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Departamento de Parasitología
Ciudad de La Habana
2003
Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”
Departamento de Parasitología
Ciudad de La Habana
2003
Síntesis
Para la evaluación de las acciones llevadas a cabo, hicimos una segunda aplicación de las
encuestas arriba mencionadas. Los resultados nos permitieron conocer de una significativa
mejoría en la casi totalidad de los aspectos cognoscitivos y perceptuales evaluados y de
progresos parciales en los aspectos técnico-organizativos en que incursionaban los
cuestionarios.
Indice
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en consecuencia, no tratarse de un caso de amebiasis; la segunda, que los supuestos casos de
resistencia amebiana al metronidazol podrían en realidad tratarse de pacientes que acudieron
a los servicios hospitalarios por presentar diarreas, se les indicó un examen microscópico de
heces para confirmar la sospecha clínica y éste resultó en un falso diagnóstico de amebiasis
intestinal (bien porque se confundieron con amebas estructuras presentes en las heces, bien
porque se informó la presencia de E. histolytica en una muestra en que la ameba presente era
E. dispar). Así, el paciente regresa con la sintomatología inicial porque se le indicó
tratamiento para una enfermedad que no padecía.
El conjunto de elementos hasta aquí descritos nos sugirió que la amebiasis intestinal en
nuestro país, como posiblemente en otros, podría ser un problema de salud
sobredimensionado: porque se sobrediagnosticaba, porque se desconocía la existencia de E.
dispar y porque se consideraba erróneamente que existía resistencia de E. histolytica al
metronidazol.
Con la intención de tener un acercamiento más objetivo al problema, durante 5 meses
colectamos en hospitales y policlínicos de la provincia de Cienfuegos todas las muestras de
heces en las que había sido detectada por los procedimientos microscópicos de rutina la
presencia de “quistes y/o trofozoítos de E. histolytica". A las muestras colectadas se les aplicó
el inmunoensayo ENZYMEBA, procedimiento que permite confirmar la presencia de
infección por una o ambas especies del complejo E. histolytica/ E. dispar.
Para precisar la especie (o las especies) presente en las muestras positivas a ENZYMEBA, se
aplicó a las mismas un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Esta
prueba de RCP es el primer ensayo biomolecular desarrollado en nuestro país para
discriminar entre infección por E. histolytica e infección por E. dispar. Esta se diseñó y
estandarizó especialmente para este estudio y presentaba, respecto a las reportadas en la
literatura internacional al momento de su desarrollo (Cruz-Reyes y cois., 1992; Romero y
cois., 1992; Tachibana y cois., 1992; Acuna-Soto y cols, 1993; Katzwinkel-Wladarseh y
cois., 1994; Aguirre y cois., 1995; Guo y cois., 1995; Mackenstedt y cois., 1995; Britten y
cois., 1997; Mirelman y cois., 1997; Newton y cois., 1997; Troll y cois., 1997; Haque y
cois., 1998; Haque y cois., 1999; Pillai y cois, 1999; Zengzhu y cois., 1999), dos novedades
técnicas: 1) el bombardeo de las muestras, durante el proceso de extracción de ADN, con
partículas de circonio y 2)
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la realización simultánea, en una misma reacción, de dos ensayos de RCP (de aquí la
denominación de RCP Múltiple), uno para detectar E. histolytica y otro para detectar E.
dispar.
Con el objetivo de demostrar que el metronidazol continúa siendo una droga eficaz en el
tratamiento de la amebiasis intestinal, a los individuos con infección por una o ambas
especies del complejo E. histolytica/ E. dispar, se les tomó una segunda muestra de heces
inmediatamente después de finalizado el mismo. Estas muestras fueron estudiadas por los
procedimientos ENZYMEBA y RCP.
Estudiados los tres componentes de la sobredimensión de la amebiasis como problema de
salud, decidimos incursionar en sus posibles causas. Con ese objetivo se aplicaron encuestas
sobre conocimientos, percepciones y prácticas a Médicos, Técnicos y Responsables de
Laboratorio relacionados con el diagnóstico, tratamiento y control de esta parasitosis en la
provincia de Cienfuegos. Estas nos permitieron conocer que en relación con la amebiasis
existían importantes deficiencias cognoscitivas y técnico- organizativas.
Para atenuar las deficiencias detectadas, además de informar de estos resultados a las
autoridades correspondientes del Ministerio de Salud Pública, procedimos a realizar un
grupo de acciones (que en lo adelante llamaremos intervención) en la provincia de
Cienfuegos. Los resultados de estas medidas, cuya cuantía y formas de aplicación fueron las
disponibles al momento de su ejecución, permitirían la evaluación, reformulación y,
eventualmente, la extensión de las mismas al resto del país.
Lugar protagónico entre estas medidas tuvo la preparación, publicación y posterior
distribución gratuita en todo el país, de un libro que contendría una reestructuración y
actualización de los conocimientos sobre amebiasis de los profesionales encarados al
diagnóstico, tratamiento y control de esta parasitosis.
Para la evaluación de las acciones llevadas a cabo, a un año de su completamiento, hicimos
una segunda aplicación de las encuestas arriba mencionadas. Los resultados nos permitieron
conocer de una significativa mejoría en la casi totalidad de los aspectos cognoscitivos y
perceptuales evaluados y de progresos parciales en los aspectos técnico - organizativos en que
incursionaban los cuestionarios.
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II- Hipótesis
La amebiasis intestinal es un problema de salud sobredimensionado.
III- Objetivos
A- General
Contribuir al mejor diagnóstico, tratamiento y control de la amebiasis intestinal en
Cuba.
B- Específicos
1- Confirmar, empleando una herramienta diferente al examen microscópico de heces, que
en centros hospitalarios de Ciudad de La Habana este procedimiento se asocia a un
importante sobrediagnóstico de amebiasis intestinal.
2- Desarrollar un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) que nos
permita discriminar entre infección por E. histolytica e infección por E. dispar en
muestras de heces.
3- Demostrar que la amebiasis intestinal en la provincia de Cienfuegos, como posiblemente
en el resto del país y más allá de nuestras fronteras, es un problema de salud
sobredimensionado porque:
a- Se sobrediagnostica.
b- Se desconoce la existencia de E. dispar.
c- Se considera erróneamente que existe resistencia de E. histolytica al metronidazol.
4- Conocer sobre los conocimientos, percepciones y prácticas en relación con el
diagnóstico, tratamiento y control de la amebiasis intestinal de los Médicos, Técnicos y
Responsables de Laboratorio relacionados con el problema.
5- Tomar un grupo de medidas, a manera de intervención, con la intención de contribuir a la
atenuación de la sobredimensión.
6- Como parte de las medidas antes citadas, preparar, publicar y distribuir un libro que
aporte herramientas necesarias para un mejor diagnóstico, tratamiento y control de la
amebiasis intestinal.
7- Transcurrido un año de completada la intervención, estudiar el impacto de ésta sobre los
conocimientos, percepciones y prácticas en relación con el diagnóstico, tratamiento y
control de la amebiasis intestinal de los Médicos, Técnicos y Responsables de
Laboratorio relacionados con el problema.
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Novedad científica
El trabajo que se describe en este documento tiene los siguientes element os de novedad
científica:
1- Empleando el inmunoensayo ENZYMEBA, se demostró que en centros hospitalarios de
las provincias de Ciudad de La Habana y Cienfuegos el examen microscópico de heces
se asocia a un importante sobrediagnóstico de amebiasis intestinal.
2- Se desarrolló por primera vez en nuestro país un procedimiento de reacción en cadena de
la polimerasa que nos permite la detección y diferenciación de la infección por una o
ambas especies del complejo Entamoeba histolytical Entamoeba dispar. Al momento de su
desarrollo, este procedimiento tenía respecto a los reportados en la literatura
internacional dos novedades técnicas: 1) la utilización de partículas de circonio durante
el proceso de extracción de ADN, y 2) la realización simultánea, en una misma rea cción,
de dos ensayos de RCP, uno para detectar E. histolytica y otro para detectar E. dispar.
3- Con un acercamiento simultáneo a varios aspectos del diagnóstico y tratamiento de la
amebiasis intestinal en una situación concreta, se demostró que esta parasitosis en la
provincia de Cienfuegos, como posiblemente en el resto del país, es un problema de
salud sobredimensionado.
Valor Social
1- Partiendo del criterio de que la aproximación a un problema no debe terminar en su
demostración, se incursionó en las causas de la sobredimensión de la amebiasis intestinal
como problema de salud en la provincia de Cienfuegos; se diseñó y aplicó, a manera de
intervención, un grupo de medidas con la intención de atenuarla; y se realizó una
evaluación del impacto de éstas, a fin de valorar su reformulación y, eventualmente y
según las circunstancias de cada lugar, su extensión al resto del país.
2- Se preparó, publicó y distribuyó gratuitamente una monografía sobre la amebiasis que
titulamos Amebiasis: enfoques actuales sobre su diagnóstico, tratamiento y control.
Para la preparación de este libro, además de realizar una exhaustiva revisión de todo lo
publicado sobre los temas en él abordados, tuvimos en cuenta, y éste es uno de sus
elementos de novedad, los resultados de las investigaciones
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descritas en esta tesis de doctorado (aquellos que condujeron a la intervención realizada
en la provincia de Cienfuegos, de la cual el propio libro forma parte).
Premios:
Los resultados contenidos en este documento fueron premiados en diferentes eventos
nacionales:
1. Fonte L, Fernández MA, López A, Núñez Y. Sobredimensión de la amebiasis intestinal
como problema de salud. XV Conferencia Científica del CIMEQ. M1NSAP. Ciudad de
La Habana. Cuba. Marzo. 1997. Premio “Raúl Dorticos Torrado” al mejor trabajo
sobre enfermedades infecciosas.
2. Fonte L, Sánchez L, Fernández MA, Marín H, Montano I, Maestre JL. Aportes al
conocimiento sobre la amebiasis intestinal en Cuba. XIII Forum Nacional de Ciencia y
Técnica. MINSAP. Ciudad de La Habana. Cuba. Enero. 2001. Resultado Relevante del
MINSAP.
3. Fonte L, Sánchez L, Fernández MA, Marín H, Montano I, Maestre JL. Detección y
diferenciación de la infección por una o ambas especies del complejo Entamoeba
histolytica/Entamoeba dispar. IV Jornada Internacional de Infectología Pediátrica.
SLIPE. Holguín. Cuba. Abril. 2001. Beca para la presentación del trabajo en Congreso
Latinoamericano de Infectología Pediátrica. SLIPE. San Salvador. Salvador. Agosto.
2001.
4. Fonte L, Sánchez L, Fernández MA, Marín H, Montano I, Maestre JL. Amebiasis
intestinal. Resultados de una intervención para la redimensión de un problema. III
Convención Nacional de Salud. MINSAP. Marzo. 2002. Premio al mejor trabajo sobre
enfermedades parasitarias.
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II- Revisión Bibliográfica
1. Aspectos conceptuales
En relación con los vocablos ameba y amebiasis, y otros con ellos vinculados, existen algunas
confusiones. Por ese motivo, nos ha parecido útil iniciar esta breve incursión por los saberes
relativos a E. histolytica y la infección que produce en el humano, haciendo precisiones, a
veces consideraciones, sobre los términos que abordamos a continuación.
1.1 Ameba
El vocablo ameba designa un grupo de protozoos de la superclase Rhizopoda, pertenecientes a
los géneros Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia, Entamoeba, Endolimax y lodoameba. A las
especies incluidas en este grupo, coinciden los textos clásicos, les son comunes dos elementos
morfológicos de su fase trófica: la presencia de un protoplasma desnudo y la formación de
seudópodos lobulados como estructuras de locomoción (Beaver y cois., 1986).
La cantidad de especies de amebas presentes en la naturaleza es numerosa y la relación que
éstas establecen con otros seres vivos es variada. Las hay de vida completamente libre y
existen las que parasitan, de manera facultativa u obligada, órganos y tejidos de una amplia
gama de especies de animales. Sin embargo, sólo un número reducido de especies
pertenecientes a los géneros Naegleria, Acanthomoeba, Balamuthia y Entamoeba son patógenas
al hombre (Beaver y cols., 1986; Ma y cols., 1990; Visvesvara y cols., 1993).
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1.1.2 Amebas parásitas obligadas
Además de las especies de amebas de vida libre, el hombre puede ser infectado por especies
amebianas de los géneros Entamoeba, Endolimax y lodoameba. Estas, a diferencia de las
primeras, son parásitos obligados del hombre y de otros animales, pues deben realizar en uno
de ellos parte de su ciclo evolutivo de vida (Beaver y cois. 1986). De las amebas parásitas del
aparato digestivo del hombre, E. histolytica es la única especie patógena. Cuando invade los
tejidos del humano, el espectro de las manifestaciones clínicas a que da lugar es tan amplio
como variadas son las localizaciones que alcanza. E. histolytica, según detallaremos más
adelante, puede habitar en el lumen intestinal, invadir la pared de esta viscera e, incluso,
realizar migraciones a tejidos y órganos lejanos (Martínez-Palomo, 1989; Bruckner, 1992;
Reed, 1992; Ravdin, 1995).
1.2 Amebiasis
La infección del hombre por especies de los géneros Naegleria, Acanthomoeba y Balamuthia da
lugar con relativa frecuencia a manifestaciones clínicas, generalmente cuadros de muy mal
pronóstico (Ma y cois., 1990; Visvesvara y cois., 1993). La infección del humano por E.
histolytica, por el contrario, es asintomática en la mayoría de las ocasiones (Martínez-Palomo,
1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Ravdin, 1995). Es decir, los datos disponibles indican que
la proporción de personas que enferman y la gravedad de sus lesiones son mayores entre los
individuos que se infectan con amebas de vida libre.
Sin embargo, las cifras de prevalencia de infección por especies de los géneros Naegleria,
Acanthomoeba y Balamuthia, sobre todo si se les compara con las estimadas para la infección
por E. histolytica, son extremadamente bajas. En este argumento radica que se haya reservado
el término amebiasis exclusivamente para la infección producida por la especie de ameba
intestinal a que estamos haciendo referencia.
Por lo antes expuesto, es de aceptación universal considerar la amebiasis como la infección
del hombre por E. histolytica, con independencia de que esta de lugar o no a manifestaciones
clínicas (Martínez-Palomo, 1989; Matijasevic, 1992).
2. Aspectos históricos
Descripciones de disentería (del griego dys: alteración, enteron: intestino) aparecen en
antiquísimos documentos de muy diversas culturas e idiomas (desde hebreos y griegos,
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hasta chinos y sánscritos). Con el término disentería, aquellos remotos predecesores
designaron un síndrome clínico caracterizado por la presencia de heces diarreicas muco-
sanguinolentas, que era el azote de ejércitos en guerra, y de regiones pobres y muy pobladas
(Matijasevic, 1992).
Aunque no la nombrara de la forma que hoy lo hacemos, se considera a Fedor Aleksandrovich
Lösch el descubridor de E. histolytica (Imperato, 1981). En 1875, Lösch estudió
microscópicamente las heces de un campesino de San Petersburgo, Rusia, que padecía de
diarreas disentéricas (Lösch y cois., 1875). Lösch observó en las heces unos microorganismos
que poseían ecto y endoplasma, y contenían glóbulos rojos. Posteriormente, inoculó cuatro
perros por las vías oral y rectal con las heces del paciente y logró reproducir la disentería en
uno de ellos. Al sacrificar al animal enfermo, encontró en la mucosa del colon de aquél el
microorganismo que antes había observado en las heces del paciente. Meses más tarde, el
paciente fallece y en su autopsia fueron demostradas numerosas y extensas ulceraciones de la
mucosa del colon, en las que nuevamente fueron observados los mic roorganismos antes
descritos.
En 1886, Robert Koch estudió cinco casos de disentería, dos de ellos complicados con
absceso hepático (Koch y cois., 1887). Koch ubicó con más precisión la presencia de las
amebas en la profundidad de las úlceras, en la submucosa intestinal, y lo que era más
novedoso aún, demostró la presencia del parásito en las lesiones hepáticas, incluso en los
capilares próximos a la pared de los abscesos.
Trabajando casi simultáneamente con Koch, y motivado por los estudios de éste, Esteban
Kartulis realizó 150 autopsias en pacientes egipcios que habían fallecido por disentería y
observó la presencia en las úlceras colónicas de los protozoos descritos por Lösch y Koch, en
todos los casos (Kartulis, 1886). Un año después, demostró la p resencia de amebas en
pacientes de lo que entonces se conocía como absceso hepático tropical. Kartulis fue el
primero en afirmar que la ameba era el agente causal de la disentería tropical y que el absceso
hepático era una secuela de la disentería amebiana.
En 1890, William Councilman y Henri La Fleur realizaron un detallado estudio de pacientes
de disentería y de absceso hepático en el Hospital Johns Hopkins (Councilman y La Fleur,
1891). Como resultado de sus investigaciones, confirmaron el papel patógeno de las amebas,
para las cuales propusieron el nombre de Amoebu dysenteriae, e introdujeron los términos
disentería amebiana y absceso amebiano del hígado.
Quincke y Roos, en 1893, descubrieron la forma quística de la ameba y su papel en la
diseminación de la infección (Quincke y Ross, 1893). Estos autores reportaron, además, el
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hallazgo de otra especie de ameba, aparentemente no patógena, en las heces humanas. En
1903, Schaudinn estableció la diferencia de especie entre la ameba descrita por Lósch, a la
cual nombró Entamoeba histolytica, y la especie encontrada por Quincke y Roos, a la que
denominó Entamoeba coli (Schaudinn, 1903).
Una observación realizada a principios de siglo originaba intensas discusiones entre los
estudiosos de la infección amebiana: la ausencia de manifestaciones clínicas en la mayoría de
los individuos en cuyas heces era detectada E. histolytica. Para dar solución a aquella
polémica, que llegó hasta la década de 1990, varias hipótesis fueron formuladas. Los
componentes esenciales de una de ellas, sobre la que hoy existen elementos probatorios,
fueron presentados por Emile Brumpt en 1925, cuando, basándose en observaciones clínicas y
epidemiológicas y estudios en gatos, señaló la existencia de E. histolytica como un complejo
de dos especies, a las que denominó Entamoeba disentehae, causante de la infección
sintomática, y Entamoeba dispar, encontrada en personas sanas (Brumpt, 1925).
Un conjunto de trabajos sobre aspectos funcionales, bioquímicos, inmunológicos y genéticos
de aislamientos de amebas procedentes de individuos con y sin manifestaciones clínicas de
amebiasis, de los cuales fue pionero el estudio de caracterización isoenzimática reportado por
Peter Sargeaunt en 1978 (Sargeaunt, 1978), contribuyó a la acumulación de pruebas
definitivas a favor de la existencia de las dos especies de amebas y condujeron a la
redescripción formal de E. histolytica, separándola de E. dispar, en excelente artículo de
revisión de Louis Diamond y Grahan Clark, publicado en 1993 (Diamond y Clark, 1993).
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E. dispar, E. hartmanni, E. coli y E. Polecki parasitan el intestino grueso del hombre y, por
tanto, han sido halladas en sus heces.
De las amebas que han sido encontradas parasitando en el aparato digestivo del hombre,
sólo E. histolytica es capa/ de invadir la pared de ese órgano y, en consecuencia, producir
enfermedad. Esta especie amebiana, cuya clasificación taxonómica se muestra en la tabla
1, perpetúa su existencia mediante el tránsito por un ciclo evolutivo relativamente sencillo
y realiza sus actividades vitales haciendo gala de una organización celular poco compleja.
A ambos aspectos, ciclo evolutivo y organización celular, haremos referencia en los
acápites siguientes.
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Los trofozoítos metaquísticos, incapaces de colonizar el intestino delgado, son arrastrados por
las heces y llegan al intestino grueso. En esta región, utilizando el amplio arsenal de
moléculas con actividad lítica presentes en su membrana celular y en su citoplasma, estos
trofozoítos se alimentan de bacterias y otras células en contacto con su superficie. De este
modo, los pequeños trofozoítos metaquísticos aumentan de tamaño y alcanzan las
dimensiones definitivas de los trofozoítos maduros de la especie. En la luz y en las criptas de
las glándulas de la mucosa del intestino grueso, los trofozoítos amebianos continúan
multiplicándose por simple división binaria y eventualmente, por circunstancias todavía
desconocidas, pueden invadir la pared de esta viscera e, incluso, hacer migraciones a órganos
y tejidos distantes. Paradójicamente, la invasión de los tejidos del hospedero por trofozoítos
de E. histolytica, que no es necesaria para su ciclo de vida, no da lugar a quistes y, por tanto,
no contribuye a la diseminación y perpetuación de la especie.
Sin embargo, la evolución de los trofozoítos amebianos en la luz intestinal sigue con más
frecuencia un curso diferente al descrito en el párrafo anterior. Consecuencia de condiciones
en el colon aún no bien precisadas, pero aparentemente adversas para los trofozoítos, éstos
comienzan a eliminar sus vacuolas alimenticias, entre otras inclusiones citoplasmáticas, y a
condensarse en una masa esférica, el prequiste. Posteriormente, esta forma celular se cubre de
una pared protectora y se convierte en un quiste inmaduro. Éste, como los trofozoítos que lo
preceden, sólo posee un núcleo. Dos divisiones nucleares sucesivas, que dan origen a un
quiste tetranucleado, caracterizan su proceso de maduración.
Se pueden encontrar trofozoítos, prequistes y quistes en diferentes fases de maduración en las
heces humanas. De éstos, la única forma infectante por vía oral es el quiste maduro (quiste
tetranucleado), que, en dependencia de las condiciones ambientales, puede permanecer viable
semanas y meses.
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Trofozoíto
Los trofozoítos de E. histolytica presentan formas muy disímiles y miden entre 10 y 60 mieras
de diámetro. Estas amplias variaciones en forma y tamaño dependen, entre otros factores, del
grado de actividad del parásito, siendo mayor el pleomorfismo y la talla de los trofozoítos
hallados en heces disentéricas recién evacuadas que los encontrados ocasionalmente en heces
de portadores asintomáticos.
El citoplasma presenta dos áreas relativamente bien definidas: una porción externa hialina,
transparente, sin gránulos, que recibe el nombre de ectoplasma, y una porci ón interna granular
que contiene diversas inclusiones, algunas de ellas vacuolas fagocíticas, denominada
endoplasma. La presencia de eritrocitos entre los elementos fagocitados es característica de E.
histolytica.
En frotis directo, sobre todo de heces disentéricas, es posible observar el movimiento
progresivo, en ocasiones explosivo, de los trofozoítos de E. histolytica. Este es el resultado de
la aparición de prolongaciones digitiformes del ectoplasma, denominadas seudópodos, hacia
cuyo interior fluye posteriormente el endoplasma.
Mediante el empleo de métodos de coloración habituales, ya no es posible observar la
movilidad del trofozoíto, pero se hacen evidentes características de su núcleo que permiten
identificar a E. histolytica de manera más precisa. Convenientemente fijado y teñido, el núcleo
es esférico y representa aproximadamente un cuarto de la talla del trofozoíto; tiene un
cariosoma compacto y pequeño localizado más o menos en su centro; y su cromatina se halla
dispuesta en la periferia, junto a la superficie interna de la membrana nuclear, de manera
finamente granular.
Prequiste
El prequiste es una célula inmóvil, de forma ovalada o redonda, de 10 a 20 mieras de
diámetro, aún sin cubierta quística y con algunas inclusiones citoplasmáticas. Con r elación a
la fase de trofozoíto, su citoplasma muestra dos nuevas estructuras: una vacuola de glucógeno
más o menos grande y de bordes difusos, que aporta los requerimientos energéticos para la
maduración del quiste, y cuerpos refringentes, de forma cilíndrica y de tipo cristalino que
reciben el nombre de cuerpos cromatoidales. El núcleo muestra un tamaño superior al de la
fase precedente y su cariosoma ya no es tan compacto.
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Quiste
Hasta el presente, la obtención de quistes de E. histolytica no ha sido posible mediante cultivo
in vitro. Por este motivo, la información de que se dispone acerca de la estructura de éstos es
mucho menor que la existente con respecto a los trofozoítos. Como los prequistes que los
preceden, los quistes son células inmóviles, de formas ovaladas o redondas y miden entre 10 y
16 mieras de diámetro. A diferencia de los trofozoítos, los quistes de E. histolytica tienen
tamaño y formas relativamente uniformes.
Apenas se observan inclusiones citoplasmáticas en los quistes. La vacuola de glucógeno,
remanente de la etapa anterior, sólo está presente en los quistes inmaduros (el glucógeno ha
sido consumido durante la maduración). Se conservan los cuerpos cromatoidales surgidos en
la fase anterior y, en dependencia del grado de maduración del quiste, éste contiene de uno a
cuatro núcleos con las características de especie ya descritas.
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ésta tiene asiento un importante grupo de moléculas (lectinas y proteasas, entre ellas) muy
vinculadas con la actividad lítica de E. histolytica (Carrero y Laclette, 1996).
La observación de la superficie del quiste de E. histolytica al microscopio electrónico de
barrido permite apreciar el aspecto rugoso de su pared. El grosor de ésta, cuya uniformidad
puede ser observada con el empleo del microscopio electrónico de transmisión, fluctúa entre
los 125 y 150 nm y está compuesta fundamentalmente por polímeros de N-acetil-D-
glucosamina (Mesa y cois., 1994; Carrero y Laclette, 1996).
El citoplasma amebiano
E. histolytica exhibe una organización citoplasmática muy primitiva. En el citoplasma del
trofozoíto, su fase metabólicamente más activa, están ausentes componentes tales como
mitocondrias, aparato de Golgi y un sistema de lisosomas primarios y secundarios como el
observado en otras células eucarióticas (Mesa y cois., 1994; Carrero y Laclette, 1996;
Espinosa-Castellano y cois, 1998). La organización del citoplasma del quiste, su fase de
resistencia, es aún más sencilla.
En el citoplasma de los trofozoítos amebianos, observado al microscopio electrónico de
transmisión, se aprecian abundantes vacuolas. Estas son relativamente uniformes en fo rma
(redondas u ovaladas) y muy variables en tamaño (entre 0,5 y 9 p.m de diámetro) (Martínez-
Palomo, 1989; Espinosa-Castellano y cols, 1998).
El citoplasma de E. histolytica, en cualesquiera de las fases de su ciclo evolutivo, carece de un
retículo endoplásmico bien desarrollado. En el de los trofozoítos se puede observar una red de
túbulos y vesículas que recuerda un retículo endoplásmico liso. En esta fase evolutiva, los
ribosomas se organizan en forma de cúmulos helicoidales de 300 y 40 nm de longitud y
diámetro, respectivamente. En los quistes, estos cúmulos se agregan y forman grandes
estructuras cristalinas, de hasta varias mieras de longitud; son los llamados cuerpos
cromatoidales que se observan con el empleo del microscopio de luz ( Martínez-Palomo, 1989;
Espinosa-Castellano y cois, 1998).
Un componente importante del citoplasma de E. histolytica es su citoesqueleto. Varias
actividades amebianas, sobre todo motrices, están relacionadas con la estructura y funciones
de éste. Tres moléculas del citoesqueleto de este protozoo han sido identificadas y
parcialmente caracterizadas: actina, miosina y tubulina (Carrero y Laclette, 1996).
La actina es la proteína más abundante en el citoplasma amebiano. In vitro, se polimeriza
formando filamentos de 7 nm. In vivo, se encuentra dispersa en el citoplasma
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o concentrada en el seudópodo frontal y en la región del uroide caudal de las amebas en
movimiento (Mesa y cols., 1994; Carrero y Laclette, 1996).
La actina de E. histolytica participa en las tres fases del movimiento ameboideo: extensión del
seudópodo, flujo del citoplasma hacia el interior de aquél, y retracción de la región posterior
de la célula (Mesa y cois., 1994). Una actividad defensiva de la actina, muy relacionada con
sus funciones motrices, es el desplazamiento de moléculas unidas a la superficie amebiana
hacia la región del uroide. El desprendimiento del uroide, sin que ocurra daño celular, permite
la eliminación de dichas moléculas.
Aunque en los trofozoítos de E. histolytica sólo se ha podido demostrar la presencia de una
forma de actina, en el genoma de este protozoo han sido identificados varios genes que
codifican para esta molécula (Carrero y Laclette, 1996).
A diferencia de lo que ocurre con la actina, el mareaje de trofozoítos amebianos con
anticuerpos fluorescentes contra miosina ha permitido comprobar que la misma no está
presente en el seudópodo frontal. Sin embargo, la miosina sí ha sido localizada en la región
del uroide y en el anillo contráctil involucrado en su formación, tal como suc ede con la actina.
Por este motivo, se considera que esta molécula también ejerce funciones motrices y
defensivas (Rahin-Zeaur y cols, 1993). Dos publicaciones reportan la identificación de genes
que codifican para la cadena pesada de la miosina de E. histolytica (Arhets y cols., 1992;
Raymond-Denise y cois., 1993)
La caracterización del gen que codifica para la tubulina también fue realizada. Este, del cual
aparentemente existen dos copias contiguas, codifica para una proteína de 455 aminoácidos
(Sánchez y cois., 1994). La tubulina amebiana, a diferencia de las identificadas en el
citoesqueleto de otras células, carece de un complejo poliacídico en el extremo carboxilo -
terminal, que es necesario para su polimerización. Este hecho podría explicar la menor
presencia de microtúbulos en el citoesqueleto amebiano: escasos en el citoplasma y presentes
en forma de haces en el núcleo de trofozoítos en división (Carrero y Laclette, 1996).
El núcleo amebiano
Los núcleos de trofozoítos y quistes maduros de E. histolytica miden entre 3 y 5 pm de
diámetro y, como ya se expresará anteriormente, son morfológicamente idénticos (Carrero y
Laclette, 1996). Por lo regular, los trofozoítos son uninucleados. Sólo en ocasiones,
posiblemente como consecuencia del desarrollo no acoplado de las divisiones
16
celular y nuclear, se observan trofozoítos con dos o más núcleos. Los quistes de esta especie,
según su grado de maduración, exhiben de uno a cuatro núcleos.
La membrana nuclear permanece intacta durante todo el ciclo celular. Se ha comprobado,
utilizando técnicas microscópicas especiales, la presencia de poros en ella. Éstos están
distribuidos regularmente y organizados en forma de series hexagonales (Mesa y cols., 1994).
Mediante estudios citoquímicos y de incorporación de precursores nucleotídicos marcados, se
ha constatado una reorganización de los ácidos nucleicos según la fa se del ciclo celular. En la
interfase, los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) se encuentran dispersos en el núcleo; antes
de la división nuclear, los ADN se concentran formando el cariosoma central (Albach, 1989).
La cromatina periférica, visible al microscopio de luz, es una capa de gránulos basófilos a lo
largo del borde interno de la membrana nuclear constituida, fundamentalmente, por ADN
involucrado en la síntesis de ácidos ribonucleicos (ARN). En la mayoría de las células
eucarióticas, la cromatina está organizada en nucleosomas. En el caso de E. histolytica, la
cromatina muestra una estructura de semillas en rosario, con nucleosomas de 10 nm de
longitud (Carrero y Laclette, 1996).
Los datos publicados acerca del número de cromosomas de E. histolytica no son coincidentes.
Unos autores sugieren la presencia de 5 a 8 cromosomas, otros especulan con la existencia de
4 a 5 pares de éstos (Carrero y Laclette, 1996).
Diferentes estudios se han realizado para determinar el contenido total de ADN de E.
histolytica. Los más recientes estiman, en el caso de la cepa HM1, la presencia de 0,5 pg de
ADN por núcleo y un tamaño del genoma de 4 x 10 pares de bases (Carrero y Laclette, 1996).
Debido a que E. histolytica no posee mitocondrias u otros organelos citoplasmáticos que
contengan ADN, este tipo de ácido nucleico sólo está presente en el núcleo.
Los genes que codifican para los ARN ribosomales se encuentran, según fuera demostrado a
finales de la década de 1980, en moléculas circulares de ADN situadas fuera de los
cromosomas. Cada uno de estos plásmidos, cuyo número excede los 200 por núcleo, está
constituido por dos unidades transcripcionales de ARN ribosomal en posición invertida.
Estudios recientes han demostrado que la mayoría de las secuencias repetitivas en el genoma
de E. histolytica se encuentran en estas moléculas. La comparación de las secuencias
nucleotídicas de las moléculas de ADN extracromosomal de las diferentes especies amebianas
demuestra importantes diferencias entre ellas. Este
17
hecho ha sido utilizado con fines taxonómicos y, sobre todo, en el desarrollo de
procedimientos para el diagnóstico de amebiasis (Bhattacharya y cols., 1989; Huber y cois.,
1989; Ackers, 2002).
18
4. Entamoeba histolytica: marcadores de patogenicidad
Como expresáramos antes, durante más de seis décadas a varias generaciones de amebólogos
llamó la atención la marcada diferencia siempre encontrada entre la prevalencia de infección
por Entamoeba histolytica y la incidencia de enfermedad en los individuos supuestamente
infectados por este protozoo. Sobre la base de estudios realizados en diferentes áreas
geográficas, se estimó que alrededor de 10 % de la población mundial es taba infectada y, sin
embargo, poco menos de 1 % desarrollaba manifestaciones clínicas atribuibles a esta
parasitosis.
Para dar explicación a este hecho, se formularon varias hipótesis. Obviando algunos detalles,
éstas pueden ser resumidas en tres:
1. E. histolytica es una especie que siempre produce lesiones intestinales en el humano, y
aquéllas pueden dar lugar o no a manifestaciones clínicas.
2. E. histolytica es normalmente un comensal que habita en el colon humano y, en ocasiones,
por razones no conocidas, se convierte en un patógeno invasor.
3. E. histolytica es un complejo de dos especies morfológicamente idénticas: una especie
patógena que, en dependencia del contexto en que reside, exhibe diferentes grados de
virulencia, y otra que no invade los tejidos.
Los componentes esenciales de la tercera hipótesis fueron presentados por Emile Brumpt en
1925 (Brumpt, 1925), cuando señaló que E. histolytica era un complejo de dos especies:
Entamoeba disenteriae, causante de la infección sintomática, y Entamoeba dispar, encontrada en
personas sanas. La información acumulada en las décadas de 1970, 1980 y 1990 permitió
demostrar la existencia de marcadores de patogenicidad amebianos, que prueban los
postulados de Brumpt. A continuación nos referiremos a esos marcadores, en orden
cronológico de conocimiento.
19
receptores de superficie con un alto contenido de glucosa y mañosa), carencia de carga
negativa de superficie a pH neutro (lo cual favorece la adherencia a células de mamíferos
cargadas negativamente), mayor habilidad para realizar eritrofagocitosis, poseer mayor efecto
citopático in vitro y, finalmente, para sólo hacer referencia a las mejor caracterizadas,
capacidad de producir lesiones (en colon e hígado) en animales de experimentación
(Martínez-Palomo, 1989).
20
presente en aislamientos con zimodemos patógenos, no estaban presentes en la molécula
correspondiente de amebas con zimodemos no patógenos.
Posteriormente, también con el uso de anticuerpos monoclonales, se identificaron y
caracterizaron otras moléculas que permitían establecer la diferenciación. Veamos a
continuación (Diamond y Clark, 1993; Jackson y Ravdin, 1996):
Dos moléculas de superficie. Estas, de 29-30 y 96 kDa, están presentes en las cepas patógenas
y ausentes, o presentes en menor cuantía, en las cepas no patógenas.
En 1990, fue reportada la obtención de un anticuerpo monoclonal que reconocía los gránulos
electrodensos relacionados con la actividad colagenolítica de E. histolytica. Éste reaccionaba
solamente con los gránulos de aislamientos con zimodemos patógenos. Se ha sugerido que
varias proteasas, incluida una con actividad colagenolítica, son liberadas en forma de cuerpos
de membrana electrodensa, por un mecanismo similar al de exocitosis.
Anticuerpos monoclonales específicos a antígenos intracelulares también han sido utilizados
para distinguir entre aislamientos de las dos especies. Así, por ejemplo, se observó que uno
dirigido contra una molécula de 81-84 kDa reaccionaba, en ensayo de Inmunofluorescencia
indirecta, sólo con aislamientos con zimodemos patógenos.
21
En 1991, se obtuvieron los correspondientes ADNc, de aproximadamente 400 pb, que
codifican para el antígeno de 29-30 kDa en los aislamientos con zimodemos patógenos y no
patógenos, y se compararon sus respectivas secuencias nucleotidicas. Se halló una diferencia
de 4,5 % entre las secuencias de aminoácidos inferidas de ambas formas. Este fra gmento
también puede ser utilizado para distinguir entre las dos especies mediante RCP y restricción
enzimàtica.
La comparación de las secuencias de ADNc de los genes de simple copia de superóxido
dismutasa provenientes de aislamientos con patrones isoenzimáticos patógenos y no
patógenos, reveló una divergencia nucleotídica de 5 %. Esta diferencia fue consistentemente
observada tras restricción enzimàtica del ADN total e hibridación con dichas sondas marcadas.
La organización de los genes para las moléculas actina del citoesqueleto amebiano también
difiere entre ambos tipos de aislamientos. Estas variaciones genéticas parecen constituir un
marcador de patogenicidad, pues se han obtenido mutantes de E. histolytica que carecen de una
distribución regular de actina en su citoesqueleto y, en consecuencia, presentan menor
movilidad y un comportamiento menos agresivo en modelos animales.
Los genes de ARN ribosomal, muy conservados filogenèticamente, también han sido
estudiados. Mediante la secuenciación parcial de los genes de ARN de la subunidad ribosomal
pequeña de aislamientos con zimodemos patógenos y no patógenos, se pudo estimar en 2,2 %
la distancia genética entre ambos, una diferencia que es mayor que la existente entre los
humanos y los ratones.
Mención aparte merecen las cisteíno-proteinasas amebianas. Estas, como veremos más
adelante, constituyen importantes factores de virulencia de E. histolytica. Estas enzimas son
codificadas por al menos siete genes, denominados EhCPl-6 y EhCP112 (Que y Reed, 2000).
Al menos cuatro secuencias nucleotidicas homologas han sido identificadas en aislamientos
con zimodemos no patógenos (EdCPl-4) (Que y Reed, 2000). Mediante un estudio de genes
homólogos de una de estas enzimas (EhCP3 y EdCP3) en aislamientos con zimodemos
patógenos y no patógenos, se encontraron diferencias estructurales y de expresión entre los
mismos, y se determinó una divergencia de alrededor del 5 % entre las respectivas secuencias
aminoacídicas (Bruchhaus y Tannich, 1996; Mirelman y cois., 1996).
El conjunto de evidencias (funcionales, bioquímicas, inmunológicas y genéticas) hasta aquí
descritas, contribuyó a la acumulación de pruebas definitivas a favor de la
22
existencia de las dos especies de amebas y condujeron a Louis Diamond y Graham Clark, en
1993 (Diamond y Clark, 1993) a la redescripción formal de E. histolytica, separándola de E.
dispar.
En enero de 1997, un Grupo de Expertos de la OMS, reunidos en Ciudad de México, evalúo
las implicaciones que para la práctica médica y para la investigación sobre amebiasis tiene la
confirmación de la existencia de las dos especies, implicaciones que revol ucionan ya, entre
otros aspectos, la interpretación de los datos epidemiológicos, y los criterios diagnósticos y
terapéuticos en relación con esta parasitosis (WHO/PAHO/UNESCO, 1997). A las
conclusiones y recomendaciones devenidas de aquella reunión hacemo s referencia en otros
acápites de este documento.
5. Factores de Virulencia
La infección por E. histolytica no siempre tiene expresión clínica. Aunque en la mayoría de las
ocasiones los patrones isoenzimáticos de las amebas obtenidas de individuos asintomátic os
corresponden a E. dispar, se han encontrado zimodemos de E. histolytica en portadores sanos.
Es decir, en determinadas condiciones, la cepa presente de la especie patógena puede ser
avirulenta.
No se debe olvidar que el desarrollo de enfermedad como consecuencia de la infección por un
parásito, no depende exclusivamente de las características de éste. Las manifestaciones
clínicas que se produzcan, y las formas que éstas asuman, serán el resultado de la interacción
de tres grupos de factores: los relacionados con el parásito, el hospedero y el medio ambiente.
A continuación abordaremos los aspectos de la biología del parásito más estrechamente
vinculados con su capacidad para invadir y producir daños en los tejidos (a los relacionados
con el hospedero y con el medio ambiente haremos referencia en los acápites de este
documento que abordan la inmunobiología y la epidemiología de la infección amebiana,
respectivamente).
Las fases que caracterizan la infección invasiva por E. histolytica han sido mejor estudiadas en
modelos animales. De manera general, éstas se suceden así: adherencia al epitelio intestinal,
degradación de la matriz extracelular, lisis extracelular (por contacto) e intracelular (por
fagocitosis) de células del hospedero y evasión de los mecanismos defensivos de éste. Veamos
con más detalles cada uno de estos eventos y los factores de virulencia de E. histolytica
relacionados con los mismos.
23
5.1 Adherencia al epitelio intestinal
Como en el caso de otros microorganismos que parasitan el tubo digestivo, E. histolytica
requiere adherirse a la superficie de esa viscera. Varias moléculas han sido implicadas en la
adhesión amebiana al epitelio intestinal, paso necesario para fases posteriores del proceso
invasivo. Dos de ellas han recibido la mayor atención: la lectina Gal/GalNAc (Petri y cols.
1990a; Petri y cols, 1990b), a la cual ya nos referimos, y una adhesina de 112 kD (García. -
Rivera y cols., 1999)
La lectina Gal/GalNAc es una proteína de 260 kD, integrada por una subunidad ligera, de 35
kD, y una pesada, de 170 kD. En esta última subunidad. más exactamente en un dominio de la
misma rico en residuos de cisteína. reside su capacidad de unirse a residuos de galactosa y a
N-acetil galactosamina presentes en la membrana de las células con las que int eractúa (Petri y
cois, 1990b).
Además de su acción facilitadora de la adherencia, otros dos atributos funcionales de esta
lectina la hacen de los más potentes factores de virulencia de E. histolytica: 1) su necesaria
presencia para el eficiente desarrollo de la actividad citolítica dependiente de contacto de este
protozoo y 2) su participación en uno de los mecanismos de resistencia amebiana a la lisis
mediada por la activación del sistema del complemento, a lo que haremos referencia después.
Los trofozoítos de E. dispar también expresan una lectina Gal/GalNAc. A pesar del parecido
estructural de ésta con la de E. histolytica, varios estudios revelaron significativas diferencias
de epitopes entre ellas. Uno de éstos demostró que cuatro de seis epitopes presentes en la
lectina de E. histolytica, no se expresaban en la de E. dispar (Petri y cols, 1990a; Ackers, 2002).
La adhesina de 112 kD de E. histolytica está formada por dos polipéptidos (de 75 y 49 kD,
respectivamente) codificados por dos genes diferentes. La caracterización de estos genes y de
las moléculas recombinantes codificadas por ellos, demuestra que el polipéptido de 75 kD
posee un dominio que participa en la adherencia de los trofozoítos amebianos a células
epiteliales y a eritrocitos, mientras que el de 49 kD es una proteinasa cisteíno-dependiente
(García-Rivera y cois, 1999).
Experimentos con el empleo de microscopía confocal han demostrado la presencia de la
adhesina de 112 kD en la membrana plasmática y en los bordes de los canales fagocíticos d e
los trofozoítos de E. histolytica. Estos resultados sugieren que la molécula de 112 kD, además
de participar en los procesos de adhesión, interviene en la ingestión amebiana de células de l
hospedero (García-Rivera y cols, 1999).
24
5.2 Degradación de la matriz extracelular
Moléculas de E. histolytica con actividad proteolítica dependiente de cisteína parecen ser las
principales responsables de la degradación de la matriz extracelular ( Martínez- Palomo y
cois., 1994; MaCoy y cols., 1994; Mesa y cois., 1994; Reed, 1995; Que y Reed, 1997). El
papel de éstas como factor de virulencia está sustentado en su habilidad para degradar
componentes de la matriz extracelular como son colágeno, elastina y fibronectina (Keene y
cois., 1986; Luaces y Barrett, 1988; Que y Reed, 2000), en su capacidad para interferir con las
funciones del sistema inmune del hospedero (Reed y Gigli, 1990; Reed y cois., 1995; Que y
Reed, 2000), a lo cual haremos referencia después, y en el hecho de que E. histolytica, en
relación con E. dispar, libera mayor cantidad de este tipo de proteinasas (Reed y cois., 1989;
Que y Reed, 2000).
Como antes mencionamos, las proteinasas dependientes de cisteína de E. histolytica, todas
pertenecientes a la familia de la papaína, son codificadas por al menos siete genes,
denominados EhCPl-6 y EhCP112 (Que y Reed, 2000). Al menos cuatro secuencias
nucleotídicas homologas han sido identificadas en E. dispar (EdCPl-4) (Que y Reed, 2000).
Comparando los locus genómicos que contienen los genes para CP5 (cp5), fue demostrado que
la posición de cp5 está conservada dentro del contexto genómico de ambas especies, pero que
el gen está altamente degenerado en E. dispar, con numerosas inserciones y delecciones que
resultan en múltiples codones de parada en el fragmento de lectura de cp5. Sobre la base de
éste y otros estudios comparativos de secuencias nucleotídicas de E. histolytica y E. dispar, ha
sido sugerido que cp5 comenzó a degenerar en E. dispar cuando los dos organismos
comenzaron a divergir a partir de un ancestro común (Willhoeft y cols, 1999).
Las proteinasas resultantes de la expresión fenotípica de los genes para EhCPl -3 y EhCP5 han
podido ser obtenidas en el sobrenadante de cultivos in vitro de E. histolytica. Éstas son muy
activas en la degradación de proteínas de la matriz extracelular y, además, participan del
efecto citopático de esta especie sobre monocapas de fibroblastos, un modelo in vitro de
virulencia (Que y Reed, 2000). Como mencionáramos antes, ha sido demostrada la presenc ia
de la proteinasa EhCP112 (péptido de 49 kD en la adhesina de 112 kD de E. histolytica) en la
membrana plasmática y en los bordes de los canales fagocíticos de los trofozoítos de esta
especie (García-Rivera y cois, 1999).
La secuencia nucleotídica del gen EhCP3 tiene regiones con marcada homología con genes
que codifican cisteíno-proteinasas liberadas por macrófagos activados y células
25
tumorales invasivas. Estas similitudes estructurales y bioquímicas sugieren que la proteolisis
por cisteíno-proteinasas excretadas pudiera constituir un mecanismo de invasión hística
evolutivamente conservado (Que y Reed, 2000).
5.3.1 Amebaporos
E. histolytica posee una familia de pequeños péptidos, denominados amebaporos, que tienen la
capacidad de insertarse en la bicapa lipídica de la membrana de la célula blanco y formar
canales por los que difunden agua y otras moléculas, lo que produce la inmediata lisis de la
célula. Las tres isoformas de esta familia, amebaporos A, B y C, son producidas en una
relación de 35:10:1, están integradas por 77 aminoácidos y muestran entre sí una identidad en
el rango de 35 a 57 %. E. dispar produce un amebaporo cuya secuencia aminoacídica tiene 95
% de homología con el amebaporo A de E. histolytica. Sin embargo, el nivel de síntesis y la
actividad lítica de ese amebaporo son muy inferiores a los correspondientes al de la especie
patógena. Los amebaporos aislados de los gránulos citoplasmáticos de E. histolytica tienen una
significativa homología con otras proteínas con actividad lítica extracelular (por ejemplo,
proteínas presentes en los gránulos de células T y células asesinas naturales humanas)
(Leippe, 1997).
5.3.2 Fosfolipasa A
Una fosfolipasa A de E. histolytica participa en la lisis de leucocitos polimorfonucleares en las
áreas invadidas. Esta enzima, que es dependiente de la presencia de iones Ca 2+, al hidrolizar
los fosfolípidos de la membrana plasmática de los leucocitos con los que interactúa, genera
productos altamente tóxicos para los mismos. La actividad de la fosfolipasa A se incrementa
en presencia de amebaporos. Se ha especulado con que éstos hacen más acce sibles los
fosfolípidos de las membranas de las células dianas (Long-Krug y cols., 1985).
26
5.3.3 Otras moléculas con actividad citolítica
Otras moléculas de E. histolytica han sido implicadas en el proceso lítico y, por tanto, también
han sido consideradas factores de virulencia de esta especie. Entre las más recientemente
reportadas, se encuentra un grupo de hemolisinas que in vitro son citotóxicas a una línea de
células epiteliales de intestino (Caco-2) (Janssen y cols., 1994).
27
se aborda la inmunobiología de la infección amebiana, hemos ubicado allí una referencia más
detallada a estos mecanismos evasivos).
28
Formada la úlcera intestinal, a cuyas características histopatológicas nos referiremos más
adelante, la invasión amebiana puede evolucionar de las siguientes maneras (Pérez Tama yo R,
1989; Pérez Tamayo R y cols., 1994):
Cura espontánea o por tratamiento'. Con el tratamiento amebicida adecuado, y en ocasiones sin
él, las lesiones iniciales pueden curar sin dejar huellas.
Megacolon tóxico: Esta forma evolutiva, de muy mal pronóstico, es el resultado de la
confluencia de numerosas úlceras y de la necrosis de grandes áreas del intestino grueso.
Cuando ocurre, se producen múltiples perforaciones en la pared de este órgano, las que
conducen al desarrollo de una peritonitis purulenta.
Perforación intestinal'. Generalmente, los trofozoítos de E. histolytica llegan a la submucosa y
no atraviesan la muscular, pero, en ocasiones, pueden penetrar esta última capa, extenderse a
la serosa y aún perforarla. Esta complicación, que es más frecuente en las úlceras -situadas en
el ciego, es casi siempre de evolución fatal.
Ameboma: Este vocablo designa una forma evolutiva poco frecuente de la amebiasis invasiva,
macroscópicamente caracterizada por el desarrollo de una masa tumoral que tiende a obstruir
la luz intestinal y a simular un adenocarcinoma. Esta tumoración, que puede llega r a medir
hasta 30 cm en su eje mayor, suele ser única y de forma irregular. Como las úlceras, de las
cuales se origina, el ameboma se ubica, en orden decreciente de frecuencia, en ciego, colon
sigmoide y recto. En términos microscópicos, la principal cara cterística de esta lesión es la
presencia de tejido de granulación, con linfocitos y células gigantes, y la ausencia de
trofozoitos en el interior de la misma. El ameboma puede coexistir con úlceras en las que sí es
posible el hallazgo de trofozoítos. Diseminación hematógena al hígado y de éste a otras
localizaciones: A pesar de que con cierta frecuencia se han observado trofozoítos en vasos
linfáticos de la pared intestinal, éstos raras veces son encontrados en los ganglios linfáticos
mesentéricos. De aquí que exista acuerdo en que la principal vía de diseminación
extraintestinal de la infección amebiana sea la hematógena. Desde la submucosa intestinal, y
después de digerir la pared de pequeñas vénulas mesentéricas, los trofozoitos llegan al hígado
en la circulación portal. En este órgano forman uno o más abscesos, la mayoría de las veces
en su lóbulo derecho. El absceso hepático es la más frecuente de las lesiones extraintestinales
de la amebiasis invasiva. Desde él puede haber diseminación a sitios extrahe páticos, por
ruptura (a peritoneo, estómago, duodeno, vías biliares, colon, pleura, pulmón, pericardio y
mediastino), por continuidad (a pared abdominal y piel) y por vía
29
hematógena (a cerebro). La migración sanguínea de trofozoítos desde la submucosa in testinal
a localizaciones extrahepáticas, sin afectación del hígado, es muy rara. Extensión directa a la
piel: Esta evolución, poco frecuente, se observa en pacientes con disentería y, sobre todo, en
hombres homosexuales. Úlceras en las regiones perianal y perineal, de bordes irregulares,
tamaño variable y muy dolorosas, constituyen su expresión clínica más característica.
30
7. Inmunobiología de la infección amebiana
Determinados factores del hospedero, al incidir directa o indirectamente sobre sus
mecanismos defensivos, pueden hacer variar su susceptibilidad al desarrollo de amebiasis en
cualesquiera de sus formas clínicas (Kretschmer, 1989; Kretschmer y López-Osuna, 1994;
Kretschmer y López-Osuna, 1999). Los citados con más
frecuencia, son los siguientes:
Edad\ La disentería amebiana es más frecuente en personas menores de quince años, con una
relación de 2:1. Esto se correlaciona con los resultados de estudios en ratones, en los cuales se
ha demostrado una mayor susceptibilidad a la infección por E. histolytica en los animales
jóvenes. A la inversa, el absceso hepático amebiano es más frecuente en indivi duos mayores
de quince años, con una relación de 2:1.
Sexo: El absceso hepático amebiano es más frecuente en hombres que en mujeres, con una
relación de 2:1.
Raza. En el continente africano, las personas de raza negra se infectan por E. histolytica con
una frecuencia mayor que los individuos de raza blanca.
Estado nutricional: La desnutrición contribuye a incrementar la mortalidad en personas
infectadas por E. histolytica, especialmente en niños.
Dieta. En modelos animales, dietas ricas en carbohidratos y pobres en proteínas favorecen la
colonización del epitelio intestinal por E. histolytica.
Embarazo'. Un estudio realizado en Nigeria hace alusión al embarazo como un factor de riesgo
en mujeres que padecían de colitis amebiana.
Infecciones bacterianas intercurrentes: A pesar de que experiencias más recientes hacen pensar
que la coinfección bacteriana no es un requerimiento absoluto para el desarrollo de una
amebiasis invasiva, parece existir acuerdo en que las bacterias contribuyen a la invasividad
amebiana al promover indirectamente la adherencia de este protozoo al epitelio intestinal,
entre otras acciones.
Tratamientos Esteroideos'. Existen reportes de complicaciones severas en pacientes de
amebiasis que han recibido tratamiento con drogas corticoesteroides.
31
7.1.1 Funciones defensivas del mucus intestinal
El mucus intestinal es una compleja mezcla de glicoproteínas, péptidos, lípidos, electrolitos,
moléculas séricas (por ejemplo, IgA), miembros de la flora bacteriana y restos celulares. Su
principal componente, las mucinas (glicoproteínas de estructura química no bien definida),
son producidas por las células caliciformes del epitelio intestinal (Tse y Chadee, 1991).
En el caso de la infección por E. histolytica, el mucus intestinal realiza funciones defensivas
por, al menos, dos mecanismos: 1) atenuación de las funciones motrices de los trofozoítos, a
consecuencia de su viscosidad y 2) unión de parte de las glicoproteínas que lo componen, por
intermedio de sus residuos oligosacarídicos, a la lectina Gal/GalNAc. Esto tiene dos
consecuencias: el impedimento de la adherencia de los trofozoítos al epitelio y su
atrapamiento en el interior del mucus, con su posterior eliminación peristáltica (Tse y Chadee,
1991).
32
produce la lisis del trofozoíto.
Como barrera defensiva contra E. dispar, la activación de la vía alternativa del complemento
es altamente eficiente. De hecho, éste es uno de los mecanismos que impide la invasión
hística por esta especie (Reed, 1995). Sin embargo, E. histolytica ha desarrollado la capacidad
de evadir los efectos biológicos que se derivan de la acción de los dos fragmentos antes
mencionados (vea más adelante acápite “Mecanismos de evasión de E. histolytica”).
33
cinco años siguientes (Caballero-Salcedo A y cols., 1994).
Sobre los mecanismos que median el desarrollo de inmunidad antiamebiana existe menor
claridad aún. Al respecto, haremos referencia a las respuestas mejor caracterizadas.
34
Por otro lado, ha sido demostrado in vitro que en presencia de anticuerpos séricos
antiamebianos, los trofozoítos de E. histolytica disminuyen su ritmo de crecimiento, pierden
movilidad y eritrofagocitan a menor velocidad (Kretschmer y López-Osuna, 1999).
Estudios in vitro han demostrado que anticuerpos IgA secretorios antiamebianos pueden
bloquear la adherencia de trofozoítos de E. histolytica a células de líneas de cultivo (Carrero y
cois., 1994). Estos resultados han sugerido que dichos anticuerpos podrían desempeñar un
papel protector in vivo, al impedir la colonización del epitelio intestinal. Sin embargo, al
reflexionar sobre la definitiva función protectora de los anticuerpos IgA secretorios anti -f.
histolytica, se debe tener en cuenta la ausencia de evidencias en favor de que la amebiasis
intestinal es más frecuente o más severa en individuos con déficit de IgA (Kretschmer y
López-Osuna, 1999).
35
7.3 Mecanismos de evasión de E. histolytica
La relativa ineficiencia de los mecanismos defensivos del hospedero contra la infección por E.
histolytica, que es más manifiesta en las primeras fases de ésta, ha conducido a la
consideración de que este protozoo desarrolla mecanismos evasivos de las respuesta s
inmunitarias. De ellos, y sin que en todos los casos exista aún información concluyente, los
mejor caracterizados son los siguientes:
36
derivados proteicos purificados y candidina). Las evidencias experimentales hoy disponibles
hacen pensar que la hiporrespuesta es consecuencia de efectos moduladores de los trofozoítos,
o sus productos, sobre las funciones defensivas de macrófagos y células T (Betz y Fox, 1991;
Wang y Chadee, 1992; Wang y Chadee, 1995; Talamas- Rohana, 1995; Campbel y Chadee,
1997; Kretschmer y López-Osuna, 1999).
7.3.5 Evasión de los efectos derivados de la activación del sistema del complemento
Tanto E. dispar como E. histolytica activan la vía alternativa del complemento. In vitro, además,
ha sido demostrado que anticuerpos anti~£. histolytica activan la vía clásica de este sistema.
Sin embargo, E. histolytica evade los efectos que se derivan de la acción de los fragmentos
C3a, C3b y C5a resultantes de la activación del complemento.
Veamos:
37
media la inhibición de la formación del CAM. Ello está basado en el parecido estructural de la
lectina, demostrada mediante análisis secuencial y el uso de anticuerpos monoclonales, con la
molécula CD 59, un inhibidor del CAM en células sanguíneas humanas.
. La resistencia de E. histolytica a la lisis mediada por el complemento es una propiedad
adquirida en su interacción con el hospedero. Este planteamiento encuentra soporte en dos
hallazgos: 1) el más alto ritmo de eritrofagocitosis de las cepas más virulentas, resulta en una
más amplia incorporación de moléculas regulatorias (por ejemplo, CD 59) a su superficie y 2)
cepas de E. histolytica susceptibles a la acción del complemento, se hacen resistentes a este
mecanismo lítico cuando son incubadas con una fuente de proteínas reguladoras, por ejemplo,
suero humano.
38
desarrolle. De manera general, puede ser tan breve como de dos a cinco días, o tan
prolongado como de un año.
La mayoría de los autores coinciden en que las formas de presentación de la amebiasis
intestinal sintomática son dos: 1) colitis amebiana disentérica y 2) colitis amebiana no
disentérica. Estas formas clínicas pueden dar lugar a complicaciones de mayor gravedad, a las
que nos referiremos posteriormente.
39
preescolar y con frecuencias parecidas en hembras y varones. Estudios de autopsias han
demostrado la localización hepática de la amebiasis invasiva hasta en 30 % de los
pacientes de colitis amebiana. Por otro lado, el absceso hepático amebiano puede ocurrir
sin historia reciente de infección intestinal y en ausencia del parásito en las heces del
paciente.
No existe acuerdo en la literatura médica en cuanto al modo de inicio de los síntomas. En
general, los autores que viven en países donde el absceso hepático amebiano no es frecuente,
aluden a dos formas de presentación de éste: aguda, con la aparición de los síntomas y signos
más característicos de la entidad en los primeros diez días, y subaguda, caracterizada por un
comienzo más lento, en la que los componentes principales del cuadro pueden tardar semanas
y meses para hacerse presentes de conjunto.
Presentación aguda
El dolor, de aparición brusca e intensidad variable, y la fiebre son síntomas siempre presentes
en esta forma de debut del absceso amebiano del hígado. Otras características semiológicas
del dolor dependerán del número (regularmente uno), tamaño y ubicación de los abscesos. La
fiebre, que suele acompañarse de escalofríos, alcanza cifras entre 38 y 40 °C,
fundamentalmente durante la tarde y la noche.
Los pacientes de absceso hepático pueden presentar tos seca, particularmente cuando este se
ubica en el lóbulo derecho. Otros síntomas, no siempre presentes, contribuyen a completar el
cuadro. Estos son: anorexia, náuseas, vómitos y diarreas.
Mención aparte merecen las diarreas. Las deposiciones líquidas, que pueden ser de tipo
disentérico, están presentes en aproximadamente 90 y 30 % de los niños y adultos,
respectivamente, que padecen de un absceso hepático amebiano. En la mayoría de los casos no
se logra demostrar la posible causa amebiana de las mismas.
Presentación subaguda
La forma de presentación subaguda del absceso hepático, considerada menos frecuente, se
caracteriza por una incorporación gradual, en semanas o meses, de los síntomas y signos que
conformarán el cuadro florido de la enfermedad. Al comienzo, cuatro son las manifestaciones
clínicas más comunes: pérdida de peso, hepatomegalia, anemia y fiebre (rara vez sobrepasa los
38 °C y, como en el caso de la forma aguda, suele presentarse fundamentalmente durante la
tarde y la noche).
40
Complicaciones del absceso hepático amebiano
Sin el tratamiento adecuado y oportuno, la evolución de los pacientes de absceso hepático es
generalmente desfavorable, pues suelen progresar hacia complicaciones graves, como la
diseminación extrahepática, la más frecuente, la sobreinfección bacteriana del absce so y la
insuficiencia hepática. Sin embargo, es válido señalar que la fistulización del absceso hacia
los bronquios, el tracto gastrointestinal y la piel, al permitir la evacuación de su contenido,
suele producir una mejoría del paciente y, en ocasiones, la cura espontánea del mismo.
9. Diagnóstico de la Amebiasis
Nos referiremos primero a los Procedimientos Diagnósticos que, partiendo de una sospecha
clínica, son empleados en el diagnóstico de esta parasitosis, y después al Diagnóstico de las
Formas Clínicas de Amebiasis, cuando hagamos alusión al conjunto de hallazgos clínicos y
complementarios que permiten el diagnóstico de las formas clínicas de esta entidad.
41
Procedimientos microscópicos para la identificación amebiana en heces
Los procedimientos microscópicos que se deben emplear para la identificac ión de amebas en
heces son de dos categorías: preparaciones húmedas y técnicas suplementarias. Veamos:
Preparaciones húmedas
Las preparaciones húmedas permiten el examen directo de la materia fecal y, por su facilidad
y bajo costo de ejecución, pueden ser empleadas en los laboratorios del nivel primario de
salud. Entre éstas, las más utilizadas son las realizadas con solución salina fisiológica, con
solución de azul de metileno amortiguado y con solución yodada.
42
Técnicas suplementarias
Las técnicas suplementarias son de dos tipos: las técnicas de concentración y las técnicas de
tinción permanente. Éstas, en general, son de complejidad y costos de ejecución mayores
que los exámenes con preparaciones húmedas y se emplean cuando, después de realizado
uno o más de aquellos:
. No se encuentran amebas en las heces del paciente y existen sospechas clínicas de su
presencia en el sistema digestivo de éste. En este caso, se utilizarían las técnicas de
concentración. De éstas, las más empleadas son las técnicas de concentración con formo l
acetato etílico y formol éter (método de Ritchie) y la que se realiza mediante flotación con
sulfato de zinc (método de Faust).
. No son suficientes los criterios morfológicos de que se dispone para establecer la identidad
de las estructuras encontradas. En estas circunstancias, se haría uso de las técnicas de tinción
permanente. De éstas, las más empleadas son la técnica de tinción con hematoxilina férrica y
la técnica de tinción tricrómica para protozoos. Estas técnicas permiten, además, la
conservación de las preparaciones para su observación posterior con fines múltiples.
43
. La insuficiencia del examen microscópico para diferenciar entre quistes de E. histolytica y de
E. dispar, a cuyas implicaciones nos referimos más adelante, es otra fuente de sobrediagnóstico
de amebiasis intestinal (WHO/PAHO/UNESCO, 1997).
44
emplear preparaciones húmedas y tinciones permanentes que faciliten la identificación de
trofozoítos. Con ese fin, excepto en la preparación húmeda con solución yodada, se suelen
utilizar las preparaciones húmedas y las tinciones permanentes antes descritas.
45
E. histolytica e infección por E. dispar, han conducido al desarrollo de procedimientos que
permitan la detección de componentes de la especie presente.
46
de la década de 1980, cuando aún la discusión taxonómica transcurría en términos de cepas
patógenas y no patógenas de E. histolytica (Garfinkel y cols., 1989; Samuelson y cols., 1989;
Tannich y cois., 1989; Agarwal y cols., 1998). La falta de certeza acerca de su sensibilidad, le
ha restado seguidores a este acercamiento durante los últimos años (Ackers, 2002).
2. La amplificación, mediante el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), de
fragmentos nucleotídicos de una o ambas especies amebianas. Genéricamente, utilizando
trofozoítos obtenidos de cultivo in vitro, la detección y diferenciación amebiana por
procedimientos de RCP parece ser más sensible que la realizada mediante ensayos de
búsqueda de antígenos (Mirelman y cois., 1997). Las secuencias nucleotídicas más utilizadas
para la detección y diferenciación amebiana por procedimientos de RCP en muestras de heces
están situadas en el ADN circular extracromosomal de ambas especies (Troll y cois., 1997;
Ackers, 2002). La detección de E. histolytica por procedimiento de RCP en muestras de pus de
absceso hepático parece ser más sensible y específica con el empleo de cebadores basados en
la secuencia nucleotídica del gen que codifica para la proteína de 30 kDa de esta especie
(Zengzhu y cois., 1999).
9.1.2 Procedimientos indirectos Detección de
anticuerpos anti-f. histolytica
Como en el caso de otras parasitosis, la detección sérica de anticuerpos contra el
microorganismo supuestamente implicado en el proceso infeccioso, fue el primer abordaje
inmunológico empleado para el diagnóstico de la amebiasis (Bruckner, 1992; Reed, 1 992;
Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Pérez-Montfort y Kretschmer, 1994; Ravdin, 1995;
Ackers, 2002). Posteriormente, dando continuidad a este paralelismo, la búsqueda de
anticuerpos anti-Zi. histolytica se extendió a la saliva y a las heces (Urdaneta y cois., 1996).
47
Anticuerpos séricos antiamebianos pueden ser encontrados en más de 85 % de los pacientes de
alguna forma de amebiasis invasiva y, con mucha menor probabilidad, en individuos con la
infección asintomática (Reed, 1992). En los casos en que se produce la invasión amebiana,
estos anticuerpos son detectados después de transcurridos siete a diez días del comienzo de los
síntomas (Pérez-Montfort y Kretschmer, 1994). Este hecho tiene dos implicaciones
importantes:
. La ausencia de anticuerpos antiamebianos durante los primeros diez días de evolución de los
síntomas, no debe descartar el diagnóstico de amebiasis invasiva. Transcurrido ese período,
debe realizarse una segunda prueba.
. La ausencia de anticuerpos después de diez días de evolución de los síntomas, aunque
tampoco lo descarta, es una evidencia en contra del diagnóstico de amebiasis invasiva.
Después de la invasión amebiana, los anticuerpos séricos anti-£. histolytica pueden persistir
durante años (Reed, 1992; Pérez-Montfort y Kretschmer, 1994; Ackers, 2002. Este hecho
parece estar relacionado con la retención de antígenos amebianos en el sistema
reticuloendotelial del hospedero. La extensión temporal de la presencia sérica de anticuerpos
antiamebianos tiene dos aristas significativas:
. Por un lado, ha permitido la realización de estudios seroepidemiológicos en áreas endémicas
de amebiasis, donde entre 6 y 20 % de la población sana resulta positiva a los ensayos
serológicos correspondientes.
. Por el otro, ha limitado la utilidad de los procedimientos serológicos para detectar un
episodio invasivo actual; sobre todo en áreas endémicas, donde, ante el hallazgo de
anticuerpos antiamebianos, siempre existe la posibilidad de que los mismos sean consecuencia
de una infección pasada.
Para la detección sérica de anticuerpos antiamebianos se ha utilizado la casi totalidad de los
procedimientos serológicos conocidos. De ellos, los más empleados han sido la doble
inmunodifusión, la contrainmunoelectroforesis, la hemaglutinación e inmunofluorescenci a
indirectas y los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA). Hasta muy reciente, estos métodos
utilizaban casi exclusivamente extractos antigénicos provenientes de cultivo in vitro de E.
histolytica.
Una aproximación al aumento del valor diagnóstico de las prueba s serológicas ha sido la
identificación de antígenos amebianos que puedan estar asociados a respuestas de más corta
duración. En ese sentido, las mejor estudiadas son las que se producen a la subunidad de 170
kDa de la lectina Gal/GalNAc y a la proteína rica en serina de E. histolytica (PRSEH). Tres
estudios retrospectivos utilizando procedimientos
48
desarrollados para la detección de anticuerpos séricos a las formas recombinantes de estos
antígenos, demostraron que los valores predictivos positivos de estas pruebas para el
diagnóstico de formas agudas de amebiasis invasiva eran mejores que el del método
convencional empleado (Lotter y cols., 1995; Stanley y cois., 1998; Haque y cois., 1999). Con
la misma intención, la detección de anticuerpos IgM a la subunidad de 170 kDa de la lectina
Gal/GalNAc tuvo mejores resultados (Abb-Alla y cols, 1998).
Estudios endoscópicos
Determinadas circunstancias del diagnóstico de la amebiasis intestinal sintomática hacen
necesaria la realización de estudios endoscópicos de colon y recto (Sepulveda, 1989; Reed,
1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Ravdin, 1995). Éstos permiten:
. La toma de muestras de heces en la luz intestinal. En éstas, comparadas con las obtenidas
por defecación, se observan con más frecuencia trofozoítos móviles y eritofagocíticos.
. La observación de la mucosa de ese órgano en busca de lesiones características de la
invasión amebiana y la toma de tejido de las mismas, mediante raspado o biopsia, para
posterior análisis anatomopatológico.
Estudios imagenológicos
Los estudios imagenológicos hoy disponibles son poco útiles para diagnóstico de amebiasis
intestinal. Esto obedece a que las anomalías que podrían ser detectadas por estos exámenes,
en general, no son exclusivas de las formas intestinales de esta parasitos is. La radiografía de
colon contrastada con bario, en los casos de amebomas, es la que mayor información ofrece.
49
Sin embargo, el desarrollo de los exámenes imagenológicos ha incrementado en alto grado la
capacidad de los médicos asistenciales para diagnosticar algunas de las formas
extraintestinales de la amebiasis (Sepulveda, 1989; Bruckner, 1992; Reed, 1992; Muñoz,
1994; Treviño-García, 1994; Ravdin, 1995). De éstos, la ultrasonografía, por su eficacia
diagnóstica superior al 90 %, no invasividad, rapidez de ejecución y accesibilidad, y la
tomografía axial computarizada, por su eficacia diagnóstica superior al 95 % y su precisión
en la detección y localización de lesiones muy pequeñas, son las más utilizadas en el
diagnóstico del absceso hepático amebiano.
50
el hallazgo de trofozoítos no hematófagos y de quistes con las características microscópicas
de E. histolytica no confirma dicho diagnóstico. La observación de estas estructuras sólo
permite suponer la presencia de una o ambas especies del complejo E. histolytica E. dispar. En
estos casos, se debe emplear alguno de los procedimientos que permiten la identificación
precisa de la especie presente. Si no se dispone de una de estas pruebas, se deben tener en
cuenta otros exámenes complementarios y elementos epidemiológicos (Diamond, 1993;
WHO/PAHO/UNESCO, 1997).
Cuando las características del paciente hacen pensar en una de las formas de amebiasis
intestinal y el estudio de muestras fecales no ha permitido arribar a un diagnóstico definitivo,
la realización de estudios endoscópicos de colon y recto puede aporta r, como comentáramos
anteriormente, nuevos elementos.
El cultivo in vitro de E. histolytica a partir de muestras fecales, puede ser empleado en el
estudio de un paciente en el que se sospeche una forma de amebiasis intestinal. Sin embargo,
los inconvenientes de esta prueba, de manera particular el hecho de que sus resultados tardan
cuatro o más días, le restan utilidad diagnóstica.
La presencia de anticuerpos antiamebianos en suero, en saliva o en heces sólo es indicativa de
infección actual o pasada por E. histolytica. Sin embargo, la detección de éstos, sobre todo en
individuos que no viven en áreas endémicas de amebiasis, es una herramienta de mucha
utilidad para el diagnóstico de las formas invasivas de esta parasitosis.
Excepto la radiografía de colon contrastada con bario, de utilidad en los casos de amebomas,
los estudios imagenológicos son poco empleados en el diagnóstico de la amebiasis intestinal.
Cuando se sospecha un cuadro de amebiasis intestinal sintomática, y la realización de uno o
más procedimientos complementarios no ha permitido demostrar la infección por E. histolytica,
o cuando dichos exámenes no están disponibles, algunos elementos epidemiológicos pueden
ser de utilidad diagnóstica. En ese sentido, una historia de contacto est recho del paciente-
problema con un caso de amebiasis invasiva o la estadía de éste en un área geográfica
endémica o en una institución cerrada donde existan evidencias del desarrollo de una
epidemia de amebiasis, son datos de mucho interés.
Diagnóstico diferencial
Lesiones de colon y recto de muy variada naturaleza pueden manifestarse por un síndrome
disentérico y, en consecuencia, deben ser tenidas en cuenta cuando se estudia
51
un posible caso de colitis disentérica de causa amebiana (Sepùlveda, 1989; Bruckner, 1992;
Reed, 1992; Muñoz, 1994; Treviño-García, 1994; Ravdin, 1995).
La colitis amebiana debe ser diferenciada de las colitis bacterianas causadas por Shiguella,
Salmonella, Campilobacter, Vibrio, Escherichia coli enteroinvasiva y Yersinia enterocolitica. En
general, la diferenciación se debe realizar mediante la indicación de coprocultivos bacterianos
y de los exámenes complementarios que permiten el diagnóstico positivo de amebiasis
intestinal.
Por su frecuencia, sobre todo en países en desarrollo, la disentería bacilar o shiguelosis
merece mención aparte. Esta colitis bacteriana cursa casi siempre con fiebre, es de aparición
brusca y, en relación con la colitis amebiana, lleva más rápidamente a la deshidratación. La
simple observación microscópica de muestras fecales aporta un importante detalle
diferenciante: la presencia de numerosos leucocitos, en los casos de shiguelosis, y la relativa
ausencia de éstos, en las heces de los individuos infectados por E. histolytica. La
diferenciación se completará con la indicación de los exámenes mencionados en el párrafo
anterior.
En raras ocasiones es necesario hacer diagnóstico diferencial entre amebiasis y
linfogranuloma venéreo. En tales casos, al diagnóstico de la enfermedad producida por
Clamydia trachomatis se llega mediante la constatación de adenopatías inguinales, la presencia
de pruebas serológicas positivas, el aislamiento del germen y estudios histopatológicos.
Otro grupo de enfermedades infecciosas que se deben diferenciar de la disentería amebiana
son las parasitarias. Al menos tres de éstas pueden causar síndrome disentérico:
tricocefaliasis, balantidiasis y esquistosomiasis. En estos casos, los exámenes
coproparasitológicos resuelven regularmente el problema diagnóstico.
Entre las enfermedades no infecciosas que cursan con colitis y diarreas, se debe hacer
diferenciación con la colitis ulcerativa idiopàtica, los adenocarcinomas de colon sigmoides y
recto, y la polipolisis colorectal, entre otras. En estos casos, los exámenes endoscópicos, con
toma de muestras para estudios histopatológicos de las lesiones, permiten llegar al diagnóstico
sin muchas dificultades.
Los amebomas deben ser diferenciados de otras enfermedades de colon y recto, como
adenocarcinomas de esos segmentos intestinales, granulomas tuberculosos y linfogranulomas
venéreos. La realización de una radiografía de colon contrastada con bario puede demostrar la
lesión principal y la coexistencia de úlceras en las proximidades de la misma. El examen
endoscópico correspondiente, con toma de
52
muestras para estudios parasitológicos e histopatológicos de las lesiones, permite llegar al
diagnóstico definitivo.
Por las manifestaciones clínicas que le son comunes, la apendicitis amebiana debe ser
diferenciada de la de causa bacteriana. El hallazgo de trofozoítos hematófagos en las heces de
estos pacientes, puede establecer el diagnóstico etiológico de la apendicitis.
53
Treviño-García, 1994). Por este motivo, con la excepción mencionada, la conducta
diagnóstica ante posibles casos de amebiasis en dichas localizaciones debe incluir la
detección de un absceso hepático de base.
54
amebas en la luz intestinal intestinal. Estos fármacos difunden ampliamente en los tejidos y
algunos, como el omidazol y el secnidazol, permanecen en ellos por mayor tiempo. Todos se
eliminan por la orina y, en menor medida, por otros fluidos, como la saliva y la leche materna
(Guamer, 1994).
Los medicamentos nitroimidazólicos producen efectos colaterales frecuentes y, en general, no
graves. Éstos son fundamentalmente manifestaciones del aparato digestivo, como sabor
metálico, náuseas, vómitos, dolor epigástrico y anorexia (Ravdin, 1995). Durante la
administración de estos compuestos se debe proscribir el consumo de bebida s alcohólicas.
Ello es así porque estas drogas inhiben enzimas implicadas en el metabolismo de los
alcoholes, lo que puede tener una acción potencializadora sobre los efectos de éstos (Ravdin,
1995).
Aunque las drogas nitroimidazólicas no parecen ser teratogénicas (Beard y cols., 1979), no
existen criterios definitivos acerca de sus posibles efectos sobre el desarrollo fetal. Por este
motivo, y teniendo en cuenta que estos compuestos atraviesan la barrera placentaria y
alcanzan con rapidez la circulación fetal, se recomienda que no se empleen durante el primer
trimestre del embarazo (Ravdin, 1995). Por otro lado, y como consecuencia de su eliminación
en la leche materna, tampoco se deben administrar a madres que se encuentren lactando.
De los derivados 5 nitroimidazólicos, el metronidazol es el más utilizado con fines
antiamebianos. Esto es así, ante todo, porque es al que más fehacientemente se le han
demostrado sus actividades amebicidas (Powell y cois., 1966). Sin embargo, otros
introducidos con posterioridad, como el tinidazol, el secnidazol y el omidazol, tienen lina vida
plasmática más prolongada, lo que hace posible su empleo en esquemas de menor duración e,
incluso, en dosis únicas. La administración de éstos, además, da lugar con menor frecuencia a
reacciones colaterales (Ravdin, 1995).
El metronidazol se administra en todas las formas de amebiasis invasiva, de preferencia por
vía oral, en dosis de 250 mg, tres veces al día, durante siete a diez días. En niños, se debe
emplear a razón de 30 mg/kg/día, repartidos en tres dosis, también durante siete a diez días.
La administración endovenosa es muy efectiva en el tratamiento de las formas más graves,
como la colitis fulminante, amebomas y abscesos hepáticos múltiples. En estos pacientes, la
dosis recomendada es de 500 mg cada seis horas, durante cinco a diez días (Ravdin, 1995).
55
10.1.1 Drogas antiamebianas en perspectivas
En el tratamiento de muchas enfermedades infecciosas, el ensayo de nuevas drogas obedece
en primer lugar al desarrollo de resistencia a los fármacos en uso. No ocurre así en el caso de
la amebiasis. A pesar de ello, no pocos laboratorios trabajan en la obtención de nuevos
medicamentos antiamebianos (Sohni y cols., 1995; Khaw y Panosian, 1995; Di Staci. 1995;
Ghoshal y cols, 1996). Se busca disponer de drogas que, siendo tan o más eficientes que las
actuales, su uso dé lugar a menos reacciones colaterales y sean aplicables en dosis única. En
los últimos años, se han introducido nuevos fármacos, los cuales aún no han sido evaluado s
suficientemente (Bhopale y cols., 1995). Entre éstos, algunos derivados oxadiazoles;
moléculas nuevas como la nitazoxanida; y antibióticos del grupo de los macrólidos, como la
azitromicina.
56
de la relación hospedero-parásito que se establezca, pueden evolucionar hacia el desarrollo de
una de las formas de amebiasis sintomática. Por estos motivos, aplicar tratamientos
antiamebianos en estos casos es una conducta bastante generalizada. Este modo de proceder,
si se tiene la certeza de que se trata de casos de infección por E. histolytica, no es incorrecto.
Sin embargo, en la mayoría de las ocasiones se indican tratamientos antiamebianos por el
simple hallazgo de quistes, supuestamente de E. histolytica, al examen microscópico de heces.
Esta práctica conduce, cuando menos, al uso indiscriminado e injustificado de drogas
antiamebianas.
En enero de 1997, un Grupo de Expertos en Amebiasis de la OMS evaluó las implicaciones
que para la práctica médica tiene la existencia de las dos especies (WHO/PAHO/UNESCO,
1997). El texto de algunas de las recomendaciones emitidas al término de aquella reunión lo
adecuamos a continuación a las características de este documento:
1. E. histolytica, o sus componentes, debe ser identificada específicamente para el diagnóstico
de certeza de amebiasis intestinal asintomática. Si el diagnóstico se realiza, el individuo
infectado debe ser tratado.
2. Si solamente se identifica a E. dispar en las heces de un individuo asintomático, no se trata
de un caso de amebiasis y, por tanto, el tratamiento antiamebiano es innecesario.
3. Cuando se ha detectado la infección por el complejo E. histolytica/E. dispar en individuos
asintomáticos, y no existe la posibilidad de identificar específicamente a E. histolytica, no
se debe asumir a priori que esta última es la especie presente. En tales casos, el
tratamiento sólo estaría indicado si existieran razones para sospechar la infección por E.
histolytica (una historia de contacto estrecho con un caso de amebiasis invasiva, la estadía
de la persona en cuestión en un área geográfica o en una institución cerrada donde existan
evidencias del desarrollo de una epidemia de amebiasis).
4. Sólo se deben emplear amebicidas de acción luminal en el tratamiento de la amebiasis
intestinal asintomática
Las drogas recomendadas para el tratamiento de la amebiasis intestinal asintomática son el
furoato de diloxanida y, en menor medida, la quinfamida y la paramomicina. El primero se
emplea por vía oral en dosis de 500 mg, tres veces al día, durante diez días. En niños se
recomiendan 20 mg/kg/día, repartidos en tres dosis, también durante diez días.
57
10.3.2 Tratamiento de la amebiasis intestinal sintomática
A continuación citamos, adecuadas a las características de este documento, las
recomendaciones del informe de la reunión de expertos en amebiasis de la OMS para el
tratamiento de las formas habituales de amebiasis intestinal sintomática:
1. Para el diagnóstico de certeza de amebiasis intestinal sintomática, E. histolytica, o sus
componentes, debe ser identificada específicamente. Si el diagnóstico se realiza, el
paciente debe recibir el tratamiento correspondiente.
2. Si en las heces de un individuo sintomático se identifica a E. dispar, no se trata de un caso
de amebiasis y, por tanto, todo tratamiento antiamebiano es innecesario. En este
individuo, dado que existen síntomas, se debe buscar la causa de los mismos.
3. En personas sintomáticas, cuando se ha detectado la infección por el complejo E.
histolytical E. dispar y no existe la posibilidad de identificar a E. histolytica, no se debe
asumir a priori que esta última especie es el agente etiológico de los síntomas. En tales
casos, se indicaría tratamiento antiamebiano si existieran razonbs para sospechar que E.
histolytica es la especie presente (títulos altos de anticuerpos antiamebianos, una historia
de contacto estrecho con un caso de amebiasis invasiva o la estadía de la persona en
cuestión en un área geográfica o en una institución cerrada donde existan evidencias del
desarrollo de una epidemia de amebiasis).
4. En el tratamiento de la amebiasis intestinal sintomática se deben emplear uno o más
amebicidas de acción hística (el metronidazol, el más utilizado), con la intención de
combatir los trofozoítos que ya han invadido los tejidos, y, a continuación, un amebicida
de acción luminal (el furoato de diloxanida, el más empleado) con el objetivo de actuar
sobre los trofozoítos remanentes en la luz del intestino.
En algunos casos, el tratamiento de un cuadro de amebiasis disentérica pudiera incluir la
adopción de medidas para el mejoramiento del estado general del paciente, entre ellas, la
rehidratación del mismo.
58
La realización, en el caso de los exámenes coprológicos, de un número diferente de ensayos
por individuos incluidos en el pesquisaje. Ello, a su vez, tiene dos posibles consecuencias
adversas: 1) el riesgo de subdiagnóstico en aquellos estudios que emplean un solo ensayo por
persona, y 2) la posibilidad de incrementar el sobrediagnóstico de amebiasis asociado al
examen microscópico de heces cuando se realizan pruebas seriadas.
. La imposibilidad, para la mayoría de los laboratorios, de disponer de las tecnologías
necesarias para distinguir entre E. histolytica y E. dispar. Dado que los reportes más recientes
indican que, de manera general, la infección por E. dispar es diez veces más frecuente, todos
los estudios de prevalencia de infección por E. histolytica basados en la observación
microscópica de heces realizados con anterioridad deben ser reconsiderados, a fin de evitar
una sobredimensión del problema.
Estas limitaciones en muchos de los estudios epidemiológicos sobre amebiasis realizados
hasta el presente, que en el menos desfavorable de los casos introducen inexactitudes en sus
resultados de los mismos, deben ser tenidas en cuenta por el lector al transitar por algunos
aspectos contenidos en los acápites que siguen.
59
Las epidemias de amebiasis son extremadamente raras y, en la mayoría de las ocasiones,
pasan inadvertidas debido a sus índices relativamente bajos de morbilidad y a la variabilidad
del período de incubación de esta infección. La casi totalidad de las epidemias de amebiasis
han tenido lugar en comunidades cerradas, en las que hábitos higiénicos inadecuados de sus
miembros facilitan la transmisión de la infección de persona a persona (Gutiérrez y Muñoz,
1994).
11.2.1 Portadores
Los portadores, en sentido estricto, son individuos sin síntomas ni signos de enfermedad
amebiana, que eliminan quistes de E. histolytica en las heces. La correcta detección de los
mismos, que en la actualidad no está al alcance de la mayoría de los laboratorios, tiene una
doble importancia epidemiológica: 1) puede ser un indicador de la magnitud de la infección en
una población determinada, y 2) dado que los quistes son la forma infectante, permite la
identificación de los individuos que estarían transmitiendo la infección en dicha población.
11.2.2 Seroepidemiología
La respuesta de anticuerpos a E. histolytica es intensa y prolongada en individuos con alguna
forma de amebiasis invasiva y es menor, o está ausente, en personas con infecciones
asintomáticas. Por este motivo, se considera que los estudios serológicos son mejores
indicadores de amebiasis invasiva que de infección amebiana.
Si bien la presencia de anticuerpos antiamebianos es la huella de una infección y no ésta
propiamente, la detección sérica de los mismos se ha utilizado para estimar indirectamente la
prevalencia de esta parasitosis (Caballero-Salcedo y cols., 1994). Los resultados de cada una
de las encuestas seroepidemiológicas realizadas, pocas veces son factibles de ser comparadas
con los de las demás. Ello es consecuencia de la utilización de inmunoensayos diferentes y de
diseños muéstrales muchas veces inadecuados. En general, los resultados fluctúan entre el 6 y
el 20% de seropositividad en los estudios realizados en áreas endémicas de amebiasis.
60
11.2.3 Frecuencia de enfermos
Excepto en los casos de amebiasis extraintestinal, en los que regularmente se realiza un
diagnóstico correcto, por las limitaciones antes referidas la frecuencia real de enfermedad
amebiana ha sido difícil de precisar.
11.3 Transmisión
11.3.1 La forma infectante
Aunque existen reportes de transmisión de trofozoítos de E. histolytica por contacto sexual, la
forma infectante de este protozoo es, casi exclusivamente, el quiste cuadrinucleado (Walsh,
1986; Matijasevic, 1992; Gutiérrez y Muñoz, 1994). En lo fundamental, es así porque los
quistes, a diferencia de los trofozoítos:
. Conservan su capacidad infectante en las heces, aguas y suelo hasta ocho días, cuando la
temperatura oscila entre 28 y 34 °C, y hasta un mes, cuando desciende a 10 °C.
. Preservan su viabilidad debajo de las uñas por periodos de hasta cuarenta y cinco minutos.
. Resisten condiciones adversas, como la acción del cloro a las concentraciones que
regularmente son utilizadas para el tratamiento de las aguas de uso humano.
. Sobreviven a la exposición al ácido clorhídrico y a las enzimas digestivas presentes en el
tracto gastrointestinal.
A pesar de que no se conoce con precisión el inoculo mínimo infectante, estudios en
voluntarios sanos parecen demostrar que la ingestión de 2 000 o más quistes produce infección
en 100 % de los casos.
61
11.3.3 Modos de Transmisión
Diseminación fecal-oral de quistes
La amebiasis se transmite en todas las formas de diseminación fecal-oral, especialmente a
partir de heces de portadores evacuadores de quistes maduros (éste es el principal mecanismo
de transmisión).
62
12.1.1 Saneamiento ambiental
Una de las vías más eficaces para prevenir la amebiasis es dotar a la población que vive en
áreas endémicas de mecanismos seguros para la eliminación de sus desechos, de manera
particular proveerla de instalaciones sanitarias que impidan la contaminación de aguas y
alimentos. Lamentablemente, la mayoría de los estudios realizados para evaluar la eficacia de
la aplicación de medidas de saneamiento ambiental adolecen de importantes deficiencias
metodológicas y, en consecuencia, ofrecen resultados contradictorios. A las limitaciones de
las pesquisas epidemiológicas, ya referidas anteriormente, se suma en estas investigaciones la
observación no rigurosa, o simplemente la no observación, de variables tales como
escolaridad, ingresos, hacinamiento y fuentes de agua.
Por otro lado, en muchas ocasiones las medidas de saneamiento ambiental sólo logran
beneficios limitados. En lo fundamental, ello es consecuencia de que en su aplicación no se
tiene en cuenta la multifactorialidad del problema. Así, por ejemplo, de nada serviría dotar a
una comunidad de un nuevo sistema de eliminación de excretas si los miembros de ésta, por
factores socioculturales que son desatendidos, no hacen un uso adecuado del mismo.
63
suficientes, se hace imposible mantener niveles adecuados de higiene personal y de los
alimentos.
64
núcleo las recomendaciones en relación con el tema recientemente emitidas por un grupo de
expertos de la OMS, en el acápite “Tratamiento de la amebiasis” hemos detallado los criterios
que se deben tener en cuenta para la indicación de tratamientos antiamebianos.
12.3 Inmunoprofilaxis
Como otras enfermedades infecciosas, la amebiasis es más frecuente en lugares donde las
condiciones higiénico-sanitarias son inadecuadas. La vía ideal para su control sería el
mejoramiento de dichas condiciones. Ello incluiría, desde luego, el desarrollo s ocioeconómico
de las regiones y países donde esta parasitosis es endémica, lo que no parece que ocurrirá a
corto o mediano plazo. En consecuencia, la inmunoprofilaxis ha devenido una alternativa
razonable para el control de esta parasitosis en el futuro inmediato.
Un aspecto importante a tener en cuenta cuando se valora la factibilidad de obtención de una
vacuna contra un agente infeccioso, es conocer si la primoinfección desarrolla algún grado de
inmunidad. Así, enfermedades como el sarampión y la viruela, cuyos agentes etiológicos
estimulan inmunidad protectora al primer contacto con el hospedero, son eficazmente
prevenibles mediante vacunas. No es ese el caso de enfermedades como la malaria, en las
cuales las respuestas inmunitarias a la infección inicial son insuficientes para controlar la
multiplicación del parásito (Stanley, 1997).
La información disponible sobre la adquisición de inmunidad después de la infección con E.
histolytica es limitada. Aunque se conoce que la curación de un episodio de colitis o de un
absceso hepático resulta en el desarrollo de cierto grado de inmunidad (de León, 1970), lo
cierto es que no existen estudios prospectivos rigurosamente controlados al respecto.
Se han emprendido varios caminos para el desarrollo de una vacuna anti amebiana. Todos
tienen un elemento común, el empleo de antígenos de trofozoítos de E. histolytica. Ello es así,
porque ésta es la única fase del parásito que ha podido ser cultivada in vitro.
El empleo de microorganismos muertos o inactivados, estrategia e xitosa en el logro de
inmunidad a algunos virus y bacterias, tuvo resultados favorables cuando se probaron
esquemas de inmunización con trofozoítos de E. histolytica en modelos animales. Sin embargo,
dos elementos impiden su empleo en humanos: el alto costo de la obtención
65
de trofozoítos a la escala necesaria para producir vacunas, y la reactogenicidad asociada a la
utilización de microorganismos enteros en preparados vacunales (Stanley, 1997).
Los progresos más recientes en la inmunoprofilaxis de la amebiasis, todavía en modelos
animales, vienen de la inmunización parenteral con antígenos recombinantes y del desarrollo
de promisorias vacunas orales, avances en los que se han empleado novedosos
procedimientos de la biología molecular y, desde luego, el mejor conocimiento que se ha ido
adquiriendo acerca de la inmunobiología de esta parasitosis (Stanley, 1997).
66
intestinal.
Una vacuna oral capaz de estimular la síntesis de anticuerpos IgA secretorios antiamebianos
tendría, además, otra ventaja: una administración más fácil y menos
costosa.
En varias aproximaciones a una vacuna antiamebiana oral se registran importantes progresos.
En dos de ellas se reportan los avances más prometedores: 1) la administración oral de una
proteína de fusión que contiene la subunidad B de la toxina colérica y un dodecapéptido
repetido de la PRSEH (Zhang y Stanley, 1995) y 2) la administración oral de una cepa
atenuada de Salmonella typhimurium que expresa y libera la molécula PRSEH recombinante
(Zhang y Stanley, 1996).
67
III- Materiales y Métodos
Para la redacción de esta tesis de doctorado seleccionamos una modalidad de documento que
incluye una compilación de las publicaciones del autor cuyos contenidos, de conjunto,
permitirían refutar (o aceptar) la hipótesis planteada.
La modalidad de documento seleccionada nos libra de la necesidad de hacer detalladas
descripciones de los materiales y métodos empleados en la ejecución de cada uno de los
estudios que incluye. Esas descripciones están contenidas en las publicaciones, presentadas en
forma secuenciada, que forman parte de este documento. Sin embargo, haremos a
continuación algunos comentarios que, unas veces como complemento y otra s como hilo
conductor, pueden facilitar la mejor comprensión de lo relacionado con los materiales y
métodos utilizados.
2- Inmunoensayo ENZYMEBA
ENZYMEBA, inmunoensayo que permite detectar la presencia de infección por una o ambas
especies del complejo E. histolytica/ E. dispar, fue empleado como prueba comparativa en los
estudios de control de calidad del diagnóstico de amebiasis intestinal por observación
microscópica de heces a que hacíamos referencia en el acápite ante rior ( artículos I y II).
ENZYMEBA también fue utilizado, junto al procedimiento de RCP que describimos más
adelante, en los estudios de diferenciación de especies amebianas (artículo III) y de eficacia
terapéutica ( artículo IV). Referencias a este ensayo, como herramienta con la que se demostró
el sobrediagnóstico microscópico, también aparecen en los artículos que reportan los
resultados de las encuestas aplicadas a Técnicos (artículo VI) y Responsables de Laboratorio
(artículo VII).
68
ENZYMEBA se realizó según reportaron Luaces y colaboradores (Luaces y cois., 1992), con
algunas modificaciones introducidas en el proceso de validación del procedimiento (Fonte y
cois., 1998). Descripciones detalladas del modo en que empleamos este inmunoensayo
aparecen en varios de los artículos que forman parte de este documento ( artículos II, III y VI).
4- Tratamiento antiamebiano
A individuos con infección confirmada por una o ambas especies del complejo E. histolytica/
E. dispar en el estudio descrito en el acápite anterior, a los que sus respectivos médicos de
asistencia les habían indicado tratamiento con metronidazol (250 mg, 3 veces al día, durante
10 días), se les tomó una segunda muestra de heces inmediatamente después de finalizado el
mismo. A estas muestras postratamiento se le aplicaron los procedimientos ENZYMEBA,
para detectar la presencia de una o ambas especies del complejo E. histolytica/ E. dispar, y RCP
Múltiple, para precisar la especie
69
(o especies) presente (Artículo IV). Estas segundas aplicaciones de los procedimientos citados
tenían la intención de conocer de la eficacia del tratamiento antiamebiano empleado.
70
de las investigaciones descritas en este documento (aquellos que condujeron a la
intervención).
71
IV- Resultados
Todos los resultados de este trabajo están descritos en las publicaciones que lo componen.
72
Artículo 1
Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 93(6): 799-800, Nov./Dec. 1998
RESEARCH NOTE
74
tively demonstrated that the current solution of animation of serial samples of faeces, leads to an
the microscopical subdiagnosis of amoebiasis, the increase of the occurrence of microscopical
ex- overdiagnosis of this infection. Thus, it is clear
that there is an urgent need of complementary
TABLE tests for an efficient diagnosis of amoebiasis. The
Results of microscopical examination and the ENZYMEBA new methods must be based on appropriate
test on faecal samples of 288 individuals (three per each) technologies for use in a broad range of logistic
ENZYMEBA Positive ° Tota conditions, included those more frequently present
l at the health services of developing countries, and
Negative must differentiate between E. histolytica and E.
Positive b 28 109 137 dispar infections.
Stool microscopy, due to its low cost and ca-
Microscopy pacity for detecting different parasitic protozoa
Negative 3 148 151 and helminths in the same assay, will continue to
play an essential role in supporting the physicians
Total 31 257 288 in the diagnosis of intestinal parasitism.
a: ENZYMEBA test was positive in the three samples of 31 Accordingly, the improvement of the technician’s
persons; b: microscopical examination was considered competence to execute the microscopical
positive when cysts and/or trophozoites of Entamoeba examination of faeces remains a necessary
hisiolytica/E. dispar were observed in at least one sample approach to the reduction of the overdiagnosis of
per individual. intestinal amoebiasis.
75
Artículo II
DEMOSTRACIÓN, MEDIANTE ENZYMEBA, DEL
SOBREDI AGNÓSTICO DE AMEBIASIS INTESTINAL A
SÓCIA DO AL EXAMEN MICROSCÓPICO DE HECES.
REPÓRTE DE UN ESTUDIO EN (TENFLEGOS, CUBA
Luis Funle. María A Fernández.' Lizet Sánchez. Humberto Marín. ' Yury O
Vúñez y Ivon Montano'
RESUMEN
1 I sohrcdiagníSstico microscópico de amebiasis intestinal ha sido ampliamente
reportado, peo pocas \eces objetivamente demostrado I n el presente trabajo,
empleando l'nzymeba. un procedimiento diagnóstico de amebiasis intestina!
desarrollado en el Instituto de Medicina 1 ropical Pedro kouri. C ludad de La
Habana, abordamos este problema Durante seis meses se colectaron en los
servicios de parasitología de la casi totalidad de los po'.iclimcos (13 de 14), y de
los dos mayores hospitales (2 de 3) de la provincia de Cienluegos, todas las
muestras de heces en las que el personal técnico correspondiente habla
informado la detección por observación microscópica de uno o más estadios de
Emamoeba histolytica En sólo 61 (14 4%) de 424 muestras colectadas l-.nzvmeba
confirmó el hallazgo microscópico previo No encontramos diferencia
estadísticamente significativa (p>0 05) en'.rc la eficiencia del diagnóstico
microscópico en los hospitales y en los policlímcos de aquella provincia
77
intestinal (Bruckner. 1992; Ravdin, 1995). Sin embargo, este método tiene importantes
limitaciones en primer lugar, la excreción intermitente de quistes de Entamoeba
histolytica obliga a la realización de al menos tres exámenes por paciente para solo
detectar 80% de las infecciones (Walsh, 1986); en segundo lugar, sobre todo cuando la
prueba es realizada por personal insuficientemente entrenado, el parecido de los
diferentes estadios de E histolytica con otras estructuras que pueden estar presentes en
las heces frecuentemente conduce a falsos diagnósticos de amebiasis (Anaya &
Sabanero, 1989). A estas limitaciones se suma que la observación microscópica de
heces, sobre todo cuando se visualizan quistes, no permite distinguir entre E histolytica
y E dispar (Diamond & Clark. 1993; WHO,
1997) .
Algunas pruebas serológicas han sido utiles en el diagnóstico indirecto de las
formas extraintestinales de amebiasis, en particular del absceso hepático (Madison.
1991). Sin embargo, para las formas intestinales estos exámenes no han representado
una solución eficiente al problema de su diagnósti co (Ravdini, 1995). Sistemas para la
detección de antígenos en heces han sido recientemente desarrollados (Haque et al.,
1993; Abd-Alla et al.,1993; González-Ruíz et al., 1994; Haque et al., 1995; Urdaneta et
al., 1996; Jackson & Ravdin. 1996). Al menos uno de ellos, que permite la
diferenciación entTe E histolytica y E dispar, ya se comercializa; pero por su relativo
alto costo aún no está disponible para su uso regular en la mayoría de los servicios
parasitológicos.
En 1988, Luaces y colaboradores (Luaces et al., 1988) describieron una
proteasa de E histolytica a la que nombraron histolisaina Posteriormente, Luaces y cois.
(Luaces et al., 1992a; Luaces et al., 1992b) desarrollaron un ensayo inmunoenzimático
(Enzymeba) para la detección de histolisaina en h eces, siendo éste el primer
procedimiento diagnóstico en que el propio parásito aporta la enzima (histolisaina) que
revela su presencia La eficacia de este procedimiento fue probada en sendos estudios
realizados en Mérida, México (Comisión de Expertos de l a Universidad Autónoma de
Yucatán, Mérida, México, 1992) y en Ciudad de La Habana, Cuba (Fonte et al., 1998).
El sobrediagnóstico de amebiasis intestinal, en particular la cuantía de éste,
ha sido hasta el presente un problema ampliamente reportado pero pocas veces
objetivamente demostrado. Teniendo en cuenta las bondades de Enzymeba, en especial
el hecho de que sus altos indices de sensibilidad y especificidad no dependen de la
subjetividad asociada a un observador (Luaces et al., 1992a; Luaces et al., 1992b;
Comisión de Expertos de la Universidad Autónoma de Yucatán, M énda, México, 1992;
Fonte et al,
1998) , decidimos demostrar con precisión la presencia, y cuantía, del
sobrediagnóstíco de amebiasis asociado al examen microscópico de heces en la
provincia de Cienfuegos, Cuba
78
MATERIALES Y METODOS
1 Muestras de heces
La provincia de Cienfuegos es una de las catorce en que esta dividid a el
territorio cubano. Esta, a su vez, esta constituida por ocho municipios: Cienfuegos. el
municipio capital de la provincia y siete
municipios periféricos, fundamentalmente rurales.
Durante los meses de mayo a octubre de 1996 se colectaron en los Hospit ales
Clinico-Quirúrgicos "Gustavo Aldereguía" y Pediátrico “Paquito González" de
Cienfuegos y en prácticamente todos los policlinicos (13 de 14) de aquella provincia,
muestras fecales en las que los técnicos de laboratorio de los citados centros
asistenciales habían detectado por observación microscópica uno o mas estadios de
Entamucbu histulylica En todos los casos, el diagnostico coproparasitologico había sido
realizado mediante examen directo con coloración de Lugol: en algunas muestras sobre
las que existieron dudas diagnosticas emplearon, además, la observación con tinción
tricrómica. Se consideró a un individuo positivo por observación microscópica cuando
en uno de tres exámenes realizados los técnicos informaron, según sus criterios, la
presencia de uno o más estadios de E histolytica. Durante el período en que se
colectaron las muestras supuestamente positivas, los técnicos de laboratorio no
conocían que con las mismas se haría un estudio de la calidad del diagnóstico
microscópico que realizaban.
Todas las muestras fueron conservadas, congeladas (debido a que después se
emplearía Enzymeba, no era posible la utilización de preservantes), en las respectivas
instituciones en que se realizó el diagnóstico primario. De estas fueron transportadas,
también congeladas, al Centro Provincial de Higiene y Epidemiologia de la provincia
Cienfuegos y de allí en iguales condiciones, al Instituto de Medicina Tropical “Pedro
Kouri" (IPK).
Con la intención de confirmar con una herramienta más objetiva el
diagnóstico microscópico previo, una vez las muestras de heces en el IPK. a las
mismas se les realizó Enzymeba
2 Obtención de anticuerpos antihistolisaina
La histolisaina se purificó según describieran Luaces \ Barret en 1988
(Luaces y Barret, 1988). Para la obtención de anticuerpos contra esta enzima se
procedió de la siguiente manera: dos conejos Chinchilla de 2 -3 kg de peso fueron
inmunizados subcutáneamente con 500 ng de la proteína diluida en 0.5 mi de solución
salina tamponada (PBS) (0 1 M, pH 7.2) > emulsificada e n igual volumen de adyuvante
completo de Freund. A
79
intervalos de dos semanas, ambos conejos fueron inmunizados en otras
nueve ocasiones con cantidades decrecientes de la enzima (50 pg menos de por vez,
hasta inocular sólo 50 jag en la última de ellas) emulsificada en igual volumen de
adyuvante incompleto de Freund. Una semana después de la décima inmunización los
conejos fueron sangrados. De la sangre colectada fue separado el suero y de este se
obtuvo una preparación cruda de mmunoglobulinas mediante p recipitación en sulfato
de amonio, siguiendo una metodología similar a la empleada por Luaces y cois, en
1992 (Luaces).
3. Enzymeba
Enzymeba se realizó según reporto Luaces y cois, en 1992, con algunas
modificaciones. Placas de poliestireno de fondo plano y d e 96 pocilios (Marxisorp,
NUNC) fueron sensibilizadas durante 16 horas a 4°C con 125 n 1/pociIlo de una
solución 0.1 M de carbonato de sodio pH 9.6, contentiva de anticuerpos antihistolisama
obtenidos en conejo (5 |ug/ml). Los sitios no recubiertos por los anticuerpos fueron
bloqueados durante 2 horas a 37°C con 150 |il/pocillo de seroalbúmina bovina al 0.1%
en PBS (0.1 M, pH 7.2). Transcurrida esta incubación, se eliminó el agente bloqueante
en exceso y se añadieron 100 jaI del sobrenadante de las muestras de heces previamente
diluidas (lg de heces diluido en 3 mi de agua destilada y dejado reposar durante 15
minutos).
Después de 4 horas en contacto con la placa a 4°C el material no “capturado"
fue desechado y tras cuatro lavados con Tween-20 al 0.05% en PBS (PBS-T) en ios
pocilios fueron colocados 100 |il de 100 mM Benziloxicarbonil -L Arginil-L Arginine 2-
(4-metoxi) naphthylamida (z-arg- arg Mna), Bachen, Suiza, en solución 50 mM glicina -
EDTA pH 9.5 que contenía, además, L-cysteina 2 mM.
Luego de 16 horas de incubación a 37°C, la acción de la enzima capturada
fue revelada mediante la adición de 100 |jl de una solución que contenía p -cloro
mercuribenzoato 5 mM, Fast gamet 22.5ng/pl, EDTA 25 mM y Tween 20 al 1% pH 6 0
La aparición inmediata de color rosado (de diferente intensidad) fue considerada como
un resultado positivo, y negativo en aquellos pocilios cuyo contenido continuo
amarillo. En cada ensayo se utilizaron dos controles (positivo y negativo).
4. Análisis Estadístico
Se empleó una prueba de comparación de proporciones para analizar la
diferencia entre grupos (hospitales y policlinicos). Se consideró como nivel de
significación un valor de p<0.05.
80
RESULTADOS Y DISCUSION
Se colectaron en los ocho municipios de la provincia Cienfuegos un total de
448 muestras de heces en las que el personal técnico de los centras asistenciales
incluidos en el estudio habia informado la detección por examen microscópico de uno o
mas estadios de E hislolytica. Veinticuatro de ellas fueron descartadas por no haber sido
transportadas al IPK en condiciones de congelación. En relación con las 424 muestras
restantes, fue informada la presencia de quistes en 412 (97.2%), trofozoitos, ninguno
hematófago, en I I (2.6%) y quistes y trofozoitos en 1 (0.2%).
La tabla I muestra los resultados del estudio de la eficacia del diagnóstico
morfológico en la provincia Cienfuegos Como puede observarse, de las 424 muestras
finalmente incluidas en el estudio, sólo 61 (14 4%) fueron positivas a Enzymeba. No se
observaron diferencias estadísticamente significativas entre la calidad del diagnóstico
en los hospitales (18.2% de eficacia) y la de los policlinicos (13.8%) (p -0.051
Tabla I Resultados de la aplicación de Enzymeba a muestras de heces informadas
positivas a E histolytica por examen microscópico en hospitales y policlinicos
de la provincia Cienfuegos
N.° de muestras Enzvmeba Porciento
positivas
Hospitales 55 10 18.2
Policlinicos 369 51 13 8
Totales 424 61 14.4
p > 0.05
Tres estudios anteriores (Luaces et al., 1992; Comisión de Expertos de la
Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, México, 1992; Fonte et al.,
1998) demostraron que el procedimiento Enzymeba para el diagnóstico de amebiasis
es altamente eficiente y sólo requiere la realización del ensayo en una muestra por
paciente para la obtención de un diagnóstico acertado (Enzymeba detecta una proteasa
excretada por las amebas en el lumen intestinal y, por tanto, son posibles resultados
positivos aún en ausencia de quistes y trofozoitos en las heces) Este procedimiento, a
diferencia de los demás ensayos inmunoenzimáticos, no requiere de enzimas
conjugadas, pues el propio parásito aporta la enzima que detecta su presencia. En este
hecho radica su doble fuente de especificidad, la del anticuerpo por el antígeno (la
enzima) y la de la enzima por su sustrato colonmétrico
Los resultados arriba mencionados nos demuestran, por tanto, que existe un
marcado sobrediagnóstico microscópico de amebiasis intestinal en los centros de salud
de la provincia Cienfuegos.
81
observación microscópica de heces permite la detección de una amplia gama de
parasitos en una misma prueba, el diagnóstico morfológico debe ser perfeccionado.
Para incursionar en los factores que condicionan los falsos diagnósticos microscópicos
de amebiasis, y posiblemente de otras parasitosis, actualmente aplicamos encuestas
sobre percepciones, conocimientos y prácticas relacionadas con este problema, a
técnicos de laboratorio, a responsables de éstos y a médicos de la provincia de
Cienfuegos.
SUMMARY
Demonstration, using Enzymeba test, of the overdiagnosis of intestinal amebiasis
associated to the microscopical examination of faeces. Report of a study in Cienfuegos,
Cuba.
The overdiagnosis of amebiasis has been widely reported, but not rigorously
demonstrated. We confronted this issue utilizing Enzymeba, a diagnostic method for
intestinal amebiasis developed at the Tropical Medicine Institute “Pedro Kouri”,
Havana City. From 424 faccal samples collected at the parasitology division of almost
all local polyclinics (13 of 14), and two of the. largest hospitals (2 of 3) belonging to
the province of Cienfuegos, in only 61 (14.4%) Enzymeba confirmed the microscopic
diagnosis. We did not find statistically significant differences (p>0.05) between the
microscopic diagnosis at the hospitals and at the local polyclinics.
KEYWORDS: Amebiasis. Microscopical overdiagnosis. Enzymeba.
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