Microorganismos extremófilos

Dr. J.V. Sinisterra

Biotransformations Group
Faculty of Pharmacy
Universidad Complutense
www.biotransformaciones.com
Tabla 1 Tipos de microorganismos extremófilos

AMBIENTE COMPORTAMIENTO PARÁMETRO EJEMPLO ORGANISMO

Temperatura Hipertermófilo Crecimiento > 80ºC Pyrolobus fumarii (113ºC)

Termófilo Crecimiento 60-80ºC Synechoccus lividis
Psicrófilo Crecimiento < 15ºC Psychrobacteria (algunos
insectos)

Radiación Atomófilos Superior a 6000 rad/hr; 15 Mrad Deinococcus radiodurans

tot.
Presión Barófilos Por encima de los gigapascals Sh. Oneidensis, E. coli

Sequedad Xerófilos Ausencia de agua Artemia salina, hongos, etc

Salinidad Halófilos 2-5 M NaCl Halobacteriaceae, D. salina

pH Alcalófilos pH > 9 Natronbacterium, B. Firmus

(Acidez/alcalinidad) Acidófilos pH < 0 Cyanadium caldarium (pH 0)

Presión de oxígeno Anaerobio No tolera O2 Methanococcus jannaschii

Microaerófilos” Tolera bajas [O2] Clostridium

Extremos químicos Gases Atmosfera pura de CO2 Cyanidium caldarium

Metales Elevadas concentraciones de Ferroplasmic acidarmanus
metales
 BIODIVERSIDAD
Especies
Especias Conocidas %
Reino Estimadas 1995 Conocido
Virus 13 x 104 - 13 x 106 5 x 103 0,04

Archea ?? 500 ??

Bacteria 4 x 104 - 4 x 106 4,8 x 103 0,12

Hongos 1,5 x 106 69 x 103 5

Algas 6 x 104 4 x 104 67

Total 1,9 x 107 1,2 x 105 0,65

 BIODIVERSIDAD
% Microorganismos
Biotopo cultivables
Agua Marina 0,001 – 0,1
Agua Dulce 0,25
Lagos Mesotrópicos 0,1 – 1
Aguas de Estuario 0,1 – 15
Sedimentos 0,25
Suelo 0,30
Lodos Activos 1 – 15
Arqueas (Archaea)

Microorganismos primitivos cuyas biomoleculas, enzimas y

mecanismo metabólicos son diferentes de los de otros
microorganismos
Suelen estar adaptadas a vivir en condiciones extremas
de T, pH, salinidad etc

Hipertermófilos
Halófilos
Metanogéncios
 Diferencias con los organismos mesófilos
1) No tienen triglicéridos en las membranas sino polieters
formados por uniones de glicerol y unidades de isopreno
O
O
OH

O O HO
O
O O O
O O
O O
OH

2) Microorganiosmo acidófilos
Sulfolobus sp. HO

Paredes celulares con

pseudo-peptidoglicanos de
NAG beta-1-3 y NAT beta 1,3- OH
resistentes a la lisozima
bacteriana
2)Metabolismo especial

HOH
HO Acetil-CoA via oxidación y no via glicolisis normal
HO
HO H OH OH
H H

Acetil-CoA CH3- tetrahidrometopterina

Lactato
CO-deshidrogenasa
(especifica de arqueas)

CO2
 Microorganismo metanogénicos

CO2 + 4H2 CH4 + H2 O  Go = -131 kJ/mo l

 Go = -220 kJ/mol
4 CO + 2 H2O CH4+ 3 CO 2

4 HCOOH CH4 + 3 CO2 + 2 H2O  Go = -319 kJ/mol

CH3-NH2 +HCl
CH4 + CO2 + 4 NH4 Cl  Go = -230 kJ/mol

CH4 + CO + 2H2O  Go = -319 kJ/mol

2CH3OH

CH4 -COOH + H2O  Go = -31 kJ/mol

CH4 + CO2
Aplicaciones industriales

1.- Arqueas metanogénicas .- producción de metano a partir de residuos urbanos

2.- DNA polimerasas termoestables de Thermus aquaticus para ensayos de PCR

3.- Alcohol deshidrogenasas resistentes a los medios orgánicos.

Sulfolobus sulfataricus
4.- Recuperación de metales Ni, Cu, U, Au etc Sulfolobus sp.

Enzimas mas termoestables que las de los mesofilos

1.- Sustitución aminoácidos flexibles (Gly, Ser, Ala etc) por aminoácidos
Rígidos (Thr, Val, Pro)

2.- Sustitución de aminoacidos con grupos reactivos Cys (SH), Glu y Asp
(COOH), Asn (CONH2) porotros inertes Ala, Leu etc.
3.- Tiene una relación Arg/Lys alta lo que permite fuertes interacciones
polares
Aplicaciones industriales de enzimas aisladas de microorganismos termófilos

EXTREMOFILO HABITAT ENZIMA APLICACIONES REPRESENTATIVAS

Termófilo Elevada temperatura Amilasas Glucosa, fructora para edulcorantes

Termófilos moderados (45-65ºC) Xilanasas Blanqueo del papel
Termófilo (65-85ºC) Proteasas Fermentaciones, detergentes
Hipertermófilos (< 85ºC) DNA polimerasas Ingeniería genética

Psicrófilo Baja temperatura Proteasas Maduración del queso, producción de lácticos

Deshidrogenasas Biosensores
Amilasas Degradación de polímeros en detergentes

ACIDÓFILO Bajo pH Oxidación de sulfuros Desulfuración del carbón

Concentrado de calcopirita Recuperación de metales

Alcalinófilo Elevado pH Celulasas Degradación de polímeros en detergentes

Halófilo Elevada salinidad

Barófilos Elevada presión Cualquier microorganismo Formació de geles y almidones granulados

Metalófilo Elevada concentración de metal Cualquier microorganismo Bioremediación, biomineralización

Radiófilo Elevados niveles de radiación Cualquier microorganismo Bioremediación contaminación radionuclear???

Microaerofilo Crecimiento en <21% O2

Hipertermófilos

Se conocen como hipertermófilso aquellos microorganismos que crecen por encima de 80ºC.
Hay algunos que crecen por enzima de la temperatura de ebullición del agua.-
Pyrolobus fumarii 113ºC

Muchos de ellos corresponden al dominio de las Archeas.

Los hipertermófilos se encuentran en entornos terrestres o marinos, siempre que haya agua
Caliente v.g. agua calentada por fuentes termales, geisers o volcanes.

El estudio de secuencias 16S rDNA de los hipertermófilso ha demostrado que se encuentran

en lo mas profundo de las ramas de la evolución. Son organismos muy primitivos.
 Enzimas de hipertermófilos

Hidrolasas.- Pyrobaculum calidifontis y Sulfolobus solfataricus producen

Carboxil-esterasas y esterasas termoresistentes.
No se han descrito hasta ahora verdaderas lipasas .-selectivas hacia
esteres de ácidos grasos

Pyrococcus furiosus es un excelente productor de proteasas

Su perfil de actividad es similar al de la subtilisina

P.furiosus, P.horikoskhii y S. sulfataricus producen enzimas sacarolíticas

Estan descritas α-amilasa, β-glicosidasa, β- glucosidasa, β-galactosidasa y
Exo-β-D- glucosaminidasa
 Enzimas de hipertermófilos

Alcohol dehidrogenasas.- P. furiosus, S. solfataricus y Aeropyrum pernix

Se han descrito como productores de estas enzimas
En concreto la de P. furiosus tiene 234 aminoacidos y presenta similitudes
con las ADH de cadena corta (van der Ost ycol 2001)

Este tipo no suele tener una gran estereospecificidad

HO

O R- 21.8 U/mg
ADH P. f
uriosus

HO

S- 32.3 U/mg
 Enzimas de hipertermófilos

Alcohol dehidrogenasas.- S. solfataricus

Tiene 347 aminoacidos y es NADH dependiente. Muestra una buena
Enantioselectividad en la reducción de cetonas pequeñas (Esposito y col 2002)

Asi la (R,S) 3-metil-butan-2-ona da el alcohol de configuración S, pero no

hay una marcada selectividad hacia la configuración del centro que
lleva el metilo
HO

ADH S. solfataricus

HO
Enzimas de hipertermófilos

En la actualidad se están identificando los genes de los hipertermófilso que producen

las enzimas de interés para expresarlas en E. coli.
 Psicrofilos. Organismos cuya T óptima de crecimiento es <15ºC

Psicrotrofos organismos cuya T óptima de crecimiento es de 15 º<T<20ºC

Psicrotolerantes Organismos mesófilos que pueden adaptarse a vivir a

bajas. T
Metodologías para aumentar la actividad enzimática en los organismos Psicrofilos

1.- aumentar la concentración intracelular de enzimas.- Psicrotolerantes y psicrotrofos

2.- Fabricando enzimas cuya actividad es casi independiente de T. G ≈ 0

3.- Fabricando enzimas muy específicas y de elevado turnover

α-amilasa T(ºC) K(s-1) ΔG≠ ΔH≠ ΔS≠

(kJ/mol) (kJ/mol) (J/mol x
K)

A.halophantis 15 187 58 71 46
(psicrof)

B. amyloliquefaciens 15 34 62 97 122
Subtilisina

B.TA41 (psicrof) 15 25 62 36 -92

B. subtillis 15 5 66 46 -70
La diferencia fundamental es que sus proteínas son muy flexibles
para que a bajas T sigan manteniendo la estructura 3D.

Por ello tienen:

1) pocos puentes salinos o pares iónicos y por ello la relación (Arg+Lys)/ Lys
es muy baja
2) posee pocos enlaces de H. esto hace que se pierdan los contactos
entre los barriles β. Tienen además pocos aminoácidos tipo
Ser, Thr, Asn, Gln
3) tienen pocas interacciones de stacking entre anillos aromáticos Tyr, Phe y Trp.
4) tiene pocas interacciones bipolares entre C=O y NH en las hélices – α
5) sus proteínas tienen poca afinidad por iones estabilizadores de estructuras
tales como Ca(II)
6) sus superficies son muy hidrófobas dando valores anormales de pI
7) su interior es mas hidrófilo que en los mesofilos pro lo que hace que se
desnaturalicen por el agua.
La Ingeniería de los Procesos Enzimáticos- aplicación a enzimas de termófilos

 BÚSQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS MÁS EFICIENTES

 CLONAJE E HIPEREXPRESIÓN
 MUTACIÓN (PURIFICACIÓN, PROPIEDADES…)
 MEJOR PROTOCOLO DE PURIFICACIÓN
 PROTOCOLOS MUY SENCILLOS DE INMOVILIZACIÓN + ESTABILIZACIÓN
 INGENIERÍA MICROSCÓPICA DEL CATALIZADOR
 INGENIERÍA DE LA REACCIÓN
 INGENIERÍA DEL REACTOR

RESULTADOS PODRIAN SER ESPECTACULARES

 INGENIERIA ENZIMÁTICA COMO INGENIERIA MULTIDISCIPLINAR Y COMPLEJA:

NUEVAS POSIBILIDADES EN TECNOLOGIAS DE ALIMENTOS
 ENZIMAS
MICROBIOLOGÍA BBIO
IOLLOOGGÍA
ÍAMMOOLLEECCUULLAARR

Biodiversidad Alteración de la
Súper-producción
secuencia
de aminoácidos
3D

NUEVOS Y
MEJORES
ENZIMAS

DNA RECOMBINANTE PCR

Aplicación a la QUIMICA ORGANICA

ENZIMAS DE TERMÓFILOS

 “criterio de selección natural”: eficacia biológica

a altas temperaturas
 producto de la evolución natural: enzimas
termo-resistentes
 criterio selección natural = criterio selección industrial

 enzimas muy minoritarias

 los microorganismos extremófilos
crecen muy lentamente

Clonación, súper expresión en microorganismos

hospedadores adecuados
 Microorganismos Termófilos: Viven a Altas Temperaturas

BIOLOGIA INDUSTRIA
ENZIMAS TERMORRESISTENTES

PROCESOS A ALTA TEMPERATURA

(prevención de contaminaciones, economía del proceso)

Microorganismos termófilos€ Enzima minoritaria

€ Difícil de crecer en fermentadores
industriales

Clonac iió
ón e h iip
perexpres iió
ón en m iic
croorgan iis
smos mesófilos
hospedantes fáciles de manejar
ENZIMAS DE MICROORGANISMOS QUE NO HAN SIDO DETECTADOS

Suelos Amplificación
Aguas Termales DNA
Aguas de Dorsales (PCR) Biblioteca
Marinas de
Secuencias

Extracción
DNA
mRNA
Homología con
enzimas conocidas

Clonaje, súper-expresión

Nuevas Enzimas
 Aprovechamiento de evolución natural – TERMÓFILOS

 Utilización directa de DNA ( organismos difíciles de identificar)

 Mejora por evolución dirigida

 Estructura 3D ( Rayos X, modelos matemáticos... )

 Mejora por mutagénesis dirigida

ENZIMAS INDUSTRIALES
Actividad y selectividad substratos naturales
Estabilidad
 Las enzimas deben ser purificadas

Alta actividad volumétrica

Enzimas puras

 Problemas de alergenicidad (solubles)

 Ausencia de reacciones laterales catalizados por otras enzimas
contaminantes (oxidaciones, hidrólisis, proteasas solubles o inmovilizadas)
 Máxima capacidad de carga de los derivados inmovilizados
 Enzimas inmovilizadas y estabilizadas

Re-uso

 Reactores en continuo para tratamiento de grandes volúmenes de sustrato

La enzima no se libera al alimento

(posibilidad de utilizar un mayor número de enzimas)

Derivados inmovilizados y estabilizados para su uso por prolongados periodos de

tiempo

>tecnología y economía
Purificación de enzimas industriales mediante procesos cromatográficos

ESTE MÉTODO DE PURIFICACION PUEDE SER:

a). Muy eficiente y útil a escala laboratorio

b). Deberían ser muy útiles a escala industrial pero necesitan

simplificarse y optimizarse
A
Addssoorrcciióónn SSeelleeccttiivvaa ddee EEnnzziim
maass G
Grraannddeess SSoobbrree SSooppoorrtteess IIóónniiccooss PPooccoo A
Accttiivvaaddooss

Adsorción de enzimas Adsorción selectiva

grandes y pequeñas de enzimas grandes
 Deessoorrcciióónn ddee llaa β--ggaallaaccttoossiiddaassaass ddee TThheerrm
D muuss sspp.. TT22,,
A
Addssoorrbbiiddaa aa SSooppoorrtteess M
MA AN NA AEE ddee D Diiffeerreennttee G
Grraaddoo ddee A
Accttiivvaacciióónn

100 100

80 80

Proteinas (%)
Actividad (%)

60 60

40 40

20 20

0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Grado de aminación del soporte (µmols)

Pessela y col. J. Chromatgr. A, 1034, (2004), 155-159 .

 PPuurriiffiiccaacciióónn ddee EEnnzziim
maass M Muullttiimméérriiccaass ddee M
Miiccrroooorrggaanniissm mooss TTeerrmmóóffiillooss C
Clloonnaaddaass eenn
M
Meessóóffiillooss ppoorr A Addssoorrcciióónn SSeelleeccttiivvaa aa SSooppoorrtteess ddee IInntteerrccaam
mbbiioo IIóónniiccoo PPooccoo AAccttiivvaaddooss

Análisis por filtración en gel de las proteínas del extracto crudo de E. coli
adsorbidas a soportes MANAE-agarosa con diferente grado de activación

12

10
Proteínas (µg/ml)

8
Proteínas adsorbidas a
MANAE altamente activado
6

4 Proteínas
adsorbidas
2 a MANAE 1 μmol/g

0
50 60 70 80 90 100 110
Volumen de Elución (mL)
 Análisis por Filtración en Gel de PROTEINAS de Microorganismos Termófilos
Clonadas en Mesófilos por Adsorción Selectiva a Soportes de Intercambio Iónico Poco Activados

12
Proteinas (ugr /mL) 10
8
6
4
2
0
45 55 65 75 85 95 105
Volumen de elución (mL)

- Se eliminan las proteínas de elevado peso molecular del organismo mesófilo

- La proteína de mayor peso molecular se mantiene intacta (nuestro interés)

Pessela y col. Biotechnol. Progr. 20, (2004), 1507-1511

 PPuurriiffiiccaacciióónn ddee llaa --ggaallaaccttoossiiddaassaa ddee TThheerrm
muuss sspp.. TT22 C
Clloonnaaddaa eenn EE.. ccoollii

94
67 1- Patrón de PM

-galactosidasa 2- Extracto crudo

43
3- Proteínas tras choque térmico
30 4- Proteínas adsorbidas a soportes
con baja densidad de grupos
20
1 2 3 4

Pessela y col. J. Chromatog. A, 1055, (2004), 93-98

 ENZIMAS DE TERMOFILOS

 Elevada estabilidad térmica

 Elevada estabilidad en presencia de codisolventes orgánicos
 Temperatura óptima elevada
Baja actividad a temperaturas moderadas

Esterasa de Bacillus stearothermophilus

Catecol 2,3 dioxigenasa de Bacillus stearothermophilus
Alfa y beta galactosidasa de Thermus sp.
Xilanasa de Thermotoga maritima
 ESTERASA DE B. stearothermophilus

 Temperatura óptima del microorganismo: 60ºC

 Temperatura óptima de la enzima: 62ºC
 Elevada actividad a temperatura moderada
 Amplia especificidad
ACTIVIDAD DE LA ESTERASA DE B. stearothermophilus
EN MEDIOS DESFAVORABLES

Efecto de co-disolventes Efecto de la fuerza iónica

100 95 100 95

Actividad Residual, (%)

Actividad Residual, (%)

80 80
60
60 60

40 30 40

20 20

0 0

30% propanol 500 mM ClNa

 Catecol 2,3 dioxigenasas
Enzimas multiméricas
X X Centro catalítico
con un grupo Fe 2+ no
Y OH Y OH hemo
Muy inestables
Z OH E Z COOH Posibilidad de ser utilizadas
C O en síntesis de piridinas complejas
Catecol H
Semialdehido
2- hidroximucónico

Catecol 2,3 dioxigenasa de B. stearothermophilus

Estabilidad térmica elevada ( microorganismo crece a 55ºC )

 EFECTO DE LA UNION COVALENTE MULTIPUNTUAL
EN LA ACTIVIDAD DE LA CATECOL 2, 3 DIOXIGENASA EN
CONDICIONES DESFAVORABLES

100 100

Actividad Residual, (%)

Actividad Residual, (%)

75 75

50
50
25
25
0
0,00001 0,001 0,1 10 1000 0
[catecol mM] 0 25 50 75 100
Temperatura

pH 7, 40ºC pH 7, 0.1 mM catecol

 XILANASA DE Thermotoga maritima

 Temperatura crecimiento, 80ºC

 Enzima muy termoestable
 Máximo de actividad 105ºC
 Vida Media a 100ºC aproximadamente 10 minutos

Un buen modelo para estudiar la degradación química

de proteínas correctamente plegadas
EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD
DE LA XILANASA DE T. maritima

10000
Vida media (min)
1000

100

10

0,1

0,01
95 105 115 125

T, (ºC)

pH 7
EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD
DE LA XILANASA DE T. maritima

10000
Vida media (min)
1000

100

10

0,1

0,01
95 105 115 125

T, (ºC)

pH 7
 Inmovilización y Estabilización de Enzimas Multiméricas

INMOVILIZACIÓN Y ESTABILIZACIÓN DE LA ß-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2.

● Enzima tetramérica de elevado peso molecular

● Altamente termorresistente
● Activa y estable en un amplio rango de pH.

Potencialmente útil para hidrolizar lactosa en leche y en sueros de quesería a alta temperatura

INMOVILIZACIÓN MULTIPUNTUAL CON DIFERENTE ORIENTACIONES SOBRE SOPORTES EPÓXIDO

 Inmovilización Multipuntual de Enzimas Sobre Soportes Epóxido

O
H2N
O

O
O
HS

O
O
HO
O

 Muy estables: transporte

 Pueden reaccionar con distintos nucleofilos de la enzima:
inmovilización multipuntual muy favorable
 Facilidad del bloqueo de epóxidos remanentes

 Muy poco reactivos: velocidad de inmovilización extremadamente lenta

 Posibilidad de modular la enzima sobre el soporte
 Mecanismo de Estabilización de Enzimas

Detecciió
ón de subuniid
dades enziim
máttiicas no uniid
das all soporte víía
a epóxido.

SDS Mercaptoetanol,
100ºC

Derivado no estabilizado

derivado
estabilizado
+
SDS-PAGE
Estabilización del Derivado Boronato por Entrecruzamiento con Dextrano Aldehído pH 6,5 70 ºC

100 derivado boronato entrecruzado 97000

66000 - galactosidasa

80
de Thermus sp. T2
Actividad residual,(%)

45000
60
30000
40
20100
20 -galactosidasa soluble
14400
0

0 2 4 6 8 10
1 2 3
Tiempo (horas)
1 Patrón de peso molecular
2 Derivado boronato sin entrecruzar
3 Derivado boronato entrecruzado

Pessela y col. Biotechnol. Prog. 20, (2004), 388-392

Adsorción de proteínas sin colas de Poli-His sobre soportes quelatos altamente activados

Adsorción en ausencia de Imidazol Adsorción en pprreesseenncciiaa de Imidazol

Las proteínas de elevado peso molecular se pegan mucho mas

fuertes que las proteínas de pequeño peso molecular
 Adsorción de la α-galactosidasa de Thermus sp. T2 clonada en E. coli á soportes
IMAC altamente activados

Grado de activación del soporte: 115 M de qquueellaattooss //g de ssooppoorrttee

Efecto del Imidazol en la adsorción de la α-galactosidasa y de otras proteínas de E. coli

100 Actividad 100

α-galactosidasa

Proteínas adsorbidas ,%
Actividad residual ,%

80 80

60 60

40 40

20 20
Proteínas totales

0 0
0 10 20 30 40 50
[Imidazol, mM]

Pessela y col. Enzyme Microbial Technol. 39, (2006), 909-915.

 Adsorción de la α- y β-galactosidasas de Thermus sp. T2 clonadas en E. coli á
soportes IMAC altamente activados

Purificación de la α- y β-galactosidasas de Thermus sp. T2 clonadas en E. coli

1.- Choque térmico

2.- Adsorción sseelleeccttiivvaa a ssooppoorrttee IIM
MAAC
Cmmuuyy aaccttiivvaaddooss en presencia de 50 mM de imidazo

LMW (kDa) α-galactosidasa β-galactosidasa

LMW (kDa)
94
67 94
67
43
43

31 31

21
21

1 2 3 1 2
1- PM; 2- Extracto crudo; 3- enzima purificada

Pessela y col. Enzyme Microbial TTeecchhnnooll.. (In press).

 Purificación-Inmovilización-Estabilización de la α-y β-galactosidasas
de Thermus sp. T2 sin Poli-His, adsorbidas a soportes IMAC muy activados

Inactivación Térmica de los Derivados de la α- y β-galactosidasas

α-galactosidasa β-galactosidasa
100 100
Actividad residual, (%)

80 Sepabeads-EB-IDA-Ni 80 Sepabeads-EB-IDA-Ni
60 60

40 Soluble 40 Soluble
20 20

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 10 20 30

Tiempo (h)

Condiciones de inactivación: pH 7, 70ºC

Pessela y col. Enzyme Microbial Technol. (In press)