UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ACCIÓN BACTERIOSTÁTICA SELECTIVA DEL CRISTAL VIOLETA

LABORATORIO N° 5 DEL CURSO MICROBIOLOGÍA – SA323K

GUILLEN MANCHA, WILLIAM

DOCENTE: ING. JORGE GILBERTO TELLO CEBREROS

Lima – Perú
2018
UNIVERSIDAD NACIONAL DE I N G E N I E RIA
Facultad de Ingeniería Ambiental

INDICE

RESUMEN................................................................................................................ 4
SUMARY .................................................................................................................. 4
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 5
II. OBJETIVO ......................................................................................................... 6
III. MARCO TEÓRICO ........................................................................................ 6
1. Conceptos Previos: ........................................................................................ 6
IV. RESULTADOS ............................................................................................... 8
V. DISCUSION DE RESULTADOS ........................................................................ 9
VI. CONCLUSIONES: ......................................................................................... 9
VII. RECOMENDACIONES: ............................................................................... 10
VIII. CUESTIONARIO .......................................................................................... 10
IX. FUENTES DE INFORMACIÓN: ................................................................... 11
X. ANEXOS: ........................................................................................................ 11
XI. APENDICE................................................................................................... 12
1. Metodología ................................................................................................. 12
2. PROCEDIMIENTO ....................................................................................... 12

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INDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1.Imagen de las paredes celulares de las bacterias gram positivas y gram
negativas. ............................................................................................................... 11
Ilustración 2.Fotografías, tubos con agar nutritivo y placas Petri dividida en zona A y
B. grupos 4. ............................................................................................................ 11

INDICE DE TABLAS
Tabla 1.resultados de crecimiento de los grupos 1,2, 3,4, y 5. .................................. 8
Tabla 2.Resultados crecimiento teórico. ................................................................... 8
Tabla 3.Resultados de coloración gram de placa sin coloración de los grupos 1,2,
3,4 y 5....................................................................................................................... 8

INDICE DE FIGURAS

Figura 1.Microorganismos:Izquierda. Escherichia coli..Derecha Bacillus subtilis. ..... 7

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RESUMEN
En el presente laboratorio se determina el efecto de la acción bacteriostática selectiva
del cristal violeta, este colorante inhibe el desarrollo de las bacterias especialmente
de las bacterias gram positivas (Bacillus subtilis).El cristal violeta es un derivado del
trifenilmetano que posee un excelente efecto bacteriostático.Los resultados fueron
analizados con bacterias con muestras en 5 grupos de alumnos,en los grupos 1,2,3,4
y 5 en la dilución de concentracion 1:10000 predomino el crecimiento(+) para todos
los grupos.En la concentracion 1:100000 crecimiento(+) , excepto en el grupo 2 en la
colonia A sin crecimiento(-),en la concentración 1:1000000 hay crecimiento para las
placas de todos los grupos, el colorante cristal violeta no tiene ningún efecto sobre los
organismos y el crecimiento se lleva a cabo como si no hubiera colorante en el medio
agar.

SUMARY
In the present laboratory the effect of the selective bacteriostatic action of crystal violet
is determined, this dye inhibits the development of bacteria especially of gram positive
bacteria (Bacillus subtilis). Crystal violet is a derivative of triphenylmethane which has
an excellent bacteriostatic effect The results were analyzed with bacteria with samples
in 5 groups of students, in groups 1,2,3,4 and 5 in the concentration dilution 1: 10,000
growth predominated (+) for all groups. In the concentration 1 : 100000 growth (+),
except in group 2 in colony A without growth (-), in the concentration 1: 1000000 there
is growth for the plates of all groups, the crystal violet dye has no effect on organisms
and the growth is carried out as if there was no dye in the agar medium.

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I. INTRODUCCIÓN
El cristal violeta es un colorante derivado del trifenilmetano,tiene la accion
bacteriostática selectiva sobre los organismos gram positivos en diluciones que no
tienen ningún efecto apreciable sobre el crecimiento de las bacterias gram
negativas.En general la accion bacteriostática selectiva es semejante a la reacción
de gram,aunque presenta unas cuantas excepciones resaltantes.Esto quiere decir
que los microorganismos gram positivos son mas susecptibles a la accion de estos
colorantes que las bacterias gram negativas.Se presenta las concentraciones en la
metodología del laboratorio.Es importante en la aplicación en el campo de la
medicina.

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II. OBJETIVO
- Observar y determinar el efecto de la acción bacteriostática selectiva del cristal
de violeta de las bacterias: Escherichia coli y del Bacillus subtilis.

III. MARCO TEÓRICO

1. Conceptos Previos:
Colorantes:
Los colorantes se utilizan ampliamente en bacteriología para tinción y como
indicadores. La incorporación de un colorante a un medio de cultivo con frecuencia lo
torna selectivo. La acción bacteriostática de los colorantes se debe a la modificación
del potencial de óxido-reducción del medio, lo que inhibe el desarrollo de los
microorganismos. En general, son más activos contra bacterias gran positivas y
algunos hongos. Los principales colorantes son los derivados dela acridina
(proflavina), y los derivados deltrifenilmetano (verde brillante, cristal violeta).
 Los derivados de la acridina interfieren en la síntesis de ácidos nucleicos y
proteínas. Este se inserta entre dos bases sucesivas del ADN separándolas
físicamente provocando errores en la duplicación del ADN.
 Los derivados del trifenilmetano interfieren en la síntesis de la pared celular. Para
lograr su objetivo bloquean la conversión del ácido UDP-acetilmurámil péptido.
Cristal violeta:
El violeta cristal es un colorante básico bacteriostático potente perteneciente al grupo
trifenilmetano, estos colorantes presentan una marcada acción bacteriostática
selectiva sobre las bacterias gram positivas, en diluciones que aparentemente no
afectan a las gram negativas. Esta propiedad se aprovecha mediante la incorporación
de alguno de esos colorantes en medios de cultivo con el fin de facilitar el aislamiento
de bacterias gram negativas.Otros colorantes usados con estos propósitos son4
fucsina básica, verde brillante,verde malaquita.
Coloración Gram
Bacterias Gram positivos
Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul
oscuro o violeta por la tinción de Gram. Esta característica química está íntimamente
ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de

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organización bacteriana. Incluyen especies tanto móviles como inmóviles como la

forma bacilo(Bacillus subtilis).
Bacterias Gram negativas
Se denominan bacterias granm negativas a aquellas que no se tiñen de azul ocuro o
violeta por la tinción de Gram,estos se tiñen de un color rosado tenue.Estas presentan
membranas lipídicas. Estas pierden el cristal violeta.Tenemos a la Escherichia coli.
Escherichia coli: también conocida por la abreviación de su nombre, E. coli, es una
bacteria gramnegativa con forma de bacilo de la familia de las enterobacterias que se
encuentra en el tracto digestivo gastrointestinal de humanos y animales de sangre
caliente .

Figura 1.Microorganismos:Izquierda. Escherichia coli..Derecha Bacillus subtilis.

Fuente: Sagar Aryal.Biochemical Test of Escherichia coli (E. coli). Escherichia, Gram Negative Bacteria
Recuperado de: https://biochemicaltest.com/biochemical-test-of-escherichia-coli-e-coli/ (extraido 09-
05-2018).

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IV. RESULTADOS
Datos del Grupo 01:
Tabla 1.resultados de crecimiento de los grupos 1,2, 3,4, y 5.
GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4 GRUPO 5
CONCENTRACIÓN
A B A B A B A B A B
1:10000 + + + + + + + + + +

1:100000 + + - + + + + + + *

1:1000000 + + + + + + + + + +
Sin
+ + + + + + + + + +
colorante
Nota. Fuente: Grupo 01, 02, 03,04 y 05.
*No especifica
(+) Hay crecimiento, (-) Sin crecimiento.

Tabla 2.Resultados crecimiento teórico.

colorante concentración Escherichia coli Bacillus subtilis
(gram negativo) (gram positivo)
Cristal violeta 1:10000 - -
1:100000 + -
1:1000000 + +
Control Sin colorante + +
*(+) Hay crecimiento, (-) Sin crecimiento.

COLORACION GRAM
GRUPOS
COLONIA “A” COLONIA”B”
N° 1
( BAÑO FIA DE Gram(+) Gram(+)
HOMBRES - Estreptobacilos Estreptobacilos
PRIMER PISO)
N° 2 Gram(-) Gram(+)
(Aula 171 vacía ) cocos bacilos
N° 3

N° 4

N° 5

Tabla 3.Resultados de coloración gram de placa sin coloración de los grupos 1,2, 3,4 y 5.

Nota. Fuente: Grupo 01,02,03,04 y 05.

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V. DISCUSION DE RESULTADOS

 En la concentración 1:10000 el colorante cristal violeta debería inhibir el

crecimiento tanto de la Escherichia coli(gram negativa),como del Bacillus
subtilis(gram positiva),pero se observa crecimiento en todos los grupos.Puede
ocurrir por una mal observación de cada grupo.Tambien por no seguir el
procedimiento adecuado.
 En la concentración 1:100000 hay crecimiento para las placas de todos los
grupos, excepto en el grupo nro. 2 en la colonia A, sin crecimiento. Esto ocurre si
las bacterias son de tinción gram positivas(Bacillus subtilis), por lo que inhibe su
crecimiento.
 En la concentración 1:1000000 hay crecimiento para las placas de todos los
grupos, ocurre porque el colorante cristal violeta no tiene ningún efecto sobre los
organismos y el crecimiento se lleva a cabo como si no hubiera colorante en el
medio agar.

VI. CONCLUSIONES:
 Para el grupo N° 1,se observa que en la placa petri de las diluciones con colorante
cristal violeta de concentración 1:10000,1:100000,1:1000000 predomina el
crecimiento(+), tanto en las zonas A y B.También se ve crecimiento en la placa
sin colorante.
 En el grupo N° 2,se observa que en la placa petri de las diluciones con colorante
cristal violeta de concentración 1:10000 y 1:1000000 crecimiento(+), tanto en las
zonas A y B.Mientras que en la concentración 1:100000 sin crecimiento(-) en la
zona A pero si se observa en el sector B crecimiento(+).Se ve crecimiento en la
placa sin colorante.
 Para el grupo N° 3,se observa que en la placa de las diluciones con colorante
cristal violeta de concentración 1:10000,1:100000,1:1000000 hay crecimiento(+),
tanto en las colonias A y B.También se ve crecimiento en la placa sin colorante.
 En el grupo N° 4,se observa que en la placa de las diluciones con colorante cristal
violeta de concentración 1:10000,1:100000,1:1000000 ,crecimiento(+), tanto en
las colonias A y B.También se ve crecimiento en la placa sin colorante.
 Para el grupo N° 5, se observa que en la placa de las diluciones con colorante
cristal violeta de concentración 1:10000,1:100000,1:1000000 predomina

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crecimiento (+), tanto en las colonias A y B,excepto en la concentracion 1:100000

zona B que no especifica. Se ve crecimiento en la placa sin colorante.

VII. RECOMENDACIONES:
 Seguir el procedimiento de manera ordenada.
 Concentrarse al momento de la observación para ver si hay crecimiento o no.
 Tener una correcta manipulación de los instrumentos.
 Reconocer una bacteria con la tinción gram positiva y negativa.

VIII. CUESTIONARIO
ACCIÓN BACTERIOSTÁTICA SELECTIVA DEL CRISTAL VIOLETA
1. ¿Qué es un Agente bacteriostático?

Es aquél que tiene la propiedad de inhibir la multiplicación bacteriana, inhiben la

tinción de las bacterias, la misma que se reanuda cuando se retira el agente. Algunos
agentes tienen finalidad particular por medio de genes o los lesionan específicamente.

2. ¿Qué quiere decir una acción bacteriostática selectiva?

La incorporación de un colorante a un medio de cultivo con frecuencia lo torna

selectivo. La acción bacteriostática selectiva se debe a la modificación del potencial
oxido-reducción del medio, lo que inhibe el desarrollo de los microorganismos .En
general, son más activos con las bacterias gram positivas y algunos hongos. Los
principales colorantes son los derivados de la acridina (proflavina) y los derivados del
trifenilmetano (verde brillante y violeta cristal) (Negroni, 2009)

3. Aplicaciones

Evitar el deterioro de los alimentos y evitar la contaminación tanto en procesos

industriales que requieran cultivos puros como en laboratorios de diagnóstico o
investigación. Además se ha difundido mucho el uso de agentes bacteriostáticos en
la industria farmacéutica para la producción de antibiótico.

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IX. FUENTES DE INFORMACIÓN:

M.NEGRONI.MICROBIOLOGIA ESTOMATOLOGICA Editorial Médica
Panamericana S.A.Buenos Aires 2da.Edic.2009. (pág. 114-116).

Sagar Aryal.Biochemical Test of Escherichia coli (E. coli). Escherichia, Gram Negative
Bacteria Recuperado de: https://biochemicaltest.com/biochemical-test-of-escherichia-
coli-e-coli/ (extraido 09-05-2018).

Cristóbal Chaidez Quiroz.El Agua Embotellada y calidad bacteriológica.Octubre

2002(pág. 38-39)

X. ANEXOS:

Ilustración 1.Imagen de las paredes celulares de las bacterias gram positivas y gram negativas.
Fuente: crecimiento microbiano.Diefrencias entre gram positivas y gram negativas.Recuperado de:
https://es.slideshare.net/toons1233/capitulo-6-14297911 (Extraído 08-05-2018)

Ilustración 2.Fotografías, tubos con agar nutritivo y placas Petri dividida en zona A y B. grupos 4.
Fuente: Propio

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XI. APENDICE
1. Metodología

1mL 1mL 1mL

9mL de agua de
dilución estéril

1:1000 1:10000 1:100000 1:1000000

Sin colorante
Cristal violeta

PLACAS PETRI
ESTERILES

TUBO
CONTENIENDO
AGAR NUTRITIVO
FUNDIDO A 45 ºC
Invertir las placas e incubarlos a 37 ºC por 48 horas
Fuente propia

2. PROCEDIMIENTO
PROCEDIMIENTO: ACCIÓN BACTERIOSTÁTICA SELECTIVADEL CRISTAL
VIOLETA

Recibir en el laboratorio, las muestras enumeradas o etiquetadas.

1) Mantener 4 tubos con agar nutritivo fundido en el baño maría a 45 ºC.

2) Transferir 1ml de la solución acuosa de cristal violeta de 1:1000 a uno de los tubos
con 9 ml de agua. Esto da una disolución de 1:10000.
3) Usando la misma pipeta, transferir 1ml de la dilución 1:10000 a una placa Petri y
1 ml al segundo tubo con 9ml de agua. Esto da una disolución de 1:100000.

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4) Transferir 1ml de la solución 1:100000 a una placa de Petri y 1 ml a un tercer tubo

con 9 ml de agua esto da una dilución de 1:1000000.
5) Transferir 1ml de la dilución 1:1000000 a una placa Petri.
6) Vertir el agar fundido en las tres placas de Petri y mezclar bien el colorante con el
agar rotando suavemente la placa,para obtener una distribución uniforme del
colorante.
7) Vertir el contenido del ultimo tubo de agar en la placa de petri sin colorante para
que sirva de control.
8) Cuando se ha solidificado el agar se invierte la placa y dividir cada una en en dos
partes iguales con un lápiz de cera.
9) Marcar cada mitad con el nombre del organismo con el que se va sembrar por el
método de estrías.
10) Rayar en estrías la mitad de una placa de petri con una gotita ,tomada con el asa
del inoculador ,del cultivo Sector A: Siembra de Escherichia. Coli,y la otra mitad
iguakmente con una gotita del cultivo Sector B: Siembra de Bacillus Subtillis.
11) Proceder de igual forma con las demás placas de Petri.
12) Invertir las placas e incubarlas a 37 ºC por 48 horas.
13) Anotar los resultados obtenidos,indicando la presencia y ausencia de crecimiento
por los signos (+) y (-) respectivamente.

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