Manual ExperimentaciÃ N Corregido

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
QUERÉTARO
FACULTAD DE QUÍMICA
Manual de Laboratorio de Experimentación

Bioquímica-Biológica
ACADEMIA DE QUÍMICA
Clave: 932
Pre-requisito: N/A
ÍNDICE
1. Microscopio y moléculas orgánicas

2. Material Genético
3. Membrana Celular: Transporte Celular y potencial de membrana
4. Organelos celulares y Demostración de Fosfatasa Ácida
5. División Celular: Mitosis y Meiosis
6. Identificación de aminoácidos
7. Propiedades de las proteínas
8. Cuantificación de proteínas
9. Electroforesis de proteínas SDS-Page
10. Catálisis Enzimática
11. Identificación de carbohidratos
12. Identificación de lípidos
13. Extracción y Separación de Lípidos totales de Tejidos Animales
Estructura del Microscopio
Práctica No. 1
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I. Introducción
En la actualidad, se dispone de la tecnología para descifrar los principios básicos
que rigen la estructura y la actividad de la
célula. Por lo general, las células son muy
pequeñas para observar a simple vista. Se
les visualizó hasta el siglo XVII, cuando se
inventó el microscopio. A partir de ese
momento y durante cientos de años, todo
lo que se supo sobre las células se
descubrió con este instrumento. Con el
empleo de un microscopio simple, Robert
Hooke examinó un trozo de corcho y en
1665 informó que el corcho estaba
compuesto por un conjunto de cámaras
diminutas, que denominó “células”.
-Tipos de microscopios:
a) Microscopio óptico: utiliza la luz visible

para iluminar las muestras. Permite
aumentar las imágenes de las células hasta
1000 veces y resolver detalles de tan solo
0.2 m
b) Microscopio electrónico: emplean haces

de electrones en lugar de haces de luz
como fuente lumínica, lo que amplía
mucho la capacidad para observar detalles sutiles de las células.
c) Microscopio de fluorescencia: es similar a un microscopio óptico, excepto que la

luz atraviesa dos sistemas de filtros y utiliza colorantes fluorescentes para teñir las
células. El primero filtra la luz antes de que alcance el espécimen y sólo deja pasar
longitudes de onda que excitan al colorante usado. El segundo bloquea esta luz y
sólo deja pasar las longitudes de onda emitidas por el colorante fluorescente.
d) Microscopio confocal: es un tipo especializado de microscopio de fluorescencia
que construye una imagen por barrido del espécimen con un haz láser.
Las células vivas están compuestas por un número limitado de elementos, cuatro
de los cuales (CHON) componen el 96.5% de su masa. Los organismos vivos
contienen un conjunto característico y restringido de pequeñas moléculas
compuestas basadas en el carbono que son esencialmente iguales en todas las
especies vivas. Las categorías principales son los azúcares, los ácidos grasos, los
aminoácidos y los nucleótidos.
Los azúcares son una fuente primaria de energía química para las células y se
pueden incorporar a polisacáridos que almacenan energía (almidón, glucógeno).
Los ácidos grasos también son importantes como reserva de energía, pero su
función primordial es la formación de las membranas celulares.
La gran mayoría de la masa seca de una célula está formada por macromoléculas,
que son polímeros de azúcares, aminoácidos o de nucleótidos. Los polímeros
formados por aminoácidos constituyen las proteínas, los de los azúcares, son los
carbohidratos. Los nucleótidos desempeñan una función central en la transferencia
de energía y son subunidades que componen el RNA y el DNA.
Los nucleótidos están formados por un grupo fosfato, una pentosa y una base
nitrogenada que puede ser purina o pirimidina.
II. Conocimientos previos

a) ¿Para qué sirve un microscopio?
b) ¿Tipos de microscopios?
c) Esquema del microscopio óptico indicando sus partes
d) ¿Para qué es utilizado el aceite de inmersión?
e) ¿Qué es una base nitrogenada? (ejemplo y estructura de 3).
f) ¿Qué son los aminoácidos? (ejemplo y estructura de 3).
g) ¿Qué son los carbohidratos? (ejemplo y estructura de 3).
h) ¿Qué son los lípidos? (ejemplo y estructura de 3).
i) Investigar cómo se utiliza el microscopio.
III. Objetivo
Aprender a utilizar el microscopio, sus partes y obtener conocimiento de moléculas
orgánicas.
IV. Metodología
1) Material y Equipo
- Microscopio será proporcionado por el maestro.
- Porta y cubre objetos.
- Muestras para observar bajo el microscopio (sangre, papa, flores).
1) Reactivos y Soluciones
Ninguno
2) Requerimientos de Seguridad
Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad, zapato
cerrado y guantes.
3) Disposición de residuos
Ninguno
4) Técnica
Se darán un ejemplo de moléculas orgánicas (carbohidrato, aminoácido, lípido), se
realizara la representación de la estructura con ayuda de modelos moleculares y se
dará la toda la información acerca de la molécula en cuestión.
Se indican cada una de las partes que componen el microscopio y se explica su

función, después se observan cada una de las muestras elegidas.
5) Procedimiento
1. Se escogen muestras para observar
2. bajo el microscopio (sangre, papa, flores) y se cortan en pequeños pedazos.
3. Se ponen las pequeñas muestras en portaobjetos limpios.
4. Se añade una gota de agua o solución a la muestra.
5. Se cubren los portaobjetos con cubreobjetos.
6. Se ponen en el microscopio y con ayuda de los conocimientos previos, se
enfoca la muestra y se analiza.
7. Observar las muestras a diferentes resoluciones para comparar.
V. Resultados
a. Cálculos
VI. Discusión de resultados

VII. Conclusiones
VIII. Anexos
IX. Bibliografía
Extracción de DNA e Identificación por Electroforesis
Práctica No. 2
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I. Introducción
El ácido desoxirribonucleico (DNA) es el centro de almacenamiento o biblioteca
celular que contiene toda la información requerida para construir las células y los
tejidos del organismo.
El DNA y el RNA se componen de sólo cuatro nucleótidos diferentes, todos con

una estructura común: un grupo fosfato unido por un enlace fosfodiéster a una
pentosa (una molécula de azúcar de 5 carbonos) que a su vez se une a una base
orgánica. En el RNA la pentosa es ribosa y en el DNA desoxirribosa. Los
nucleótidos de DNA y RNA difieren además en una de sus bases nitrogenadas, las
bases adenina, guanina, citosina y timina se encuentran en el DNA y el uracilo sólo
en el RNA.
El DNA consta de dos hebras de polinucleótidos asociadas que se enlazan entre sí

en el espacio, para formar una estructura que se suele describir como doble hélice.
Las dos hebras tienen orientación antiparalela ósea que sus direcciones 5` y 3` son
opuestas. La estructura de la doble hélice fue propuesta por James Watson y
Francis Crick en 1953, la estructura proveyó las primeras pistas de cómo una
molécula de DNA codificaría las instrucciones para la elaboración de proteínas, lo
cual marcó el comienzo de la era de la biología moderna.
Electroforesis
La electroforesis es una técnica que ayuda en el estudio del movimiento de las

biomoléculas con una carga neta a través de un campo eléctrico. Su migración
depende de la forma, tamaño carga y composición química. La mayoría de las
biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya magnitud depende del pH del
medio en el que se encuentran.

a) Estructura del DNA
b) Carga del DNA
c) Función del DNA
d) ¿Qué es la electroforesis y su fundamento?
e) Tipos de electroforesis
f) Cuál es la función de cada uno de los reactivos utilizados en la práctica:
etanol, agarosa, bromuro de etidio, buffer de carga, buffer de corrida TAE,
detergente, enzimas o jugo de papaya o ablandador de carne?
III. Objetivo general

Extraer el DNA de células vegetales e identificarlo por electroforesis en gel de
agarosa.
IV. Metodología
1) Material y equipo.
Material
- 2 vasos de precipitado de 250ml

- 2 vasos de precipitado de 500ml
- 1 cuchillo
- 1 mortero con pistilo
- 1 termómetro de 0-100°C
- 1 embudo
- Papel filtro de cafetera o tela porosa
- 5 Palillos de madera largos
- 5 tubos ensayo 10x 100
Equipo (lo provee el profesor):
- Lámpara de luz ultravioleta

- Cámara de electroforesis
- Fuente de poder
2) Reactivos y soluciones.
- ¼ cebolla, 1 fresa, ¼ jitomate, 1/3 plátano (traer por equipo 3 opciones de
cualquiera de las anteriores )
- SDS (dodecil sulfato de sodio)
- Agua destilada
- NaCl (1.5g por equipo)
- Enzimas proteasas: 3 ml de jugo de papaya (fresco) o 0.5g de ablandador de
carne.
- Alcohol etílico (15 ml por equipo)
- Agarosa (0.4 g por cada dos equipos)
- 400 ml de buffer TAE 1X (por equipo). Para preparar 1L de TAE 1X se
necesitan: 4.84g de Tris-base, 1.14 ml de ácido acético y 0.37 g de EDTA.
Disolver todo en 1L de agua destilada y refrigerar.
- Buffer de carga para DNA Azul de bromofenol-Xylene Cyanol (250 ul por
cámara). Para preparar 1 ml del buffer: mezclar 25 mg de azul de
bromofenol, 25 mg de Xylene-Cyanol, 0.3 ml de glicerol y aforar a 1 ml con
agua destilada.
Bromuro de etidio (provisto por el profesor)
El bromuro de etidio es un compuesto CANCERÍGENO, MANEJAR CON

GUANTES.
3) Requerimientos de seguridad
cerrado y guantes.
Colocar en los recipientes correspondientes.
5) Procedimiento.
1. Se corta la cebolla, fresa, etc., en trozos pequeños para poder triturar con
facilidad. Se agregan 15 ml de agua destilada, disolver.
2. Moler las muestras, obtener el jugo y ponerlo en un vaso de precipitado de
150 ml.
3. Agregar 2.5 ml de detergente y se mezcla.
4. Filtrar la solución en un tubo de ensayo con tela porosa (magitel, etc.) o
filtro para cafetera (No Watman).
5. Se pesan en la balanza 0.5g de NaCl (POR CADA MUESTRA). Mezclar la
solución de sales con la muestra en el mortero.
6. Agregar 0.1 g de las enzimas (ablandador de carne) y disolver.
7. Esperar 5 min y agregar cuidadosamente por las paredes del tubo 3ml de
alcohol (etanol) previamente enfriado. Se formarán 2 fases (cuidar de no
mezclarlas).
8. Con un palillo de madera o vidrio largo hacer movimientos rotatorios
lentos justo entre las dos fases.
9. Sacar con el mismo palillo las hebras blancas (DNA) que se forman y,
colocarlas en un microtubo.
PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA Y ELECTROFORESIS DEL DNA
Preparación de agarosa al 1% en TAE 1X: 0.4g de agarosa disolverla en 40 ml de

TAE 1X calentando a 60°C para disolver, una vez disuelta dejarla enfriar hasta
50°C y agregar el bromuro de etidio (profesor). Verter la solución en un molde,
colocar el peine y dejar reposar durante 25 min para su solidificación (no
mover).
El gel de agarosa se coloca en la cámara de electroforesis, se llena la cámara con

solución TAE 1X hasta cubrir el gel.
Cargar las muestras en los pozos junto con el buffer de carga (azul), tapar la
cámara y correr el gel 30 min a 120V (explicación del profesor). Observar el gel
en la luz UV.
V. Resultados.
VI. Discusión.
VII. Conclusiones.
VIII. Anexos
IX. Bibliografía
Membrana Celular: Transporte Celular y Potencial de Membrana.
Práctica No. 3
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I. Introducción
El Potencial de Membrana se genera cuando los iones en una solución pasan del
interior de la membrana hasta exterior. La teoría que mayor aceptación ha tenido
para explicar el establecimiento del potencial de membrana es la teoría de la
electrodifusión de Nernst-Planck. Esta teoría descansa en los principios de la
termodinámica clásica, al comprender como se establece el Vm con la participación
de un solo ion (potencial de membrana) permite tener una idea clara del
mecanismo básico por el cual se establece el potencial de reposo en condiciones
fisiológicas.
Distribución iónica asimétrica.
Una observación que permite aplicar la teoría de Nerst-Planck a la fisiología es el

hecho de que en las células en donde se ha medido la concentración intra y
extracelular se presenta una distribución asimétrica de los iones de ambos lados de
la membrana. Para los casos citados tenemos que: [k+]e>[k+]i>[Na]e>[Na]i>[cl-
]e>[cl-]i.
Esta asimetría sugiere la presencia de uno o varios mecanismos que le permiten a

la célula mantener su medio interno. Se han descrito mecanismos que permiten
explicar la distribución asimétrica de los iones entre los líquido intra y extracelular.
Equilibrio Donnan.
Para comprender el equilibrio Donnan debe tenerse en consideración: principio de

electroneutralidad y permeabilidad selectiva de la membrana.
Este equilibrio se produce entre los iones que pueden atravesar la membrana y los
capaces de hacerlo. Las composiciones en el equilibrio se ven determinadas tanto
por las concentraciones de los iones como por sus capacidades.
La regla de Donnan establece que sucede:
[k+]1 [cl-]1=[k+]2 [cl-]2

Las bombas metabólicas.
Se le añade NaCl en el líquido extracelular. Sin embargo, la célula no es

impermeable al Na+ y por lo tanto [NA+]e tiende a ser igual a la [Na+]i esto se
evita con las bombas metabólicas donde se cambia Na+ por k+ manteniendo la
presión osmótica.
La ecuación de Nernst-Planck
A partir de esta distribución asimétrica es posible aplicar la teoría iónica o de la

electrodifusión de Nernst a la célula. La solución de la ecuación establece la
diferencia de potencial que habrá en una interface en presencia de un solo
electrolito.
Potencial de membrana
Las células animales mantienen una diferencia de potencial a través de la

membrana plasmática que ronda los 90mV, siendo el interior electronegativo con
respecto al exterior. Lo que intenta responder este pequeño texto es a que se debe
esa diferencia de potencial.
La electroneutralidad
La existencia de una diferencia de potencial es ante todo una indicación de la

existencia de una separación de cargas. De alguna manera las membranas
biológicas contribuyen a que se mantenga un exceso relativo de cargas negativas
en el interior celular con respecto al medio extracelular. Sin embargo, es un hecho
empírico muchas veces elevado a nivel de principio, el que cualquier porción
macroscópica de una solución es electroneutra. La contradicción aparente se
despeja cuando se considera lo que se entiende por “macroscópica” en la frase
precedente. El entorno inmediato de las membranas biológicas puede ser lo
suficientemente pequeño para ser considerado no macroscópico, y sin embargo
soportar una diferencia de potencial medible con instrumentos usuales.
Potencial de Nernst: Es la relación que hay entre el potencial de difusión y la

diferencia de concentración de unión. Nivel de potencial a través de la membrana,
que se opone exactamente a la difusión neta de un ion específico a través de la
membrana
Transporte celular
El transporte celular es uno de los fenómenos hablando a escala celular más

importante, gracias a éste, las células pueden intercambiar sustancias con su medio
o bien, con otras células mismas. Gracias a esto, algunos organismos como los
unicelulares pueden respirar y excretar distintas sustancias.
El transporte se puede dar de dos maneras: Pasivo y Activo
Pasivo: El proceso es muy similar al de la difusión, definida como la distribución

de moléculas en un medio, pasando a una zona de alta concentración a una de baja
concentración. No requiere gasto energético, y otro fenómeno que lo representaría
es la osmosis.
Activo: va en contra de gradiente y requiere gasto de energía.
Difusión simple. Es el paso de pequeñas moléculas a favor del gradiente; puede

realizarse a través de la bicapa lipídica o a través de canales proteínicos.
Difusión simple a través de la bicapa, entran moléculas lipídicas como fármacos

liposolubles. Y sustancias apolares como oxígeno y el nitrógeno atmosférico.
Algunas moléculas polares de muy pequeño tamaño.
Difusión simple a través de canales. Se realiza mediante las denominadas proteínas

de canal. Así entran iones como el Na+, K+, Ca2+, Cl-. Las proteínas de canal son
proteínas con un orificio o canal interno, cuya apertura está regulada
La principal diferencia entre estos transportes es que el pasivo va hacia el

gradiente y el activo va en contra del gradiente.
Gracias a que todos los organismos por medio de osmosis mantienen agua, hay
dos términos que definen la retención de agua dependiendo de si la célula es
animal o vegetal.
En las células vegetales:
Turgencia
Presión ejercida por los fluidos y contenido celular sobre paredes de una célula, al
momento de absorber agua, la célula se hincha y se hace más rígida, esto aumenta
la presión de la membrana celular y hace que ésta se tense dando una cierta
firmeza gracias a la dilatación de las células. En este caso, la pared celular protege
a que con toda la presión ejercida no explote. Es el fenómeno que mantiene vivas y
firmes a las plantas.
El proceso equivalente a una célula animal se llama lisis, en el cuál las células al
retener tanta agua, explotan por no tener una pared celular que las proteja.
Plasmólisis
Es el fenómeno contrario a la turgencia, en éste, las células pierden agua lo que

hace que éstas se contraigan y causa la separación del protoplasto y la pared
celular.
Esto pasa cuando la célula es sumergida en solución hipertónica, el agua pasa al

entorno y se contrae causando que la membrana plasmática se separe de la pared
celular.
Esto sucede mucho en las plantas cuando hay mucho sol que les está dando
directo, las plantas empiezan a transpirar desprendiendo toda el agua contenida en
ellas, y empiezan a perder agua. En éste fenómeno la presión de turgencia es nula
ya que no hay presión ejercida sobre las paredes celulares y por eso no hay
firmeza.
El fenómeno equivalente en una célula animal, recibe el nombre de Crenación.

a) ¿A qué se le llama turgencia?
b) ¿Qué es la crenación?
c) ¿Diferencia entre la lisis y la turgencia?
d) ¿En qué consiste la osmosis?
e) Menciona los tipos de transporte celular y explícalos
f) Que es potencial de membrana?
III. Objetivo General

Observar el efecto de diferentes concentraciones de sales en el potencial de
membrana y sobre la morfología de células animales.
IV. Objetivos
• Apreciar el fenómeno de potencial de membrana transmembranal para
comprender los efectos que tiene esta con varias soluciones de diferente
concentración.
• Diferenciar entre el proceso de difusión y osmosis por medio de la
observación de ambos fenómenos.
• Observar y diferenciar los efectos de soluciones hipotónica, hipertónica e
isotónica en células animales.
V. Metodología
- Voltímetro
- 2 Pinzas caimán-caimán
- 2 pinzas banana-caimán
- 5 tubos de ensayo
- Cubreobjetos
- Portaobjetos
- Muestras de sangre
- 1 cascarón de huevo: (retirar la yema y clara en casa para su consumo,
enjuagar con agua común y con mucho cuidado para evitar romper la
membrana interna).
- Microscopio
- 2 electrodos de plata (2 cm c/u, conseguirlos fuera de la facultad con los que
venden joyería de plata)
- 7 vasos de precipitados 100ml
- Pipetas
- Aforados 100ml
- Aforados 5ml
- 1 pila AA
- 3ml de Soluciones al 1.2%, 0.9% y 0.6% de NaCl (soluciones hipertónica,

isotónica e hipotónica). Los 3 ml alcanzan para todos los equipos, es decir,
los 3 ml son para todo el grupo.
- 100 ml de KCl 400mM. Esta cantidad es por equipo. Calcular lo que se

necesita preparar para todo el grupo. (2.982 g de KCl por equipo).
- 30 ml (por equipo) de cada una de las siguientes soluciones de KCl: 100mM

(.22g por equipo), 50mM (0.11g por equipo), 20mM (0.044g), 10mM (0.022g
por equipo), 5mM(0.011 g por equipo), 2.5mM (0.0055 por equipo), 1mM
(0.0022 g por equipo). Los 30 ml son por equipo, calcular lo que se necesita
para todo el grupo.
cerrado y guantes.
4) Disposición de residuos.
Desechar el NaCl al recipiente de sales.
5) Procedimiento.
PARTE A. TRANSPORTE CELULAR EN CÉLULAS ANIMALES
1. Limpiar el dedo de un compañero y con una lanceta estéril pincharlo para

sacar muestra de sangre.
2. Tomar unas gotas con una pipeta Pasteur y distribuir en tres tubos de
ensayo diferentes con soluciones previamente preparadas con 3 mL de
0.6 %, 0.9% y 1.2% de NaCl.
3. Dejar reposar un aproximado de 2 minutos y colocar una gota de la
solución en el portaobjetos para cada una de las concentraciones.
4. Observar las muestras al microscopio comparando el tamaño y forma de
eritrocitos en cada solución.
PARTE B. POTENCIAL DE MEMBRANA
1. Preparar cada una de las siguientes soluciones de KCl:

a) Solución para líquido intracelular: 400mM
b) Soluciones para líquido intracelular: 100mM, 50mM, 20mM, 10mM,
5mM, 2.5mM, 1Mm
Preparación de la membrana celular
El huevo cuenta con una parte apical estrecha y una basal más ancha. En
el interior del huevo en su parte basal, se encuentra una cámara de aire
que separa a las membranas y se procede de la siguiente manera:
1.- Vaciar el contenido del huevo rompiendo su parte apical.
2.-Lavar la parte interior del cascarón cuidadosamente
3.-Exponer la región externa de la membrana basal resquebrajando la

región central de la parte basal del cascaron retirándolo con sumo
cuidado.
Simulación de las condiciones electrolíticas

1. Llenar vaso de precipitado con solución 1mM y ésta solución se irá
cambiando por las demás soluciones extracelulares 2.5 mM, 5mM,
10mM, 20mM 50mM y 100mM
2. Llenar el cascarón con la solución 400mM
3. Colocar el cascarón sobre la solución
Medición del potencial transmembranal con electrodos polarizables
4. A partir de la ecuación de Nernst-planck se calcula el valor teórico

de potencial transmebranal que se espera registrar:
Ek=58log (k+)/(k+) = 58log(20/400)=-75.46mV
(Este es el valor teórico del potencial)
5. Colocamos el voltímetro la escala más adecuada para medir con la

mayor precisión un valor de orden -75mV.
6. Conectar las puntas del voltímetro a los alambres de plata.
7. Introducir los dos electrodos de plata dentro del líquido
extracelular teniendo cuidado de que no se toquen entre sí.
8. Comparase el voltaje hasta que la diferencia de potencial medida de
los dos electrodos sea cero.
9. Introduzca el electrodo común del voltímetro en el líquido
intracelular dejando el positivo en el líquido extracelular.
10. Repita 3 veces los pasos, observe y registre lo que sucede con el
valor de mV en función del tiempo.
11. Calcular la media y la desviación estándar de los datos obtenidos.
12. Tabule y anexar el valor esperado de acuerdo a la ecuación de
Nernst como el valor obtenido experimentalmente.
13. Grafique concentración contra potencial para ver el
comportamiento del potencial.
VI. Resultados.
a. Cálculos
VII. Discusión.
VIII. Conclusiones.
IX. Anexos
X. Bibliografía
Organelos Celulares y Demostración de Fosfatasa ácida
Práctica No. 4
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I. Introducción
Organelos
Existen dos tipos de células: las eucariotas y las procariotas. Las primeras son las
que componen a todos los organismos pluricelulares, tanto las células animales
como las vegetales son eucariotas. Las segundas son aquellas que son
autosuficientes en la naturaleza, tales como bacterias y arqueas. Ambos tipos de
células tienen una estructura similar que les permite cumplir con sus funciones;
esta estructura tiene tres componentes principales: La membrana, el citoplasma y
el núcleo (sólo en células eucariontes) estos son conocidos como organelos
celulares.
Desde el punto de vista de su procedencia, las células también se pueden clasificar

en célula animal y célula vegetal, pero ojo, estos dos tipos de células son siempre
eucariotas.
Las células animales no tienen una pared celular (en el exterior de la célula), son
heterótrofas porque son incapaces de sintetizar su propio alimento, incorporando
los nutrientes de los alimentos que poseen otros seres vivos, ya que no poseen
cloroplastos con clorofila para la fotosíntesis. Además presentan Lisosomas
funcionales para la digestión intra y extracelular (endocitosis y exocitosis).
La célula vegetal tiene una pared celular de celulosa, que hace que tenga rigidez.
Además estas células tienen los cloroplastos, con clorofila, que son los que gracias
a ellos realizan la fotosíntesis y por eso son autótrofos (son capaces de realizar su
propio alimento).
El cloroplasto es el plasto más importante. Los plástidos son organelos que

efectúan diversas funciones, como la síntesis de sustancias y el almacenamiento de
alimentos y pigmentos, sólo existen en las células de las plantas y algas.
Los plástidos se clasifican en leucoplastos (almacenan

almidón o en ocasiones proteínas o aceites);
cromoplastos (contienen pigmentos y se asocian con el
anaranjado y amarillo de flores, frutos y hojas otoñales), y cloroplastos (contienen
clorofila).
Los cloroplastos son los lugares donde se realiza la fotosíntesis, las células de las
hojas de las plantas verdes. Tienen formas diferentes y, al igual que las
mitocondrias, se dividen por alargamiento y constricción media. Contienen un
pigmento llamado clorofila, cuya función es la fotosíntesis: pueden encontrarse en
ellos otros pigmentos, como la xantofila, que es amarilla, y el caroteno, que es
naranja.
Fosfatasa ácida
El lisosoma es una vesícula membranosa que contiene enzimas hidrolíticas que

permiten la digestión intracelular de macromoléculas. Son orgánulos esféricos u
ovalados que se localizan en el citosol, de tamaño relativamente grande, los
lisosomas son formados por el retículo endoplasmático rugoso (RER) y luego
empaquetados por el complejo de Golgi.
En un principio se pensó que los lisosomas serían iguales en todas las células, pero
se descubrió que tanto sus dimensiones como su contenido son muy variables. Se
encuentran en todas las células animales. No se ha demostrado su existencia en
vegetales.
La mayoría de los lisosomas contienen ENZIMAS HIDROLASAS ÁCIDAS. Hasta

ahora se han identificado unos 40 tipos distintos de enzimas hidrolíticas, que
degradan proteínas (proteasas), ésteres de sulfato (sulfatasas), lípidos (lipasas y
fosfolipasas) o fosfatos de moléculas orgánicas (fosfatasas). No todas están
presentes en todos los lisosomas. La más común es la FOSFATASA ÁCIDA. El pH
es de 5 en el interior del lisosoma. Para mantener este pH, los lisosomas poseen en
su membrana una proteína transmembranal que bombea protones hacia el interior
del lisosoma. El pH 5 es el óptimo para la actuación de las enzimas.
La enzima fosfatasa ácida ubicada en los lisosomas, hidroliza al substrato B-

glicerofosfato. El fosfato liberado se precipita como fosfato de plomo mediante la
presencia de plomo en el medio-reacción. Este debe prepararse anticipadamente a)
Para permitir que el plomo precipite el fosfato libre que puede hallarse en las
muestras comerciales de glicerofosfato libre que puede hallarse en las muestras
comerciales de glicerofosfato y b) Para que el plomo se equilibre con el
glicerofosfato. No puede utilizar el calcio para esta captura (como en el método de
gomori de fosfatasa alcalina) debido a que el fosfato de calcio es soluble a pH en el
que la fosfatasa acida actúa en forma óptica.
Dado que el fosfato de plomo es incoloro o blanco, se tiene que trans forman en
sulfuro de plomo que tiene fuerte coloración (café o negro cuando se encuentra
concentrado). Al observarse que los tejidos han sido tratados en un pH acido para
producir fosfato de plomo, es probable que el cambio de pH distorsione mucho las
células, se debe sugerir entonces en sulfuro de amonio a un nivel muy alcalino de
pH, para transformar el precipitado en sulfuro de plomo. De aquí que el H2O-H2s
del aparato de kipp, o una solución de sulfato de sodio, se utiliza para este
propósito.
En un principio se pensó que los lisosomas serían iguales en todas las células, pero
se descubrió que tanto sus dimensiones como su contenido son muy variables. Se
encuentran en todas las células animales. No se ha demostrado su existencia en
vegetales.
Entre sus enzimas, la más importante es la fosfatasa ácida. En el caso de los

lisosomas se encuentran en la vacuola. Su polimorfismo resulta ahora
comprensible, puesto que actúan como vacuolas digestivas y esto proporciona
contenidos heterogéneos.
Una característica común entre ellos es que contienen ENZIMAS HIDROLASAS

ÁCIDAS. Hasta ahora se han identificado unos 40 tipos distintos de enzimas
hidrolíticas, que degradan proteínas (proteasas), ésteres de sulfato (sulfatasas),
lípidos (lipasas y fosfolipasas) o fosfatos de moléculas orgánicas (fosfatasas). No
todas están presentes en todos los lisosomas. La más común es la FOSFATASA
ÁCIDA. El pH es de 5 en el interior del lisosoma. Para mantener este pH, los
lisosomas poseen en su membrana una proteína transmembrana que bombea
protones hacia el interior del lisosoma. El pH 5 es el óptimo para la actuación de
las enzimas.
Composición química de la membrana de los lisosomas:
La hemimembrana interna de la membrana de los lisosomas está intensamente

glucosilada, lo que ayuda a proteger la membrana de los enzimas que contiene. La
membrana contiene proteínas de transporte que permiten que los productos finales
de la digestión (como azúcares y nucleótidos) sean transportados cara el citosol
donde van a ser utilizados por la célula o secretados al exterior. La membrana
también contiene una bomba de hidrógeno impulsada por ATP que bombea
hidrogeniones cara el interior del lisosoma, lo que hace que se mantenga el pH
ácido en su interior, pH ácido necesario para la actuación de las hidrolasas ácidas.
Formación de las enzimas lisosómicas y transporte al lisosoma
Los enzimas lisosómicos se forman en el RE donde se les va a añadir una manosa.

Del RE pasan por transporte vesicular a la cara cis del complejo de Golgi, y aquí, a
la manosa se le une un grupo fosfato. Avanzan por tansporte vesicular o tubular
por los diferentes sáculos del dictiosoma, y en la cara trans se van a unir la un
receptor situado en las membranas de estos sáculos de la cara trans. Estos
receptores reconocen la manosa-6-fosfato.
De la cara trans del C.G. se escinden vesículas recubiertas de clatrina.

Posteriormente el recubrimento de clatrina se pierde y por un transporte
dependiente de receptores que van a reconocer los lisosomas, estas vesículas se
van a fusionar con los lisosomas. Debido al pH ácido del interior del lisosoma, los
enzimas se disocian del receptor. Posteriormente se libera el grupo fosfato que
estaba unido a la manosa y ya tenemos los enzimas maduros. A su vez, ve a haber
un proceso de reciclaje de los receptores, mediante vesículas que se separan del
lisosoma y se fusionan con los sáculos de la cara trans del C.G.
Funciones de los lisosomas
Degradan los diferentes tipos de sustratos. Dependiendo de su origen, los

materiales siguen diferentes rutas incluso los lisosomas. El fluido extracelular y las
macromoléculas son captadas por pequeñas vesículas (pinocitosis). Estas pequeñas
vesículas, al fusionarse, forman endosomas tardíos. Estos endosomas tardíos se
fusionan con los lisosomas primarios y se forman los lisosomas secundarios donde
se produce la degradación del contenido de los endosomas. Las partículas
extracelulares son captadas por fagocitosis formándose fagosomas que se van a
fusionar con los lisosomas primarios dando

lugar a fagolisosomas donde se produce la
degradación de las partículas fagocitadas.
Otra ruta es la de utilizar partes viejas de la
célula, así se pueden ver lisosomas
digiriendo mitocondrias u otros orgánulos.
II.
III. Conocimientos previos
a) ¿Cuál es la clasificación de los plastos y define la función de cada uno de
ellos?
b) Explicación de la reacción del medio de reacción con el tejido.
c) Fotosíntesis
Investigar los siguientes términos:
- Membrana plasmática
- Citoesqueleto
- Retículo endoplasmático Rugoso, RER
- Ribosomas
- Retículo endoplásmico Liso, REL
- Aparato de Golgi
- Lisosomas
- Peroxisomas
- Mitocondrias
- Centríolo
- Pared celular
- Vacuolas
15. Menciona 6 organelos celulares y describe su función
16. Qué tipo de enzimas se encuentran en los lisosomas
17. Cuál es el fundamento del medio de reacción utilizado en la práctica?
18.
IV. Objetivo
Observar y conocer la función de los plastos y lisosomas en células vegetales y
animales. Así como conocer el manejo de animales de laboratorio.
V. Metodologia
. Material y equipo.
- Cajas Petri
- Porta objetos
- Cubre objetos
- Microscopio
- Vegetales: jitomate, zanahoria, papa, nabo (si se consigue) y algas elodea (se
consigue en acuarios). Traes de cada uno de los vegetales una pequeña
porción o 1 pieza para todo el grupo.
- Microespátula
- Cloroformo
cerrado y guantes
8) Procedimiento para organelos:
1. Hacer varias rebanadas de los vegetales lo más delgadas posible.
2. Pasar los cortes a una caja petri conteniendo agua de la llave durante 2
min.
3. Montar los cortes más delgados a un portaobjetos.
4. Observar al microscopio.
Procedimiento para fosfatasa ácida:
1. Matar el ratón rápidamente, primero se duerme con cloroformo y

posteriormente se desnuca, obtener los testículos y tomar una muestra lo
más delgada posible, colocarla en un portaobjetos.
2. Haga reaccionar las secciones colocadas en el portaobjetos a una
temperatura de 37°C en el medio-reacción, colocándolos en una caja de
Petri, dúrate una hora aproximadamente.
3. Al finalizar el tiempo de incubación, lavar con agua destilada para
remover todo el plomo que se observe como ion libre. Cubrir durante 1
min con agua destilada que ha sido saturada con H2S o bien por una
solución de sulfuro de sodio al 2% en ácido acético 0.1N.
Medio-reacción.
4. Agregue 0.53g nitrato de plomo y 40ml de una solución al 3% de B-

glicerofosfato de sodio a 400ml de una solución de acetato de sodio 0.05M:
Amortiguador de ácido acético a un pH=5. Déjese al menos de un día para
otro (preparación desde un día anterior) a una temperatura de 37°C,
durante cuyo tiempo, puede formarse un precipitado o floculación. Enfríe
y luego filtre, use de inmediato.
NOTA: No se necesitan preparar los 400ml de acetato de sodio, ésta

cantidad se ajusta dependiendo del número de equipos en el grupo (se
utilizan aprox. 5ml por equipo). También se ajustará las cantidades de
nitrato de plomo y de la solución al 3% de B-glicerofosfato dependiendo de
cuantos ml de solución de acetato de sodio 0.05M se necesiten. Se utilizarán
7 ml por equipo.
VI. Resultados.
VII. Discusion.
VIII. Conclusiones
IX. Anexos
X. Bibliografia
División Celular: Mitosis y Meiosis
Práctica No. 5
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I. Introducción
El crecimiento y desarrollo de los organismos vivos depende del crecimiento y
multiplicación de sus células, cuando una célula se divide la información genética
contenida en su ADN debe duplicarse de manera precisa y luego las copias se
transmiten a cada célula hija.
En las células eucariotas el ADN está organizado en más de un cromosoma, siendo

el proceso de división celular más complejo.
El ciclo celular de las células eucariontes se divide en 4 fases. Fase G1, Fase S, Fase
G2 y Fase M. Las primeras 3 Fases son parte de un período denominado Interfase
durante el cual la célula aumenta de tamaño, el DNA de los cromosomas se replica
y se duplica el centrosoma.
La fase M consiste en la división nuclear, o mitosis, y la división citoplasmática, o

citocinesis. La mitosis se compone por las siguientes fases: la Profase, la Metafase,
la Anafase y la Telofase; en cada una de estas fases se realizan procesos que
participan en la división de la célula. Con la mitosis se obtienen células hijas con la
misma cantidad de cromosomas que la célula madre.
La citocinesis consiste en división del citoplasma en dos, dando lugar a la
formación de dos células hijas.
La Meiosis es un proceso de división de las células germinales (sexuales), en el cual

solo se transmite a cada célula nueva un cromosoma de cada una de las parejas de
la célula original. Por esta razón cada gameto contiene la mitad del número de
cromosomas que tiene el resto de las células del cuerpo. Este proceso se lleva a
cabo en dos divisiones nucleares y citoplasmáticas, llamadas meiosis I y meiosis II.
Ambas comprenden profase, metafase, anafase y telofase.

14. Investigar:
- Ciclo celular y sus etapas
- Mitosis
- Meiosis
- Diferencia entre mitosis y meiosis
III. Objetivo
Observar las diferentes fases del ciclo celular en células eucariontes,
principalmente la etapa de división celular; observar las diferencias entre la
Mitosis y la Meiosis.
IV. Metodologia
- Microscopio
- Porta y cubreobjetos
- Vaso o recipiente (para sumergir la base del bulbo de la cebolla en agua)
- 1 vaso de p.p. de 125mL
- Plato caliente
- Navaja o pinzas de disección
- Bulbo de cebolla fresca de 5-7cm de diámetro
- Flor de tradescantia
2) Reactivos y soluciones
- Colorante de acetorcamín
cerrado y guantes.
4) Procedimiento.
PARTE A. MITOSIS
1. Quitar raíces y fibras secas de la base bulbo de cebolla sumergir solo la
base del bulbo de la cebolla en un recipiente con agua. Las raíces crecerán
en 2 o 3 días (hacerlo con anticipación).
2. Cortar 3 mm de la parte inferior de la punta de la raíz, ponerla en un
vidrio de reloj y agregarle gotas de colorante de acetocarmín hasta
cubrirla.
3. Dejar reposando 10 minutos.
4. Calentar el vidrio de reloj de 3 a 5 minutos (el líquido no debe hervir). No
dejar secar, agregar colorante si es necesario.
5. Hacer cortes más delgados de la raíz teñida y disgregar sobre el
portaobjetos, cubrir la preparación con un cubreobjetos presionar
firmemente para convertir el material del portaobjetos en una capa
delgada.
6. Examinar en el microscopio y localizar algunas células en cada etapa de la
mitosis.
PARTE B. MEIOSIS
1. Recibir del profesor una muestra de Tradescantia.

2. Extraer de las anteras la mayor cantidad de granos de polen posibles,
colocarlos sobre un portaobjetos agregar una gota de acetocarmín y cubrir
con cubreobjetos.
3. Pasar el portaobjetos sobre la llama del mechero, dejar enfriar.
4. Presionar firmemente para convertir el material del portaobjetos en una
capa delgada.
5. Observar la muestra en el microscopio, trate de localizar algunas células
en cada etapa de la meiosis.
V. Resultados
VI. Discusión
VII. Anexos
VIII. Bibliografía
Práctica No. 6
FACTORES DE DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS
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I. Introducción
Las proteínas se encuentran en diferentes concentraciones dentro de los
organismos, para conocer cómo determinarla es necesario conocer algunas
propiedades de las mismas.
La desnaturalización proteica es cuando se realiza cualquier modificación de su

conformación a niveles de la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria que no
vaya acompañada por la ruptura de los enlaces peptídicos implicados en la
estructura primaria. Por lo que se generan cambios a las propiedades químicas,
físicas y biológicas. Puede ocurrir por acción térmica, fuerzas mecánicas, agentes
químicos, etc. Durante este proceso las moléculas plegadas y enrolladas de las
proteínas, se desdoblan, por lo que se da la coagulación o agregación de las
moléculas, formando un gel.
La sensibilidad de las proteínas a la desnaturalización térmica, depende de factores

como su naturaleza, concentración, actividad del agua, pH, fuerza iónica, etc.

a. ¿Qué sustancias se utilizan para la desnaturalización proteica?
b. ¿Qué es absorbancia?
III. Objetivo
Identificar el efecto de la concentración, la mezcla con otras substancias, el pH en la
temperatura de desnaturalización de las proteínas contenidas en la clara del huevo.
Metodologia
1) Material y equipo
Termómetro
- Tiras de pH
- Vasos de precipitado
- Tubos de ensayo
- Pipetas
- Mechero o plato caliente
- Gradilla para tubos de ensayo
- Clara y yema de huevo
- Agua destilada
- Sacarosa
- ácido cítrico al 40%
- NaOH 2N
- Equipo de seguridad completo: bata de algodón, lentes de seguridad,
zapato cerrado y guantes.
- Manejo cuidadoso del material a utilizar.
Desechar cada reactivo en el recipiente correcto
5) Procedimiento
PARTE A. DETERMINACIÓN DE LAS TEMPERATURAS DE

DESNATURALIZACIÓN (COAGULACIÓN) DE LAS PROTEÍNAS DEL HUEVO.
1. Separar la clara del huevo en dos vasos pequeños de precipitado. Poner

una pequeña cantidad de clara de huevo en un tubo de ensayo y calentar
el tubo suavemente dentro de un vaso de precipitado con agua (baño
maría, con la precaución de no llevar a ebullición).
2. Sujetar un termómetro dentro del tubo de ensayo. Anotar la temperatura
en la cual la albúmina de huevo se pone opaca, es decir coagula (aprox. A
los 60°C).
3. Repetir lo anterior utilizando yema de huevo y encontrar la temperatura
de coagulación para esta proteína. El cambio se reconoce más difícilmente
(aprox. a los 65-70°C).
PARTE B. EFECTO DE DISTINTOS FACTORES SOBRE LA TEMPERATURA DE

DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL HUEVO.
A)Efecto de la concentración de proteína (dilución).

1. Diluir con agua destilada las muestras de clara y de yema de huevo (2:1,
huevo-agua) y agregar 3 ml de cada una de las diluciones en un tubo cada
una.
2. Mezclar muy suavemente.
3. Repetir la prueba anterior y registrar las temperaturas de coagulación.
B)Efecto de la adición de azúcares (sacarosa):
1.Añadir 1.5 ml de una solución de sacarosa al 50% (p/v) a 5 ml de

albúmina de huevo y mezclar suavemente.
2. Determinar la temperatura de desnaturalización.
C)Efecto de la adición de ácidos y bases (influencia de pH).
1. Medir el pH de la clara de huevo y anotar su temperatura de coagulación.

2. Añadir a 3 ml de la clara de huevo, unas gotas de ácido (3 gotas de ácido
cítrico al 40%) hasta pH=4.8 (pI) y a otro 3 ml de clara de huevo agregar
gotas NaOH 2N hasta conseguir una muestra alcalina.
3. Repetir las pruebas y anotar las temperaturas de coagulación. Valores
extremos de pH pueden causar coagulación. Por lo que el ensayo no se
debe realizar bajo esas condiciones. En el punto isoeléctrico una proteína
es menos soluble, por lo que coagulara más rápidamente.
4. El punto isoeléctrico para la albúmina de huevo es de un pH de 4.8 con los
valores de pH más cercanos a 4.8 la temperatura de coagulación será más
baja.
IV. Resultados
Tabla I: Determinación de las temperaturas de desnaturalización de las proteínas
del huevo con distintos factores.
Factores Temperatura de Temperatura de
desnaturalización de la desnaturalización de la
clara (°C) yema (°C)
Muestra sin factor
Dilución 2:1 con agua
Sacarosa
pH Ácido
cítrico
NaOH
pH de la muestra
Ácido cítrico
NaOH
Muestra sin factor
V. Discusión
VI. Conclusiones
VII. Anexos
VIII. Bibliografía
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD Y
PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA
Existen distintos métodos para determinar las concentraciones de las proteínas.

Dentro de ellos se encuentran los siguientes métodos:
1. Biuret: Se crea un complejo en el que se colorea con cobre el enlace

peptídico.
2. Lowry: Se crea un complejo y un derivado de la tirosina que
contribuye con la absorbancia total.
3. Bradford: Se emplea un colorante hidrofóbico que en presencia de
ácido fosfórico; tiene un color café y al entrar en contacto con el
entorno hidrofóbico del interior de la proteína, origina un color
azul que puede ser medido.
Para calcular las concentraciones de las proteínas totales es necesario realizar una
curva de calibración, empleando un patrón.
Ensayo de proteína Bio-Rad
El ensayo de proteína bio- rad, basado sobre el método de Bradford (1976), es un

simple y exacto procedimiento para determinar la concentración de proteína
solubilizada involucra la adición de un colorante ácido (el reactivo empleado
contiene colorante azul de coomassie G2509, ácido fosfórico y metanol) a una
solución de proteína, y después media a 595 nm con un espectrofotómetro. La
Comparación con una curva estándar da una relativa medida de la concentración
de proteína. El ensayo de proteína bio-rad es un método que se basa en el cambio
de color de un colorante, dependiendo de las diferentes concentraciones de
proteína. La absorbancia máxima para una solución ácida de azul brillante de
coomassie va desde 465 nm hasta 595 nm cuando se une a proteínas. El colorante
azul de coomassie se une principalmente a residuos aminoácidos básicos y
aromáticos, especialmente a arginina. Spector (1978) encontró que el coeficiente de
extinción de una solución del complejo colorante-albúmina era constante en un
rango de diez veces la concentración. Sin embargo, se debe aplicar la ley de Beer
para obtener una cuantificación apropiada de la proteína.
Objetivo: Conocer el fundamento y realizar la cuantificación de la proteína total

contenida en una muestra biológica por el método de Bradford.
CONOCIMIENTOS PREVIOS
¿Cuál es el fundamento de los métodos de cuantificación de proteínas

mencionados anteriormente?
¡Qué otros métodos o técnicas conoces?
PARTE C. MÉTODO DE BRADFORD
1. Preparar de 3 a 5 disoluciones de una proteína standard que sea

representativa de la solución de proteína que va a ser examinada. El rango
lineal del ensayo para BSA es de 1.2 a 10 ≤g/ml. Mientras que con IgG el
rango lineal es de 1.2 a 25 ≤g/ml
2. Medir 800≤L de cada estándar y colocar la muestra en una celda
3. y seco. Las soluciones de proteínas se realizan comúnmente en
duplicados o triplicados
4. Poner 200≤L de colorante a cada celda.
5. Incubar a temperatura ambiente por lo menos 5 minutos. La absorción se
incrementara con el tiempo, las muestras deben incubarse a temperatura
ambiente por no más de 1 hora
6. Medir absorción a 595nm
7. Preparación de la solución stock para la curva:
3.
Solución 0.1 ≤g/ml: 104.2≤g/ml (150≤g) de la solución comercial de
BSA(1.44mg/ml)
1395.8≤l de H2ODD
Celda Concentración Vol. BSA H2O Reactivo de Bradford

BSA (0.1 μg/μL) (μL) (μL)
(μg/μL)
1 - - 800 200
2 1 10 790 200
3 5 50 750 200
4 10 100 700 200
5 15 150 650 200
6 20 200 600 200
7 2 798 200
8 5 795 200
8. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y leer a 595 nm. Calcular la
regresión lineal o graficar para extrapolar las muestras no conocidas sobre
la curva.
IX. Resultados
a. Cuantificación de proteína
Muestra Concentración
(μg / μL) Absorbancia
4. Calcular la concentración de la muestra problema

𝑦−𝑏
𝑥=  y = mx + b
𝑚
m = Pendiente; b = ordenada al origen ; y = Absorbancia
Muestra Concentración
Absorbancia (μg / μL)
Problema
Identificación de Aminoácidos
Práctica No. 7
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I. Introducción
Un aminoácido es una molécula orgánica con un grupo amino (-NH2) y un grupo
carboxilo (-COOH).
Los aminoácidos se pueden clasificar según diversos criterios. Limitándonos a

grupos representativos:
o Aminoácidos con un anillo fenólico: Fenil-analina y tirosina

o Aminoácidos que contienen azufre: Cistina, Cisteína, Metionina.
o Aminoácidos con un grupo guanídico: Arginina.
o Aminoácidos derivados del indol: Triptófano.
a) ¿Cuáles son los métodos que existen para la identificación de
aminoácidos?
III. Objetivo
Identificar aminoácidos mediante reacciones específicas de sus grupos
estructurales.
IV. Metodología
- Termómetro
- Vasos de precipitado
- Tubos de ensayo
- Pipetas
- Mechero o plato caliente
- Clara y yema de huevo
- Agua destilada
- Ninhidrina
- Reactivo de Millon
- HNO3 concentrado
- NaOH 40%
- Ácido acético concentrado
- Ácido sulfanílico
- Nitrito de sodio 0.5%
- Pedir 0.5g de 2 aminoácidos de distintos grupos: metionina, triptofano,
tirosina, arginina, fenilalanina, cisteína.
- Reglamento general del laboratorio.
Desechar cada reactivo en el recipiente correcto
5) Procedimiento
Diluir 1 volumen de clara con 9 volúmenes de agua destilada (1:10) (preparar lo

que se vaya a necesitar en la práctica; sacar cálculos). Dejar una porción de clara sin
diluir (revisar práctica para sacar la cantidad a utilizar).
PARTE A. REACCIÓN CON NINHIDRINA
1. Colocar en 1 tubo de ensayo 1mL de agua, en otro tubo 1mL de clara

diluida y en otro 1mL de la muestra problema (el profesor la entregará).
2. Añadir 1 mL de ninhidrina a cada tubo.
3. Calentar suavemente a baño maría y observar cambio de color. Color azul
o rojizo-violeta indica presencia de aminoácidos.
PARTE B. REACCIÓN DE MILLON
1. Colocar en 1 tubo de ensayo 1mL de agua, en otro 1mL de clara SIN diluir
y 1mL de la muestra problema.
2. Añadir 1 mL de reactivo de Millon a cada tubo.
3. Colocar en baño maría y caliente hasta observar un cambio de color. Si el
color de la muestra problema da igual al de la clara de huevo indica
presencia del aminoácido fenólico (melón-café).
PARTE C. REACCIÓN XANTOPROTÉICA
1. Colocar en 1 tubo de ensayo 1mL de agua, en otro 1mL de clara diluida y

en otro tubo 1mL de la muestra problema.
2. Añadir 1mL de HNO3 concentrado a cada tubo lentamente y agitando.
3. Calentar hasta que hierva suavemente y anotar el color.
4. Dejar enfriar.
5. Agregar gota a gota NaOH 40% hasta alcalinizar y anotar color. Si el color
de la muestra problema da igual al de la clara de huevo indica que
contiene tirosina o bien, una proteína que contiene este aminoácido (rojo
ladrillo).
PARTE D. REACCIÓN CON ACETATO DE PLOMO
1. Colocar en 1 tubo de ensayo 2 mL de agua, en otro 2mL de clara SIN

diluir y en otro tubo 2mL de la muestra problema.
2. Añadir 5 gotas de NaOH 40% a cada tubo.
3. Hervir a baño maría durante dos minutos y agitando.
4. Agregar 5 gotas de disolución de acetato de plomo.
5. Anotar color del precipitado. Si el color de la muestra problema da igual
al de la clara de huevo indica que contiene azufre. Da un color café
obscuro.
6. PARTE E. REACCIÓN DE SAKAGUCHI
1. Colocar en 1 tubo 2.5 mL de agua, 2.5 mL de clara diluida y 2.5 mL de la

muestra problema.
2. Añadir 1mL de NaOH al 40% a cada tubo. Mezclar.
3. Dejar reposar en baño de hielo a 2- 4 °C o en refrigerador por 15 minutos.
4. Añadir 2.5mL de alfa-naftol 0.15% y 10 gotas de reactivo de Sakaguchi.
Mezclar.
5. Reposar 30 minutos. Anotar el color producido. El color de la muestra
problema igual al de clara de huevo indica que contiene arginina u otro
aminoácido guanídico (naranja).
PARTE F. REACCIÓN CON ÁCIDO GLIOXÍLICO
1. Colocar en 1 tubo de ensayo 1mL de agua, en otro 1mL de clara diluida y

en otro 1mL de la muestra problema.
2. Añadir 2mL de ácido acético concentrado (contiene impurezas de ac.
Glioxílico) y mezclar.
3. Añadir a cada tubo 1.5 mL de H2SO4 concentrado muy cuidadosamente y
por las paredes (tubo inclinado).
4. Observar la formación de un anillo de color en la superficie de separación
de las 2 fases. La formación de un anillo (violeta-naranja) significa que la
muestra problema contiene triptófano.
PARTE G. REACCIÓN DE EHRLICH
1. Colocar en cada tubo de ensayo 1mL de ácido sulfanílico y 1mL de nitrito

de sodio al 0.5% (preparar 3 tubos).
2. Dejar reposar durante 15 minutos.
3. A un tubo agregar 1 ml de agua, en otro agregar clara diluida y en otro la
muestra problema.
4. Alcalinizar cada tubo con gotas de hidróxido de amonio 10%.
5. Anotar color producido. El color de la muestra problema igual al de la
clara de huevo indica que contiene histidina o tirosina (o ambas)(rojo-
naranja).
V. Resultados
VI. Discusión
VII. Conclusiones
VIII. Anexos
IX. Bibliografía
Millon-fenólicos
Xantoporteca- tirosina
Acetato de plomo-azufrados
Sakaguchi- arginina
Ac glioxilico- triptofano
Ehrlich- Histidina o tirosina

Electroforesis SDS Page
Práctica No. 8
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I. Introducción
La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida,
comúnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide
gel electrophoresis') es sin duda una de las técnicas más ampliamente usada para
caracterizar mezclas complejas de proteínas. La electroforesis en poliacrilamida es
un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues se requieren
sólo cantidades del orden de microgramos de proteína.
Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que
tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de
desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es
proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor
carga por unidad de masa más rápida será la migración. Empleando geles de sílice
o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a
los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta (carga total/masa)
entre proteínas. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de
poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las
proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño
y forma de las proteínas. Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es
que son químicamente inertes, transparentes y estables en un rango amplio de
pHs, temperatura y fuerza iónica.
Existen diferentes tipos en función del tipo de separación empleado: electroforesis

de zona (separación en función de la carga), isoelectroenfoque y separación por
tamaño en tamiz molecular (también aplicable a ácidos nucleicos). Electroforesis
de zona: las proteínas son moléculas anfóteras: su carga neta depende del pH del
medio. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se hace a pH
alcalino, en el que la mayoría de las proteínas presentan una carga global negativa.
También se puede trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que las
proteínas precipitan en medio ácido (básicamente se usa en la detección de
variantes de la hemoglobina).
Como medio de soporte se puede usar (de más antiguo a más reciente): papel,
acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar. La muestra
cuyas proteínas se quieren separar se inserta en un medio de soporte y se aplica
una diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las
proteínas. Cada proteína migrará más o menos en función de su carga (que
también determina hacia qué polo se dirigirá la proteína, ánodo (-) o cátodo (+) y
su tamaño. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de migración.
Isoelectroenfoque: en lugar de separar las proteínas en función de su carga a un

pH dado, se separan en función de su punto isoeléctrico (pI): el pI es el pH en el
que la carga neta de la proteína es nula, y depende de la composición aminoacídica
de la proteína. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a
lo largo del gel). Cada proteína migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual
precipitará al acumularse (de ahí el nombre, isoelectroenfoque).
También se suelen utilizar acoplados a zimogramas si deseamos determinar el pI

de una enzima o en electroforesis bidimensional como primera dimension.
Separación por tamaño: permite separar proteínas y ácidos nucleicos. En el caso

de las proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su
carga sea negativa y todas migren hacia el ánodo (no es necesario hacer eso con los
ácidos nucleicos, ya que tienen carga negativa); la separación se hace en medios de
soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las
proteínas más pequeñas corran más que las más grandes.

a) Fundamento de la Electroforesis en poliacrilamida PAGE
b) Aplicaciones de la electroforesis PAGE
III. Objetivo
• Obtener el conocimiento teórico y práctico de la técnica de electroforesis
de proteínas (SDS-PAGE).
• Realizar la preparación de geles para electroforesis.
• Realizar una cuantifica de proteínas por el método de Bradford para saber
la cantidad a utilizar en la electroforesis.
IV. Metodología
- Equipo para electroforesis
- Solución A Acrilamida (30% acrilamida, T, 2.67% C)
- Solución B Amortiguador para el gel inferior separador (1.5 M Tris-HCl pH
8.8)
- Solución C Amortiguador de gel superior o concentrador (o.5 M Tris-HCl
pH 6.8)
- Solución D SDS 10%
- Solución F Amortiguador de electrodo (de corrida) 5X pH8.3
- Solución E amortiguador de la muestra (Tris-HCl 0.05 M 10% SDS pH 6.8)
- PSA persulfato de amonio 10%
- Solución para teñir geles (azul brillante de coomassie R-250 0.1%)
- Metanol 40%
- Ácido acético 10%
- Etanol
- Reglamento general del laboratorio.
4) Disposición de Residuos
Desechar cada reactivo en el recipiente correcto.
5) Procedimiento
 Preparación de soluciones
o Solución A: Acrilamida (30% T, 2.67% C)

- (30 % acrilamida; 0.8 % de bis-acrilamida)
- 30 g de acrilamida
- 0.8 g de N’N’-bis-metilen-acrilamida
- Cuanto baste para 100 ml de DDH2O
- Mezclar con agitador magnético, filtrar con papel Whatman No. 1 y
conservar a 4ºC.
Nota: muy tóxico, usar guantes.
5. Solución B: Amortiguador para el gel inferior o separador

- (1.5 M Tris-HCl, pH 8.8)
- 18.17 g de Tris-base
- Mezclar con 50 ml de DDH2O en el agitador magnético, agregar HCl 1N
hasta que el pH sea de 8.8, ajustar a 100 ml y conservar a 4ºC.
6. Solución C: amortiguador del gel superior o concentrador

- (0.5 M Tris-HCl, pH 6.8)
- 6.06 g de Tris-base
- Mezclar con 50 ml DDH2O en agitador magnético, agregar HCl 1N hasta
que el pH sea de 6.8, ajustar a 100 ml y conservar a 4ºC.
7. Solución D: SDS 10%

- 5g de SDS (pesar en el vaso)
- Ajustar a 50 ml y consevar a 4ºC
8. Solución F: Amortiguador del electrodo (de corrida) 5X, pH 8.3
- Tris-base 7.55g
- Glicina 36 g
- SDS 2.5 g
- Ajustar a 500 ml, mezclar y guardar a 4ºC. No ajustar pH.
9. Solución E: Amortiguador de la muestra

- (Tris-HCl, 0.5 M 10%, SDS pH 6.8)
- H2O 4.0 ml
- C 1 ml
- D 1.6 ml
- Glicerol 0.8 ml
- Azul de bromofenol 0.2 ml (0.5%)
- 2-β mercaptoetanol 0.4 (reductoras) (agregar en el momento). Para
condiciones no reductoras, se ponen 4.4 ml de H2O.
10. PSA: Persulfato de amonio 10%

- 100 mg de persulfato de amonio en 1 ml de H2O.
- Se prepara en el momento. Solo pesarlo, hidratar hasta el momento de
usarse.
11. Solución para teñir geles:

- Azul brillante de Coomasie R-250 0.1 %
- Metanol 40%
- Ácido acético 10%
12. Solución para secar geles:

- Etanol 35%
- Glicerol 2%
PARTE A. PREPARACIÓN DE LOS GELES
1. Lavar los vidrios con agua y jabón con las yemas de los dedos y secar con
aire. Limpiar los vidrios con solución amoniacal al 10% o con alcohol con
gasa con el objeto de quitar la grasa, ya que esta no permite polimerizar la
acrilamida.
2. Atemperar soluciones metiendo los frascos en un baño de agua.
3. Colocar el ensamblador en la cuneta de la torre con las pestañas hacia
arriba, tornillos hacia atrás; empujar con la placa de plástico los
separadores hasta que se encuentren en los extremos del ensamblado
totalmente verticales. Con el acrílico transparente presionar el ensamblado
y apretar los tornillos superiores. Verificar la alineación y apretar tornillos
inferiores.
4. Acomodar los ensambles en la torre. Presionar el acrílico del ensamble
sobre el hule hasta que se inserte el ensamble en la pestaña de la torre (45º
empuje hacia abajo y atrás).
5. Pesar el persulfato de amonio (la solución debe ser preparada fresca cada
vez). Hidratar 0.0100g en 100 microlitros aproximadamente (10%).
Preparar la solución del gel separador según la concentración requerida
(ver tabla: para 10 ml suficiente para 2 geles de 5x9 cm de un mm de
grosor), sin el SDS ni los catalizadores para desgasificar durante 5
minutos. Una vez desgasificado, añadir los catalizadores.
Gel resolvedor 7.5 10% 12% 12.5 % 15% Gel concentrador (4%)
Para vidrios de 1 %
mm
H2O (ml) 4.85 4.35 3.35 3.2 2.35 H2O (ml) 3.05
Solución B (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Solución C (ml) 1.25
Solución A (ml) 2.5 3.0 4.0 4.15 5.0 Solución A (ml) 0.65
Desgasificar 5 minutos (quitar burbujas)
Solución D 100 100 100 100 100 Solución D 50
(microlitros) (microlitros)
TEMED 5 5 5 5 5 TEMED 5 ó10
PSA 10% 50 50 50 50 50 PSA 10% 25
6. Llenar el espacio de entre los vidrios hasta una altura de 2 cm antes del
extremo del vidrio pequeño. Con una jeringa Hamilton, cubrir con agua la
interfase para evitar la formación de meniscos (también puede utilizarse
alcohol isopropílico).
7. Esperar a que se complete la gelificación, aproximadamente, 30 minutos.
8. Secar el agua introduciendo un pedazo de papel filtro.
9. Preparar la solución del gel concentrador (4%) con las mismas
indicaciones para desgasificar. Aplicar la solución sobre el gel separador
ya formado casi hasta el borde. Introducir el peine según el grueso de los
separadores utilizados, así como la cantidad de pozos requerida. Aplicar
más solución hasta cubrir los bordes.
PARTE B. ELECTROFORESIS
1. Preparar las muestras para analizar en volúmenes totales adecuados al

tipo de peine utilizado (volumen del pocito). Para peines de 15 pozos y 1
mm de grosor, trabajar con volúmenes máximos de 10 microlitros (se
agregarán otros 10 con amortiguador de la muestra, que contiene glicerol
para que por efecto de la densidad se evite al máximo la difusión hacia el
buffer de corrida).
2. Hervir las muestras 5 minutos.
3. Montar la cámara con los geles asegurándose de que el hule selle bien y no
se presenten fugas. Quitar el gel no polimerizado con pedacitos de papel
filtro. Se pueden lavar primero los pozos y después secar con el papel.
Poner parte del amortiguador de corrida en el tanque y colocar la cámara
en su interior. Llenar el centro de la cámara con amortiguador. Tapar el
tanque con los electrodos y conectarlos a la fuente de poder. Encender la
fuente de poder con un voltaje constante: 100 v primeros 20 minutos hasta
que el frente llega al gel separador (marca a 2 cm en el vidrio pequeño) y
150 v después de 1 hora hasta el final del gel.
4. Desconectar la fuente y sacar la cámara; despegar los vidrios con los
separadores haciendo palanca. Despegar el gel y dejarlo caer en la caja con
colorante. Teñir durante 2 horas (o el tiempo necesario para que el
colorante difunda por todo el gel) y desteñir con ácido acético/metanol
hasta que el fondo se aprecie claro. Si no se desea teñir el gel, puede
prepararse para una transferencia.
13. Resultado de electroforesis
V. Discusión
VI. Conclusiones
VII. Anexos
VIII. Bibliografía
Catálisis Enzimática
Práctica No. 9
- Realizó:
- Revisó:
- Autorizó:
- Fecha de Entrega:
I. Introducción
Las enzimas son proteínas que se encargan de catalizar reacciones biológicas
específicas, actuando por reducción de energía de activación de las mismas
reacciones.
Dentro de las enzimas de clase 1 se encuentra la enzima llamada catalasa, su

función se considera muy importante ya que cataliza la descomposición de agua
oxigenada, reduciendo su toxicidad. Esta enzima, como otras, es alterable por la
presencia de activadores o de inhibidores y por los factores que afectan la
estructura y conformación proteica, como son principalmente el pH, la
temperatura y la concentración. Los tejidos que no tienen adecuada cantidad activa
de la catalasa, son muy sensibles a la acción nociva del agua oxigenada y otros
peróxidos.
Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces α-1,4 glucosídicos
de las moléculas de almidón y glucógeno. Dentro de las amilasas existen dos
grupos: α y β amilasas.
Las α-amilasas hidrolizan al azar los enlaces internos glucosídicos α-1,4 de

carbohidratos que contienen más de 3 unidades de glucosa, dando almidón
soluble, eritrodextrinas, acrodextrinas, maltotriosa, finalizando en maltosa y
glucosa. Las β-amilasas hidrolizan los enlaces α-1,4 glicosídicos de polisacáridos,
eliminando maltosa a partir del extremo no reductor de la cadena (exoamilasa),
suspendiendo la hidrólisis cuando llega al punto de ramificación α-1,6.
II. Conocimientos Previos

a) ¿Cómo se clasifican las enzimas?
b) ¿Qué efecto produce el cianuro sobre la catalasa?
c) ¿Qué son las amilasas?
d) ¿Qué es la α-amilasa y cuál es su función?
e) ¿Qué es la β-amilasa y cuál es su función?
f) ¿En qué consiste la hidrolisis de almidón?
III. Objetivo
Comprobar la presencia de catalasa mediante la reacción con peróxido de
hidrógeno, observar su actividad ante ciertos inhibidores y medir
cuantitativamente su actividad específica; así como la presencia de amilasa con
sacáridos.
IV. Metodología
- 15 Tubos de ensaye de los más pequeños
- 1 gradilla
- 3 pipetas de 1 ml
- 3 pipetas de 5 ml
- Baño María
- Matraz 50 mL
- Vasos de precipitado de 100 mL
- Pipetas pasteur o goteros (uno para cada tubo)
- Almidón al 1% en agua o en regulador de fosfatos 0.02 M
- Solución de yodo (lugol)
- Amilasa salival (ptialina): esta la proveerá el alumno en el momento de la
práctica. Se obtendrá de la saliva. Se necesita fresca.
- Cloruro de sodio al 5%
- Amortiguador de fosfato 0.02 M de pH 7
- H2O2 0.05M en amortiguador de fosfato 0.02M de pH 7
- Agua destilada
- KCN 5x10-4
- Catalasa: el estudiante la proveerá en el momento de la práctica. Se obtendrá
de la sangre.
- KMnO4 0.05M
- H2SO4 6N
Bata, lentes, guantes y reglamento general.
5) Procedimiento.
 Preparación de Reactivos
- Lugol: Pesar 1 g de KI y 500 mg de yodo y disolverlos en 100 mL de agua
destilada.
- Regulador de fosfatos 0.02 M pH 6.9: Pesar 7.12 g de Na2HPO4•12H2O y
aforar a 1000mL con agua destilada. Pesar 2.72 g de KH2PO4 y aforar a 1000
mL con agua destilada. Mezclar en proporción 6:4. Ajustar el pH si es
necesario. Ajustar las cantidades de los reactivos para el volumen que se
utilizará en la práctica.
PARTE A. AMILASA
 Preparación de la amilasa:
4.
5. Pruebas:
1. Se prepara una serie de 7 tubos de ensayo debidamente etiquetados de
acuerdo a la tabla, utilizando 5 diluciones diferentes de enzima.
2. Antes de agregar la enzima y a intervalos de 1 minuto después de
adicionada, haga la prueba de gota del contenido de cada tubo con
solución diluida de yodo (lugol). Transcurridos 10 minutos, haga las
determinaciones cada 2 minutos, que las lecturas se parezcan al tubo
testigo.(ANTES DE AGREGAR LA ENZIMA RESUSPENDA LA
SOLUCIÓN DE ALMIDÓN, YA QUE ÉSTE SE ASIENTA EN EL VASO
DE PRECIPITADO).
3. Se anota el tiempo inicial y final de la digestión en cada tubo.
 Preparación de los tubos:

No. De tubo 1 2 3 4 5 6 Testigo
Almidón 1% (mL) 0 1 1 1 1 1 0
Agua destilada
1 0 0 0 0 0 1
(mL)
Pre-incubación 5 minutos en baño maría a 37 °C
1:10 1:5 1:10 1:20 1:40 1:50 0
Enzima (ml)
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
NaCl 5% 1 gota a cada tubo y agitar
Incubación 37°C en baño maría
Lectura (min) Color
0
2
4
6
8
10
PARTE B. CATALASA
 Preparación de la Catalasa:
1. Se utiliza como fuente de enzimas una disolución de sangre fresca de
1:1000. Se ponen 10 mL de agua destilada fría en un matraz de 50 mL
rodeado de hielo picado. Se recoge una muestra de sangre fresca capilar
del dedo, del orden de 10 lambda (10 µL), mediante la punción de una
lanceta estéril.
2. Se deja caer la sangre en el agua fría. Se toma agua con la pipeta varias
veces para asegurar que toda la sangre pasó al agua. Se agita el matraz
durante un minuto para tener una mezcla homogénea. La sangre diluida
se mantiene a temperatura baja todo el tiempo para evitar una
inactivación de calor.
3. Los reactivos se preparan a partir de la tabla
4. Se preparan los tubos de ensayo de 18 x 150. Todos los reactivos deben
encontrarse a temperatura de hielo fundente, y la reacción se lleva a cabo
a 0 °C. Después de añadir cada componente, se mezcla el contenido de los
tubos por movimientos de rotación.
5. El tubo 1 es un blanco de reactivo y representa la cantidad total de H 2O2
añadida en cada tubo. En este tubo se añaden 2 mL de H2SO4 6 N antes de
añadir la enzima; el ácido debe añadirse a ese tubo antes de iniciar las
reacciones en los demás tubos. Se calcula la cantidad de KMnO4 0.005M
que se necesita para que reaccione con 2 mL de H2O2 0.05. Si el tubo 1 no
da un valor vecino calculado, se descompuso la solución en peróxido y
debe prepararse otra nueva.
6. En los tubos 2 a 5, la reacción se detiene 5 minutos exactamente después
de empezar, por adición de 2 mL de H2SO4. Después de terminar la
reacción en el momento indicado, la mezcla de enzima inactivada se pasa
a un vaso de 50 mL.
7. El H2O2 que no fue descompuesto por la catalasa permanece estable en la
solución ácida durante media hora aproximadamente. Durante este
periodo se termina la titulación del peróxido con KMnO4 0.005 M. La
primera gota de permanganato en exceso respecto a la cantidad necesaria
para la oxidación del peróxido vuelve rosa la solución.
Número de tubo 1 2 3 4 5
Amortiguador de fosfatos 0.02 M (mL) 10 10 10 10 10
2 2 2 2 2
H2O2 0
.05 M en amortiguador de fosfato 0.02 M (mL)
Agua (mL) 1.0 1.0 1.0 0.5 0
KCN 5x10-4 M (mL) 0 0 0 0.5 1.0
Catalasa (mL) 0.5 0.5 0 0.5 0.5
Catalasa calentada (mL) 0 0 0.5 0 0
V. Resultados
PARTE A.
a.
b. Indique el tiempo necesario para que la reacción sea completa en cada
tubo.
c. Calcule las unidades de amilasa en cada tubo, definiendo una unidad de
amilasa como “Número de milímetros de solución de almidón 1% que
pueden ser hidrolizados en 30 minutos, por 1 mL de extracto puro,
condiciones de pH y temperatura a la que haya trabajado”.
d. Explique brevemente, ¿Cómo demostraría que la reacción fue completa?
PARTE B.
a. Completa la siguiente tabla:

Número de tubo 1 2 3 4 5
mL de KMnO4 0.005 M utilizados
H2O2 restante
H2O2 descompuesto
Actividad específica
b. Cálculo de la actividad:
La actividad de la catalasa puede expresarse como µmoles de H2O2
descompuestos por efecto de la enzima en 5 minutos a 0 °C por mL de sangre.
Para empezar, puesto que se utilizó una solución 0.05 M de H2O2 al iniciar el
experimento, existían en este momento 100 µmoles de H2O2 en cada tubo. Para los
cálculos, el testigo de tiempo 0 es el número de µmoles de H2O2 encontrados en el
tubo 1; si se produjo alguna reacción enzimática, se encontrará una cantidad de
H2O2 inferior a los 100 µmoles existentes al principio. La estequiometría de la
descomposición del H2O2 por el permanganato indica que por cada 2 moles de
MnO4- que se añaden se descomponen 5 moles de H2O2. El factor es 2.5. Para
calcular los µmoles restantes de H2O2 deben multiplicarse por 2.5 los µmoles de
MnO4- que se añadieron. Restando la cantidad de H2O2 que no fue atacado de la
cantidad de H2O2 existente al principio (tubo 1) se pueden conocer los µmoles de
H2O2 descompuestos. Como se trabajó con una disolución de sangre de 1:1000, y el
ensayo se realizó con una muestra de 0.5 mL, los µmoles de H2O2 descompuestos
por la catalasa deben multiplicarse por 2000 para obtener la actividad específica de
catalasa correspondiente a la definición antes mencionada.
Se calculan las inhibiciones por 100 en los tubos 3 a 5, y se señalan en el reporte.

VI. Discusión
VII. Conclusiones
VIII. Anexos
IX. Bibliografía
Estructura y Funcionamiento de los Carbohidratos
Práctica No. 10
- Realizó:
- Revisó:
- Autorizó:
- Fecha de Entrega:
I. Introducción
Los carbohidratos son las biomoléculas más abundantes en la naturaleza. Se
conforman por monosacáridos (unidades básicas), oligosacáridos (oligómeros) y
polisacáridos.
Pueden representarse con la formula estequiométrica simple (CH2O)n. Sin

embargo, esta fórmula es una simplificación excesiva, ya que muchos
carbohidratos están modificados y algunos contienen grupos amino, sulfato y
fosfato.
Los carbohidratos desempeñan gran variedad de funciones en los organismos

vivos. De hecho el principal ciclo energético de la biosfera (fotosíntesis y oxidación
metabólica) depende en gran parte del metabolismo de los carbohidratos como el
glucógeno y el almidón.
La glucosa es el carbohidrato más importante. La mayor cantidad del carbohidrato

dietético pasa al torrente sanguíneo en forma de glucosa o es convertida en el
hígado y, a partir de ella, pueden formarse los demás carbohidratos en el cuerpo.
Es también el combustible principal de los mamíferos (excepto los rumiantes) y un
combustible universal para el feto.
Los polímeros insolubles de glúcidos actúan como elementos estructurales y de

protección en las paredes celulares de bacterias y plantas y en los tejidos
conjuntivos como lubricantes de articulaciones óseas o como adhesivos celulares.
Los polímeros complejos de glúcidos, unidos covalentemente a proteínas o lípidos,
actúan como señales que determinan la localización intracelular o el destino
metabólico de estos glucoconjugados.
a) ¿Cómo se define y cuál es la estructura de los carbohidratos?
b)
c) Clasificación de los carbohidratos.
d) ¿En qué consiste el método de Molish?
e) ¿En qué consiste el método de Tollens?
f) ¿En qué consiste el método de Seliwanoff?
g) ¿En qué consiste el método de Fehling?
h) ¿En qué consiste el método de solubilidad y reacción de yodo?
III. Objetivos
Comprender e identificar enlaces glucosídicos así como las reacciones que pueden
llevarse en los carbohidratos dependiendo de su conformación.
IV. Metodologia
- Tubos de ensaye
- Gradillas
- Perilla
- Baño maría
- Termómetro
- Pipetas 1ml
- Pipetas 2 ml
- Gotero
- Glucosa al 1%
- Sacarosa al 1%
- Furfural al 1%
- Arabinosa al 1%
- Almidón al 1%
- Maltosa al 1 %
- Lugol
- Reactivo de Molish al 1%
- Reactivo de Fehling, sol. A y B
- Reactivo de Tollens
- Ácido sulfúrico concentrado
- Reactivo de Seliwanoff
cerrado y guantes.
5) Procedimiento
 Preparación de soluciones y reactivos
- Glucosa al 1%: Disolver 1g de glucosa en 100mL de agua destilada.
Refrigerar.
- Sacarosa al 1%: Disolver 1g de sacarosa en 100mL de agua destilada.
Refrigerar.
- Fructosa al 1%: Disolver 1g de fructosa en 100mL de agua destilada.
Refrigerar.
- Arabinosa al 1%: Disolver 1g de arabinosa en 100mL de agua destilada.
Refrigerar.
- Furfural al 0.01%: Tomar 0.01mL (10 microlitros) de furfural y disolver en
100 mL de agua destilada.
- Solución de almidón al 1%: Pesar 1g de almidón y disolver en 100mL de
agua caliente.
- Maltosa al 1%: Pesar 1g de maltosa y disolver en 100mL de agua destilada.
- Lugol: Pesar 1g de yodo metálico, 2g de KI (2 partes de KI por una de yodo).
Mézclese en un mortero y agregue agua destilada poco a poco hasta
disolución total. Aforar a 300mL con agua destilada y conservar en un frasco
ámbar.
- Reactivo de Molish: Disolver 5g de α-naftol en 100mL de alcohol de 96°.
- Reactivo de Fehling: Solución A. Disolver 34.65g de sulfato de cobre en
300mL de agua destilada. Aforar a 500mL con agua y conservar en frasco
con tapón de hule.
- Solución B. Disolver 125g de KOH y 173g de tartrato de sodio y potasio.
Aforar con agua destilada a 500mL.
- Reactivo de Tollens: Mezclar 10mL de HCl concentrado con 2mL de
floroglucina al 2% y aforar con agua destilada hasta 18mL.
- Reactivo de Seliwanoff: Disolver 0.05g de resorcinol en 100mL de HCl
- diluido 1:3.
 Pruebas de identificación
PARTE A. REACCIÓN DE MOLISH
14. En un tubo de ensayo (para cada muestra marcada con * en la tabla
1) coloque 1mL de la solución a probar y 2 gotas del reactivo de
Molish
15. Mezclar bien y dejar resbalar por la pared 1 mL de ácido sulfúrico
concentrado, de tal manera que se forme una capa bajo la solución
del carbohidrato. En la interfase aparecerá un anillo de color violeta
rojizo lo cual indica la presencia de carbohidratos.
PARTE B. REACCIÓN DE TOLLENS
1. En un tubo de ensayo (para cada muestra marcada con * en la tabla 1)

colocar 1mL del reactivo de Tollens y 0.5 mL de la solución a probar,
mezclar y calentar a baño maría 1 h. La aparición de un color rojo cereza
en 2 o 3 minutos indicará positivo para pentosas. Solo con el furfural la
reacción positiva da color verde. La pentosa con HCl se convierte en
furfural y da coloración roja.
PARTE C. REACCIÓN DE SELIWANOFF
1. En un tubo de ensayo (para cada muestra marcada con * en la tabla 1)

colocar 1mL de la solución a probar y adicionar 0.5mL del reactivo,
calentar a baño maría 1 min, anotar en resultado y continuar calentando
observando el cambio de color a intervalos de un minuto durante 15
minutos. Las pruebas dan positivo para dos tipos de carbohidratos cuando
se obtiene un color rojo intenso o cuando dan la prueba muy débil y
ocurre lentamente. Precipitado rojo indica prueba positiva para cetosas.
PARTE D. REACCIÓN DE FEHLING
1. Testigo: mezclar 0.5 de Fehling A y 0.5 del B, añadir 2mL de agua

destilada y calentar a ebullición en baño maría para determinar si la
solución por sí misma produce un precipitado rojo parduzco de óxido
cuproso. Repetir en la misma forma la prueba pero usando 1mL de cada
una de las soluciones marcadas con * en la tabla 1 y 1mL de reactivo de
Fehling A y 1ml del B, calentar a baño maría y hacer lectura en intervalos
de un minuto durante 5 minutos. La prueba positiva color rojo cuproso
indica la presencia de azúcar reductor.
PARTE E. SOLUBILIDAD Y REACCIÓN DEL YODO
Solubilidad:
1. Ensayar la solubilidad en agua fría y caliente tomando 50mg de almidón y
disolviendo en 2 o 3mL de agua destilada.
2. Repetir esta prueba con sacarosa, glucosa y fructuosa.
Reacción del yodo:
1. Tomar 1mL de la solución de almidón y adicionar una gota de lugol,

observar el color producido caliente en baño maría al tacto (37°C).
2. Repetir la prueba con cada una de las soluciones anotando resultados e
interpretación.
V. Resultados
a. Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificación en carbohidratos.
Mollish Tollens Seliwanoff Fehling Solubilidad Yodo
(carboh) (pentosas) (cetosas) (Azúcar Frío (polisacarid)
Reduct) Caliente
Blanco H2O * * * * * * *
Glucosa * * * * * * *
(aldohexosa)
Arabinosa * * * *
Maltosa * * * * *
Sacarosa * * * * * *
Fructosa * * * * * *
Furfural * * *
Almidón * * * * * *
Interpretación
CÁLCULOS:
La cantidad indicada a continuación para preparar cada uno de los reactivos está
considerada para un solo equipo, por lo tanto las cantidades mostradas se tienen
que multiplicar por el número total de equipos, y deben considerar un equipo
extra por lo del pipeteo.
Se necesitan 5 ml de cada uno de los carbohidratos. Pedir 0.05g de cada uno.

Preparar 200 ul de lugol, 1ml de reactivo de Mollish, 8 ml de reactivo de Tollens, 4
ml de reactivo de Selliwanof, 9 ml de reactivo de Felling A y 9 ml del B; 100 mg de
cada uno de los carbohidratos indicados en la tabla para la prueba de solubilidad;
3 ml de furfural al 0.1%
VI. Discusion
VII. Conclusion
VIII. Anexos
IX. Bibliografía
Extracción y separación de lípidos totales de tejidos animales Práctica
No. 11
- Realizó:
- Revisó:
- Autorizó:
- Fecha de Entrega:
I. Introducción
Los lípidos son moléculas orgánicas que presentan funciones de reserva de
energía, estructura celular, biocatalizadores y como medio de transporte. Los
lípidos se pueden dividir en saponificables, estos en simples (acilgliceridos y
céridos) y en complejos (fosfolípidos y glucolípidos), y en insaponificables
(terpenos, esteroides, prostaglandinas).
Los lípidos son insolubles en agua y menos densos que ella. Se disuelven bien en
disolventes no polares, tales como el éter sulfúrico, sulfuro de carbono, benceno,
cloroformo y en los derivados líquidos del petróleo. Se encuentran lípidos tanto en
vegetales como en los animales. Muchos vegetales acumulan considerables
cantidades de lípidos en los frutos y semillas. Los animales tienen grasa en las
diferentes partes de su cuerpo, especialmente entre la piel y los músculos, en la
medula de los huesos y alrededor de las vísceras.
Hay lípidos solidos denominados grasas, y líquidos denominados aceites. El

término grasa se emplea para aquellas mezclas que son sólidas o semisólidas a
temperatura ambiente, en tanto que el término aceite a mezclas que son liquidas a
temperatura ambiente.
La fosfatidiletanolamina (PE) o cefalina es

un fosfolípido presente en las membranas
celulares, uno de los más abundantes en
los tejidos humanos. Está compuesta por
un glicerol esterificado en los hidroxilos 1 y 2
por dos ácidos grasos, y en el hidroxilo 3 con un grupo fosfato que, a su vez, se
esterifica con el aminoalcohol etanolamina, un derivado del etanol. La
fosfatidiletanolamina posee mayoritariamente ácido palmítico, ácido
esteárico u ácido oleico en posición 1 y un ácido graso poliinsaturado de cadena
larga, como el ácido araquidónico, e
posición 2. Es, junto con la fosfatidilcolina, uno de los fosfolípidos más frecuentes
en la bicapa lipídica de las membranas celulares.
La fosfatidilcolina o polienilfosfatidilcolina (tambié

n llamada lecitina) es un fosfolípido que, junto con
las sales biliares, ayuda a la solubilización de
los ácidos biliares en la bilis. Es el componente más
abundante de la fracción fosfatídica que puede
extraerse tanto de yema de huevo, como de granos
de soja. La fosfatidilcolina es uno de los principales constituyentes de las bicapas
lipídicas de las membranas celulares. Además es un componente de mayor
relevancia en la lecitina, y en algunos contextos, los términos se usan como
sinónimos. Sin embargo, el extracto de lecitina está constituido por una mezcla de
fosfatidilcolina y otros compuestos.
En esta práctica se asume que el extracto obtenido por extracción soxhlet

corresponde al contenido graso de la muestra. Se determina su masa, una vez libre
de disolvente, por pesada (método gravimétrico). Muchas veces, la extracción
soxhlet se usa como primer paso de una purificación o separación.
La extracción de muestras solidas con disolventes, generalmente conocida como

extracción solido- liquido o lixiviación, es un método muy utilizado en la
separación de analitos de muestras sólidas.
II. Conocimientos Previos

a) ¿Qué son los lípidos?
b) Clasificación de los lípidos.
c) ¿Qué es la lecitina (fosfatidilcolina colina)? Dibujar la estructura.
d) ¿Qué es la cefalina? Dibujar la estructura
e) Funciones de lípidos y ejemplos
f) ¿En qué consiste la condición patológica conocida como “hígado graso”?
g) ¿Cuáles son las causas más frecuentes del “hígado graso”?
III. Objetivo
• Realizar la identificación y cuantificación de lípidos en los tejidos
animales.
• Determinación del contenido graso de una muestra de leche en polvo
mediante extracción solido- liquido (extracción Soxhlet).
IV. Metodología
- 2 Vaso de precipitado de 50 mL
- Embudo de vidrio
- Tubos de ensaye
- Mortero
- Termómetro
- Plato caliente
- Varilla de vidrio
- Papel filtro
- Equipo de extracción de Soxhlet (MICROKIT)
- Bomba recirculadora
- Mangueras
- Pipetas
- ¼ Yema de huevo (alcanza para 4 equipos)
- Éter de petróleo
- Alcohol
- Acetona
- Hígado animal (1g)
- Éter etílico
- Sulfato sódico anhidro (2g)
- Muestra de leche en polvo a analizar (comprar leche nido u otra marca no
descremada, bolsa pequeña para todos los equipos)
cerrado y guantes.
5) Procedimiento
PARTE A. EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE LECITINA Y CEFALINA DE
HUEVO
1. Separe 1/4 yema de huevo en un vaso de precipitados o en un matraz
Erlenmeyer de 50 mL.
2. Agregue 10 mL de éter etílico
3. a la yema y agite con una varilla de vidrio para homogenizar bien.
4. Agregue lentamente y sin dejar de agitar 10mL de acetona. Se observara
que la acetona provoca la precipitación de los fosfolípidos, en tanto que las
grasas y el colesterol permanecen disueltos.
5. Dejar en reposo unos minutos y filtrar.
6. El precipitado que contiene lecitina y cefalina (en el papel filtro) se lava
con 5 mL de alcohol bien frio, recibiendo el filtrado en un tubo limpio y
seco.
7. La lecitina es más soluble en el alcohol frío por lo tanto queda en el
filtrado. En el papel filtro únicamente queda cefalina. Para obtener la
lecitina, evapore el alcohol lentamente en el plato caliente.
8. Deje secar los dos precipitados y péselos (pesar en un inicio el papel filtro
y el vaso).
PARTE B. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS TOTALES DEL HÍGADO
1. Pese 1gr de hígado animal y anote este peso.

2. Corte el tejido en fragmentos pequeños y póngalos en un mortero, con dos
veces su peso de sulfato de sodio anhidro.
3. Muela la mezcla en el mortero hasta obtener una pasta homogénea.
4. Agregue 5mL de alcohol y continúe homogenizando. Transfiera la papilla
a un matraz Erlenmeyer ayudándose con una porción más de alcohol de
5mL de modo que quede limpio el mortero.
5. Coloque el matraz en un baño de agua a 70°C y manténgalo en agitación a
esa temperatura durante 10 min.
6. Deje enfriar y agregue 10mL de éter etílico para completar la extracción;
agite bien y deje reposar hasta que se asiente por completo.
7. Decante el sobrenadante y agregue al residuo otra porción de 10mL de
mezcla de alcohol- éter en proporción 3:1; que se calienta a 70°C y se
decanta de la misma forma.
8. Evapore el éter de las decantaciones reunidos, colocando el matraz en el
baño caliente, hasta que ya no se desprendan disolventes.
PARTE C. EXTRACCIÓN DE GRASA POR EL MÉTODO SOXHLET
1. Pesar 1gr de la leche en polvo. Hacer con el papel filtro un paquete de tal
forma que la muestra quede segura. Colocar el paquete en la cámara de
extracción.
2. Pesar el balón vacío, en el cual posteriormente se depositara la grasa,
anote el peso. Fije el balón a la parte inferior del Soxhlet en forma segura,
con la finalidad de evitar la fuga del éter etílico.
3. Por la parte superior del Soxhlet vierta el éter etílico o de petróleo hasta
que por diferencia de presión baje a través del cuello de Soxhlet al balón,
luego añada éter etílico hasta cubrir el paquete. Fije bien el Soxhlet a la
parte inferior del refrigerante.
4. Empezar la extracción, extraer por 60 min.
5. Transcurrido el tiempo desmontar el aparato y secar el solvente que quedo
en el matraz y pesar para sacar por diferencia el peso de los lípidos.
6. Evite que la grasa depositada en el balón se queme.
V. Resultados
16. Cálculos
El porcentaje en grasa G (%) se calcula según la siguiente expresión:
𝑥 𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐺(%) = 𝑥100
1𝑔
VI. Discusión de resultados

VII. Conclusiones
VIII. Anexos
IX. Bibliografía
Pruebas Cualitativas para la Identificación de Lípidos
Práctica No. 12
- Realizó:
- Revisó:
- Autorizó:
- Fecha de Entrega:
I. Introducción
Los lípidos, son un grupo heterogéneo de compuestos, de naturaleza antipática, es
decir que contienen regiones hidrofóbicas y regiones hidrofílicas. La mayor parte
de los lípidos abundantes en la naturaleza (triacilgliceroles), están formados por
ácidos grasos de cadenas hidrocarbonadas pares, saturados o insaturados. Los
lípidos llevan a cabo múltiples funciones en el organismo, como: almacenamiento
de energía, de transporte, cumplir funciones hormonales, actuar como vitaminas,
formar parte de las membranas celulares confiriéndoles la propiedad de
permeabilidad selectiva, al permitir el paso o no de algunas sustancias y en
determinada dirección, así como la conducción nerviosa y el transporte activo
como la bomba de Na+/K+. A diferencia de los carbohidratos, proteínas y ácidos
nucleicos, no forman polímeros, son más bien moléculas pequeñas que presentan
una fuerte tendencia a asociarse mediante fuerzas no covalentes. Algunas de las
propiedades de los lípidos pueden ser usadas para su reconocimiento, ya que
pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos
coloreados, desprendimiento de vapores, formación de jabones, entre otros.

a) Estructuras de los lípidos.
b) ¿En qué consiste la reacción de saponificación?
c) ¿Qué es la acroleína y en qué consiste la prueba para acroleína?
d) ¿En qué consiste la prueba de Liberman-Buchard?
e) ¿En qué consiste la prueba del yodo?
III. Objetivos
Identificar las características de los componentes grasos en aceites vegetales
comunes.
IV. Metodología
- Tubos de ensaye
- Gradilla
- Pipetas graduadas de 10ml o de 5ml
- Pinzas para tubos de ensaye
- Vaso de precipitado para baño María
- Vaso de precipitados para calentar agua destilada
- Varilla de agitación
- Gotero
- Cápsula de porcelana
- Mechero bunsen
- Tripié
- Tela de asbesto
- Plato caliente
- Éter
- Cloroformo
- KHSO4
- H2SO4
- KOH
- Glicerina
- Aceites vegetales distintos por equipo.
- Reactivo de Hübl
- Anhídrido acético
- Yodo
- Cloruro de mercurio
- Alcohol etílico al 95%
ACEITES
Oliva, soya, girasol, canola, coco, almendras, ricino, mantequilla. Traer suficiente para
todas las pruebas y para todos los equipos.
Equipo de seguridad completo (bata de algodón, lentes de seguridad, zapato
cerrado y guantes).
5) Procedimiento
Las pruebas de solubilidad, yodo y acroleína se realizarán con todos los aceites que
se hayan llevado.
PARTE A.PRUEBA DE SOLUBILIDAD
1. Colocar en un tubo de ensayo para cada prueba 1mL de aceite y 1mL a

cada uno de los reactivos a probar (agua, cloroformo y éter).Observar la
solubilidad en cada caso.
PARTE B. PRUEBA DE YODO (dobles enlaces-desaparece color)
1. A los tubos usados para la prueba de solubilidad con éter, agregar 1 gota
del reactivo de Hübl, mezclar y esperar 5 min para observar cambios en la
coloración.
6.
Nota: Para preparar el reactivo de Hübl disolver 2.5g de yodo y 3g de cloruro de
mercurio (HgCl2) en 100mL de etanol al 95%. Ajustar la cantidad a preparar a lo
que realmente se necesite en la práctica.
PARTE C. PRUEBA DE ACROLEÍNA (glicerina)
Colocar 1ml de aceite en un tubo de ensayo para cada muestra, agregar 0.5 g de
KHSO4 y calentar fuertemente. Observar desprendimiento de vapores blancos e
irritantes y olor desagradable (prueba positiva).
PARTE D. PRUEBA DE LIEBERMAN (colesterol-verde)
17. Colocar en un tubo de ensayo para cada muestra 0.5mL de aceite

18. Añadir 1mL de anhídrido acético y agitar.
19. Después agregar 1mL de ácido sulfúrico, agitar suavemente y
observar la coloración.
PARTE E. SAPONIFICACIÓN
Realizar la saponificación con uno solo de los aceites.
1. Colocar en una capsula de porcelana 6mL de aceite y calentar >80°C.

2. Calentar >80°C en un tubo de ensayo 1.5mL de KOH al 85% y 1mL de
glicerol posteriormente adicionarlos a la cápsula de porcelana. Dejar
calentando 2 min y dejar enfriar.
3. Al producto obtenido colocar en un tubo de ensayo y agregar 2mL de
agua, observe sus propiedades espumantes y compare con el resto del
grupo.
V. Resultados.
a. Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificación de lípidos.
Muestra
Agua
Solubilidad Éter
cloroformo
P. acroleína
P. Lieberman
P. yodo
P. Saponificación
VI. Discusión
VII. Conclusión
VIII. Anexos
IX. Bibliografía

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Activo: va en contra de gradiente y requiere gasto de energía.

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Difusión simple a través de canales. Se realiza mediante las denominadas proteínas

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