Universidad de San Buenaventura- Cartagena

Programa de Ingeniería Química

Laboratorio de Biotecnología

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO

1. INTRODUCCIÓN

Los sistemas de bioconversión anaerobia son procesos biológicos donde la materia orgánica es
reducida hasta metano y dióxido de carbono por la acción de diferentes grupos microbianos que
trabajan en sintrofía. Los microorganismos involucrados en la digestión anaerobia (DA)
corresponden a) Bacterias fermentativas-hidrolíticas b) Bacterias acetogénicas y c) Arqueas
metanogénicas. Los microorganismos involucrados en la DA corresponden a) Bacterias
fermentativas-hidrolíticas b) Bacterias acetogénicas y c) Arqueas metanogénicas. El primer grupo
está representado por los géneros Peptostreptococcus, Propionibacterium, Bacteroides,
Micrococcus y Clostridium los cuales producen enzimas que desdoblan lo polímeros orgánicos
hasta monómeros fácil fermentables. Luego las bacterias acidogénicas metabolizan los
monómeros para generar acetatos, propionatos y butiratos que son reducidos posteriormente por
las bacterias acetogénicas hasta acetato, dióxido de carbono e hidrógeno. Finalmente, las arqueas
metanogénicas actúan sobre el acetato e hidrogeno para transformarlo en metano. Estudios sobre
DA a condiciones mesofílicas, han reportado rendimientos en la producción de metano entre 0.29
y 0.50 m3 CH4/kg SV, utilizando pollinaza como sustrato y lodo anaerobio de plantas de
tratamiento de aguas residuales como inóculo. Un parámetro importante a nivel operacional en
DA es la concentración del sustrato representada mediante la relación Inóculo/sustrato (RIS). Se
ha demostrado experimentalmente, que la RIS afecta la velocidad de biodegradación del sustrato,
por tanto este parámetro permite especificar el rendimiento del proceso que a su vez corresponde
a un indicador de factibilidad (Cuando Biogás obtengo a partir de la cantidad de sustrato
consumida).

2. FASES DEL LABORATORIO

Fase 1: Instrumentación y técnicas analíticas

Fase 2: Diseño de experimentos

3. MÉTODOS ANALÍTICOS
3.1 DETERMINACIÓN SÓLIDOS TOTALES (ST)

Los sólidos totales son los obtenidos después de secar la muestra a 103-105°C

Equipos y materiales:

- Crisoles de porcelana
- Estufa a 103-105°C
- Desecadora
- Balanza Analítica de precisión 0,1mg
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Procedimiento:

a) lavar los crisoles de porcelana y dejar en la mufla por al menos 2 horas, luego
retirar y dejar enfriar en la desecadora y pesar, repetir el ciclo de secado, enfriado y
pesado hasta alcanzar peso constante o hasta que la pérdida de peso sea menor
que 4% del peso previo o 0.5mg, éste será el peso (A) en gramos.
b) Tomar 10mL de muestra homogénea y depositarlo dentro de un crisol de porcelana
el cual se coloca en la estufa a 103-105°C por 8 horas como mínimo, luego retirar
de la estufa y dejar enfriar en la desecadora, pesar y chequear hasta alcanzar peso
constante, este valor es el peso (B) en gramos, realizar el ensayo por duplicado.

Así:

ST g / L 
PesoB  PesoA *1000
Vol.muestra

En donde el volumen de la muestra es 10mL y si fuese sólido, anotar los gramos

correspondientes (hasta 5g)

3.2 DETERMINACION DE SÓLIDOS VOLÁTILES (SV)

Los sólidos volátiles (SV) corresponden a los compuestos volatilizados durante la
calcinación de la muestra a 550± 50°C. Representan una medida de la materia orgánica.

Equipos y materiales:

- Crisoles de porcelana para un volumen de 20mL

- Estufa a 103-105°C
- Mufla a 550±50°C
- Desecadora.
- Balanza analítica de precisión 0,1mg.

Procedimiento:

a) Lavar un crisol de porcelana y dejar en la mufla por al menos 2 horas, luego retirar
y dejar enfriar en la desecadora y pesar en una balanza analítica, repetir el ciclo de
secado, enfriado y pesado hasta peso constante o hasta que la pérdida de peso
sea menor que el 4% del peso previo o 0.5mg. éste será el peso (A) en gramos.
b) Colocar un volumen de muestra de 10mL en el crisol dentro de la estufa a 103-
105°C por 8 horas como mínimo, retirar de la estufa y dejar enfriar en desecadora,
pesar en una balanza analítica y chequear peso constante, este valor constituye el
peso (B) en gramos.
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Luego flamear el crisol (agarrar crisol con pinzas metálicas y sobreponerlo en mechero
bajo campana o bien bajo extractor, hasta que salga humo negro) luego colocarlo en la
mufla a 550°C por al menos 8 horas, enfriar y pesar hasta obtener peso constante (peso
C en gramos)

Los SV se calculan de la siguiente manera: Volumen de la muestra es 5mL.

SV= (Peso C-Peso B)*1000/Volumen de Muestra (g/L)

3.3 DETERMINACIÓN DE CARBONO ORGANICO

Tabla 1. Preparación Reactivos Determinación Carbono Orgánico.

REACTIVO/SOLUCION PREPARACION

Acido crómico 0.4 N - Disolver 39.232 g secos de K2Cr2O7 en 1 litro de agua

destilada
- Adicionar muy cuidadosamente (en un baño de hielo) 1
litro de ácido sulfúrico concentrado
- Dejar enfriar
FAS 0.2 N Disolver 80 g de sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH4SO4)·
6H2O) en 1 litro de agua destilada, conteniendo 20mL de
ácido sulfúrico concentrado

Indicador de ortofenantrolina Disolver 1.485 g de ortofenantrolina y 0.695 de sulfato ferroso

amoniacal en 100mL de agua destilada.

Metodología:
 Pesar hasta 0.1g de muestra seca, previamente molida, transfiriéndola a un balón de
vidrio esmerilado de 250mL.
 Adicionar 50mL de ácido crómico 0.4 N, agitando suavemente para mantener la
suspensión.
 Conectar el matraz a un sistema de condensación, poner a calentar y dejar ebullir
moderadamente durante 15 minutos. Retirar el frasco y dejar enfriar.
 Transferir el contenido a un matraz de aforo de 250mL y aforar con agua destilada.
 Agregar entre 3 a 5mL de ácido sulfúrico concentrado, agitar bien.
 Sacar 25mL de la solución para titular
 Agregar 3 gotas de indicador
 Titular con una solución de FAS estándar hasta el punto final, el cual es marcado por
un café rojizo.
 Realizar un blanco que consiste en la solución de ácido crómico sin muestra.
Cálculos:

El porcentaje de carbono orgánico esta dado por:

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%C 
Vblanco  Vmuestra   C  N Ac  0.003  100
Vblanco  P

Donde:

V: volumen de FAS gastados en la titulación, mL

C: volumen de ácido crómico (50mL), mL

NAC: normalidad del ácido crómico (0.4N)

0,003: m.e. peso de carbono

P: peso de la muestra, g

3.4 ALCALINIDAD
RAZÓN ALFA
La razón α es un parámetro importante dentro de la operación de un reactor anaerobio, ya
que es una relación entre alcalinidades que se puede determinar como el valor de
alcalinidad debida a AGV sobre la alcalinidad total. Este valor se puede usar como
parámetro de control de estabilidad, recomendando no superar el valor de 0.3 para evitar
la acidificación del reactor (APHA, 1992)

Tabla 21. Preparación Reactivo para determinar Alcalinidad

REACTIVO/SOLUCION PREPARACION OBSERVACIONES

Ácido Sulfúrico Disolver 5.566mL de H2SO4 0.1 N estandarizado

concentrado y aforar a 2L de
agua destilada.

Metodología:

 Colocar en un vaso precipitado 10mL de muestra

 Titular con el H2SO4, hasta pH 5.75. Anotar el volumen de H2SO4 gastado.
 Continuar la titulación hasta llegar pH 4.3. Anotar el volumen total de H2SO4 gastado

Cálculos
El valor de la razón  de alcalinidad está dado por:
V pH 5.75 4.3
razón 
V pH 4.3
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Donde:

VpH5.75-4.3: volumen de H2SO4 gastado entre pH 5.75 y pH 4.3

VpH4.3 : volumen de H2SO4 gastado hasta llegar a pH 4.3

3.5 ALCALINIDAD TOTAL

Definición: Se define la alcalinidad como la capacidad de neutralizar ácidos. Dicha
capacidad se debe a la presencia de sustancias tampón o amortiguadoras. El
comportamiento de dichas sustancias puede variar ampliamente de acuerdo con el pH de
la disolución (APHA, 1992)

Principio: Los reactores anaerobios se acidifican debido a sobrecargas y presencia de

tóxicos, dicha acidificación se debe a la diferencia de velocidades con que las poblaciones
bacterianas realizan el proceso de acidogénesis y metanogénesis, con lo cual podrían
acumularse AGVs y afecte el pH, lo que finalmente puede provocar la acidificación del
sistema, pues su disminución es la respuesta al agotamiento de la alcalinidad
considerando que los AGVs son el intermediario más importante en el proceso de
digestión anaerobia.

La alcalinidad se determina por titulación con una solución estándar de un ácido mineral
fuerte a los puntos sucesivos de equivalencia del bicarbonato y el ácido carbónico. Se
utilizará el método propuesto por Jenkins et al. (1983) para determinar la alcalinidad en
digestores anaerobios, en donde se utilizan dos puntos de titulación uno a pH 5.75 y otro
a pH 4.3. Si el punto final de la titulación de alcalinidad es pH 5.75 la capacidad buffer del
sistema carbonatado es medido pero la capacidad buffer de los ácidos grasos volátiles no.
Teóricamente a pH 5.75, cerca del 80% del bicarbonato ha sido titulado, pero menos del
20% de ácidos grasos volátiles han contribuido a la alcalinidad. Cuando la alcalinidad
cuantificada a 5,75 desciende bajo los 1200mg/L como CaCO3, los ácidos grasos volátiles
son usualmente altos, indicando un stress del reactor. Este valor de 1200mg/L CaCO3
podría servir positivamente como un límite inferior operacional de una buena actividad del
digestor.

Tabla 2. Preparación Reactivo determinación Alcalinidad.

REACTIVO/SOLUCION PREPARACION OBSERVACIONES

Ácido Sulfúrico Disolver 5.566mL de H2SO4 0.1 N estandarizado

concentrado y aforar a 2L de
agua destilada.
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VH 2 SO 4 ·N H 2 SO 4 ·PM CaCO3 ·1000

alcalinida d 
Vmuestra·N eq

Donde

Alcalinidad: expresada como mgCaCO3/L

VHCl : volumen de H2SO4 gastado hasta llegar a pH 4.3

Vmuestra: volumen de muestra

NHCl : normalidad del H2SO4

PMCaCO3 : Peso Molecular del Carbonato de Calcio ( 100 g/mol)

Neq : número de equivalentes, 2

3.6 NITRÓGENO AMONIACAL: MÉTODO FENOL-HIPOCLORITO

Es determinado por medio del método de fenol-hipoclorito descrito por Weatherburn M.,
1967 utilizando NH4Cl como solución patrón con una concentración de 10 ppm.Las
muestras se preparan en tubos de vidrio secos, previa ambientación con agua destilada.
La mezcla consiste en:

2.5 [mL] de muestra, previamente diluida (dentro del rango lineal del método),
previamente centrifugada según requiera la muestra (eliminar Sólidos
suspendidos)
1 [mL] de Reactivo 1
1.5 [mL] de Reactivo 2

El blanco consiste en 2.5 [mL] de agua destilada y la misma cantidad de Reactivo 1 y 2.

Las muestras se agitan utilizando un Vórtex y se mantienen a temperatura ambiente
durante 45 [min], se mide a 635 [nm].

REACTIVO 1

Tabla 3. Preparación Buffer

Na3PO412H2O 30 [g]

Na3C6H5O72H2O 30 [g]

EDTA 3 [g]
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Disolver en un litro de agua (medir pH 12). Almacenar a 4°C. Luego, en 500 [mL] de
buffer, agregar y disolver:

Tabla 4. Preparación Reactivo 1

Sodio nitroprusiato 0,1 [g]

Fenol 30 [g]

Este reactivo es estable, alrededor de 1 mes, almacenado en botella ámbar a 4°C.

REACTIVO 2

Tabla 5. Preparación Reactivo 2

Hipoclorito comercial 30 [mL]

NaOH (1 [N]) 400 [mL]

Disolver en 1 litro.

RECTA DE CALIBRADO:
PATRÓN: Solución de NH4Cl, 0.3819 [g] en 100 [mL]. Cuando se realiza la curva
patrón se debe tomar 1 [mL] de la solución anterior y aforar a 100 [mL]. Presenta una
concentración final de 10ppm.

Tabla 6. Preparación Curva de Calibrado Amonio

Volumen patrón [L] 0 50 100 150 200 250

Volumen agua [L] 2500 2450 2400 2350 2300 2250

Concentración final
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
[mg/L]
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4. REFERENCIA
 Standard Methods for WasteWater 1995, 19th Ed. Washington.
 Jenkins, S. R., Morgan, J. M., and Sawyer, C. L. (1983). "Measuring anaerobic sludge
digestion and growth by a simple alkalimetric titration." Journal WPCF, 55(5), 448-453.
 Ripley, L. E., Boyle, J. C., and Converse, J. C. (1986). "Improved alkalimetric
monitoring buffer capacity and total volatile fatty acid levels in anaerobic digestion of
high-strength wastes." Journal WPCF, 58(5), 406-411.
 Weatherburn, M. (1967) Phenol-hypochlorite reaction for determination of ammonia.
Analytical Chemistry, 39 (8), 971-974.