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Establecimiento de meristemos

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Departamento de Ciencias de la Vida y de la Agricultura, Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las
Fuerzas Armadas – ESPE, Sangolquí, Ecuador
Fecha de entrega: Agosto 02 del 2017

RESUMEN
La presente práctica, realizada en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales, estuvo enfocada en el
cultivo in vitro de meristemos apicales obtenidos a partir de bulbos o cormos de Tulipán, Fresia y Gradiolo,
esta técnica es empleada comúnmente para obtener plantas libres de infecciones virales, siendo también el
mejor material para conservación de germoplasma. Los factores clave para el éxito de la práctica son:
obtención del explante con meristemos apicales libres de contaminación, la presencia de hormonas en el
medio de cultivo necesarias para formación de brotes a partir de meristemos apicales, y completa asepsia
durante el tratamiento y siembra proporcionando el menor daño a la muestra. En base a las normas de
bioseguridad del laboratorio y siguiendo el protocolo de desinfección y manejo de muestras vegetales, el
tratamiento de desinfección de bulbos y cornos requirió de lavados en soluciones de detergente al 2% y de
NaCl al 2.5%. Ya en cámara se obtuvieron los meristemos y se sembraron en medio MS enriquecido con
2mg/L de KIN, 0.5 mg/L de AIA, 30 g/L de azúcar y 7.5 g/L de agar, a un pH de 5.8 Tas 7 días de incubación
a una temperatura de 22.7°C, humedad relativa de 49.8±2, los resultados presentaron que en un 28,57%
existía contaminación, dichos explantes fueron descartados. Después de 14 días de incubación de las
muestras restantes se obtuvo que el 57.14%de explantes presentó oxidación, tomando una coloración rojiza,
también se observó que el 42.86% mostraba contaminación, del cual el 28.57% fue por hongos y un 14.9%
por bacterias. El origen de contaminación en su totalidad (100%) parecía provenir del explante.

Palabras claves: cultivo in vitro, bulbo, cormo, explante, meristemos.

ABSTRACT
The present practice, carried out in the Plant Tissue Cultivation Laboratory, focused on the in vitro
cultivation of apical meristems obtained from bulbs or corms of tulip, fresia and gradiolo, this technique is
commonly used to obtain plants free of viral infections, being also the best material for conservation of
germplasm. The key factors for the success of the practice are: obtaining the explant with contamination-
free apical meristems, the presence of hormones in the culture medium necessary for formation of shoots
from apical meristems, and complete asepsis during treatment and planting the least damage to the sample.
Based on laboratory biosafety standards and following the disinfection protocol and handling of plant
samples, the treatment of disinfection of bulbs and horns required washing in 2% detergent solutions and
2.5% NaCl solutions. Already in the chamber the meristems were obtained and seeded in MS medium
enriched with 2 mg / L KIN, 0.5 mg / L AIA, 30 g / L sugar and 7.5 g / L agar, at a pH of 5.8 After 7 days
Of incubation at a temperature of 22.7 ° C, relative humidity of 49.8 ± 2, the results showed that in 28.57%
there was contamination, these explants were discarded. After 14 days of incubation of the remaining

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samples, 57.14% of the explants presented oxidation, taking a reddish coloration. It was also observed that
42.86% showed contamination, of which 28.57% was by fungi and 14.9% by bacteria. The source of
contamination in its entirety (100%) appeared to come from the explant.
Keys Words: In vitro culture, bulb, corm, explant, meristems.

I. Introducción de esta familia como plantas ornamentales son el


Iris, Gladiolus Fresia y Crocus. (Gutierrez, 2016)
El cultivo de meristemos es una técnica que
consiste en aislar asépticamente la región Para el cultivo de meristemos se empleó un medio
meristemática con uno o tres primordios foliares MS enriquecido con citocininas como la kinetina
jóvenes e implantarlos en un medio de cultivo (KIN) y auxinas como el ácido indolacético (AIA).
estéril, con el objetivo de inducir la diferenciación La Kinetina es una citocinina sintética que
de celular. (Sierra Posada, 2005) promueve la división celular, en cambio, el ácido
indolacético de origen vegetal que actúa a nivel de
Esta técnica se usa en el cultivo in vitro para la
los ápices, en los que hay tejido meristemático, el
propagación de plantas libres de patógenos, lo cual
cual es indiferenciado, Promueve el crecimiento y
es de gran utilidad para obtener altos rendimientos
diferenciación celular. (Rivero, G.; Ramírez, M. &
en cultivos de propagación vegetativa. (Villalba ,
León, S., 2001).
2012)
El objetivo de esta práctica fue la inducción a la
El reconocimiento de la zona meristemática varía
formación de una planta a partir de explantes de
entre especies, por tanto, se requiere de estudios
meristemos de plantas.
preliminares que revelen su ubicación y
manipulación adecuada, con el objetivo de facilitar
su extracción. (Lopez, 2002) Por lo que trabajar
II. Métodos
con bulbos o cormos debido a la ausencia de tejido
vascular en la proximidad del meristemo apical y Recolección de muestras
que las conexiones plasmodermáticas en las
células de este tejido son muy pequeñas, por tanto, Para el cultivo in vitro del meristemo apical se
los microorganismos se desplazan muy lentamente seleccionaron plantas que se reproduzcan a partir
hacia esta zona. Esta característica morfológica, de bulbos o cornos. Se seleccionaron plantas de la
unida a la activa multiplicación celular que allí familia Liliaceae (Tulipanes) e Iridaceae (Freesia
ocurre, puede explicar la baja concentración o la y Gladiolo) que cuentan con las características
ausencia de patógenos en este tejido. (García & necesarias para este cultivo.
Noa , 1998) Preparación de la sala de siembra
Las siguientes familias: Liliaceae (Tulipanes) e Se barrió y se desinfectó el piso con Kalipto. Las
Iridaceae (Freesia y Gladiolo); fueron con las que cámaras de siembra fueron limpiadas con alcohol
se trabajaron en la presente práctica. al 90% y se ingresaron mecheros de alcohol,
La familia Liliaceae son plantas herbáceas, con juego de pinzas y bisturí, papel toalla estéril,
frecuencia perennes, con órganos subterráneos de plásticos adherentes, ligas, botellas de agua estéril
reserva como bulbos, rizomas o raíces y vasos de precipitación vacíos, previamente
tuberosas. (Aizpuru & etal, 2004) La familia de las roseados con sablón. Para la esterilización de los
Iridaceae, se trata de plantas herbáceas provistas materiales se prendió las lámparas UV de las
de bulbos, tubérculos o rizomas, con hojas alternas cabinas de flujo durante 20 minutos, luego se
y sin estípulas. Las especies que destacan dentro procedió a apagar el UV y encender el flujo de aire

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Desinfección
En la sala de preparación de medio y material
vegetativo, se lavaron a los explantes con agua
corriente para retirar toda la tierra e impurezas.
Luego, los explantes fueron sumergidos en
500mL de una solución al 2% de detergente en
agitación durante 15 minutos. Después se procedió
a lavar los explantes, dos veces con agua destilada
y una con agua estéril. Finalmente se eliminó el
agua y se sumergió a los explantes en una solución
de hipoclorito de sodio al 2.5% más 3 gotas de
Tween-20 durante 15 minutos en agitación (Peña,
2017).

Siembra del material


Se realizaron los lavados de los explantes que se
encontraban en solución de hipoclorito de sodio
con agua estéril dentro de la cámara de flujo
laminar. Con las pinzas y el bisturí previamente
sumergidos en alcohol y flameados, se procedió a
quitar las capas de tejidos o primordios foliares
hasta llegar al meristemo. Luego se sembraron en
frascos que contenían medio de cultivo MS Ilustración 1. Primera semana tras la siembra de meristemos
enriquecido con 2mg/L de KIN, 0.5 mg/L de AIA, de distintas muestras vegetales. 1a: fresia,1b: gladiolo, 1c:
gladiolo, 1d: fresia, 1e: gladiolo, 1f: tulipán, 1g: tulipán.
30 g/L de azúcar y 7.5 g/L de agar, a un pH de 5.8.
Antes de ser sellados con papel plástico de cocina Tabla 1. Resultados globales tras la primera semana desde la
y liga, se flameó la boca del frasco (Peña, 2017). siembra de explantes provenientes de meristemos de distintas
muestras vegetales. (I: Ilustración, C: contaminación, O:
oxidación)

Alto
Incubación I
(cm)
Forma Color C O

Los frascos cultivados se los trasladó al área de Verde, base:


1a 3.2 Alargada - -
blanca.
incubación y crecimiento, y se incubaron a las
siguientes condiciones: a temperatura de 22.7°C, 1b 1.5 Rectangular Amarillo + -

humedad relativa de 49.8±2, y se mantuvo los dos Blanco, base:


1c 1.6 Rectangular - +
primeros días en oscuridad y los siguientes días café

bajo un fotoperiodo de 12 horas diarias por 2 1d 3 Alargada Verde + -


Alargada y
semanas. termina en Verde, base:
1e 3 - +
forma de blanca.
caracol.

III. Resultados Meristemo Verde, base:


1f 2.7 ancho, base blanca con - +
redonda. rojo.

4 formaciones Blanco, base:


1g 2 - +
redondas roja.

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En base a la observación pudo determinarse que Tabla 2. Resultados globales tras catorce días desde la
siembra de explantes provenientes de meristemos de distintas
cinco de los siete explantes sembrados presentaron muestras vegetales. (I: Ilustración, C: contaminación, O:
crecimiento, correspondientes a: dos muestras de oxidación)
fresia, una de gladiolo y dos de tulipán [Ilustración
I Alto (cm) Forma Color C O
1a, 1d, 1e, 1f y 1g]. Sin embargo, en tres de los 2a 5.3 Alargada Verde + -
cinco explantes que presentaron crecimiento se 6 formaciones Verde,
2b 2 - +
observó la presencia de oxidación, por lo que redondas base: roja
Meristemo con Verde,
presentaron coloración rojiza en la base de los 2c 4 - +
una hoja ancha base: roja
mismos y el medio tenía un oscurecimiento leve 2d 6.4 Alargada Verde - -
2e 1.5 Rectangular Café - +
[Ilustración 1e, 1f y 1g]. Uno de los cinco
explantes con desarrollo presentó contaminación
Se preservaron cinco explantes, ya que dos de los
por hongo de coloración blanca y aspecto
explantes iniciales fueron desechados por la
esponjoso proveniente del explante [Ilustración
presencia de contaminación, [Ilustración 1b y 1e],
1d-fresia]. Los meristemos de gladiolo [Ilustración
en el caso del explante de gladiolo que poseía
1b y 1c] no se desarrollaron, el primero de ellos,
oxidación [Ilustración 1e], al noveno día, presentó
[Ilustración 1b], presentó contaminación por
crecimiento abundante de contaminación por
bacteria, adoptando una coloración café
hongo (no mostrado), por lo que fue desechado.
amarillenta tanto el explante como el medio y la
Cuatro de los cinco explantes restantes
bacteria fue de aspecto cremoso, mientras el otro,
continuaron con su crecimiento tras catorce días
[Ilustración 1c], presentó oxidación de coloración
desde su siembra, estos corresponden a los
café en su base y la zona media del explante. Los
explantes de fresia y tulipán [Ilustración 2a, 2b,
meristemos de mayor crecimiento provinieron de
2c y 2d], el explante de gladiolo no alcanzó ningún
fresia con 3.2 cm [Ilustración 1a] y 3 cm
desarrollo y se mantuvo con oxidación [Ilustración
[Ilustración 1d]
2e]. El crecimiento del hongo en el explante de
fresia [Ilustración 2a] no se detuvo y alcanzó un
halo de crecimiento de 4 cm, el hongo provenía del
explante y presentaba coloración blanca y aspecto
esponjoso. Sin embargo, la contaminación no
impidió el desarrollo del explante que alcanzó los
5.3 cm. El meristemo con mayor crecimiento fue
de fresia [Ilustración 2d] con una altura de 6.4 cm.
Se realizó un análisis estadístico global de los
resultados obtenidos con ayuda del programa
Microsoft Excel 2013, de donde se obtuvo que el
57.14% de los explantes no se contaminaron,
mientras el 42.86% sí presentaron contaminación
de bacterias y hongos, siendo esta último mayor a
la contaminación por bacterias (28.57% frente al
14.9%) [Ilustración 3]. El origen de contaminación
en su totalidad (100%) parecía provenir del
explante [Ilustración 4]. El 42.86% de los
explantes no exhibieron oxidación, mientras el
57.14% de estos presentó oxidación [Ilustración
Ilustración 2. 14 días tras la siembra de meristemos de
distintas muestras vegetales. 2a: fresia, 2b: tulipán, 2c:
5].
tulipán, 2d: fresia, 2e: gladiolo.

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de las yemas apicales se caracterizan por una alta
Tipo de contaminación organización de las células, ausencia de tejido
vascular y conexiones plasmodesmáticas
pequeñas que impiden el desplazamiento de los
60.00%
40.00% virus hacia dicho tejido (García, Quintero, &
20.00% López, 2004; Roca & Jayasinghe, El cultivo de
0.00%
meristemas para el saneamiento de clones de yuca,
1982).
En algunas monocotiledóneas, los tallos que
Tipo de contaminación funcionan como almacenamiento de reservas son
órganos subterráneos que poseen un meristemo en
Ilustración 3. Análisis global del tipo de contaminación
presentado en los explantes.
forma de corona debajo de los primordios foliares
(Alonso, 2011).

Origen de contaminación En la práctica se emplearon tres tipos de


monocotiledóneas, gladiolo, fresia y tulipán, que
se desarrollan mediante bulbos (Alonso, 2011;
Raven, Evert, & Eichhorn, 1992). Los bulbos son
100%
pequeños tallos cortos y aplanados con numerosas
0%
hojas engrosadas, carnosas y no fotosintéticas que
Explante Medio almacenan sustancias de reserva; de la base del
tallo nacen raíces adventicias (Alonso, 2011;
Origen de contaminación Raven, Evert, & Eichhorn, 1992).
Ilustración 4. Análisis global del origen de la contaminación Los protocolos de micropropagación empleando
en los explantes que la presentaron. meristemos pueden lograr altos niveles de
eficiencia (Sadia, et. al., 2010). El empleo de
meristemos en la investigación realizada por
Presencia de oxidación Sairam, et. al., (2003) permitió el desarrollo de 6 a
8 brotes de Zea mays en cuatro semanas. El la
práctica tras 14 días de incubación, cuatro de los
siete explantes sembrados lograron desarrollarse a
100% partir de los meristemas de sus bulbos, estos
pertenecen a las plantas de fresia y tulipán
0% [Ilustración 2a, 2b, 2c y 2d], en el caso de la fresia
No oxidación Oxidación
este logró los explantes de mayor tamaño 5.3 cm
[Ilustración 2a] y 6.4 cm [Ilustración 2d].
Presencia de oxidación
En las técnicas de cultivo in vitro es importante
Ilustración 5. Análisis global de la presencia o ausencia de
oxidación en los explantes. establecer métodos eficientes que controlen la
contaminación microbiana y la oxidación de los
IV. Discusión explantes pues generan dificultades para el
adecuado desarrollo de los explantes (Hernández
El cultivo de meristemos es una técnica empleada
& González, 2010). La técnica de cultivo de
para la obtención de clones libres de patógenos,
meristemos supone ser eficiente en la obtención de
principalmente de virus (Roca & Jayasinghe, El
explantes libres de patógenos (Roca, et. al., 1983)
cultivo de meristemas para el saneamiento de
pero según Ramos & Patiño, (2012) la obtención
clones de yuca, 1982), los tejidos meristemáticos
de cultivos exentos no sucede en el cien porciento

5
de los casos, adicional a aquello se sabe que las contaminación alguna, o verse afectada por el
corrientes de aire pueden arrastrar esporas y proceso de descontaminación. El meristemo con
células de microorganismos permitiendo su mayor crecimiento fue de Fresia con una altura de
depositó en las cámaras de flujo laminar 6.4 cm.
(Alvarado, 2000).
La contaminación del cultivo in vitro de
La composición del medio de cultivo es esencial meristemos de Gladiolo, Tulipán y Fresia
para el adecuado desarrollo del explante, las corresponde el 42.86% del total de los explantes
relaciones auxina y citoquina permiten la evaluados. Estos presentaron contaminación de
formación y mantenimiento del meristema, se ha bacterias y hongos, siendo la contaminación
demostrado que una concentración ligeramente bacteriana la predominante con un 28.57% frente
mayor de citoquinas promueve el aumento del al 14.9% que presento contaminación fúngica.
tamaño y actividad de los meristemas (Su, Lui, &
El origen de contaminación más probable es de los
Zhang, 2011). El medio empleado, repecto a
explantes, ya que la desinfección con hipoclorito
concentraciones de fitohormonas, contenía 2 mg/L
de sodio (NaClO) no fue suficiente para eliminar
de KIN, 0.5 mg/L de AIA, estas concentraciones
posibles esporas presentes en las muestras
fueron suficientes para que los explantes de fresia
vegetales o el proceso de desinfección no se llevó
y tulipán se desarrollaran. En una investigación
a cabo eficazmente.
realizada con Fragaria chiloensis,
concentraciones de 0.5-5 mg/L producen una tasa El porcentaje de explantes oxidados es de 57.14%
media de multiplicación de 3 a 6 brotes por planta debido a que los cortes realizados en los explantes
(Quiroz, y et. al., 2017). provocaron rupturas abruptas en los tejidos del
mismo, haciendo que estos cambien de coloración
En la práctica se obtuvieron un total de 3 frascos
y comience su proceso de descomposición.
contaminados, uno de ellos por bacterias (14.9%)
y los restantes debido a hongos (28.57%),
[Ilustración 3], uno de los frascos con crecimiento
de hongo no fue de impedimento para que el VI. Agradecimientos
explante continúe con su desarrollo pasando a Los autores agradecen y reconocen la
crecer 2.3 cm de una semana a la otra mientras el colaboración del Ing. Cristian Peña M.Sc.
hongo también crecía radialmente en el medio responsable de la asignatura de Cultivo de Tejidos
[Ilustración 2a]. Vegetales en la Universidad de las Fuerzas
Los resultados mostraron que cuatro de los Armadas ESPE, Carrera de Ingeniería en
explantes presentaron oxidación, en cultivo in Biotecnología, de igual manera desean agradecer
vitro este proceso es causado por los efectos la ayuda brindada por las tesistas de la carrera al
abrasivos del agente desinfectante, los cortes que enseñar las normas de bioseguridad, manejo de
sufre el explante, la composición del medio, etc. equipos y seguimiento del protocolo durante el
(Azofeifa, 2009), para nuestro caso el corte proceso de desinfección y la siembra de los
realizado al explante parece ser la principal razón explantes.
de esta oxidación pues se observan rupturas entre
los tejidos del explante en cuyas zonas se observan VII. Referencias
los cambios de coloración [Ilustración 1]. Aizpuru, & etal. (2004). Universidad publica de
Navarra. Obtenido de Universidad
V. Conclusiones publica de Navarra:
http://www.unavarra.es/herbario/htm/Lili
Se obtuvo 57.14% explantes viables para la
aceae.htm
formación de nuevas plantas, debido a que estos
no presentaron a lo largo de la incubación

6
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