Fundamentos de Biotecnología

Ingeniería Química Año 2018

Facultad de Ingeniería-UNSa

Trabajo práctico de laboratorio Nº 1

Preparación de materiales y medios de cultivo
Esterilización. Control de esterilización

OBJETIVOS
1. Conocer los equipos utilizados en esterilización a fin de comprender su modo de uso y el
fundamento de los métodos empleados.
2. Aprender las formas adecuadas de acondicionar el material para esterilizar.
3. Practicar la preparación de medios de cultivo.

INTRODUCCIÓN
Para el estudio de las características morfológicas y fisiológicas de los microorganismos se los
debe cultivar en un medio que les suministre los nutrientes adecuados y bajo las condiciones
ambientales que le permitan crecer.
Estos medios deben estar esterilizados, o sea libres de toda forma de vida. La esterilización es
un proceso por el que se produce la muerte o eliminación de todos los organismos viables del medio
de cultivo.
Los microorganismos que obtienen la energía de la luz se llaman fotótrofos, los que utilizan la
energía que proviene de compuestos químicos quimiótrofos. La mayor parte de los microorganismos
son quimiorganótrofos es decir obtienen la energía a partir de compuestos orgánicos; mientras que
aquellos que la obtienen a partir de compuestos inorgánicos se llaman quimiolitótrofos (la
terminación trofo deriva del griego y significa alimentarse).
El conocimiento del metabolismo representa una gran ayuda para el desarrollo de
procedimientos de laboratorio que permitan cultivar ciertos microorganismos como así también
impedir el desarrollo de otros.
Un medio de cultivo es una solución acuosa con los nutrientes necesarios para que el
microorganismo se multiplique, o sea, que produzca más células como él. Los componentes del medio
de cultivo deben proporcionarle:
 una fuente de energía: que puede ser un compuesto orgánico o inorgánico (o bien la
luz, si se trata de un fotótrofo),
 una fuente de carbono,
 una fuente de nitrógeno,
 minerales y
 factores de crecimiento (ciertos aminoácidos, bases nitrogenadas y/o vitaminas).
En microbiología se usan dos tipos de medios de cultivo: los químicamente definidos y los
indefinidos o complejos. Los químicamente definidos son aquellos que se preparan agregando agua
destilada a compuestos orgánicos e inorgánicos altamente purificados. Los medios complejos son
aquellos cuya composición química exacta desconocemos y en general, emplean lisados de caseína
(proteína de la leche), de carne, de soja, de levadura o cualquier sustancia altamente nutritiva
(químicamente indefinida).
El objetivo principal al diseñar un medio de cultivo para un determinado microorganismo es
proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes necesarios, en concentraciones adecuadas, que
permitan su crecimiento.
Los microorganismos heterótrofos pueden usar azúcares, alcoholes y también aminoácidos
como fuente de carbono. Algunos pueden utilizar polisacáridos, como almidón y celulosa
hidrolizándolos hasta azúcares sencillos.
El nitrógeno se puede incorporar como amonio, urea o nitratos y el fósforo como fosfatos. Los
aminoácidos y nucleótidos constituyen una fuente primaria de nitrógeno. También es posible, para
algunos microorganismos, degradar péptidos, proteínas y polinucleótidos.
Los minerales se agregan a los medios como sales. Los oligoelementos, requeridos en
pequeñas cantidades, generalmente se incorporan como impurezas de los componentes principales de
los medios de cultivo o de los recipientes de vidrio.

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Los factores de crecimiento generalmente se aportan mediante materiales ricos en ellos, de

composición compleja como extractos de levadura, de malta, etc., o eventualmente puros cuando el
microorganismo solamente requiere uno o dos de ellos y su costo es bajo.
Los requerimientos nutritivos de los mohos y levaduras son similares. En laboratorio el medio
común es el extracto de malta con o sin extracto de levadura y agar. Para el crecimiento de algunos
mohos se utiliza un medio definido constituido por sacarosa y sales minerales como el agar Czapek, a
veces con el agregado de extracto de levadura. Cuando se desea hacer crecer hongos osmófilos se
agrega sacarosa al 20-50%.
Un medio de cultivo común para bacterias no exigentes desde el punto de vista nutricional es
el agar nutritivo que contiene peptona, extracto de carne y agar. La peptona es un producto que
resulta de la digestión de materiales proteicos como carne, caseína y gelatina, digestión que se realiza
con ácidos o con enzimas. Es fuente de nitrógeno orgánico, puede contener además algunas vitaminas
y carbohidratos. El extracto de carne es un extracto de carne de tejido de buey, rico en minerales,
micronutrientes, proteínas e hidratos de carbono.
En general, los microorganismos desarrollan muy bien en superficies sólidas en la medida que
a éstas accedan los nutrientes y la humedad necesaria. El agente solidificante más empleado es el
agar, un polisácarido producido por las algas, que no es tóxico para los microorganismos y muy pocos
pueden degradarlo. Se agrega a los medios acuosos en una concentración de 1,5-2% y se mantiene
sólido a las temperaturas de incubación, mientras que pasa al estado líquido a temperatura de
ebullición.
Otra manera de proporcionar una superficie nutritiva es utilizar un filtro de membrana de
ésteres de celulosa depositado sobre un disco absorbente embebido en el medio de cultivo. Este
traspasa los poros permitiendo el desarrollo superficial del microorganismo.
Los agentes esterilizantes pueden ser físicos y químicos. Entre los primeros se hallan el calor,
la filtración, las radiaciones ionizantes y no ionizantes. Entre los químicos se utilizan alcoholes,
aldehídos, colorantes, fenoles, halógenos y el óxido de etileno (agente utilizado para materiales
sensibles al calor, es un gas tóxico).
El calor, en diversas formas, es el agente más empleado para la esterilización de medios y
materiales de uso frecuente en el laboratorio.

Formas de reducción de poblaciones microbianas por calor

Vapor saturado a presión (autoclave)

Pasteurización (tratamiento térmico)

Ebullición
Húmedo Vapor fluente

Calor discontinuo o tyndalización

Flameado (llama del mechero)

Seco
Aire caliente (estufa)
Incineración

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 Vapor saturado a presión

El agente esterilizante más rápido y efectivo por su penetración es el calor húmedo, siendo el
vapor saturado a presión la manera más frecuente y eficaz de esterilizar medios
y material de vidrio. Para ello se utiliza el autoclave. En éste, no es la presión lo
que mata a los microorganismos sino la temperatura alta del vapor de agua.
El autoclave de Chamberlain es el más utilizado en los laboratorios de
microbiología. Es un sistema cerrado donde se forma vapor de agua que se
somete a una presión elevada, una atmósfera de sobrepresión, lo que hace que el
agua alcance una temperatura de 121ºC causando la desnaturalización de
enzimas lo que conlleva a la muerte de los microorganismos y la destrucción de
las esporas. Habitualmente, se esteriliza a 121ºC durante 20 minutos.
Consiste en una caldera metálica de paredes resistentes (1 y 2) cerrada en la
parte superior por una tapa de bronce hermética (5) gracias a una junta de goma
y tornillos mariposas (6) que se ajustan en cruz. En la parte interna hay un
soporte o rejilla (3) donde se coloca una cesta metálica, que contiene el material
a esterilizar. La tapa contiene una válvula para escape de aire y/o vapor, la
espita (8), una válvula de seguridad (7) y un manómetro (9) para controlar la
presión. La fuente de calor es una corona de picos de gas ubicada en la parte inferior, aunque también
puede ser una resistencia en los autoclaves eléctricos.
El proceso completo de esterilización en un autoclave se compone de diferentes fases:
-Fase de purgado: A medida que la resistencia calienta el agua del fondo del calderín, se va
produciendo vapor que desplaza el aire, haciéndolo salir por la válvula de purgado que está abierta.
Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilización.
-Fase de esterilización: Una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura de
esterilización previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilización.
-Fase de descarga: Terminado el proceso de esterilización, deja de funcionar la resistencia calefactora,
con lo que deja de producirse vapor y la presión y temperatura del calderín empieza a bajar poco a
poco.

 Pasteurización
Es un proceso que reduce las poblaciones microbianas de la leche y de otros alimentos líquidos
(bebidas alcohólicas, jugos de frutas) los que son sensibles al calor, el nombre se debe a Pasteur que
utilizó el calor para controlar el deterioro del vino. Pasteurización no significa esterilización.
Originalmente se utilizó para matar patógenos, especialmente los causantes de la tuberculosis, la
brucelosis, la fiebre Q y la fiebre tifoidea. Actualmente la leche raramente viene contaminada con
patógenos y la pasteurización se utiliza primordialmente para alargar el período de almacenamiento
de la leche, productos lácteos y otras bebidas. La leche se pasa por un tubo en contacto con la fuente
de calor (71 ºC durante 15 segundos), a continuación se enfría, el proceso completo se llama
pasteurización. Con este procedimiento se altera menos el aroma y mata eficazmente los
microorganismos.

 Vapor fluente
Se utiliza para sustancias que se alteran con temperaturas superiores a 100ºC, por ejemplo medios
de cultivos con azúcares, caldo gelatinoso, leche etc.
Esto se realiza en autoclave con la espita abierta durante 60 minutos. No elimina las endosporas
termoresistentes de las bacterias.

 Calor discontinuo o tyndalización

Se emplea para sustancias que se alteran con temperaturas superiores a 100 ºC y pierden sus
propiedades nutritivas, por ejemplo medios de cultivos ricos en albúminas o que contienen suero. La
temperatura de calentamiento es entre 60-80ºC durante una hora repitiendo el proceso por 3 días
consecutivos. El producto a esterilizar es mantenido a temperatura ambiente entre los calentamientos.
El primer calentamiento destruye las formas vegetativas y los siguientes matan las endosporas que
germinan en los períodos de mantenimiento a T ambiente.

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 Calor seco
El calor es absorbido por la superficie externa del objeto a esterilizar y conducido al interior.
Al ser el aire mal conductor del calor, los materiales deben estar separados unos de otros para que el
aire circule. La estufa es un equipo construido en doble pared, con un relleno de amianto u otro
material aislante para evitar la pérdida de calor, su puerta está ubicada al frente y presenta un cierre
hermético. En la parte superior hay dos orificios: uno donde se ubica el termómetro y otro para regular
el paso del aire y facilitar la circulación de calor. La fuente de calor es por lo general una resistencia
eléctrica, tiene un termorregulador donde se fija la temperatura deseada.
La temperatura de esterilización para el material de vidrio es de 180ºC, durante 2 horas.

 Filtración
Método adecuado para esterilizar fluidos biológicos termolábiles como suero, soluciones de
enzimas, algunas vitaminas y antibióticos.
En la actualidad el material filtrante de los filtros bacteriológicos se prepara con ésteres de
celulosa u otras sustancias polímericas con poros de tamaño preciso y uniforme. Los filtros de
membrana son los más utilizados en microbiología, es un disco generalmente compuesto de acetato de
celulosa o de nitrato de celulosa que contiene un gran número de diminutos agujeros, son estructuras
abiertas, el 80 –90 % está ocupado por espacios, el diámetro de poros va de 0,01 a 10 µm, el espesor
es muy delgado, de 150 µm. Algunas bacterias tienen un diámetro de 10 µm, mientras que otras de 0,3
µm.

 Radiaciones
Radiaciones no Ionizantes
La radiación ultravioleta que llega a la tierra está restringida a 280-390 nm, las longitudes de
onda germicida están entre 280-320 nm.
Las lámparas germicidas son utilizadas para reducir la población de microorganismos en
quirófanos, hospitales, sala de envasado aséptico en la industria farmacéutica, en frigoríficos, en
habitaciones de lechería, panaderías etc.
Posee poco poder de penetración, no pasa a través del vidrio transparente y de objetos opacos.
La absorción de UV es al nivel de ácidos nucleicos, produce dímeros de timina en el ADN,
suprime la replicación produciendo mutaciones.
Radiaciones Ionizantes
Los rayos X son letales para toda forma de vida, poseen gran energía y poder de penetración.
Se han utilizado para producir mutantes microbianos, requiere de instalaciones especiales, son caros.
Los rayos  son más energéticos, emitidos por ciertos isótopos radiactivos como 60Co, al tener
menos longitud de onda, tienen más energía, alto poder de penetración, son letales. Se utilizan para
esterilizar equipos médicos.
Los rayos catódicos son producidos en equipos emitidos en haces de electrones, estos tienen
una alta intensidad (millones de voltios) son acelerados a velocidades extremadamente altas. Se
emplean para esterilizar materiales quirúrgicos, drogas. Al igual que los rayos  tienen la ventaja de
que el material puede ser esterilizado luego de empaquetado.

ACTIVIDADES
Cada grupo preparará el siguiente material para esterilizar:
 12 placas de Petri
 1 pipetero con pipetas de 1 ml
 2 pipetas de 5 ml y una de 10 ml
 100 ml de agar nutritivo en Erlenmeyer de 250 ml
 5 tubos con aproximadamente 7 ml de caldo nutritivo cada uno
 1 caja de puntas para pipeta automática

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1) Preparación del material de vidrio

El material de vidrio debe estar lavado, enjuagado y seco. Las pipetas se tapan con algodón
por el extremo no aguzado con ayuda de un punzón, se colocan en un pipetero de acero inoxidable o se
preparan individualmente con una tira de papel de 4-5 cm de ancho por un largo de unos cm más que
la pipeta y se coloca formando un ángulo de 45º para empezar a enrollarlo alrededor de la misma. Las
cajas de Petri deben estar cerradas y envueltas con papel poroso. Los tubos de ensayo deben estar
tapados con algodón, se arma un tapón de manera que se pueda quitar y volver a colocar sin que se
deforme. A los erlenmeyer se los tapa con un tapón de algodón y se cubre la boca con papel que se
sujeta con piolín o gomillas.

2) Preparación del medio de cultivo

Actualmente existen diferentes casas comerciales que se dedican a fabricar medios de cultivo
complejos desecados. Su preparación es muy simple, se pesa una determinada cantidad, se disuelve en
un volumen adecuado con agua en frío y luego se calienta, finalmente se esteriliza.
Estos medios desecados en general son muy higroscópicos de manera que debe guardarse bien
tapados y en lugares secos.
La mayoría de las bacterias heterótrofas se desarrollan en un medio común denominado caldo
nutritivo que se puede preparar disolviendo: 3g de extracto de carne, 5g de peptona o triptona y 3g de
NaCl en un litro de agua. Si agregamos agar en una concentración de 1,5 –2 % se obtiene un medio
llamado agar nutritivo. Para disolver el agar se calienta a Baño María o en autoclave a vapor fluente.
El pH del medio debe estar próximo a 7. Se esteriliza en autoclave 15 minutos a 1 atmósferas de
sobrepresión (1,2 atm en la ciudad de Salta).
Los hongos suelen crecer más lentamente que las bacterias y toleran mejor la acidez, un medio
para hongos es el agar dextrosa papa cuya concentración es 39 g/L y el pH próximo a 5,6. Se esteriliza
en autoclave durante 15 minutos a 1, atmósferas de presión manométrica (1,2 atm en la ciudad de
Salta).
Los medios de cultivo se distribuyen en erlenmeyer ocupando hasta un tercio del volumen o en tubos
de ensayos. Se preparan como se describió anteriormente, tapando la boca de los tubos y erlenmeyer
con tapones de algodón, luego se cubren con papel sujetos con hilo o gomilla.

3) Esterilización en autoclave
El vapor a una presión absoluta de 2,066 kg/cm2 proporciona una temperatura de 120,6ºC
mortal para las endosporas bacterianas en pocos minutos.
La presión absoluta a la que está sometido el material dentro del autoclave es igual: Presión
manométrica + Presión atmosférica del lugar que varía con la altura sobre el nivel del mar. Se debe
entonces calcular la presión manométrica necesaria para llevar a cabo la esterilización en cada
localidad. En Salta la altura es de 1187 m sobre el nivel del mar y se debe esterilizar a una presión
manométrica de aproximadamente 1,2 atmósferas.
El tiempo de funcionamiento para lograr la esterilización depende de la naturaleza del material, el tipo
de envase y del volumen del material.
Por ejemplo, 1000 tubos de ensayo con 10 ml de líquido en cada uno requieren 15 minutos a 121ºC y
10 recipientes de un litro necesitan entre 20 a 30 minutos, a la misma temperatura.

Pasos en la esterilización
1. Llenar el autoclave con el material a esterilizar (controle que el nivel del agua esté hasta la
rejilla).
2. Encender el mechero.
3. Cerrar la tapa (las mariposas opuestas se las ajusta en cruz).
4. Controlar que la espita esté abierta (para expulsar el aire)
5. Purgar el autoclave. Estará PURGADO cuando un chorro de vapor continuo sale por la espita.
6. Cerrar la espita.
7. Esperar que el indicador de la presión MANOMETRO llegue a 1,2 atm. A partir de ese
momento contar 15 minutos. PRECAUCION: UNA VEZ QUE LLEGA A LA PRESIÓN

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DESEADA, ÉSTA DEBE SER CONTROLADA CON LA ALTURA DE LA LLAMA. VIGILAR EL

AUTOCLAVE MIENTRAS DURA LA ESTERILIZACION.
8. Apagar la llave de gas.
9. Esperar que la aguja del manómetro llegue a cero. ¡CUIDADO! Si se abre antes los líquidos
pueden ser expulsados con fuerza desde los recipientes, pero... tampoco se debe esperar
mucho tiempo sino el vapor se condensará sobre los papeles y algodones.
10. Abrir la espita.
11. Abrir la tapa del autoclave y retirar el material.

4) Control de la eficacia de la esterilización del autoclave

Se coloca junto con el material de esterilización una sustancia que funda o que cambie de
color a la misma temperatura requerida para la esterilización, es decir 121ºC por ejemplo el ácido
benzoico en polvo (p.f. 121ºC) luego de la esterilización quedará como una masa homogénea, también
podemos usar como control pinturas indicadoras; carbonato de plomo + azufre ppdo. + carbonato de
Litio (10:1:3), después de 30 minutos a 100ºC pasa a color gris, 121 ºC en 5 minutos a negro. Como
indicador biológico se puede usar Bacillus stearothermophilus o un poco de tierra pulverizada.

GUÍA PARA INFORME

Este informe y el de los trabajos prácticos de laboratorio siguientes NO deben incluir una
introducción teórica. Sólo contendrán información sobre las actividades desarrolladas en el
trabajo práctico.

Material preparado para esterilizar

Medios de cultivo preparados

Esterilización en autoclave

Material esterilizado por este método:

Presión manométrica:

Control de la eficacia:

Cambio observado:

Conclusiones: