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Múltiplas estratégias funcionais para amplificar a sensibilidade do imunoensaio amperométrico para

marcadores tumorais: uma revisão

Abstrato
Várias estratégias funcionais mostraram grande potencial em imunoensaios amperométricos ultra-
sensíveis para marcadores tumorais, que promovem a condutividade e a amplificação múltipla de
sinal. A sensibilidade dos imunoensaios amperométricos é significativamente afetada pela
condutividade e área específica da interface sensora, bem como pela atividade eletroquímica das
espécies redox. Assim, essas estratégias são geralmente baseadas na integração de vários materiais
em conjunto e na adoção de sistemas de imunossensibilidade com muitas vantagens, como grande
área específica, alta atividade eletroquímica, boa condutividade, biocompatibilidade e desempenho
catalítico. Devido ao rápido desenvolvimento de materiais funcionais (como híbridos condutores,
híbridos catalíticos, materiais semelhantes a enzimas, espécies altamente eletroquímicas ativas,
nanocompósitos redox, materiais porosos, hidrogéis, e estrutura metal-orgânica) e novas substâncias
bioativas (incluindo novos agentes bloqueadores e receptores como peptídeos e cadeias de
oligonucleótidos), a sensibilidade dos biossensores relacionados é geralmente maior que a dos
tradicionais, o que indica que múltiplas estratégias funcionais são promissoras em imunoensaios
amperométricos. Aqui, fornecemos uma visão geral dos avanços recentes em múltiplas estratégias
funcionais que provaram melhorar drasticamente a sensibilidade dos imunoensaios amperométricos,
que incorporam os seguintes materiais: (1) híbridos condutores de nanomateriais; (2) híbridos
catalíticos de nanomateriais; (3) novos materiais redox; (4) materiais porosos tridimensionais; (5)
novos receptores e agentes de bloqueio

1 . Introdução
Todos os anos, cerca de meio milhão de óbitos ocorrem devido ao câncer e mais de um milhão de
pacientes são diagnosticados com a doença ( Siegel et al., 2016; Torre et al., 2015; Chen et al.,
2016 ). O câncer também é a segunda causa mais comum de morte em crianças menores de 14 anos,
enquanto as taxas de incidência de câncer aumentaram continuamente 0,6% ao ano desde 1975
( Siegel et al., 2016; Ward et al., 2014 ). Devido ao início insidioso, metástase fácil, mau prognóstico
alta mortalidade e taxas de recorrência, o câncer tornou-se uma preocupação importante para a saúde
pública e a segunda principal causa de morte ( Torre et al., 2015). O diagnóstico precoce e o
tratamento médico provaram ser as rotas mais eficazes para prevenir o progresso e a deterioração do
câncer, reduzir o número de pacientes com câncer e aumentar as taxas de sobrevivência. No
diagnóstico precoce, a determinação de marcadores tumorais preparou o caminho para estratégias
diagnósticas mais eficazes ( Siegel et al., 2016; Torre et al., 2015 ), uma vez que servem como
indicadores em fluidos corporais, como soro, plasma, saliva e urina ( Van Rhijn et al., 2005; Hu et
al., 2008; Perkins et al., 2003 ; Bates, 1991 ). Até agora, muitos marcadores tumorais foram
examinados e apresentam alta especificidade para certos tipos de câncer ( Tabela 1 ), incluindo câncer
de próstata, fígado, pulmão e colorretal (Ballehaninna e Chamberlain, 2011; Sturgeon et al.,
2010; Ronkainen e Okon, 2014 ). A ligeira alteração de sua concentração está fortemente relacionada
à ocorrência, desenvolvimento e palindromia do câncer e ao efeito terapêutico ( McShane et al.,
2005 ). Neste caso, o desenvolvimento de métodos eficazes para detectar sensivelmente a ligeira
alteração da concentração de marcadores tumorais foi urgente para o diagnóstico clínico.
Tabela 1 . Casos convencionais de câncer e marcadores tumorais relacionados.

Câncer Marcador tumoral


Sistema CEA, NSE, Cyfra21-1 SCC,
Câncer de pulmão
respiratório TPA
Carcinoma esofágico SCC, CEA
Carcinoma gástrico CEA, CA19-9, CA72-4
Carcinoma do ducto
CA19-9, CEA
Sistema digestivo biliar
Câncer de pâncreas CA19-9, CEA, CA12-5
Câncer colorretal CEA, CA19-1, CA12-5
Câncer de fígado AFP, CA19-9, CEA
Câncer cervical SCC, CEA
CA12-5, HCG, AFP, CA72-
cancro do ovário
Sistema 4
reprodutivo Câncer de próstata PSA
Carcinoma de
AFP, HCG, SCC
testículo
Câncer de tireoide HCT, NSE, Tg
Outras
Câncer de mama CA15-3, CEA
Câncer de bexiga TPA, CEA
Antígeno carcinoembrionário (CEA), enolase específica de neurônio (NSE), antígeno de carcinoma
de células escamosas (SCC), antígeno de polipéptido de tecido (TPA), antígeno de carboidrato (CA),
alfa-fetoproteína (AFP).

Muitos ensaios imunológicos foram desenvolvidos com sucesso, incluindo fluorescência ( XL Huang
et al., 2016b ), colorimétricos ( Lai et al., 2016 ), luminescência ( Zhang et al., 2012 ), radiométricos
( Tyan et al., 2013 ), piezoelétricos ( Zhou et al., 2013 ), amperométrico ( Tang e Ma, 2016 ),
potenciométrico ( QF Li et al., 2016; Silva et al., 2015 ) e ensaios impedimétricos ( Hou et al., 2014;
Yuan et al. 2012, Pan et al., 2017), que se baseiam na imunorreação específica entre os anticorpos
marcados e os marcadores tumorais. Entre estes métodos, o imunoensaio eletroquímico provou ser
excelente devido às suas vantagens de fabricação fácil, detecção rápida, baixo custo e miniaturização
( Zhang e Ding, 2016 , FY Li et al., 2017 , Lai et al., 2015 ).

O imunoensaio amperométrico é um processo em que as reações de redox nas superfícies dos


eletrodos são iniciadas por um campo elétrico externo, aumentando significativamente a sua aplicação
em testes analíticos ( Lai et al., 2015; Qin et al., 2015 ). Embora muitos imunoensaios
amperométricos sensíveis tenham sido desenvolvidos com limites de detecção tão baixos quanto os
picogramas por níveis de mililitro, suas respostas atuais são geralmente em vários níveis de
microamperes e limitam sua sensibilidade ( Qin et al., 2015 ), indicando que o desenvolvimento de
estratégias de amplificação de sensibilidade é urgente e necessário.

A sensibilidade de um imunoensaio amperimétrico é definida como as diferenças de sinal atuais (ΔI)


entre um imunossensor tratado com um marcador tumoral e um tratado sem (Liu e Ma, 2013). Assim,
um ΔI maior significa sempre uma maior sensibilidade de um imunossensor eletroquímico. Em
princípio, ΔI é seriamente influenciado pelas propriedades físicas e químicas do substrato sensível e
imunoprobes, como a condutividade da interface sensora e a atividade eletroquímica das espécies
redox. Por isso, a amplificação da sensibilidade é principalmente concentrada em melhorar a
condutividade, melhorar o sinal de corrente ou ampliar a área de imunossensao (Liu e Ma, 2013; N.
Liu et al., 2013; W.W. Huang et al., 2016a

As múltiplas estratégias funcionais são de grande potencial para amplificar a sensibilidade dos
imunossensores eletroquímicos ( Fig. 1 ). Geralmente, essas estratégias multifuncionais se
comportam como sinal ou condutividade de corrente de multi-amplificação ( Tang et al., 2017b; Dong
et al., 2016; Fang et al., 2014 ). Neste caso, tais imunoensaios amperométricos geralmente possuem
altas sensibilidades. Várias pesquisas sugeriram que os imunossensores amperométricos construídos
com diferentes nanomateriais funcionam de forma mais eficaz e possuem boa condutividade,
estabilidade e hidrofilicidade, atividade catalítica, alta capacidade de adsorção e uma grande área de
imunossensao ( Shi et al., 2014; Vilela et al., 2014 ; Tang et al., 2017b; ZF Wang et al., 2014). Para
amplificar efetivamente a sensibilidade, pesquisas recentes realizaram algumas estratégias
multifuncionais através da síntese de novos materiais condutores ( Liu et al., 2014; Xu et al., 2015 ),
encontrando novos materiais para enriquecer as espécies redox ( Rong et al., 2015; Li et al., 2014;
Wang et al., 2015a ), e produzindo novos materiais redox ( Wang et al., 2016b, ZM Liu et al.,
2015 ). Além disso, algumas estratégias se concentraram em elevar toda a estrutura do imunoensaio
usando novos receptores para reconhecimento específico de marcadores tumorais e empregando
novas substâncias como agentes bloqueadores para substituir a albumina de soro bovino (BSA) ( Xia
et al., 2017b; Lin et al 2015, Zhao e Ma, 2017, Shan e Ma, 2016). As sensibilidades desses
imunoensaios com base em estratégias multifuncionais são várias vezes maiores que as de outros
imunoensaios amperométricos relatados, indicando seu grande valor na amplificação de sensibilidade
para imunoensaios eletroquímicos e imunossurizados ( Tabela 2 ).

Fig. 1 . Ilustração esquemática de múltiplas estratégias funcionais para amplificar a


sensibilidade do biossensor amperométrico para o criador de tumores.

Tabela 2 . Comparação dos desempenhos analíticos de alguns imunossensores


amperométricos recentemente publicados com / sem estratégias multifuncionais.

Anticorpos de captura (Ab1), anticorpos marcados (Ab2), Nanopartículas (NPs), nanoflowers (NFs),
nanotubos (NT), nanoclustes (NCs), folhas de grafeno (GS); nanopartículas de coordenação cadmio-
orgânica (CdOP); poli (N, N'-difenil- p- fenildiamina) (PPPD); factor de crescimento epidérmico
(EGF); polieterimida (PEI), β-ciclodextrinas (CD); ácido adamantina-1-carboxílico (ADA); alginato
(Alg)

Aqui, fornecemos uma visão geral de múltiplas estratégias funcionais para aumentar a sensibilidade
do imunoensaio amperimétrico, que incluem: (1) híbridos condutores de nanomateriais; (2) híbridos
catalíticos de nanomateriais; (3) novos materiais redox; (4) materiais tridimensionais (3D) porosos; e
(5) novos receptores e agentes de bloqueio.
2 . Múltiplas estratégias funcionais em imunoensaio amperimétrico
2.1 . Nanomateriais condutores
Embora a amplificação do sinal seja o método mais comum para aumentar a sensibilidade,
nanotecnologias e nanomateriais prepararam uma nova direção para aumentar ainda mais
a sensibilidade ao imunoensaio ( Chikkaveeraiah et al., 2012; Zhu et al., 2014 ). Os
nanomateriais, como nanopartículas de ouro (AuNPs), nanopartículas de sílica,
nanopartículas de platina (PtNPs), nanopartículas de carbono, folhas de grafeno,
nanotubos de carbono multi-paredes (MWCNTs) e pontos quânticos (QDs) foram
amplamente aplicados em imunoensaios amperométricos ( Yin et al. , 2014; Gao et al.,
2014, 2013; Feng et al., 2014a ). Esse imunoensaio exibiu frequentemente um sinal de
corrente mais forte e maior sensibilidade em comparação com aqueles que utilizam
anticorpos marcados com moléculas redox ( Ahirwal et al., 2010 ; Song et al., 2011 ;Lai
et al., 2014 ). Essas propriedades aprimoradas são atribuídas principalmente aos
nanomateriais que possuem grande área superficial específica e permitem o
enriquecimento e impedem a ligação de espécies redox com anticorpos, dos quais a
bioatividade é mantida. Além disso, nanomateriais condutores também foram aplicados,
resultando em amplificação de sinal atual que é benéfica para a transferência de elétrons
na interface de imunossensibilidade ( Huang et al., 2015 ). Tang e Ma (2017) relataram
uma plataforma de imunoensenção redox baseada em iões metálicos para CEA com base
em um eletrodo de carbono vítreo modificado com polidopamina-Pb 2+ / quitosano-
AuNP (Chit-AuNPs / PDA-Pb 2+ / GCE) ( Fig. 2 ). Devido à alta capacidade de adsorção
do PDA condutor para Pb2+ , PDA-Pb 2+ produziu um sinal de corrente forte, e chitosan-
AuNPs foram empregados para amplificar o sinal atual e forneceu sites ativos para ligar
anti-CEA. Devido à sua alta atividade eletroquímica e boa condutividade, a sensibilidade
desta plataforma de imunossensão para CEA atingiu 9,95 μA [log 10 c CEA ] -1 ,
indicando o grande potencial de nanomateriais redox à base de íons metálicos para
imunoensaios ultra-sensíveis.

Fig. 2 . Ilustração esquemática do imunossensor isento de etiquetas ultra-


sensível com base em redox PDA-Pb 2+ ( Tang e Ma, 2017 ).
2.1.1 . Híbridos de nanomateriais condutores
Os híbridos de nanomateriais condutores exibem muitas vantagens para uso em
imunoensaios eletroquímicos, como a interface específica de área grande e boa
condutividade. Os nanomateriais orgânicos e os polímeros quimicamente modificáveis
são os ingredientes mais populares para híbridos de nanomateriais, tais como AuNP-
grafeno e AuNP modificados com quitosano ( Rong et al., 2015 ). Ao integrar diferentes
nanomateriais juntos através de métodos de geração camada a camada ou in situ ( Wang
et al., 2016b; Ou et al., 2007 ), as propriedades dos híbridos nanomateriais foram a união
de cada nanomaterial e até melhor do que cada nanomaterial.

O grafeno é um material 2D que atrai muita atenção devido às suas propriedades ópticas
e elétricas interessantes e é amplamente utilizado na análise eletroquímica ( Chen et al.,
2012; Piro e Reisberg, 2017 ). No entanto, sua fraca hidrofilicidade e fácil agregação
limitam seriamente seu desempenho em sensores eletroquímicos. Embora o óxido de
grafeno (GO) tenha enriquecido grupos carboxilo e hidroxilo e possa ser facilmente
disperso na água, a sua condutividade não está satisfeita. Algumas estratégias foram
desenvolvidas para efetivamente melhorar a condutividade ( Wang et al., 2010 ),
incluindo a preparação de GO parcialmente reduzida, síntese de GO dopada com N ( WR
Li et al., 2016 ), hibridização de GO com materiais condutores ( YT Li et al., 2016) e
modificação de GO com materiais carregados positivamente ( Miao et al., 2017; Kavosi
et al., 2014 ). Recentemente, Liu e Ma (2014) desenvolveram um líquido iónico condutor
(por exemplo, cloreto de 1-aminopropil-3-metilimidazólio) para modificar GO (IL-GO)
e aplicou-o com sucesso em um imunoensaio amperométrico ultra-sensível para CEA
( Fig. 3 ). Em seu trabalho, GO foi parcialmente reduzido pelo líquido iónico, o que
resultou em maior intensidade de condutividade, enquanto o AuNPs foi empregado para
melhorar a condutividade de IL-GO / GCE e imobilizar anti-CEA. A faixa linear de
detetive para CEA foi determinada na faixa de 100 ng mL -1 a 1 fg mL -1 com uma
sensibilidade de cerca de 4 μA [log 10 c CEA ] -1 . O trabalho de Liu e Ma fornece uma
maneira simples e eficaz de preparar grafeno condutor, modificável, ultra-fino e altamente
disperso, que já foi amplamente aplicado em análises eletroquímicas.

Fig. 3 . Ilustração esquemática da plataforma de imunossensão baseada em IL-


GO ( Liu e Ma, 2014 ).
2.1.2 . Apoiado pelo DNA, o enriquecimento de espécies redox

Recentemente, o método de amplificação de sinal assistido pelo DNA atraiu muita


atenção, devido à sua capacidade de enriquecimento teoricamente ilimitada para espécies
redox ( Guo et al., 2016; Wang et al., 2016d; Liang et al., 2014; Han et al. , 2013, H. Liu
et al., 2013 ). Geralmente, a amplificação de sinal assistida por DNA foi realizada
utilizando diferentes cadeias de oligonucleótidos que se hibridam parcialmente entre si
( Kong et al., 2013; Kou et al., 2016). A imunoprobe foi fabricada usando uma cadeia
oligodesoxinucleotídica modificada com anticorpos e as espécies redox foram facilmente
enriquecidas por incubação da imunoprobe com diferentes espécies redox - cadeias de
oligodesoxinucleótidos.

Além disso, o grupo de Zhu preparou e relatou sondas de concatâmero-CdTeQD de


aptamer-DNA para um citosensor em sanduíche, onde foram utilizadas as moléculas
condutoras de concanavalina A / MWCNTs-PDA-AuNPs para capturar especificamente
células cancerosas ( H. Liu et al., 2013 ) ( Fig. 4 ). Para a amplificação do sinal, os
CdTeQDs foram enriquecidos através da hibridização do DNA entre ADNA, ADNA e
CdTeQDs-SDNA. Um sinal poderoso de Cd 2+ foi obtido após o tratamento de ácido
forte, e a sensibilidade deste citosensor foi tão alta quanto 19,6 μA [log 10 células c ] -
1 . Além disso, esse ensaio enfatizou a importância das sondas e forneceu uma estratégia
para executar simultaneamente múltiplas medidas usando métodos fluorescentes e
amperométricos, o que é benéfico para aplicação no diagnóstico clínico, reduzindo os
requisitos para a instrumentação.

Fig. 4 . Ilustração esquemática do citosensor baseado em concatamer-CdTeQD


de aptamer-DNA ( H. Liu et al., 2013a ).

2.2 . Materiais catalíticos


Os catalisadores têm sido amplamente empregados na indústria química, petrificação,
bioquímica e proteção ambiental ( Wei et al., 2013 ; Yang et al., 2015 ). Na bioanálise
amperométrica, a aplicação de reações catalíticas pode amplificar drasticamente as
respostas e a sensibilidade atuais ( ZH Sun et al., 2015, GQ Sun et al.,
2015 ). Catalisadores como glucose oxidase (GOD) ( P. Li et al., 2015 ), peroxidase de
rabanete (HRP) ( Feng et al., 2014a, Han et al., 2013 ), nanopartícula de Fe 3 O 4 ( Lai et
al. , 2015), Nanocubes de Prussian Blue (PB) e PtNPs são amplamente aplicados. Reações
catalíticas de Redox que são comumente realizadas em imunoensaio amperimétrico,
como a decomposição de H 2 O 2 e a oxidação de glicose ( P. Li et al., 2015; FY Li et al.,
2017; Yang et al., 2013; Miao et al., 2017 ).

2.2.1 . Enzimas múltiplas


A amplificação do sinal de corrente baseada em catalisador é realizada simultaneamente
desencadeando a oxidação eletroquímica de espécies redox e reações catalíticas na
interface de detecção. Em princípio, a reação de acoplamento da reação catalítica e
oxidação eletroquímica é uma explicação possível para o fato de o sinal do imunoensaio
amperométrico ter sido amplificado pela reação catalítica. Devido à elevada taxa de
reacção das reacções catalíticas, conseguiram-se alguns grandes avanços no aumento do
sinal do imunoensaio electroquímico ( Feng et al., 2014a; Miao et al.,
2017). Convencionalmente, a eficiência aprimorada das reações catalíticas para o sinal de
corrente é significativamente afetada pela condutividade da interface de detecção e do
substrato e as concentrações e desempenhos do catalisador. Particularmente, o
desempenho catalítico influenciou fortemente a sensibilidade ao imunoensaio.

Por exemplo, uma estratégia de amplificação de sinal triplo para um imunoensaio


amperimétrico foi construída utilizando espécies de retox PtNPs-rGO / HRP-GOD /
anticorpos-pTEs-PTRNs condutores e catalíticas como sondas, comportando-se como
três reações químicas catalíticas circulares ( Fig. 5 ). Grande área de superfície específica
e boa condutividade de PtNPs-rGO foram benéficas para o enriquecimento de enzimas e
anticorpos - espécies redox, além de promover a transferência de elétrons, resultando em
uma resposta de corrente forte ( Jia et al., 2014). Além disso, a oxidação catalítica da
glicose, a redução catalítica do hidroperóxido e a oxidação catalítica das espécies redox
foram aceleradas por DED, HRP-PtNPs e um campo elétrico externo. Em comparação
com os imunoensaios usando anticorpos de espécies de PtNPs-redox e anticorpos
marcados com espécies redox como imunoprobes, o imunoensaio com base em anticorpos
de espécies redox RGO-PtNPs-redox apresentou uma resposta de corrente mais forte e
maior sensibilidade (3,5 μA [log 10 c CEA ] -1 ), indicando o grande potencial de
híbridos nanomateriais catalíticos e estratégias de amplificação do círculo catalítico.
Fig. 5 . Ilustração esquemática de estratégias de amplificação de sinal triplo para
o imunoensaio amperimétrico com base em PtNPs-rGO / HRP-GOD ( Jia et al.,
2014 ).

2.2.2 . Nanomateriais híbridos semelhantes a enzimas


Os catalisadores semelhantes a enzimas de alto desempenho catalítico possuem inúmeras
vantagens, incluindo aquisição fácil, boa condutividade, estabilidade e desempenho
catalítico ( YY Li et al., 2017 ; Tang et al., 2015 ). Embora os catalisadores semelhantes
a enzimas, como o grafeno, os pontos quânticos de carbono, os nanoclusters e a
polianilina, tenham sido amplamente aplicados em imunoensaios eletroquímicos, seus
desempenhos catalíticos não são tão bons quanto as enzimas ( Lai et al., 2015 ), sugerindo
que o desenvolvimento de É importante o uso de catalisadores eficientes de enzimas
eficientes. Os híbridos nanomateriais catalíticos são geralmente sintetizados por
montagem síncrona de materiais catalíticos / condutores e são uma das rotas mais efetivas
para obter catalisadores semelhantes a enzimas de alto desempenho catalítico (Zheng et
al., 2014 ). O grupo de Wei publicou muitos trabalhos engenhosos sobre híbridos de
catalisadores de enzimas semelhantes de alto desempenho catalítico que são baseados em
óxidos de grafeno funcionais, nanopartículas de Fe 3 O 4 , íons de metais de transição,
óxido de metal de transição, nanomateriais de metais ( XP Wang et al., 2015 Gao et al.,
2015 ), etc. Comparados com N-GNRs, Ni / N-GNRs e Pb / N-GNRs, o desempenho
catalítico de nanopartículas de liga de PdNi / nanoribíbulos de grafeno dobrados com N
(PdNiNPs / N-GNRs) Para o hidroperóxido revelou-se o melhor ( N. Li et al., 2015 )
( Fig. 6 ), onde a sensibilidade do imunoensaio atingiu 9 μA c CEA -1 . A propriedade
catalítica de PdNi / N-GNRs resultou principalmente de PdNiNP, indicando a alta
propriedade catalítica da liga de metais nobres.
Fig. 6 . Ilustração esquemática do imunoensaio amperimétrico usando PdNiNPs
/ N-GNRs semelhantes a emqima ( N. Li et al., 2015 ).

2.3 . Novelos redox redox


Em imunoensaios amperométricos, a atividade eletroquímica e a quantidade de espécies
redox são fatores importantes que podem afetar significativamente a força do sinal
atual. Para a preparação de imunossurantes com fortes respostas atuais, o
desenvolvimento de novos materiais redox ativos altamente eletroquímicos simples foi
simples ( HQ Wang et al., 2016a ; Wang e Ma, 2017 ; Rong et al., 2016 ; Hayat et al.,
2014 ). Para receber sinais poderosos, esses materiais redox geralmente possuem algumas
propriedades vantajosas em termos de quantidade de sites redox, grande área específica,
baixa toxicidade biológica, boa hidrofilicidade, condutividade, baixo custo e facilidade
de aquisição.

2.3.1 . Os nanomateriais à base de íons metálicos como espécies redox


Os nanomateriais inorgânicos Redox podem produzir sinais de corrente fortes devido à
existência de um grande número de íons metálicos redox ( Tang e Ma, 2017, WX Li et
al., 2017 ). Os nanocristais inorgânicos Redox, como os materiais tipo PB, são um dos
nanomateriais redox aplicados mais cedo em imunoensaios
eletroquímicos. Recentemente, algumas estratégias eficazes para sintetizar compósitos
ativos altamente eletroquímicos foram desenvolvidas usando nanomateriais carboxilados
e à base de amina, especialmente polímeros, para enriquecer iões metálicos redox ( Yang
et al., 2017 ). Devido ao grande número de grupos funcionais, tais como grupos carboxilo,
amino e hidroxilo, esses materiais possuem alta capacidade de adsorção para muitos íons
metálicos redox e os sinais atuais desses nanomateriais redox provaram ser muito
fortes.ZF Wang et al. (2015) preparou eficientemente um imunoensaio em sanduíche para
a detecção simultânea de três marcadores de câncer através da síntese de nanobeads redox
de cádmio, chumbo e alginato de cobre ( Fig. 7 ). As nanopartículas redox baseadas em
alginato uniformes foram inicialmente e simplesmente preparadas pela adição de íons
metálicos redox na mistura de alginato, tritão X-100 e álcool 1-hexílico. O alginato com
grupos carboxilo e hidroxilo pode adsorver quantidades de Cd 2+ , Cu 2+ e Pb 2+ , o que
resultou em fortes sinais de corrente e altas sensibilidades de 3,73 μA [log 10 c CEA ] -
1 , 5,54 μA [log 10 c AFP ] -1 e 4,59 μA [log 10 c PSA ] -1 , respectivamente
Fig. 7 . Ilustração esquemática do imunoensaio amperométrico com base em
nanobeads redox de cádmio, chumbo e alginato de cobre ( ZF Wang et al., 2015 ).

2.3.2 . Polímero Redox dopado com nanomateriais condutores


Nos últimos anos, os nanomateriais de polímeros redox tornaram-se muito populares
devido à sua alta atividade eletroquímica e respostas atuais que podem atingir várias
centenas de amperes ( LY Wang et al., 2016; ZM Liu et al., 2015; Shan et al.,
2016 ) . Geralmente, estes nanomateriais de polímeros redox são sintetizados pela
polimerização de derivados de anilina, derivados de fenol e corantes redox com a
coexistência de nanomateriais condutores ( HQ Wang et al., 2016; LY Wang et al.,
2015 ; Shan et al. , 2017 ; Tang et al., 2017b ). Devido à sua grande estrutura de pilha π-
π, estes nanomateriais de polímero eram condutores. Shan et al., 2016relataram a
preparação de nanocompostos redox AuNPs-poli (azul de metileno) (AuNPs-PMB), que
poderiam fornecer um sinal de corrente forte devido à sua grande área específica, a
polimerização de MB redox e a coexistência de AuNPs. Além disso, LY Wang et
al. (2015c) e LY Wang et al., (2014) prepararam inúmeros trabalhos fundamentais e
inovadores na síntese de nanomateriais redox catalíticos condutores baseados na
polimerização de derivados da anilina. Ao ajustar o pH de soluções de derivados de
anilina, poli partícula semelhante (derivados de anilina) nanocompósitos pode ser obtida
após a adição de uma solução de cloridrato de metal nobre, tal como HAuCl 4 ,
H 2 PtCl 6 , e H 2 PdCl 4. Além disso, os sinais de corrente de poli (derivados de anilina)
nanohybrids pode ser dramaticamente amplificado quando se considera a sua actividade
catalítica para a H 2 O 2 ( Fig. 8 ). Em seus estudos, a sensibilidade do imunossensor
desenvolvido atingiu 8,35 μA [log 10 c CEA ] -1 , 9,98 μA [log 10 c CA199 ] -1 ,
12,3 μA [log 10 c CA724 ] -1 e 6,65 μA [log 10 c AFP ] -1 , que são superiores aos
outros imunoensaios semelhantes, sugerindo o grande potencial de nanohybrids redox e
catalíticos em imunoensaios amperométricos. Além disso, a regulação dos potenciais
redox desses nanomateriais de poli (derivados de anilina) foi realizada em primeiro lugar
usando diferentes derivados de anilina, o que foi um descoberta inovadora e inovadora
para a detecção simultânea de marcadores tumorais múltiplos ( Ma e Liu, 2015 ; HQ
Wang et al ., 2016 ).
Fig. 8 . Ilustração esquemática do imunossensor com base em quatro nanohíbridos
ativos de poli (derivados de anilina) catalíticos e altamente eletroquímicos ( LY
Wang et al., 2014 ).

2.4 . Materiais porosos tridimensionais


A interface de imunossensibilidade pode influenciar significativamente a sensibilidade de
um imunoensaio amperimétrico, em que uma área específica grande é geralmente
benéfica para sua condutividade e capacidade de carga de anticorpos, enzimas e espécies
redox. Neste caso, os imunossensores amperométricos com uma grande área de detecção
específica geralmente exibem alta sensibilidade, baixo limite de detecção e ampla faixa
linear ( Sun et al., 2013). Embora os nanomateriais tenham mostrado grande vantagem ao
aumentar a área de interface de detecção devido à sua grande área específica, uma
diminuição na área superficial geralmente ocorre devido à coagulação de nanomateriais
que são densamente revestidos no substrato imunossensor. Em comparação com as
nanopartículas, os materiais 3D porosos possuem uma área de superfície específica maior
e podem prevenir diminuições na área de imunoensagem, até certo ponto.

2.4.1 . Nanomateriais porosos


Os materiais porosos baseados em GO, MCNT, carbono espumoso, favo de carbono,
nanocagações metálicas, zeólitos e estrutura metalogênica (MOF) foram aplicados com
sucesso em imunoensaios eletroquímicos ( WW Huang et al., 2016a, ZF Wang et al., 2014
L. Liu et al., 2015; Sun et al., 2015 ). Os materiais 3D porosos também podem adsorver
mais espécies redox e imobilizar mais anticorpos, resultando em sinais de corrente forte
e alta sensibilidade de imunoensaios amperométricos baseados em materiais 3D ( Liu et
al., 2014). Além disso, os híbridos 3D multifuncionais são promissores em imunoensaios
amperométricos ultra-sensíveis, devido às suas vantagens de grande área específica, boa
condutividade, biocompatibilidade, propriedade catalítica, modificabilidade e até mesmo
boa atividade eletroquímica. Liu et al. desenvolveu inicialmente estratégias de
amplificação de sinal catalítico duais para um imunoensaio tipo sanduíche em que foram
empregadas PtNPs porosas (pPtNPs) e nanocagações PtPb (PtPbNCs) como substrato e
sondas catalíticas, respectivamente ( N. Liu et al., 2015 ) ( Fig. 9 ). PtPbNCs e pPtNPs
possuem grande área específica e alta atividade eletrocatalítica em direção à redução de
H 2 O 2 . As sensibilidades PtPbNCs e pPtNPs (19,9 μA [log 10 c CEA ] -1 e 19,9 μA
[log 10 c AFP ] -1 , respectivamente) também foram encontradas várias dobras maiores
do que os imunoensaios anteriores.

Fig. 9 . Ilustração esquemática do imunossensor sanduíche usando PtNPs


porosas (pPtNPs) e nanocagações PtPb (PtPbNCs) como substrato e sondas
catalíticas ( N. Liu et al., 2015 ).

O método camada por camada é um dos métodos mais eficazes para sintetizar híbridos
multifuncionais de nanomateriais 3D ( Ge et al., 2013; Yan et al., 2016; Li et al.,
2013 ). Em comparação com o sistema de HRP / hidroperóxido, híbridos de policristalino
Ag-PdNCs-submicrométrica Fe 3 O 4 esferas (Fe 3 O 4 @ Ag-Pd) mostram actividade
electrocatalítica mais robusta ( Zheng et al., 2014 ) ( Fig. 10 ), que é principalmente
atribuível à grande área superficial de híbridos Fe 3 O 4 @ Ag-Pd, boa condutividade de
Ag-PdNCs e interação catalítica cooperativa entre Fe 3 O 4e Ag-PdNCs. Além disso, o
citosensor usando Fe 3 O 4 @ Ag-Pd modificado com aptamer como sondas exibiu uma
ampla faixa de detecção de 50 a 1 × 10 7 células mL -1 . Estes resultados indicam que
uma estrutura porosa e condutora é essencial para o desempenho catalítico de um
catalisador.

Fig. 10 . Ilustração esquemática do citosensor sensível para células cancerosas


usando híbridos catalíticos altamente eficazes de Fe 3 O 4 @ Ag-Pd ( Zheng et
al., 2014 ).

2.4.2 . MOFs ativos eletroquímicos


O MOF é um material poroso 3D popular, devido às suas vantagens de porosidade ultra
alta, estabilidade térmica e química, fabricação fácil e estrutura controlável ( Li et al.,
2017b, Deng et al., 2017; Ma et al., 2016 ). Uma vez que o MOF é construído juntando
unidades contendo metal com conectores orgânicos, a alta capacidade de adsorção de
redox MOF para íons metálicos redox pode resultar em uma resposta de corrente
poderosa. Alguns MOF redox, especialmente os catalíticos, foram aplicados com sucesso
em imunoensaios amperométricos ( Cui et al., 2015; Shen et al., 2015; Ling et al., 2016),
mas é bem sabido que a maioria dos materiais MOF são pouco condutores devido à sua
fraca solubilidade em água e estrutura de vara que limita a transferência de elétrons. Wen
et al. nanopartículas redox de Cu-MOF sintetizadas em um biossensor ratiométrico para
lipopolissacarídeos (LPS) ( Shen et al., 2015 ) ( Fig. 11 ). Para amplificar o sinal, os ciclos
quadráticos ativados por DNA e desencadeados por alvo foram realizados e resultaram
na clivagem de ferroceno e enriquecimento de Cu-MOFs na interface de detecção. Além
disso, Cu-MOFs foram empregados como um catalisador para acelerar a oxidação da
glicose, resultando em amplificação de sinal adicional. Verificou-se que este biossensor
era altamente sensível (0,14 [log 10 c LSP ] -1) e preciso e fornece um método para a
construção de sensores redox MOF com sinal de corrente forte.

Fig. 11 . Ilustração esquemática do biossensor com base em Cu-MOFs como


espécies redox ( Shen et al., 2015 ).

2.4.3 . Hidrogéis condutores / redox


O hidrogel, como um importante material poroso em 3D, mostrou grande potencial na
administração de medicamentos, engenharia de tecidos, dispositivos eletrônicos,
construções, análises e proteção ambiental ( Tang et al., 2017b; JF Xing et al., 2015;
Hasanzadeh et al. 2014; Ouimet et al., 2015 ). Geralmente, os hidrogéis podem ser
facilmente sintetizados através de métodos químicos ou físicos através de ligações
químicas, interação eletrostática, ligação de hidrogênio, conjugação π-π e força van der
Waals ( Zhai et al., 2013). Devido à existência de grupos hidroxilo, carboxilo, amino e
amida abundantes, os hidrogéis possuem boa biocompatibilidade que é benéfica para a
manutenção da bioatividade dos anticorpos. A estrutura 3D de hidrogéis também é
vantajosa para o enriquecimento de espécies redox e anticorpos e transferência de elétrons
na interface de detecção, o que promove amplificação de sinal e sensibilidade melhorada
( Zhao et al., 2017; FY Li et al., 2017 ). Assim, os imunoensaios à base de hidrogel são
promissores em análises ultra-sensíveis ( Zhai et al., 2013; Zhao et al., 2017 ). A Rong e
os colaboradores desenvolveram pela primeira vez uma plataforma de imunoesensura
amperométrica baseada em hidrogel para CEA ( Rong et al., 2015 ) ( Fig. 12), onde o
hidrogel de polipirrole foi simplesmente sintetizado pela polimerização oxidativa de
pirrole na GCE. A plataforma de detecção baseada em hidrogênio condutor exibiu um
forte sinal de corrente, principalmente resultante do esqueleto conjugado π-π longo e do
polipirrole condutivo contínuo 3D. Devido à sua grande área específica,
biocompatibilidade aceitável, excelente capacidade de adsorção e boa condutividade, a
sensibilidade do imunossensor atingiu 8,93 μA [log 10 c AFP ] -1 , indicando que o
hidrogel condutor é promissor na detecção ultra-sensível de marcadores tumorais.

Fig. 12 . Ilustração esquemática do imunossensor livre de etiquetas para CEA


com base em hidrogel de polipirrole como substrato ( Rong et al., 2015 ).

Os híbridos de hidrogel condutores fornecem métodos eficazes para sintetizar hidrogéis


novos e versáteis alternativos para análise eletroquímica ( Wang et al., 2017 ). Ao ajustar
a proporção de cada ingrediente e procedimentos de fabricação, os híbridos de hidrogel
podem ser facilmente sintetizados para possuir boa condutividade, repetibilidade e
atividade eletroquímica. Tang e colegas de trabalho propuseram uma maneira simples e
eficaz de preparar um hidrogel multifuncional e enfatizou o grande potencial da análise
eletroquímica baseada em híbridos de hidrogel redox ( Tang et al., 2017b ) ( Fig. 13 ). No
seu trabalho, alginato de sódio redox e condutor-Pb 2 + -óxido de grafeno (SA-Pb 2+-
GO) foi simplesmente fabricado por interação eletrostática e efeito de coordenação,
enquanto GO foi empregado para ampliar a área de superfície e melhorar a
condutividade. O quitosano foi utilizado para adsorver Pb 2+ para amplificação de sinal
adicional e proporcionou locais ativos para imobilizar o anti-CA242. Verificou-se que o
sinal atual diminuía drasticamente quando duas unidades separadas anti-CA242 estavam
ligadas pela CA242, resultando em aumento significativo de sensibilidade (32,98 μA
[log 10 c CA242 ] -1 ).
Fig. 13 . Ilustração esquemática do imunossensor com base no hidrogel redox
SA-Pb 2+ -GO como substrato ( Tang et al., 2017b ).

2.5 . Novos receptores e agentes de bloqueio


Em imunoensaios amperométricos tradicionais, a resistência da interface de
imunossensibilidade geralmente aumenta após o tratamento com anticorpos e BSA (como
agentes bloqueadores) ( Yin et al., 2014; Feng et al., 2014b ), uma vez que anticorpos e
BSA impedem a transferência de elétrons. A resistência aumentada limita seriamente a
sensibilidade, sugerindo que a sensibilidade dos imunoensaios amperométricos ainda tem
mais espaço para melhorar. Por conseguinte, os métodos baseados na elevação da
estrutura dos imunoensaios amperométricos são significativos.

2.5.1 . Novos receptores para substituir anticorpos


Ao empregar novos receptores como péptidos ( Qi et al., 2014; Y. Wang et al., 2015; Xie
et al., 2015 ) e oligonucleótidos ( Hu et al., 2014; Arya et al., 2014; Meng et al. ., 2016 )
para substituir os anticorpos, foram desenvolvidas algumas estratégias eficazes para a
detecção sensível de marcadores tumorais. Estes biossensores para marcadores tumorais
geralmente são fabricados usando receptores marcados com espécies redox e apresentam
muitas vantagens, incluindo técnicas de síntese maduras, alta sensibilidade, baixo custo,
boa estabilidade e especificidade. Comparados aos anticorpos / GCE, os sinais atuais
desses biossensores são mais fortes para esses novos receptores, uma vez que possuem
pequenos volumes que são benéficos para amplificação de sensibilidade ( Xia et al.,
2017a). De acordo com os princípios de detecção entre marcadores tumorais e receptores,
esses biossensores podem ser classificados em duas categorias: um é baseado na função
de afinidade e o segundo é baseado em reações de clivagem ( Feng et al., 2014 ; Xia et
al., 2017a ) .

Embora o biossensor baseado em péptidos com base em reações de clivagem seja


atraente, sua sensibilidade é limitada devido a que um pouco de moléculas redox podem
ser consertadas em péptidos ( Qi et al., 2014 ). Para melhorar a sensibilidade, Tang et
al. (2016) relataram que uma plataforma de detecção eficaz de PDA-Au-HRP / peptide /
Au-rGO / Au-PMB / GCE foi desenvolvida ( Fig. 14 ). Um sinal de corrente forte da Au-
PMB / GCE foi aprimorado por revestimento com Au-RGO e PDA-Au-HRP. Após o
tratamento com PSA, a resistência aumentou e depois promovida por PDA-Au-HRP
acelerando a reação de precipitação catalítica da enzima entre 4-cloro-1-naftol e H 2 O 2,
comportando-se como uma diminuição significativa do sinal atual. Neste caso, obteve-se
um grande ΔI e a sensibilidade atingiu 17,0 μA [log 10 c PSA ] -1 . Em comparação com
a amplificação do sinal, este método foi mais simples, mais eficaz e mais adequado para
sintonizar este tipo de biossensor, por estes efeitos de sinergia na amplificação do efeito
do PSA na condutividade e no sinal de corrente. No trabalho de He e colaboradores
(2015), foi apresentado um método de amplificação de sinal
utilizando nanocompósitos Au @ SiO 2 catalíticos para enriquecer as espécies redox,
onde Au @ SiO 2 foi utilizado para acelerar a deposição de prata ( Fig. 15). O tratamento
de reforço de prata realizou simultaneamente o enriquecimento de Ag e melhorou a
condutividade da plataforma de imunossensão, resultando em uma alta sensibilidade de
15,3 μA [log 10 c PSA ] -1.

Fig. 14 . Ilustração esquemática da amplificação de sensibilidade tripla para o


biossensor para PSA com base no substrato redox de Au-PMB e PDA-Au-HRP
( Tang et al., 2016 ).

Fig. 15 . Ilustração esquemática do biossensor à base de péptido para PSA com o


enriquecimento da prata ( He et al., 2015 ).

2.5.2 . Agentes de bloqueio novos / funcionalizados


Para amplificar ainda mais a condutividade de biossensores para marcadores tumorais,
estudos recentes substituíram BSA por agentes bloqueadores, como glutationa oxidada
(GSSG) e tiol ( Lin et al., 2015; He et al., 2015; Y. Xing et al. 2015, Zhao e Ma,
2017 ). Em comparação com a BSA, os agentes de bloqueio de pequenas moléculas
possuem pequenos volumes e boa hidrofilicidade, e a resistência da plataforma de
detecção aumenta ligeiramente após o tratamento com esses agentes. Li et al. relataram
uma plataforma de imunossensibilidade sensível composta de anti-IgG / AuNPs / grafeno
/ GCE com GSSG como agente de bloqueio ( Lin et al., 2015 ) ( Fig. 16). Em comparação
com BSA / anti-IgG / AuNPs / grafeno / GCE, o imunossensor bloqueado pelo GSSG
apresentou maior sensibilidade, um intervalo de detecção mais amplo e sua especificidade
e repetibilidade foram aceitáveis. Pela primeira vez, uma nova estratégia implementando
BSA como um intensificador de sensibilidade foi apresentada e reverteu com sucesso o
conceito tradicional sobre o efeito da BSA sobre a condutividade e a sensibilidade dos
biossensores eletroquímicos ( Tang et al., 2017a ) ( Fig. 17 ). Este trabalho fornece um
método simples, universal e altamente eficaz para sintetizar um substrato poroso,
condutor e redox de quitosano-Pb 2 [Fe (CN) 6 -PDDA-GO / GCE, onde Pb 2 [Fe
(CN) 6] serve como a espécie redox condutora. Os resultados mostram que o sinal atual
diminuiu seriamente, devido à BSA dificultando a transferência de elétrons e, em seguida,
aumentou drasticamente quando o biossensor foi tratado com PSA, resultando em um
grande ΔI e alta sensibilidade de 21,6 μA [log 10 c PSA ] -1 .

Fig. 16 . Ilustração esquemática do imunossensor amperométrico usando GSSG


como agentes bloqueadores ( Lin et al., 2015 ).
Fig. 17 . Ilustração esquemática de BSA como intensificador de sensibilidade
para o biossensor com um substrato poroso redox de quitosano-Pb 2 [Fe
(CN) 6 ] -PDDA-GO ( Tang et al., 2017a ).

3 . Conclusões e perspectivas futuras


Múltiplas estratégias funcionais são de grande potencial para aumentar significativamente
a sensibilidade dos biossensores amperométricos para marcadores tumorais. Para o
desenvolvimento de imunoensaios ultra-sensíveis, essas estratégias se concentram em
dotar o sistema imunossensível de muitas propriedades, como a condutividade, grande
área específica, atividade eletroquímica, desempenhos catalíticos, entre outros.

A amplificação de sensibilidade continua a ser o objetivo final em estudos relacionados,


apesar de as estratégias multifuncionais oferecerem aprimoramento do sinal e / ou
melhora da condutividade. Para imunoensaios amperométricos, as estratégias
multifuncionais devem permitir o ajuste da área de detecção, a condutividade das
interfaces de detecção e até mesmo a atividade eletroquímica das espécies redox, o que
pode afetar significativamente a sensibilidade. Neste trabalho, descrevemos estudos
relacionados em híbridos de nanomateriais, enzimas, materiais catalíticos, materiais
redox, MOFs e hidrogéis que são promissores. Além disso, os procedimentos de
fabricação desses materiais devem ser simples e suas propriedades físicas, como
estabilidade, condutividade, atividade eletroquímica e desempenho catalítico, devem ser
elevadas. Além do que, além do mais,

As estratégias de múltiplas funções também devem se concentrar em elevar toda a


estrutura da plataforma de detecção, incluindo a área de superfície de condutividade e
detecção de substratos e sondas e o valor de quantidade e proporção de anticorpos e
agentes bloqueadores. Novos receptores e agentes bloqueadores podem efetivamente
melhorar a sensibilidade e reduzir o custo do diagnóstico clínico. A chave para a
investigação futura neste aspecto é a tela investigar receptores mais confiáveis e agentes
de bloqueio para aplicação em imunoensaios.