Objetivos

 Conocer el manejo de un fluorómetro de filtros.

 Determinar el efecto del pH del disolvente sobre la intensidad de la
fluorescencia.
 Determinar el efecto de la concentración de riboflavina en la intensidad de
fluorescencia.

Fundamento
Técnica espectrofotométrica que se basa en la absorción de radiación por pare del
analito a medir en una muestra y su posterior emisión, su fundamento es la
fluorescencia molecular que se basa en que la emisión de radiación por electrones
excitados que vuelven al estado fundamental se realiza en varias etapas, de manera
que emite una radiación de una longitud de onda distinta a la absorbida. en el
fenómeno de fluorescencia, una molécula absorbe radiación electromagnética
ydebido a ello los electrones pasan de un estado basal a otra fase de excitación. Al
ser la longitud de onda de la radiación emitida diferente de la longitud de onda de
absorción, puede utilizarse para identificar y cuantificar sustancias en este caso
como la riboflavina.
Resultados

Tabla 1. Resultados de la curva de calibración de riboflavina en diferentes

medios (agua, HCl, Ác. Acético y NaOH).
Riboflavina RFU en H2O RFU en HCl RFU en CH3COOH RFU en NaOH
0 4.87 4.86 4.93 4.68
1 5.75 4.98 5.76 4.88
2 6.55 4.9 6.59 4.88
3 7.02 5.2 7.05 4.91
4 8.02 5.3 8 4.91
5 8.64 5.39 8.55 4.92
10 11.33 5.77 10.98 4.96
50 16.44 6.3 13.27 4.99
pH 5 1 4 13
Gráfica 1. Curva de calibración de Riboflavina en agua, HCl, ác. Acético y
NaOH de 0-5 ppm.

Gráfica 2. Curva de calibración de Riboflavina en agua, HCl, ác. Acético y

NaOH de 0-50 ppm.

Discusión
En la tabla 1 podemos observar los resultados de la fluorescencia emitida por la
riboflavina en distintas sustancias como lo son: agua bidestilada, ácido acético,
ácido clorhídrico y hidróxido de sodio, así como se analizaron en diferentes
soluciones, también se buscó ver el efecto del pH, para esto se gráfico en dos
distintas curvas tipo, que fueron de 0 a 5 ppm (Gráfica 1) y de 0 a 50 ppm (Gráfico
2).
En la gráfica 1 se puede observar que en la solución donde más hubo fluorescencia
es en el agua bidestilada, alcanzando como máximo 8.64 RFU, y se puede ver una
relación proporcional o lineal entre la concentración de la riboflavina y el conteo de
RFU o el aumento de la fluorescencia de la misma, en segundo lugar, tenemos al
ácido acético, donde si se obtuvó menos fluorescencia, pero es muy poco
disminuida, igualmente observamos una relación lineal entre la concentración y la
fluorescencia. Después encontramos al ácido clorhídrico, donde si ya se ve una
considerable disminución de la fluorescencia a pesar de tener las mismas
concentraciones que con las dos soluciones anteriores. Y por último encontramos
al hidróxido de sodio, donde, la fluorescencia emitida es aún menor que con el HCl.
En todos los casos vemos que conforme aumenta la concentración de la vitamina
aumenta la emisión de fluorescencia.
Sin embargo, al analizarlo desde el punto de vista del pH, observamos que en pH
considerado neutro (5, del agua) la fluorescencia de la vitamina es bastante, ya que
es fácil que los electrones se exciten y tengan la capacidad de emitir este tipo de
luz, mientras que en el ácido acético la emisión de fluorescencia disminuye
levemente (pH 4), ya que hay menos moléculas de riboflavina disponibles para llevar
a cabo la reacción o interacción. En pH ácido que es el HCl (normalmente en pH de
1 o 2), la emisión de fluorescencia es bastante disminuida, esto se puede deber a
que, hay más moléculas protonadas y por lo tanto es más difícil la excitación de los
electrones (“ya que no hay disponibles”) y por lo mismo no pasan al siguiente nivel
y no hay bastante emisión. En pH alcalino (NaOH) la fluorescencia disminuyó aún
más, ya que los iones hidronio tampoco permitían la adecuada deslocalización de
los electrones.
En la gráfica 2 se observa exactamente lo mismo que en la gráfica anterior, sólo
que, hasta mayores concentraciones, y se puede observar que la relación lineal
entre la concentración y la fluorescencia ya no es exactamente proporcional, que
aunque si bien sigue aumentando, ya no lo hace proporcionalmente, si no más lento.
Preguntas adicionales
 ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima
excitación y de máxima emisión?
Es importante conocer la longitud de onda de máxima y de mínima emisión
para seleccionar una longitud de onda adecuada para leer el tipo de
sustancia que es necesario para nuestro experimento.
 Diga cuáles son las formas coenzimáticas de la riboflavina y cuál es su
papel en el metabolismo celular.
La riboflavina se absorbe de manera activa a partir del intestino delgado
proximal y en su interior sufre un proceso de fosforilación, ya que para su
absorción es necesario que las formas FAD y FMN (presentes en los
alimentos a excepción de la leche que sí presenta riboflavina libre) se
conviertan en riboflavina por acción de las fofatasas y pirofosfatasas. Una
pequeña proporción de la vitamina es sintetizada por la flora intestinal.
 Además, su absorción se incrementa gracias a la presencia de alimento en
el tracto gastrointestinal. Una vez absorbida la vitamina viaja al hígado por
vía porta, y posteriormente parte de la riboflavina circula en el plasma, unida
a algunas inmunoglobulinas y débilmente a la albúmina. Cuando la vitamina
se encuentra en el interior de la célula, se convierte en sus formas
coenzimáticas por medio de la flavocinasa; esta transformación ocurre dentro
del citoplasma celular en la mayoría de los tejidos, en especial en el intestino
delgado, hígado, corazón y riñones. Él hígado es el encargado de
metabolizar la riboflavina, y el almacenamiento de ésta es escaso, por lo que
se excreta a través de la orina y el sudor, así como por vía biliar y las
glándulas mamarias.
 Diferencias entre fluorescencia y fosforescencia.
La fluorescencia absorbe la energía de la luz ultravioleta e, inmediatamente,
emite la radiación luminosa. En el caso de la fosforescencia, comienza igual,
absorbiendo la radiación ultravioleta, pero almacena la energía, retardando
la posterior emisión, siendo capaces de emitir esa radiación luminosa poco a
poco durante minutos u horas después de haber cesado la fuente de
radiación excitadora inicial.
Fluorescencia = Emitir luz sólo mientras iluminamos.
Fosforescencia = Emitir luz mientras y después de iluminar.
Conclusiones
 La concentración de riboflavina es proporcional a la fluorescencia emitida.
 El pH ácido y el pH alcalino no son ideales para la fluorescencia de la
riboflavina.
 En el pH del agua (5) la riboflavina tuvo su máxima fluorescencia en este
experimento.
Bibliografía
 Gil Ángel, “Bases fisiológicas y bioquímicas de la nutrición”, Ed.
Médica Panamericana, 1era edición, 2005, págs. 508-515
 Lodish Harvey. 2005. Biología celular y molecular. Ed. Médica panamericana.
5ª edición. Argentina, pág 90
 https://www.zaragoza.unam.mx/portal/wp -
content/Portal2015/Licenciaturas/qfb/tesis/tesis_pineda_penaloza.
pdf