Espectrofotometría

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Espectrofotómetro UV-VIS.

La espectrofotometría1 es un método científico utilizado para medir cuánta luz absorbe una
sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la
solución muestra, basándose en la Ley de Beer-Lambert. Esta medición también puede usarse para
medir la cantidad de un producto químico conocido en una sustancia.

Índice

 1Principios

o 1.1Ley de Lambert

o 1.2Ley de Lambert-Beer

o 1.3Ley de Bouguer-Beer-Lambert

o 1.4Transmitancia y absorción de las radiaciones

 2Aplicaciones

 3Tipos de espectrofotometría

 4Véase también

 5Referencias

Principios[editar]
En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona del
ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este
espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de
menor energía radiante. En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida como función de la
longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas
depende de la estructura de las moléculas, y es característica de cada sustancia química.

La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza haces de radiación del espectro electromagnético,

en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380 a 780 nm, por lo que es de gran
utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro.

Ley de Lambert[editar]

La ley de Lambert trata sobre la iluminancia de una superficie situada a una cierta distancia de una
fuente de luz. Determina que la iluminación producida por una fuente luminosa sobre una
superficie es directamente proporcional a la intensidad de la fuente y al coseno del si ángulo que
forma la normal a la superficie con la dirección de los rayos de luz y es inversamente proporcional
al cuadrado de la distancia a dicha fuente.

Ley de Lambert-Beer[editar]

La ley de Lambert-Beer afirma que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la
concentración en la solución.

Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azúcar disuelta y en otro vaso tenemos la
misma cantidad de agua pero con mayor cantidad de azúcar en solución. El detector es una celda
fotoeléctrica, y lo que se mide es la concentración de la solución de azúcar.

Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz
que saldría del otro lado sería mayor que si repitiéramos esto en el segundo, ya que en este
último las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y
son absorbidos por estos.2

Ley de Bouguer-Beer-Lambert[editar]

Una ley muy importante es la de Bouguer-Beer-Lambert (también conocida como ley de Lambert
Bouguer y Beer), la cual es solo una combinación de las citadas anteriormente.

Transmitancia y absorción de las radiaciones[editar]

Por las leyes mencionadas anteriormente, al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones
hay una pérdida que se expresa con la ecuación:

It/Io=T-kdc''
donde It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoeléctrica
(llamada radiación o intensidad transmitida); Io es la intensidad con la que sale al atravesar la
celda (radiación intensidad incidente), y la relación entre ambas (T) es la transmitancia.

En el exponente, el signo negativo se debe a que la energía radiante decrece a medida que el
recorrido aumenta. El superíndice k es la capacidad de la muestra para la captación del haz del
campo electromagnético, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometría que recorre la
radiación, y c es la concentración del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta.

La ecuación simplificada de la ley de Lambert-Beer

A = ε.d.c

comprende la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbancia de la muestra

(A), el espesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de calibración
relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares.

La absorción (o absorbancia) es igual a A, que es el logaritmo recíproco de la transmitancia:3

A= log 1/T

también se puede presentar como porcentaje:

A=2 -log T

Las ecuaciones mencionadas de las leyes son válidas solo y solo si:3

 la radiación incidente es monocromática;

 las especies actúan independientemente unas de otras durante la absorción;

 la absorción ocurre en un volumen de sección trasversal uniforme.

Aplicaciones[editar]

Las aplicaciones principales son:

 determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto utilizando

las fórmulas ya mencionadas;

 ayudar en la determinación de estructuras moleculares;

 la identificación de unidades estructurales específicas, ya que estas tienen distintos tipos

de absorbancia (grupos funcionales o isomerías);

 determinar constantes de disociación de indicadores ácido-base.

Tipos de espectrofotometría[editar]
  Espectrofotometría de absorción molecular VIS-UV. 13,

 Espectrofotometría de absorción molecular IR.15.

 Espectrofotometría de absorción y emisión atómica.

 Espectrofotometría con atomizadores electrotérmicos.

 Espectrofotometría de emisión con plasma.

 Espectrofotometría de fluorescencia molecular.

Espectrofotómetro

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El espectrofotómetro es un instrumento con el que se apoya la espectrofotometría para medir la

cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una solución muestra.

Espectrofotómetro

Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en

función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica
relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una
muestra. También se utiliza en laboratorios de química para
la cuantificación de sustancias y microorganismos.
Hay varios tipos de espectrofotómetros, que son de absorción atómica, de absorción molecular
(que comúnmente se conoce como espectrofotómetro UV-VIS), y no debe ser confundido con un
espectrómetro de masa.

Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una
muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al
operador realizar dos funciones:

1. dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra,

2. indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la
muestra.

Índice

 1Partes de un espectrofotómetro

 2Componentes de un espectrofotómetro

o 2.1Fuente de luz

o 2.2Monocromador

o 2.3Compartimento de Muestra

o 2.4Detector

o 2.5Fotodetectores

o 2.6Celdas

 3Historia

 4Véase también

 5Referencias

 6Enlaces externos

Partes de un espectrofotómetro[editar]

El espectrofotómetro, en general, consta de dos dispositivos; un espectrómetro y un fotómetro.

Un espectrómetro es un dispositivo que produce, dispersa y mide la luz. Un fotómetro tiene un
detector fotoeléctrico que mide la intensidad de la luz.

 Espectrómetro: Produce un rango deseado de longitud de onda de luz. Primero un

colimador (lente) transmite un haz recto de luz (fotones) que pasa a través de un
 monocromador (prisma) para dividirlo en varias componentes de longitudes de onda
(espectro). Entonces un selector de longitud de onda (ranura) transmite sólo las longitudes
de onda deseadas.

 Fotómetro: Después de que el rango deseado de longitud de onda de luz pasa a través de
la solución muestra en la cubeta, el fotómetro detecta la cantidad de fotones que se
absorbe y luego envía una señal a un galvanómetro o una pantalla digital.

Componentes de un espectrofotómetro[editar]

Fuente de luz[editar]

La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las siguientes condiciones: estabilidad,
direccionabilidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas
son: lámpara de wolframio (también llamado tungsteno), lámpara de arco de xenón, lámpara
de deuterio y lámpara LED que se utilizan en los laboratorios.

Monocromador[editar]

Artículo principal: Monocromador

El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan
desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromática.

Está constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión. El
colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es un lente que lleva el haz de luz que
entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las longitudes
de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la
rendija de salida.

Compartimento de Muestra[editar]

Es donde tiene lugar la interacción con la materia (debe producirse donde no haya absorción ni
dispersión de las longitudes de onda). Es importante destacar, que durante este proceso, se aplica
la ley de Lambert-Beer en su máxima expresión, con base en sus leyes de absorción, en lo que
concierne al paso de la molécula de fundamental-excitado.

Detector[editar]

El detector es el encargado de captar la radiación y, a su vez, dejarla en evidencia para su estudio

posterior. Existen dos tipos:

 a) los que responden a fotones;

 b) los que responden al calor.

Fotodetectores[editar]
En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 fotodetectores para percibir la señal
en forma simultánea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el
tiempo de medida, y minimiza las partes móviles del equipo.

Celdas[editar]

Celdas de espectofotometría. En un primer plano, dos de cuarzo aptas para el trabajo con luz
ultravioleta; en segundo plano, de plástico, para colorimetría (es decir, empleando luz visible).

Son los recipientes donde se depositan las muestras líquidas a analizar. El material del cual están
hechas varía de acuerdo a la región que se esté trabajando; son de vidrio o plástico si se trabaja en
la región visible, de cuarzo si se trabaja en la ultravioleta y de NaCl si se trabaja la región de
infrarrojo. Se caracterizan por tener dos paredes correspondiente a los lados ópticos por donde
cruza el haz de luz.

Historia[editar]

En 1940 estaban disponibles en el mercado varios espectrofotómetros, pero los primeros modelos
no podían trabajar en el ultravioleta. Arnold O. Beckman desarrolló una versión mejorada en el
National Technical Laboratorios Company, más tarde la empresa Beckman Instrument y en última
instancia Beckman Coulter. Se desarrollaron los modelos A, B, y C (se produjeron tres unidades del
modelo C), y luego el modelo D, que se convirtió en el DU. Toda la electrónica estaba contenida
dentro de la caja del instrumento y tenía una nueva lámpara de hidrógeno con continuum
ultravioleta, y un mejor monocromador. Este instrumento fue producido desde 1941 hasta 1976
con esencialmente el mismo diseño; más de 30 000 unidades fueron vendidas. El precio en 1941
fue de US$723. El laureado con el Nobel de química Bruce Merrifield dijo que era «probablemente
el instrumento más importante que se ha desarrollado para favorecer la realización de la
biociencia».1
Espectrometría ultravioleta-visible

La espectrometría ultravioleta-visible o espectrofotometría UV-Vis implica la espectroscopia de

fotones en la región de radiación ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y
adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano.
En esta región del espectro electromagnético, las moléculas se someten a transiciones
electrónicas.

Esta técnica es complementaria de la espectrometría de fluorescencia, que trata con transiciones

desde el estado excitado al estado basal, mientras que la espectrometría de absorción mide
transiciones desde el estado basal al estado excitado.

APLICACIONES

La espectrometría UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinación cuantitativa de soluciones

de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos muy conjugados.

Soluciones de iones metálicos de transición

Las soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz
visible) debido a que los electrones en los átomos de metal se pueden excitar desde un estado
electrónico a otro. El color de las soluciones de iones metálicos se ve muy afectado por la
presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de una
solución diluida de sulfato de cobre es muy azul; agregando amoníaco se intensifica el color y
cambia la longitud de onda de absorción máxima.

Compuestos orgánicos

Los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugación, también
absorben luz en las regiones del espectro electromagnético visible o ultravioleta. Los disolventes
para estas determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en agua, o el
etanol para compuestos orgánicos solubles. Los disolventes orgánicos pueden tener una
significativa absorción de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en
espectrometría UV. El etanol absorbe muy débilmente en la mayoría de longitudes de onda. La
polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la absorción del espectro de un compuesto
orgánico. La tirosina, por ejemplo, aumenta su máximo de absorción y su coeficiente de extinción
molar cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando disminuye la polaridad de los disolventes.
Aunque los complejos de transferencia de carga también dan lugar a colores, éstos son a menudo
demasiado intensos para ser usados en mediciones cuantitativas.

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente

proporcional a la concentración de la solución. Por tanto, la espectrometría UV/VIS puede usarse
para determinar la concentración de una solución. Es necesario saber con qué rapidez cambia la
absorbancia con la concentración. Esto puede ser obtenido a partir de referencias (las tablas de
coeficientes de extinción molar) o, con más exactitud, determinándolo a partir de una curva de
calibración.

El espectrofotómetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (CLAR). La presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la
concentración. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito debe compararse
con la respuesta a un estándar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibración. La respuesta
(por ejemplo, el pico de altura) para un concentración particular se conoce como factor de
respuesta.

LEY DE BEER-LAMBERT

La espectrometría UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para determinar
las concentraciones de especies absorbentes en solución, usando la Ley de Beer-Lambert:

donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz incidente a una determinada

longitud de onda, I es la intensidad de transmisión, L la longitud de ruta a través de la muestra, y c
la concentración de las especies absorbentes. Para cada especie y longitud de onda, ε es una
constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extinción. Esta constante es una
propiedad fundamental molecular en un solvente dado, a una temperatura y presión particular, y
tiene como unidades 1/M * cm o, a menudo, U/M * cm.

La absorbancia y extinción ε a veces son definidas en términos de logaritmo natural en lugar de

logaritmo de base 10.
La ley de Beer-Lambert es útil para la caracterización de muchos compuestos, pero no sirve como
relación universal para la concentración y absorción de todas las sustancias. En moléculas
complejas de gran tamaño, como los tintes orgánicos (Xylenol Naranja o Rojo Neutro, por
ejemplo), a veces se encuentra una relación polinómica de segundo orden entre la absorción y la
concentración.

ESPECTROFOTÓMETRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE

El instrumento utilizado en la espectrometría ultravioleta-visible se llama espectrofotómetro UV-

Vis. Mide la intensidad de luz que pasa a través de una muestra (I), y la compara con la intensidad
de luz antes de pasar a través de la muestra (Io). La relación I / Io se llama transmitancia, y se
expresa habitualmente como un porcentaje (%T). La absorbancia (A) se basa en la transmisión:

A = - log (%T)

Las partes básicas de un espectrofotómetro son una fuente de luz (a menudo una bombilla
incandescente para las longitudes de onda visibles, o una lámpara de arco de deuterio en el
ultravioleta), un soporte para la muestra, una rejilla de difracción o monocromador para separar
las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. El detector suele ser un fotodiodo o un
CCD. Los fotodiodos se usan con monochomadores, que filtran la luz de modo que una sola
longitud de onda alcanza el detector. Las rejillas de difracción se utilizan con CCDs, que recogen la
luz de diferentes longitudes de onda en píxeles.

Un espectrofotómetro puede ser único o de doble haz. En un instrumento de un solo haz (como el
Spectronic 20), toda la luz pasa a través de la célula muestra. La Io debe medirse retirando la
muestra. Este fue el primer diseño, y todavía está en uso en la enseñanza y laboratorios
industriales.

En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un haz
se utiliza como referencia, y el otro haz de luz pasa a través de la muestra. Algunos instrumentos
de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de referencia y el de la muestra se miden
al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un bloqueador que
impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la del haz de
referencia.

Las muestras para espectrofotometría UV-Vis suelen ser líquidas, aunque la absorbancia de los
gases e incluso de los sólidos también puede medirse. Las muestras suelen ser colocadas en una
célula transparente, conocida como cubeta. Las cubetas suelen ser rectangulares, con una anchura
interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud de ruta, L, en la Ley de Beer-Lambert.
También se pueden usar tubos de ensayo como cubetas en algunos instrumentos. Las mejores
cubetas están hechas con cuarzo de alta calidad, aunque son comunes las de vidrio o plástico. El
cristal y la mayoría de los plásticos absorben en el UV, lo que limita su utilidad para longitudes de
onda visibles.

ESPECTRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE

Un espectro ultravioleta-visible es esencialmente un gráfico de absorbancia de luz frente a una

longitud de onda en el rango del ultravioleta o la luz visible. Este espectro puede ser producido
directamente con los espectrofotómetros más sofisticados, o bien pueden registrarse los datos de
una sola longitud de onda con los instrumentos más simples. La longitud de onda se representa
con el símbolo λ. Del mismo modo, para una determinada sustancia, puede hacerse un gráfico
estándar del coeficiente de extinción (ε) frente a la longitud de onda (λ). Este gráfico estándar
sería efectivamente "la concentración corregida" y, por tanto, independiente de la concentración.
Para una sustancia determinada, la longitud de onda en la cual se produce el máximo de
absorbancia en el espectro se llama λ max, y se pronuncia "lambda-max".

Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones empíricas que pueden utilizarse
para predecir λ max, la longitud de onda de la absorción UV-Vis, para compuestos orgánicos
conjugados como dienos y cetonas.

Las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlace
en una determinada molécula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la
molécula. La absorción UV-Vis no es, sin embargo, una prueba específica para ningún compuesto
determinado. La naturaleza del disolvente, el pH de la solución, la temperatura, la concentración
de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden influir en los espectros de
absorción de los compuestos, así como las variaciones en la anchura de la hendidura (ancho de
banda efectivo) en el espectrofotómetro.