Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan yang memisahkan analit berdasarkan kemampuannya

bergerak dalam medium konduksi yang biasanya berupa larutan buffer dan akan memberikan respons
setelah diberikan medan listrik (Harvey, 2000).

Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisa campuran protein secara kualitatif
adalah SDS ‐ PAGE ( Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis ). Prinsip penggunaan
metode ini adalah migrasi komponen akril amida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi – kisi tersebut
berfungsi sebagai saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisa krilamid dapat
diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk
menentukan berat molekul suatu protein disamping untuk memonitor pemurnian protein (Wilson dan
Walker, 2000). SDS ‐ PAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan kekuatan ion rendah dan dapat
menentukan apakah suatu protein termasuk monomerik atau oligomerik, menetapkan berat molekul
dan jumlah rantai polipeptida sebagai subunit atau monomer.

Fungsi SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya
memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS padametode SDS‐PAGE (SDS‐
Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan
dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan
menyederhanakan protein (bentuk,ukuran, dan muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan
sebagian stukturkompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada
suatumedan listrik (Anam, 2009)

Penggunaan SDS ‐ PAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisa.
Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan berat
molekul protein tersebut (Dunn,1989). Denaturasi protein dilakukan dengan merebus sampel dalam
buffer yang mengandung β ‐ merkaptoetanol (berfungsi untuk mereduksi ikatan isulfide), gliserol dan
SDS (Wilson dan Walker,2000). Muatan asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang
teikat sehingga kompleks protein ‐ SDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang konstan. (Hames,
1987).

merupakan elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fasediam untuk memisahkan molekul‐molekul
seperti DNA dan protein menjadi pita‐pitayang masing‐masing terdiri atas molekul‐molekuldengan
panjang yang sama.Elektroforesis gel merupakan teknik memisahkan suatu makromolekul dengan
caramemberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel yangdibantu dengan
tenaga listrik. Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan lajuperpindahannya melewati suatu gel di
bawah pengaruh medan listrik. Media atau gelyang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis
DNA) dan poliakrilamid gel(elektroforesis protein). Laju pergerakan molekul dipengaruhi oleh ukuran
molekul,konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori‐pori gel, voltase, dan larutanbuffer
elektroforesis (Martin, 2006)

3.1 Elektroforesis SDS – PAGE

Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah molekul besar (seperti
protein, fragmen DNA, RNA dll) dari campuran molekul yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk
memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam
sebuah medan listrik. Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung sampel yang
akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan
melalui suatu medium (misal agarosa), maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif
menuju muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada rasio muatan terhadap
massanya dan bentuk molekulnya (Yuwono, 2008).

3.2 Fungsi SDS pada metode SDS‐PAGE

SDS (sodium dodecyl sulfat) merupakan detergen anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki
muatan negatif dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS pada metode SDS‐PAGE (SDS‐
Polyacrylamide gel electrophoresis) yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan
dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan kondisi, dan
menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan
sebagian stuktur kompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu
medan listrik (Anam, 2009).

3.3 Fungsi akrilamid pada metode SDS‐PAGE

Fungsi akrilamid pada metode SDS‐PAGE yaitu untuk mencegah difusi akibat timbulnya panas pada arus
listrik. Selain itu gel akrilamid sering dimanfaatkan untuk memisahkan molekul protein yang kecil.
Konsentrasi akrilamid total dalam gel dapat mempengaruhi migrasi protein. Pada proses pembuatan
gel, akrilamid akan berpolimerisasi secara spontan bila tidak ada oksigen (Prihanto, 2011).

3.4 Fungsi pewarnaan gel pada metode elektroforesis

Pewarnaan atau staining pada gel merupakan bagian dari metode SDS‐PAGE. Fungsi pewarnaan gel pada
elektroforesis yaitu untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Pewarnaan gel pada metode
elektroforesis protein terdiri dari commasie blue staining dan silver salt staining. Pada pengecatan
dengan menggunakan perak nitrat dianalisa jarak migrasi pita‐pita protein terbentuk pada gel pemisah.
Jarak migrasi diukur dan dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pewarna biru bromofenol.
Sedangkan pewarna biru bromofenol untuk mengamati migrasi molekul protein selama elektroforesis
(Anam, 2009).

3.5 Stacking gel

Stacking gel merupakan salah satu gel yang digunakan dalam SDS‐PAGE. Stackinggel merupakan gel
pengumpul atau gel penimbun yang terletak pada bagian atas.Stacking gel dibuat dengan campuran
antara akrilamid 30%, Tris HCl 1 M pH 6,8, sterilaquades, SDS 10%, Ammonium Phosphate (APS) 10%,
dan temed (Utami, 2007).

Stacking gel diperlukan dalam elektroforesis protein karena digunakan untuk mencetak sumuran ( well ),
selain itu digunakan untuk menimbun atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum
protein itu memasuki gel pemisah. Stacking gel juga digunakan untuk menahan sementara agar sampel
bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Pada saat elekroforesis protein, protein akan tertarik ke bagian
bawah aruslistrik. Protein yang memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga
tertariksampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besarakan
berada pada bagian atas dari gel (Utami, 2007).