

C > 1 ppm < 14% < 19%

100 ppb < C ≤ 1ppm < 18% < 25%

10 ppb < C ≤ 100 ppb < 22% < 34%

1 ppb < C ≤ 10 ppb < 32% < 46%

C ≤ 1ppb < 36% < 54%

Fonte: FAO

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Participação em PEP ou Estudos colaborativos

PEP - Método mais aceito para a validação

Estudos Colaborativos - Vários problemas


práticos para quem organiza
Custo, tempo
Coordenação
Remessa de amostras
Análise estatística e interpretação de
resultados.

32 ALICE M. SAKUMA
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Análise de Materiais de Referência

 Geralmente aceito na validação de método


 Materiais fornecidos com certificados
 O analista deve demonstrar que o método é exato e preciso

33 ALICE M. SAKUMA
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Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Limite de detecção Veracidade


Linearidade Limite de Precisão
Sensibilidade quantificação Repetitividade
Reprodutibilidade

Robustez Seletividade

34 ALICE M. SAKUMA
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Seletividade e Especificidade

Extensão no qual um analito pode ser


determinado em uma mistura complexa

Seletividade/
Especificidade

Demonstra interferentes e restrição ao uso do


método

Codex recomenda o uso do termo seletividade


35 ALICE M. SAKUMA
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Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Limite de detecção Veracidade


Linearidade Limite de Precisão
Sensibilidade quantificação Repetitividade
Reprodutibilidade

Robustez Seletividade

36 ALICE M. SAKUMA
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Robustez

 Mede a sensibilidade que um método apresenta, face a


pequenas variações:
 Tempo
Temperatura
Marca de reagente
Tamanho da amostra
Concentração de ácido
Agitação
 É determinada pelo teste de Youden

37 ALICE M. SAKUMA
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Validação é sempre o equilíbrio entre custos, riscos e


possibilidades técnicas

38 ALICE M. SAKUMA
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Muito Obrigada!

Alice M. Sakuma
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Fone: 11 3068 2915
Alice@ial.sp.gov.br

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