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Resumen
Los déficits óseos son frecuentes en pacientes infectados por VIH-1. Aquí
informamos que los osteoclastos, las células especializadas en la reabsorción
ósea, están infectados por el VIH-1 in vivo en ratones humanizados y ex vivo en
biopsias de articulaciones humanas. In vitro, la infección de osteoclastos humanos
ocurre en diferentes etapas de la osteoclastogénesis a través de virus libres de
células y, más eficientemente, por transferencia de células T infectadas. La
infección por VIH-1 mejora notablemente la adhesión y la actividad osteolítica de
los osteoclastos humanos al modificar la estructura y función de la zona de sellado,
la maquinaria de degradación ósea específica para osteoclastos. De hecho, la
zona de sellado es más amplia debido al enriquecimiento con F-actina de sus
unidades basales (es decir, los podosomas). La proteína viral Nef está involucrada
en todos los efectos inducidos por el VIH-1, en parte a través de la activación de
Src, un regulador de los podosomas y de su ensamblaje como zona de
sellado. Apoyando estos resultados, los ratones transgénicos Nef exhiben un
aumento de la densidad de osteoclastos y defectos óseos, y los osteoclastos
derivados de estos animales muestran una alta actividad osteolítica. En conjunto,
nuestro estudio muestra a los osteoclastos como células hospedadoras del VIH-1 y
su contribución patológica a los trastornos óseos inducidos por este virus, en parte
a través de Nef.
osteoclasto
pérdida de hueso
Nef
podosoma
Resultados
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Figura 1.
Los tejidos OC están infectados con VIH-1 in vivo y ex vivo. ( A ) El VIH-1 infecta
OC in vivo en ratones humanizados con BLT infectados con VIH-1. Dos secciones
en serie (3 µm de espesor, 1 y 2 ) de la cabeza de una tibia de ratones VIH-1-BLT
se tiñeron para determinar la actividad TRAP (en púrpura, 1 ) y con un anticuerpo
monoclonal dirigido hacia la proteína viral humana p24 (en marrón, 2 ). Secciones
representativas ( n = 4 ratones, dos secciones por ratón de tibia y cabezas de
fémur). Las puntas de flecha muestran un OC infectado. (Barra de escala, 50 µm.)
Marcos ampliados, zoom 2 ×. ( B) Los OC humanos están infectados con VIH-1 en
explantes sinoviales. Se cultivaron fragmentos de tejido sinovial humano no
inflamatorio con M-CSF y RANKL y se infectaron con VIH-1 (cepa ADA). Dos
semanas después de la infección, se realizaron análisis histológicos [actividad
TRAP en púrpura ( 1 ), p24 ( 2 ) y catepsina K (CtsK) ( 3 ) IHC en marrón, núcleos
en azul] en tres secciones en serie (3 µm de espesor, 1 - 3 ). Secciones
histológicas representativas ( n = 3 tejidos sinoviales, cuatro piezas por
tejido). (Barra de escala, 100 µm.) Marcos ampliados, zoom 2.3 ×.
Los OC humanos son permisivos a la infección por VIH-1 por virus sin
células en diferentes etapas de diferenciación.
Para examinar la etapa de diferenciación en la que las células se vuelven capaces
de infectarse, recurrimos a OC humanas derivadas de monocitos primarios
diferenciados in vitro en presencia de M-CSF y RANKL. El proceso de
diferenciación de OC se evaluó midiendo el nivel de proteína OC en diferentes
etapas. Mientras observamos un rápido aumento de TRAP y la integrina β3 tan
pronto como el día 1, notamos la adquisición de catepsina K (un marcador de
diferenciación de etapa tardía) en el día 6; el nivel de expresión para todas estas
proteínas aumentó hasta el día 10, cuando las células presentaron características
de OC madura, que incluyen alto índice de fusión, altas actividades de TRAP y
MMP9 y actividad de degradación ósea ( Fig. S2 A - E). Es de destacar que los
macrófagos derivados de monocitos (MDM) de los mismos donantes diferenciados
con M-CSF (en el día 10) solo mostraron niveles indetectables o bajos de
marcadores de OC, bajo índice de fusión y ausencia de actividad osteolítica ( Fig.
S2 B - E) . Las células se infectaron in vitro con la cepa ADA de VIH-1 R5 en los
días 0, 1, 6 o 10 de diferenciación ( Fig. 2 A ). La extensión de la infección por
VIH-1 y la replicación se evaluó el día 10 después de la infección mediante análisis
de inmunofluorescencia (IF) de p24 y se cuantificó midiendo la concentración de
p24 liberada en el sobrenadante. Mientras que los monocitos (día 0) eran poco
capaces de mantener la infección, las células se volvieron cada vez más
permisivas a la infección a lo largo del proceso de diferenciación ( Fig. 2 By C ,
barras negras); esto se correlacionó con el aumento de la expresión del
correceptor de entrada CCR5 desde el día 1 ( Fig. S2 F ). Además, observamos
que la producción de virus fue inhibida por el tratamiento previo de OC con el
antagonista de CCR5 Maraviroc, el inhibidor de transcriptasa inversa AZT, el
inhibidor de integrasa Raltegravir o el inhibidor de proteasa Ritonavir ( Fig. S2 G ),
lo que indica que la señal p24 corresponde a Células productivamente
infectadas. Nos dimos cuenta de que MDM y OC también sufrieron una infección
( Fig. 2 B y C ) (≥95% de los donantes apoyaron la infección, n = 29), lo cual es
consistente con niveles similares de receptores CD4 y CCR5 expresados durante
la diferenciación (Fig. S2 F ) y en el día 10 ( 20 ). Además, las partículas virales
producidas por OC o MDM infectadas tenían una infectividad comparable, según
se evaluó utilizando la línea celular informadora TZM-bl (27 ± 5% de p24 + TZM-bl
para partículas producidas con OC versus 26 ± 7% para MDM, n = 5), lo que indica
que ambos tipos de células liberaron viriones infecciosos. Es importante destacar
que el VIH-1 no afectó la viabilidad del OC, ya que la densidad celular no se alteró
incluso en el día 20 posterior a la infección (1.580 ± 276 núcleos / mm 2 para el OC
no infectado vs. 1.560 ± 352 para el OC infectado, n= 6 donantes, ≥3,000 células
por condición). Finalmente, observamos brotes de virus en OC y partículas de virus
maduras e inmaduras que se acumulan en los compartimentos intracelulares
delimitados por la membrana mediante microscopía electrónica ( Fig. 2 D ).
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Figura 2.
El VIH-1 infecta el OC humano y sus precursores in vitro. ( A - C ) Los OC están
infectados por virus sin células en diferentes etapas de diferenciación. ( A ) Diseño
experimental de la infección (cepa ADA). ( B y C ) Cinética del porcentaje
de células p24 ( B , determinado por IF) y de la liberación de p24 en los
+
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Fig. 3.
El VIH-1 se transmite de los linfocitos T infectados a OC. ( A - C ) Las OC han
estado en contacto durante 6 h con linfocitos Jurkat T no infectados ( izquierda ),
con linfocitos T infectados con VIH-1 ( Centro ) o con partículas virales libres de
células producidas por las células T durante 6 h ( derecha) ); se lavaron, luego se
cosecharon inmediatamente (día 0) o 5 días más tarde (día 5). ( A ) Mosaico
representativo de 3 × 3 campos confocales de ampliación original 20 ×, después
de la tinción para p24 (verde), F-actina (faloidina-Texas rojo, rojo) y núcleos (DAPI,
azul) en el día 5. (Escala bar, 50 µm.) ( B y C ) Cuantificaciones (media ± DE, n= 8
donantes) del porcentaje de células p24 evaluadas por IF ( B ) inmediatamente
+
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Fig. 4.
HIV-1 mejora la migración 3D de los precursores de OC en Matrigel. Los
precursores de OC se infectaron o no el día 1, se sembraron el día 2 en capas
gruesas de Matrigel polimerizado en cámaras de transwell, y la migración se midió
48 h más tarde. ( A ) Imágenes representativas de campo claro de células vivas ya
sea en la superficie (arriba) o dentro de la matriz (adentro), tomadas después de
48 h de migración utilizando un microscopio de video invertido. (Barra de escala,
50 μm.) ( B ) Se midió el porcentaje de células migratorias (media ± SEM, n = 7
donantes) (NI, no infectadas). *** P ≤ 0.001. ( C ) Las posiciones tridimensionales
de los precursores de OC en la matriz y la distancia media de migración (d la ) media
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Fig. 5.
El VIH-1 mejora la fusión de OC, la actividad osteolítica y la adhesión de OC. ( A )
El VIH-1 desencadena la fusión de OC. Diez días después de la infección, las
células se tiñeron para detectar p24 (verde), F-actina (rojo) y núcleos
(azul). Imágenes de un mosaico de 4 × 4 campos confocales de ampliación original
20 ×. (Barra de escala, 150 μm.) El índice de fusión celular (número de núcleos en
células multinucleadas / número total de núcleos) y el porcentaje de superficie
cubierto por células multinucleadas (índice de superficie) se midieron para> 3,000
células en cada condición, n = 6 donantes. Los resultados se expresan como
media ± SEM. ( B - G) La infección por VIH-1 aumenta la actividad de resorción
ósea de OC. Los días 10 no infectados y los infectados por VIH-1 se sembraron en
portaobjetos de hueso cortical durante 48 h. Luego, se eliminaron los OC, se
recogieron los sobrenadantes y se tiñeron las rodajas de hueso con azul de
toluidina para visualizar los hoyos de reabsorción en púrpura. Los datos se
obtuvieron de seis donantes. ( B ) Imágenes representativas de campo claro de
pozos de resorción ósea (púrpura). (Barra de escala, 20 μm.) ( C ) Imágenes
confocales representativas de fosas. Códigos de color para la profundidad de las
picaduras de reabsorción (barra de escala de color). (Barra de escala, 20 μm.)
Cuantificación del porcentaje de área de degradación ( D ) y circularidad ( E ) de
imágenes de campo claro y volumen reabsorbido ( F ) de imágenes
confocales. EnD , el área de degradación del OC no infectado, normalizado al
100%, correspondió al 9% del área total. ( G ) La concentración de CTX en el
sobrenadante se midió mediante ELISA y se normalizó al 100% para las células no
infectadas (concentración media de CTX = 1,790 pg / mL), n = 6 donantes. ( H - K )
Efectos de la infección en la disolución de minerales y enzimas osteolíticas
extracelulares. ( H ) Los días 10 no infectados y los infectados por VIH-1 se
sembraron en pocillos múltiples inorgánicos recubiertos con fosfato de calcio
cristalino. Las células se retiraron y los pocillos se tiñeron para revelar el área
desmineralizada (negro). (Barra de escala, 50 µm.) El gráfico muestra el área
cubierta por fosas de disolución de minerales de 10 campos por condición y por
donante, n= 3 donantes. ( I - K ) Los sobrenadantes de OC no infectados y
infectados por VIH-1 sembrados en vidrio se recolectaron el día 10. Se
cuantificaron los niveles de expresión de TRAP y CtsK (Western blot, I y J ) y la
actividad de MMP9 (análisis zimográfico, K ). La carga de proteínas se ha
controlado mediante tinción con azul de Coomassie, n = 4 donantes. ( L ) La
infección por VIH-1 aumenta las propiedades adhesivas OC. Los OC no infectados
y con infección por VIH-1 se eliminaron el día 10 con Accutase durante 10 minutos
y el porcentaje de células adherentes restantes se cuantificó contando los núcleos
(índice de adhesión). El gráfico representa el promedio de cinco campos por
condición de n = 3 donantes (NI, no infectados). *P ≤ 0.05; ** P ≤ 0.01; *** P ≤
0.001, **** P ≤ 0.0001.
En general, estos resultados indican que la infección por VIH-1 mejora la migración
3D de los precursores de OC, lo que puede favorecer el reclutamiento de OC en
los huesos, así como la adhesión y la actividad de reabsorción ósea de la OC
madura.
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Fig. 6.
El VIH-1 modifica la organización de la SZ e induce la activación de la Src-quinasa
en el OC humano. ( A - E ) La infección por VIH-1 aumenta el tamaño y la
intensidad de la actina F de la SZ. ( A ) Imágenes confocales de AO no infectados
o infectados por VIH-1 sembrados en portaobjetos de huesos. Las células se
tiñeron para p24 (verde) y F-actina (rojo). (Barra de escala, 10 μm.) ( B )
Cuantificación del porcentaje de células que forman SZ ( n= 4 donantes, 300
células por donante). ( C - E ) Gráficos de dispersión vertical que muestran para
cada SZ, la superficie ( C ), el porcentaje de la superficie celular ocupada por SZ
( D ) y la intensidad de actina F ( E ) ( n= 3 donantes,> 25 SZ). Las gráficas
muestran valores individuales de SZ y la media ± SEM. ( F y G ) La infección por
VIH-1 aumenta el tamaño de los podosomas individuales. Los OC sembrados en
vidrio se infectaron con VIH-1 y se tiñeron para la F-actina. ( F ) IF
imágenes. (Barra de escala, 10 μm.) ( G ) Cuantificación automatizada del área de
fluorescencia de actina F de podosomas individuales. Media ± SEM, n = 3
donantes (> 2,000 podosomas, 10 células por donante). ( H) La infección por VIH-1
induce la activación de la Src-quinasa. Los lisados de células completas se
sometieron a transferencia de Western usando anticuerpos contra el fosfo-Tyr416
de las quinasas Src, Src y Actina. Se muestran una transferencia representativa y
la cuantificación de la relación de quinasa fosfo-Tyr416 sobre el total de Src. Los
resultados se expresan como media ± SEM, n = 6 donantes (NI, no
infectados). ** P ≤ 0.01; *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001.
El factor viral Nef está involucrado en los efectos inducidos por el VIH-
1 en el OC tanto in vitro como in vivo.
Para comprender mejor los mecanismos virales implicados en los efectos
inducidos por el VIH-1 en el OC, nos centramos en el factor accesorio viral Nef
porque se sabe, entre otras funciones, modular la organización de la actina F y
estimular tanto la actividad quinasa de la Src ( 39 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ - 44 ) y fusión celular
( 45 ). Con este fin, se utilizó en peso VIH-1 y nef -eliminado VIH-1 ( δnef VIH-1) de
las cepas de la ADA que presentan el mismo nivel de infectividad en los
macrófagos ( 33 , 45 ⇓ - 47 ) y en OC ( Fig. S5 A). Es importante destacar que las
partículas virales producidas por OC infectadas con las cepas wt o mutantes
mostraron el mismo nivel de infectividad (26 ± 7% de las células p24 + TZM-bl para
la cepa wt frente a 22 ± 5% para δnef VIH-1, n = 4). Como se muestra en la Fig.
7 A , la migración mesenquimática en 3D de los precursores de OC infectados
con HIVnef VIH-1 fue similar a las células no infectadas . En el OC maduro, la
fosforilación de la quinasa Src, la actividad de resorción ósea, el porcentaje de
células con SZ, el índice de fusión y el área SZ se redujeron en el OC infectado
con VIH-1 en comparación con las células infectadas con el virus wt ( Fig. 7 B -F ).
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Fig. 7.
Los efectos del VIH-1 sobre la diferenciación y la función de los AO involucran la
proteína viral Nef. ( A - F ) Nef es necesario para los efectos inducidos por el VIH-1
en el OC. Los precursores de OC humanos ( A ) o los OC maduros ( B - F ) se
infectaron con wt HIV-1 o con delta nef HIV-1 (NI, no infectados ). ( A ) Porcentaje
de precursores de OC migrantes después de 48 h medido como en la Fig. 4 , n = 4
donantes. ( B ) Cuantificación de los análisis de transferencia de Western en
lisados de células completas utilizando anticuerpos contra el fosfo-Tyr416 de las
quinasas Src, Src y Actina como en la Fig. 6 H. Los resultados se expresan como
media ± SEM, n= 6 donantes. Cuantificación de ( C ) área ósea reabsorbida ( n =
4), ( D ) el porcentaje de células que forman SZ ( n = 4 donantes, 300 células por
donante), ( E ) el índice de fusión (> 3,000 células por condición, n = 6 donantes)
ilustrados por mosaicos de 4 × 4 campos confocales (F-actina en rojo y núcleos en
verde), ( F ) la superficie SZ en OC sembrada en huesos y teñida para F-actina
(faloidina), ( n = 3 donantes) ,> 25 SZ). (Barras de escala, 150 μm en E , 10 μm
en F ). Los resultados se expresan como media ± SEM. ( G y H) Expresión de Nef-
GFP en OC. Los OC se transfectaron con Nef -GFP o GFP (control) y se tiñeron
SF2
con F-actina (faloidina, roja) y núcleos (azul). ( G ) Una fracción de Nef se localiza
en la SZ. Imágenes confocales de OC expresando Nef -GFP. Las puntas de
SF2
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Fig. 8.
En ratones Nef-Tg, la actividad osteolítica de OC y defectos óseos
aumenta. ( A - D ) Los OC diferenciados de los ratones Tg son más
osteolíticos. Los OC se diferenciaron de los precursores de la médula ósea
aislados de ratones Nef-Tg y no Tg y se cuantificaron el índice de fusión ( A ), el
área de resorción ósea ( B ) y el espesor de la banda de actina F ( C ) (50 SZ por
condición, n = 3 ratones por genotipo). ( D ) Imágenes representativas de
estructuras de cinturón de OC de ratones no Tg y Nef-Tg teñidos para F-actina
(rojo), vinculina (verde) y DAPI (azul). Marcos ampliados, zoom 2 ×. (Barras de
escala, 10 μm.) ( E y F) Los ratones Nef-Tg presentan defectos óseos. ( E )
Secciones histológicas representativas de tibia de ratones de 7 semanas de edad
teñidos para TRAP para visualizar OC (púrpura), y contrastados con verde de
metilo y azul de Alcian: el tejido óseo aparece en gris, núcleos en verde
(correspondiente a los núcleos de células de la médula ósea), y cartílago en
azul. (Barra de escala, 200 µm.) Marcos ampliados: × 4 zoom. ( F ) Se muestra
la cuantificación de la superficie ocupada por el hueso trabecular y la superficie
ocupada por la señal TRAP positiva en tres secciones histológicas separadas por
ratón ( n = 3 ratones por genotipo). * P ≤ 0.05; ** P ≤ 0.01; *** P ≤ 0.001, **** P ≤
0.0001.
En conjunto, estos resultados apoyan que la proteína viral Nef es suficiente para
aumentar la actividad osteolítica de OC y, por lo tanto, contribuir potencialmente a
la pérdida ósea in vivo.
Discusión
Los defectos óseos resultantes de la infección por VIH-1 se han descrito durante
mucho tiempo, pero las causas siguen siendo poco investigadas ( 1 ). Informamos
que el VIH-1 infecta OC in vivo, ex vivo e in vitro. En el OC infectado, la estructura
y la función de la SZ se modifican, lo que afecta la adhesión y la reabsorción del
hueso. La proteína viral Nef es instrumental en estos procesos. Por lo tanto, los
OC son objetivos celulares para el VIH-1, que es, según nuestro conocimiento, el
único patógeno capaz de manipular la SZ.
Usando ratones humanizados con BLT infectados con VIH-1, obtuvimos evidencia
de la presencia de OC infectada en los huesos. OC infectados aparece como un
evento raro, ya sea debido a la viremia moderado (trabajamos poco después de la
infección) y la baja sensibilidad de la detección de IHC, o al hecho de que infectó
OC están mal detectado en los tejidos de manera similar a los macrófagos
infectados ( 22 , 50 ⇓ ⇓ ⇓ - 54). OC también puede infectarse ex vivo en explantes
sinoviales humanos frescos. Es importante destacar que la infección por OC in vivo
y ex vivo fue detectada por la IHC del p24 viral, lo que sugiere una replicación
viral. In vitro, imágenes de microscopía electrónica de OC infectada revelaron que
las partículas del virus del brote y se acumulan en compartimentos intracelulares,
sugerente de los compartimentos que contienen virus descritos en los macrófagos
( 55 ⇓ - 57 ). La producción de virus por OC fue cuantitativamente similar a la de
los macrófagos, una célula huésped del VIH-1 bien conocida ( 21 , 22 , 58).). La
infección de OC ocurrió en diferentes puntos de tiempo a lo largo del proceso de
diferenciación, comenzando en el día 1 en los precursores de OC y
correlacionando con la expresión de CCR5. Esto sugiere que los precursores
circulantes de OC, que se encuentran con el virus en la sangre, podrían infectarse
y migrar a los huesos, donde se diferencian finalmente ( 59 , 60 ) ( Fig. 9 ). Es
difícil explorar si la OC madura puede infectarse directamente en los
huesos. Hasta ahora, la presencia del VIH-1 en los huesos no ha sido
documentada. Como se mostró recientemente para macrófagos ( 61 ), contacto
directo de OC con Jurkat infectado o CD4 + primarioLos linfocitos T conducen a la
transferencia de virus y la infección productiva de OC, que es claramente más
eficaz que la infección por virus sin células. Esto es probable que sea la ruta fisio-
patológico para infectar OC in situ, lo que sería coherente con los datos que
muestran que la infección célula a célula es crítico para la propagación viral
eficiente in vitro e in vivo ( 25 , 29 , 61 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ - 69 ). En conjunto, estos
resultados muestran que las OC son células hospedadoras del VIH-1.
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Fig. 9.
Resumen gráfico propuesto para explicar los defectos óseos inducidos por el VIH-1
en pacientes. La infección por VIH-1 afecta el reclutamiento de precursores de OC
en los huesos y el proceso de diferenciación de OC. Estos efectos, dependientes
de la proteína viral Nef, dan como resultado un OC más osteolítico más numeroso
y más numeroso que muestra una SZ más grande y más densa.
En conclusión, las OC son células diana del hospedador para el VIH-1 que se
vuelven más osteolíticas como consecuencia de una SZ más grande y más
degradante. Proponemos que los OC infectados participen en trastornos óseos
encontrados en pacientes infectados con VIH-1 y pueden constituir un reservorio
para el virus. La proteína viral Nef aparece como un regulador clave de la actividad
de resorción ósea de OC infectada por el VIH-1. En resumen, este estudio
proporciona una mejor comprensión de las causas subyacentes de la pérdida ósea
después de la infección por VIH-1.
Materiales y métodos
Materiales y métodos, cultivo celular y transfección, infección por VIH-1 de ratones
humanizados con BLT, transferencia viral de células T infectadas a OC humana
primaria, infección de OC y macrófagos libres de células y análisis histológicos de
huesos de ratones y tejidos sinoviales humanos , se describen en Materiales y
Métodos SI . Los materiales y métodos adicionales incluyen análisis de citometría
de flujo, inmunotransferencia, zimografía en gel, tinción TRAP, análisis de
microscopía electrónica de IF y transmisión, migración 3D, ensayos de adhesión y
reabsorción, químicos y anticuerpos, y análisis estadísticos también están
disponibles en SI Materiales y métodos.. Los monocitos humanos fueron
proporcionados por Etablissement Français du Sang, Toulouse, Francia, bajo el
contrato 21 / PLER / TOU / IPBS01 / 2013–0042. Los experimentos con ratones
CD4C / HIV Nef fueron aprobados por el comité institucional de ética animal
(Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Investigación Clínica de Montreal,
Montreal, QC, Canadá), y los experimentos con ratones hembra BLT se realizaron
de acuerdo con las pautas y regulaciones implementadas por El Comité
Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General de
Massachusetts.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a G. Lugo-Villarino y a R. Poincloux por la lectura crítica del
manuscrito; C. Salón de US006 / Centro Regional de Exploración Fonctionnelle et
de Ressources Expérimentales; M. Dubois, M. Cazabat, M. Requena y J. Izopet
del laboratorio BSL3 de las instalaciones de BiVic; F. Moreau y C. Berrone de las
instalaciones de animales BSL3 en el Instituto de Farmacología y Biología
Estructural; C. Bordier por ayuda con experimentos de citometría; N. Ortega y A.
Métais por su ayuda en histología; A. Labrousse para ayuda con RT-PCR; E.
Cavaignac por proporcionar muestras de sinovio; E. Meunier para infecciones con
bacterias intracelulares; Marie-Chantal Simard y Julio Roberto Caceres-Corte por
tomar radiografías de ratones Nef-Tg, la instalación de imágenes TRI y la
instalación de exploración funcional ANEXPLO; Stephanie Balor de la plataforma
Multiscale Electron Imaging del Centre de Biologie Intégrative por su asistencia; y
el Programa de reactivos de referencia e investigación del SIDA, División de SIDA,
Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Este trabajo fue
apoyado por el Centro Nacional de Investigación Científica, la Agencia Nacional de
Investigación (ANR 2010-01301, ANR14-CE11-0020-02, ANR16-CE13-0005-01,
ANR-11-EQUIPEX-0003); Agence Nationale de Recherche sur le Sida et les
hépatites virales (ANRS2014-CI-2, ANRS2014-049); la Fondation pour la
Recherche Médicale (DEQ2016 0334894); Plan Cáncer INSERM, el Programa de
Ciencia de la Frontera Humana (RGP0035 / 2016); German Science Foundation
Research Fellowship US116-2-1 (a SMU); y los Institutos Nacionales de Salud
Grants R01 AI097052 y DA036298 (a TRM). LB y SB están respaldados por
subvenciones del Institut Pasteur International Network, el Institut Pasteur
Shanghai y la Academia China de Ciencias. El trabajo en el laboratorio de P.
Jolicoeur fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud.