PROTEÍNAS

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas

lineales de aminoácidos

¿Qué es un aminoácido?

¿Cómo se llama el enlace que une dos aminoácidos?

El DNA tiene 2 funciones

TRADUCIRSE
REPLICARSE
 TRANSCRIPCIÓN

TRADUCCIÓN

Figura tomada de “LehningerPrinciples of Biochemistry”

D.L. Nelson & M.M. Cox. Third Edition Worth Publishers.
 TRANSCRIPCIÓN

Transferencia de la información
contenida en el DNA hacia una
secuencia de proteínas

ARNm
ARN Polimerasa
TRADUCCIÓN
Se traduce el mensaje genético del DNA
-RNAm
-RNAt ¿Quién aporta los aminoácidos?
-Aminoácidos
-Enzimas
La información del RNAm se organiza en
tripletes
CODÓN

GUC AAU UCG CUG

codón 1 codón 2 codón 3 codón 4

aa1 aa2 aa3 aa4

aa1 aa2 aa3 aa4

 CODIGO GENÉTICO

Universal
Específico AUG Codón de inicio

Continuo
Redundante
Frecuencia de substituciones
Anemia Falciforme
 Evolución y diversidad de secuencias

Diversidad actual
10 millones de especies x 5,000 genes/especie
≈ 5 x1010 secuencias de proteína diferentes.
Conocemos una pequeña fracción(6.7 x 107 secuencias)
Las proteínas son cadenas lineales de aminoácidos
 Estructura secundaria
Es el plegamiento entre residuos de aminoácidos cercanos
en la cadena polipeptídica.
Puentes de hidrógeno entre los grupos carbonilo (-CO) y
los amino (-NH-)

Hélices Alfa Beta Plegada

 Estructura Terciaria

Se denomina estructura terciaria de una proteína a la distribución tridimensional de todos

los átomos que constituyen la proteína.

Hélices, hebras y estructuras no repetitivas como asas y giros forman dominios compactos y
globulares
 Dominios
Región compacta con mayores contactos consigo misma que con el
resto de la proteína.

Unidad de plegamiento autónomo.

Unidad funcional.

Tamaño promedio 200 aa.

El 49% de los dominios identificados tienen entre 51 y 150 aa.

Domino mas grande 907 aa

Hasta 13 dominios diferentes por proteína

 Dominios helicoidales

Manojos de cuatro hélices

Citocromo b652 Hormona de crecimiento humano

Mioglobina
 Dominios beta

Compuestas principalmente por hojas antiparalelas

Conexión entre hebras adyacentes “sube y baja”

Sandwiches
Barriles

Proteína que une retinol Proteína A Bacterioclorofila

(sube y baja) (Sube y baja)
 Dominios alfa/beta

Barriles Hojas abiertas

Estructura Cuaternaria
 STRUCTURE OF BETA-GLYCOSIDASE FROM SULFOLOBUS SOLFATARICUS

Hipertermófila
 CPO

S S S
O O
H2O2 H2O2 H2O
H2O O
4,6 Dimetil dibenzotiofeno (DMDBT) Sulfoxido (DMDBT) Sulfona(DMDBT)

Cl Cl Cl
CPO
+
H2O2 KCl
N N N
H H H

Carbazol 3- Cloro carbazol 3,6 Dicloro carbazol

Cloroperoxidasa (CPO)
Capside Viral
BASES DE DATOS DE SECUENCIAS DE PROTEÍNAS
BASES DE DATOS DE ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS

Protein Data Bank

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
Existen programas que nos permiten analizar las estructuras de
proteínas
LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO
CELULAR

FUNCIÓN EJEMPLOS
Catálisis

Defensa

Transporte

Soporte
Movimiento

Regulación

Señalización
LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO
CELULAR

FUNCIÓN EJEMPLOS
Catálisis Enzimas : proteasas, polimerasas, cinasas

Defensa Inmunoglobulinas, anticuerpos, toxinas

Transporte Hemoglobina, mioglobina, canales

membranales
Soporte Colágeno, queratina
Movimiento Actina, miosina
Regulación Factores de transcripción (proteínas de
unión al DNA)

Señalización Hormonas (insulina)

 Propiedades de las proteínas

MASA

TAMAÑO Å
 Carga

Existe un pH para el cual la carga eléctrica media de las

moléculas es cero. Este pH se llama punto isoeléctrico
(pI). El pI es el pH en el que la molécula se disocia por
igual en ambos sentidos, y como

pKa1+pKa2
PI = 2
Reconocimiento  molecular  
 ¿ PARA QUÉ NECESITAMOS PURIFICAR PROTEÍNAS?

ESTUDIAR SU FUNCIÓN y regulación enzimática

REALIZAR ANÁLISIS ESTRUCTURALES:

cristalografía de rayos X, espectroscopía NMR.

Estudiar sus interacciones con otras proteínas o con ácidos nucleícos

Para la producción de anticuerpos

Si no se conoce el gen que codifica a la proteína aislada:

La proteína purificada se puede usar para determinar la secuencia de
aminoácidos y por tanto la secuencia del gen que la codifica!!!!
Algo que debemos saber….

1. Seleccionar la muestra biológica (fuente)

2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA

Muy alta > 99% Usos terapeúticos , estudios in vivo

Alta > 95-99% Estudios estructurales, cristalografía de

rayos X, Caracterización fisicoquímica

Moderada > 95% Obtención de antigeno(s) para la

producción de anticuerpos
Secuenciación
Espectrometría de masas
¿Y cómo comienzo la purificación?
Contar con un método adecuado para la detección de la proteína de
interés.

Monitorear el progreso de la purificación

Cuantificación de proteína total

Detectar específicamente la proteína de interés

ROTURA CELULAR

MÉTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR

Algunos ejemplos son:
1. Lisis celular válido para células sin pared celular como las células de
tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.

Congelación-descongelación, prensa de
2. Destrucción mecánica
French, sonicación, macerado con N2
líquido

3. Lisis con detergentes

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a
muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!.

¿Cómo protegemos a la proteína de interés?

 UTILIZAR:
Soluciones amortiguadoras
Inhibidores de proteasas
Bajas temperaturas (4°C)

EVITAR
Altas temperaturas
Manipular demasiado la muestra

PROCURAR
que el proceso sea lo más corto posible.
Algunos agentes estabilizadores son:
 Métodos de purificación de proteínas

BAJA Precipitación con sales,

RESOLUCIÓN precipitación con temperatura y pH

Métodos cromatográficos:
ALTA filtración en gel, intercambio iónico,
RESOLUCIÓN afinidad
Métodos electroforéticos:
electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante, isoelectroenfoque
Precipitación con sales
Sal más usada: Sulfato de Amonio
EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE
AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA LLEGAR A UN % DE
SATURACIÓN ESPECÍFICO
 ALTA RESOLUCIÓN

Cromatografía
Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los
distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes

Muestra
aplicada Eluyente

Volumen
de columna

Matriz

Tapón
poroso

Eluyente Proteínas separadas

Cromatografía de intercambio iónico
 Intercambio catiónico

Fase estacionaria cargada negativamente

Intercambio aniónico

Fase estacionaria cargada positivamente

GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
 Factores)que)afectan)a)la)retención)
1.  Fuerza)Iónica)

2.)pH)

3.)Modificadores)Orgánicos)
PRINCIPIO:(
!  Tamaño(de(partícula(y(masa(molecular.(
!  Mayor(masa(molecular(eluye(primero(
!  El(gel(retiene(particuas(de(menor(masa(
molecular(
(
!
APLICACIONES! TIPOS!DE!MATRIZ!
GRANULOS!DE!UN!MATERIAL!
! ESPONJOSO!E!HIDRATADO!

! !  Dextranos!con!
!  Desalado!de!proteínas! enlaces!cruzados!
!  Purificación!de!proteínas! !  Agarosa!
!  !Determinación!del!peso!
!  Poliacridamida!
molecular!de!las!
proteínas!
Cromatografía de Afinidad
Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas
para separar componentes específicos de mezclas
complejas.
VENTAJAS:
No hay restricción por volumen.
Especificidad
Pureza del producto final

DESVENTAJAS:
Precio (alto)
Condiciones de elución drásticas
Ligando específico no disponible o inadecuado
 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN
DE PROTEÍNA

Absorción en el ultravioleta.
Es un método no destructivo.
El intervalo de concentración que se puede determinar depende del contenido de los
aminoácidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml.
La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.
Reacción del Biuret.

Las características más importantes de la reacción son:

La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas.
Su intervalo de determinación es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composición de aminoácidos.
Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.

Método de Lowry.
REACCIÓN DE BIURET + REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU
Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul de
heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado,
cisteinilos e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu2+.
 Método de BRADFORD

El intervalo de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5

-1,4 mg/ml (ensayo estándar).
La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y
aromáticos.
 Funciones de las Proteínas
Las funciones de las proteínas son específicas de cada tipo de proteína y permiten a las células
defenderse de agentes externos, mantener su integridad, controlar y regular funciones, reparar daños…
Todos los tipos de proteínas realizan su función de la misma forma: Por unión específica de otra
molécula o ión (ligando o ligante)

De la unión se derivan:

Formación de estructuras celulares (Proteínas fibrosas)

Transporte y almacenamiento

Reactividad específica (catálisis)

Cambios conformacionales (alosterismo, motores moleculares, transmisión y transducción de señales)

UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Actividad
Unidad Internacional (U)=µmol producto formado/min
Katal = mol producto formado/s

Actividad específica
U/mg proteína Katal/mg proteína
 Cómo se monitorea una purificación

Rendimiento
Porcentaje de la actividad biológica de la proteína
de interés en cada paso de la purificación.
En el paso inicial se tiene el 100 %, correspondiente a la actividad total del
extracto inicial
 Veces de purificación, factor de purificación, grado de pureza.
Incremento de la pureza de la proteína de interés en cada paso de la
purificación. Se obtiene con la relación de la actividad específica de cada
paso de purificación y la actividad específica del paso inicial.
 ACTIVIDAD ESPECÍFICA: Unidades de actividad de la
proteína de interés por unidad de masa de proteína total.

RENDIMIENTO: Porcentaje de la cantidad inicial de proteína de

interés que queda después de cada paso de purificación.

VECES DE PURIFICACIÓN: Número de veces que se incrementa

la actividad específica después de cada paso de purificación.
 Enzimas
• Las enzimas son catalizadores biológicos que disminuyen la energía de
activación de las reacciones que catalizan, pero no modifican la constante de
equilibrio.

• Por tanto aceleran en igual proporción la velocidad de la reacción en las dos

direcciones.
La reacción en que una molecula de orotidina monofosfato
pierde un CO2 ocurre 1017 veces más rápida cuando es
catalizada por la enzima orotidina monofosfato descarboxilasa
que cuando no es catalizada.

1017 = 100.000.000.000.000.000

CIEN MIL BILLONES DE VECES MÁS RÁPIDA

¿Por qué la gran mayoría de las reacciones en los seres vivos
necesitan ser catalizadas para que ocurran a una velocidad
apreciable?
 ¿Por qué la gran mayoría de las reacciones en los seres vivos
necesitan ser catalizadas para que ocurran a una velocidad
apreciable?

!Porque de lo contrario estarían todas en el equilibrio.

!Porque así la célula puede regular en forma diferencial su

velocidad, regulando la actividad de los catalizadores de cada
una de ellas.
 VENTAJAS DE LAS ENZIMAS SOBRE
LOS CATALIZADORES INORGÁNICOS

• EFICIENCIA

• CONDICIONES SUAVES DE REACCIÓN

• ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓN

• CAPACIDAD DE REGULACIÓN
 Unión específica
•La(s) molécula(s) que va(n) a reaccionar, sustrato(s), se unen a una región en la
superficie de la enzima llamada sitio activo.
 Sitio activo
Las propiedades del sitio activo están determinadas por la secuencia de
aminoácidos y el arreglo tridimiensional de la cadena polipeptídica de la enzima
Existen dos teorias para explicar la unión específica:

– TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA

– TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO

 TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA

Cada enzima se une a un sustrato único

El sitio activo de la enzima y el sustrato poseen estructuras
complementarias
El sustrato entra e interacciona con el sitio activo
 TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO

• El sustrato no se ajusta con precisión al sitio activo

• Las interacciones no covalentes entre la enzima y el sustrato
modifican la estructura tridimensional del sitio activo
• La enzima y el sustrato sufren cambios conformacionales en
el estado de transición
• Sitio catalítico no es un lugar rígido
La actividad catalítica de una enzima depende de su integridad como ESTRUCTURA
NATIVA.
Algunas enzimas requieren de otras moléculas para catalizar una reacción. (cofactores,
coenzimas).

Interacción entre los aminoácidos del sitio activo y del sustrato

 ENZIMAS

SIN GRUPOS
GRUPO PROSTÉTICO
QUÍMICOS ADICIONALES

GRUPOS COMPLEJOS
COFACTORES
COENZIMAS
IONES METÁLICOS
(Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+)

Apoenzima (si no lo tiene)

Holoenzima (si lo tiene)

 CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
En general, los nombres de las enzimas se forman añadiendo el sufijo “asa”
al nombre de la sustancia en la que actúan
 Velocidad inicial
• La velocidad de una reacción que no sea de orden cero disminuye a
medida que ésta progresa porque va disminuyendo la concentración
del o los reactantes, y porque si la reacción es reversible se da la
reacción inversa.

• Por ello es conveniente medir la velocidad inicial (v0)de la reacción,

que es la velocidad antes de que la concentración de los reactantes
disminuya significativamente y de que los productos alcancen una
concentración que produzca una significativa reacción inversa.

• En el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, otras dos

razones que hacen muy conveniente medir velocidades iniciales son:

– 1) el producto es un inhibidor de la reacción, aun cuando la

reacción no sea reversible.
– 2) la enzima puede ser inestable en el medio de reacción.
La beteína aldehído deshidrogenasa cataliza la oxidación de betaína aldehído a glicina
betaina con la reducción de NAD+. En el experimento se monitoreó la aparición de NADH a
340 nm (ε = 6220 M-1 cm-1). Si se emplearon 30 µg de proteína de la preparación enzimática,
en una cubeta de 3 mL. Determine la actividad de la enzima en unidades internacionales y la
actividad específica de esta preparación.

Tiempo (min) 0 0.1 0.2 0.3 0.5

Absorbancia 0.01 0.07 0.12 0.18 0.3