Cultura de Células

IMPRESSO POR: Débora Jacomini <debora_jacomini@hotmail.com>. A impressão é apenas para uso pessoal e privado.
Nenhuma parte
deste livro pode ser reproduzida ou transmitida sem prévia autorização do editor. Os violadores serão processados.
CAPÍTULO 1
Explante, meio nutritivo, luz e

temperatura
L. Pedro Barrueto Cid
João Batista Teixeira
Do ponto de vista biológico, os organismos vivos reproduzem-se sexual

ou assexuadamente. No primeiro caso, a variabilidade genética e a
evolução são favorecidas; no segundo, isso não acontece.
Nas plantas superiores, a reprodução assexuada pode ocorrer por meio
de vários processos, tais como: o enraizamento de estacas, a enxertia,
a apomixia e a micropropagação.
Do ponto de vista comercial, é interessante que cultivares de
importância agronômica sejam propagadas assexuadamente, pois esse
tipo de propagação resulta em plantas uniformes quanto ao seu fenótipo
(crescimento, floração, frutificação, etc.). Isso decorre do fato de que
essas plantas são altamente selecionadas para características
desejadas (alta produção, resistência a doenças, etc).
Por via sexual, a conservação dessas características poderia ser obtida
por endogamia, ou seja, pelo cruzamento entre indivíduos relacionados
pela sua ascendência ou com eles mesmos. Porém, nem todas as
plantas de importância agronômica podem cruzar-se por meio da
autofecundação, e, mesmo que isso fosse possível, deve-se considerar
o problema da depressão endogâmica, ou seja, a perda de vigor, que
resulta em tamanho reduzido das plantas, albinismo, susceptibilidade a
doenças, etc. Ademais, ainda que as plantas possam retrocruzar,
IMPRESSO POR: Débora Jacomini <debora_jacomini@hotmail.com>. A impressão é apenas para uso pessoal e privado. Nenhuma parte
muitas vezes carregam uma herança indesejável que deve ser

posteriormente retirada (VALOIS et al., 1996). Por isso, a via clonal é
uma alternativa para que se fixem características de importância
agronômica e comercial, a partir do cruzamento entre híbridos
interespecíficos por meio da genética clássica. Contudo, é sabido que o
enraizamento de estacas via clonal, por exemplo, apesar de ser uma
importante ferramenta de propagação assexuada, dificulta a produção
em grandes quantidades. Além disso, a capacidade de indução de
raízes adventícias, importante para o processo, diminui com a idade da
planta doadora de estacas.
A enxertia, por sua vez, é uma prática comercial realizada em algumas
culturas, tais como a seringueira, o limoeiro, entre outros. No entanto,
em nível comercial, essa técnica é uma prática cara e laboriosa, além
de oferecer risco de incompatibilidade entre enxerto e porta-enxerto.
Além disso, existe a possibilidade de transmissão mecânica de vírus,
fato que ocorre, por exemplo, com o vírus fanleaf, que, no caso da
videira, é passado à planta pelo nematoide Xiphinema index
(BAVARESCO; WALKER, 1994). Por essas razões, o uso da enxertia é
desencorajado em muitos casos. Já a apomixia não deixa de ser um
modelo interessante do ponto de vista clonal; no entanto, na prática,
não há exemplos concretos a propagar.
Assim, a micropropagação, ou propagação in vitro, mesmo sendo uma
prática dispendiosa em termos de mão de obra, de laboratório e de
equipamentos, oferece uma melhor relação custo-benefício, pois
permite produzir, em escala comercial, material uniforme e selecionado,
bem como realizar pesquisas de apoio às diferentes áreas da biologia,
como a genética, a fitopatologia e a fisiologia vegetal.
Notadamente, a micropropagação in vitro de plantas anuais ou perenes
possibilitou que houvesse avanços no campo do melhoramento por
meio da transformação de plantas, ou seja, permitiu a ocorrência de
rearranjos genéticos no material vegetal, sob condições in vitro, os
quais, por meio exclusivo do melhoramento tradicional, seriam muito
demorados e caros. Assim, a cultura de tecidos de plantas in vitro, como
técnica, permite o aumento da produção e causa menos danos

ambientais, por isso contribui para que os laboratórios e os países que a
adotam tenham mais vantagens competitivas. Em países como a
Alemanha, a Índia, a Holanda e os EUA, entre outros, a cultura de
tecidos aplicada à floricultura, por exemplo, gera bilhões de dólares
anualmente e, consequentemente, aumenta a oferta de empregos, além
de gerar novas demandas por genótipos, rápida multiplicação clonal,
plantas livres de doenças e independência de fatores sazonais (GOVIL;
GUPTA, 1997; WINKELMANN; GEIER, 2006).
A micropropagação requer a análise de alguns parâmetros, tais como
explante, assepsia, meio nutritivo, etc., os quais são importantes na
compreensão do trabalho in vitro.
Explante
A cultura de tecidos de plantas é um termo que exprime o conceito de
que uma ampla gama de tipos de tecidos da planta pode ser cultivada,
sob condições assépticas e in vitro, visando micropropagação,
melhoramento, armazenamento ou limpeza clonal. A micropropagação é
um termo usado exclusivamente para referir-se à propagação in vitro a
partir de alguma parte específica da planta – chamada explante –,
baseada na capacidade morfogenética e totipotencial das células
(VASIL; HILDEBRANDT, 1965).
Qualquer parte separada da planta destinada ao uso in vitro denomina-
se explante. A lista de possíveis explantes é longa e variada, e os
seguintes exemplos podem ser citados: fragmentos de raízes,
hipocótilos, epicótilos, cotilédones, flores e folhas. Além desses, grãos
de pólen, embriões, óvulos, nós, gemas axilares ou apicais também
podem ser usados como explantes.
A escolha do explante poderá ser influenciada por vários fatores, tais
como: disponibilidade de material, nível de contaminação, juvenilidade
do tecido e estação do ano.
Nem todos os explantes reagem da mesma forma a uma determinada

condição in vitro. Dessa forma, em Saussurea obvallata (planta
medicinal e ornamental), verificou-se que os explantes foliares reagiram
mais satisfatoriamente que raízes, hipocótilo e cotilédones, em termos
de indução de calos e de organogênese (DHAR; JOSHI, 2005).
Os requerimentos nutricionais também poderão variar conforme o
explante. Assim, pólen, embriões, bulbilhos, entre outros, poderão ter
suas próprias exigências. Da mesma forma, o nível morfológico do
explante também poderá influir nesse processo, já que, se o material
inicial for um fragmento foliar, para virar calo, deverá desdiferenciar-se.
Uma vez na forma de calo, esse fragmento deverá rediferenciar-se
produzindo embriões somáticos ou gemas adventícias. Tudo isso ocorre
de acordo com requerimentos nutritivos e hormonais particulares, seja
adicionando alguns ingredientes seja reduzindo outros, pois a
morfogênese, em um caso ou em outro, passará de células vacuoladas
parenquimatosas do calo para células mais totipotentes ou
embriogênicas, com núcleo proeminente, denso citoplasma, pequenos
vacúolos e intensa síntese de RNA. Esse aspecto nutricional será
abordado um pouco mais adiante.
A viabilidade do explante também é um aspecto vital a ser considerado,
já que muitos embriões, especialmente de sementes recalcitrantes (da
seringueira, do café, etc.), podem estar em condições não viáveis para
seu uso in vitro. Nesse caso, o cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC),
ou simplesmente tetrazólio, é usado como auxiliar para detectar
rapidamente a viabilidade do material. O tetrazólio produz uma
coloração avermelhada quando o tecido está viável. Notadamente, essa
coloração é muito nítida no ápice radicular e apical dos embriões. Em
uma semente do tamanho do feijão, não é necessária a utilização de
lupa para que se observe a coloração vermelha que demonstra
viabilidade. No entanto, em sementes de orquídea e de eucalipto, em
vista de seu pequeno tamanho, o uso de microscópio estereoscópico
faz-se necessário (Figura 1).
Figura 1. Sementes de orquídea (Oncidium phimatochilum) submetidas

ao teste do tetrazólio (0,1% por 24 horas em temperatura de laboratório)
para avaliação de sua viabilidade após algum tempo de armazenamento
em refrigerador.
Foto: L. Pedro Barrueto Cid
O trabalho com embriões tem dado origem a uma linha importante de

pesquisa, como é o caso do resgate de embriões imaturos derivados de
cruzamentos interespecifícos, com o objetivo de obter genótipos novos
e superiores (LIU et al., 2007).
Assepsia
Historicamente, este conceito foi desenvolvido a partir do século 19 em
trabalhos pioneiros do médico húngaro Ignácio Semmelweis, do inglês
Joseph Lister e do francês Louis Pasteur. Antisséptico é qualquer
substância ou agente capaz de inibir ou combater microrganismos ou
patógenos. Imbuído dessa ideia, Semmelweis usou as propriedades
antissépticas do cloro (água de cloro) como profilático, para reduzir a

morte nos hospitais por febre puerperal que, na ocasião, alcançava
índices alarmantes, e preconizou a lavação das mãos e dos
instrumentos com esse tipo de composto. Já Lister e Pasteur
envolveram-se mais com a ideia global de microrganismos do ar como
causadores de infecções e de doenças. Em termos profiláticos, Lister
usou o ácidocarbólico, e Pasteur desenvolveu a técnica que ficou
conhecida como pasteurização. Mais tarde, em 1878, Kock, na
Alemanha, reconheceu a utilidade do vapor quente para esterilizar
instrumentos.
A desinfestação, ou seja, a remoção de contaminantes existentes na
superfície do explante oriundo de material de campo ou de casa de
vegetação, é um passo inevitável na cultura in vitro. Pode ser alta ou
baixa, controlável ou não, constituída por fungos ou bactérias. As
contaminações por vírus já são mais difíceis de diagnosticar.
No geral, o procedimento da assepsia começa com a limpeza da
câmara de fluxo laminar com álcool 70%. Após a imersão em álcool
95%, o bisturi e as pinças que forem utilizados em processo de excisão
devem ser flambados. Os discos de papel-filtro e as placas de Petri de
vidro, assim como a vidraria em geral, precisam ser esterilizados em
autoclave por 20 minutos, a 121 ºC e em pressão de uma atmosfera.
A assepsia dos explantes é frequentemente realizada por meio de
alvejantes comerciais à base de cloro, embora diferentes substâncias
possam ser utilizadas para essa finalidade. O teor de cloro ativo desses
alvejantes varia de 2,0% a 2,5% e, geralmente, sua fonte é o hipoclorito
de sódio (NaOCl), embora incluam também hidróxido e carbonato de
sódio, sem especificar sua concentração, o que é uma limitação, ainda
que não crítica. O NaOCl poderá ser também encontrado em uma
formulação mais concentrada (10% a 12%), porém com menos outros
produtos misturados. Nesse caso, dada a alta concentração, o produto
deverá ser usado numa forma mais diluída. Outra formulação comercial
para a assepsia dos explantes é o hipoclorito de cálcio (CaOCl2) a 7%
(p/v), contudo, nesse caso, é necessário previamente filtrar o produto.
Em sua aplicação prática, o delineamento experimental do uso do

hipoclorito pode ser simples e reduzido a uma concentração em que há
vários tempos de imersão, como por exemplo, 0,0; 5,0; 10; 15; 20
minutos, etc. É conveniente que, durante esse tempo, os explantes
fiquem sob agitação e que o hipoclorito contenha também algumas
gotas de Tween 20 para facilitar a ação superficial do desinfetante.
Depois desse tratamento, os explantes devem ser lavados com água
esterilizada para que o hipoclorito residual seja removido.
Mesmo tomando todas as providências de uma assepsia rotineira, às
vezes não é possível contornar completamente a contaminação por esta
ter uma base endógena (Figura 2).
Figura 2. Estacas de café oriundas de casa de vegetação, submetidas à

assepsia com hipoclorito de sódio e colocadas para brotar em vermiculita,
em condições de laboratório. Durante o período, as estacas foram
cobertas com saco plástico transparente e o substrato umedecido
periodicamente. Apesar da assepsia, as estacas foram contaminadas.
Enquanto a estaca está verde, a aparição de fungo é retardada, porém,
uma vez marrom, o fungo alastra-se rapidamente na estaca. Trata-se
provavelmente de uma contaminação de origem endógena.
Em geral, por serem oxidantes enérgicos, além de facilmente

removíveis pela água de lavagem, os hipocloritos são bastante
utilizados na assepsia superficial dos explantes. Contudo, durante sua
manipulação, é necessário evitar seu contato com a pele ou sua
inalação, para diminuir o risco de irritações nas mãos ou na mucosa
bronquial. Além de sua efetividade como agentes desinfetantes, os
hipocloritos têm sido citados como estimulantes da germinação, em
virtude de sua capacidade de estimular a atividade da α-amilase, ou,
ainda, pelo fato de promoverem a quebra da dormência (KANEKO;
MOROHASHI, 2003; MIYOSHI; MII, 1998).
O cloreto de mercúrio (HgCl2) também é um desinfetante enérgico e tem
sido utilizado com sucesso na assepsia externa de explantes oriundos
do campo. É solúvel em água e, normalmente, usado na concentração
de 0,1% (p/v), por um ou dois minutos. Depois desse tratamento, os
explantes devem ser lavados com água esterilizada abundante antes de
serem inoculados no meio nutritivo. Mesmo assim, em alguns casos,
como em embriões de café, por exemplo, esse produto mostrou-se
tóxico, já que, logo após o tratamento ou depois de inoculados no meio
nutritivo, tornaram-se marrons, o que evidencia intensa oxidação. Um
alerta importante sobre esse produto é o fato de ele ser extremamente
tóxico para o ser humano, por isso precauções devem ser tomadas a
fim de evitar contato do produto com a pele. Além disso, seu descarte
pela pia nunca deve ser feito no laboratório.
No combate à contaminação endógena dos explantes, procedimentos
alternativos na cultura de tecidos também têm sido utilizados, como, por
exemplo, o uso de água quente em bulbos e em gemas axilares de
plantas lenhosas com resultados bastante importantes (LANGENS-
GERRITS et al., 1998). Em outros casos, a assepsia convencional à
base de cloro não apresentou resultados satisfatórios, de forma que foi
necessário lançar mão de fungicidas e de antibióticos. Nesse caso, os
rizomas foram lavados previamente com água de torneira e depois
submetidos a diferentes concentrações e marcas de fungicidas. Em

seguida, ficaram sob agitação por um período de até 48 horas e, depois,
foram transferidos para meios de cultura apropriados. Semelhante
tratamento feito também com antibióticos permitiu contornar
satisfatoriamente a contaminação (KRITZINGER et al., 1998). Com
relação ao fungicida Benlate, a experiência prática também tem sido
satisfatória. Por exemplo, quando nós de mandioca (Manihot esculenta
Crantz) colhidos no campo foram tratados primeiramente com
hipoclorito de sódio 2,0% – depois com Benlate e Claforam 0,1% por 30
minutos – e, em seguida, foram inoculados em meio de cultura, a
contaminação dos explantes foi reduzida.
O uso do Claforam (cefotaxima sódica), um antibiótico de amplo
espectro, tem mostrado bons resultados, além de apresentar como
vantagem adicional o fato de ser mais específico para o metabolismo da
bactéria do que da planta. Assim, observou-se que a quantidade de 100
ppm desse antibiótico foi eficaz para contornar a contaminação
bacteriana e não afetou a germinação nem o crescimento de plântulas
de aipo, de berinjela, de cebola e de tomate (BARRUETO CID;
DURZAN, 2003).
A literatura a respeito de cultura de tecidos oferece um amplo leque de
antibióticos, tais como: sulfato de estreptomicina, timetina, canamicina,
norfloxacina, ciprofloxacino, carbelicilina, rifampicina, tetraciclinas, etc.
Estes podem ser usados separadamente ou em combinações. O
problema principal a respeito desses antibióticos é a dúvida quanto ao
fato de eles serem ou não sistêmicos no tecido da planta. Algumas
experiências realizadas com sulfato de estreptomicina indicam que eles
não são sistêmicos (ROMEIRO, 1995), portanto testes experimentais
são necessários para delimitar melhor sua faixa de ação na cultura de
tecidos.
Embora a contaminação bacteriana seja frequentemente encontrada
nas culturas in vitro, é necessário ter certa precaução para não
confundi-la com leveduras, pois, em ambas, o formato da colônia é
muito parecido (Figura 3).
Figura 3. Leveduras (Saccharomyces boulardii) visualizadas em uma

placa de Petri. Por se tratar de um fungo imperfeito, a colônia é mais
parecida com uma colônia de bactérias do que com a de um fungo
filamentoso, podendo, então, ser confundida com uma contaminação
bacteriana.
A contaminação na cultura de tecidos pode ser o maior obstáculo para o

estabelecimento e a propagação de clones, por isso existe um
verdadeiro arsenal de substâncias para enfrentar o problema. Por
exemplo, o Plant Preservative Mixture (PPM) é um biocida também
listado nesse arsenal. Ele é estável em alta temperatura, no entanto
possui um espectro amplo de componentes (metilisotiazolinona, cloreto
de magnésio, nitrato de magnésio, benzoato de sódio e sorbato de
potássio) que podem afetar o ciclo de Krebs e o transporte da cadeia de
elétrons. Assim, a dosagem e a espécie usadas são questões muito
importantes que precisam ser consideradas (COMPTON; KOCH, 2001).
Outro problema relacionado com o explante é a oxidação fenólica. No

entanto, esse item será abordado mais adiante.
Meio nutritivo
A técnica da micropropagação ocupa um lugar chave na chamada
“segunda revolução verde”, na qual o rearranjo gênico manual (DNA
recombinante) está sendo usado para melhorar a qualidade dos
produtos agrícolas.
Nessa perspectiva, os meios nutritivos e a sua composição operam o
“milagre” da vida, ou seja, a conversão dos explantes em plântulas e
das plântulas em mudas, as quais têm o caráter clonal embutido em sua
natureza e, por isso, possuem caráter de genótipo superior. São muitos
os fatores que estão envolvidos em um protocolo eficiente de
regeneração: tipo de meio básico de cultura, seguido do suplemento de
reguladores de crescimento, concentração de sacarose, iluminação,
explante, etc. (ZHANG et al., 2003). Se o meio nutritivo falhar, ou não
for adequado em virtude de alguns de seus ingredientes, a obtenção de
clones falha. Portanto, o conhecimento a respeito do meio nutritivo é da
máxima importância.
Os ingredientes tradicionais de um meio nutritivo são: compostos
inorgânicos, orgânicos, inertes e complexas substâncias naturais.
Os sais inorgânicos proveem os macronutrientes (cálcio, magnésio,
enxofre, potássio, fósforo e nitrogênio) e os micronutrientes (zinco, ferro,
cobre, manganês, cloro, molibdênio e boro). Outros elementos, como
selênio, níquel e silício, não têm requerimento universal entre as
plantas; por isso, não são considerados essenciais, ou seja, na sua
ausência, as plantas podem crescer e desenvolver-se normalmente.
As plantas são concentradoras naturais de minerais (cálcio, fósforo,
potássio, ferro, etc.) nos seus tecidos, especialmente em seus frutos,
sementes e bulbos. No caso do selênio, por exemplo, existem plantas
indicadoras desse elemento (Astragalus pectinatus), porque crescem
em lugares em que a concentração desse elemento no solo é muito

alta, como é o caso de algumas regiões áridas ou semiáridas
(STADTMAN, 1974).
Em geral, as plantas retiram do solo altas concentrações de elementos
essenciais, por isso a agricultura requer altas doses de adubo. De igual
modo, a cultura de tecidos necessita incluir tais elementos no meio
nutritivo. No caso do bulbo da cebola, por exemplo, a quantidade de
macroelementos e de microelementos extraídos do solo é ilustrativa. As
quantidades de macroelementos extraídos são: 69,7 kg ha-1 de N;
14,50 kg ha-1 de P; 57,09 kg ha-1 de K; 24,67 kg ha-1 de Ca;
4,47 kg ha-1 de Mg. Por sua vez, os microelementos são: 749,23 g ha-1
de Fe; 265,76 g ha-1 de Zn; 150,26 g ha-1 de B; 30,18 g ha-1 de Cu
(VIDIGAL et al., 2002).
A água também forma parte do grupo de inorgânicos, e não poderia ser
diferente já que, como solvente universal, por ter caráter bipolar, ela é
indispensável para dissolver os sais e formar uma solução. É
interessante que, apesar de a água ser um dipolo, não é uma
substância iônica por excelência, visto que se dissocia muito pouco: 1 x
10-7 M. Ou seja, em cada 10 milhões de moléculas de água, uma está
ionizada a 25 oC. No entanto,
pH = - log [ H+] ⇒ - log (1x 10-7)

demonstra que o pH da água pura, em teoria, é 7 (pH = 7), portanto é
neutra. Quando se trata de cultura de tecidos, a água usada não deve
ser retirada diretamente da torneira, porque esta contém muitos sais.
Em vez disso, deve-se utilizar água destilada, ou bidestilada, ou ainda
água deionizada (ultrapura). São necessários alguns cuidados no que
diz respeito ao seu armazenamento, para evitar que ela não reaja com
as paredes do container, portanto esses recipientes devem ser de boa
qualidade, e recipientes de vidro ou plástico comum não devem ser
utilizados para essa finalidade. Nessa mesma linha de raciocínio, deve-
se evitar a carbonatação da água, o que pode acontecer em recipientes
abertos.
Existem várias formulações de meios nutritivos, entre os quais estão: o

meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962); o WPM (LLOYD; McCOWN,
1980); o B5 (GAMBORG et al., 1968); e o SP (BARRUETO CID, 2005).
A escolha de um desses meios, em geral, é baseada na literatura, na
experiência com cada espécie vegetal ou por tentativa e erro. Ademais,
quando se tratar de requerimentos nutricionais específicos, vai
depender da espécie ou do explante. Por exemplo, a germinação do
pólen in vitro poderá incluir boro e cálcio em maior concentração,
enquanto a indução de brotos a partir de um calo poderá exigir menos
nitrato de amônia (PIERIK, 1987). Todavia, nos testes de avaliação de
tolerância de algum genótipo, ambos poderão exigir a presença de NaCl
ou de alumínio (BASU et al., 1997; GANDONOU et al., 2006), o que não
é usual em qualquer meio nutritivo para planta.
A seguir, serão destacados os ingredientes dos meios nutritivos mais
importantes para a cultura de tecidos.
Sacarose
A presença deste tipo de composto é essencial para o crescimento das
plantas, visto que a fotossíntese da planta, ou do explante, é limitada. A
sacarose é um dos carboidratos mais usados na preparação de meios
nutritivos. Sua concentração mais usual varia de 2% a 3%; no entanto,
ocasionalmente, ela pode ser usada em concentrações maiores, de até
6%, como no caso de embriões, na indução de bulbilhos de alho ou na
tuberização em raízes de mandioca. Além disso, a sacarose é
parcialmente hidrolisada na sua passagem pela autoclave em glicose e
em frutose. Nessa reação, o pH, ou ainda o carvão ativado, que
também é frequentemente utilizado, podem ser importantes fatores, e a
glicose ou a frutose raramente são incluídas nos meios. Na autoclave, o
açúcar pode ainda experimentar a reação de Maillard, que dá ao meio
uma coloração amarelo-escura, que varia de intensidade conforme a
magnitude do fenômeno. Trata-se de uma reação entre açúcares e
peptídeos, forçada pela alta temperatura. Do ponto de vista químico,
essa reação é diferente da caramelização, que é outro exemplo de
browning, em que apenas açúcares participam. Essa reação é

altamente complexa, além de ser indesejável na cultura de tecidos. Ela
ocorre quando os açúcares são aquecidos acima de seu ponto de
fusão, o que leva à formação do 5-hidroximetil-furfuralaldeído.
Vitaminas
As vitaminas usadas na cultura de tecidos pertencem ao grupo das
hidrossolúveis ou grupo B. Esse grupo é constituído pelas seguintes
vitaminas: B1 (tiamina), B2 (riboflavina), B6 (piridoxina), ácido
pantotênico, ácido nicotínico (niacina), ácido fólico, ácido ascórbico,
biotina e cobalamina. Desse elenco, a tiamina, o ácido nicotínico e a
piridoxina são encontrados na maioria dos meios nutritivos. A biotina e o
ácido pantotênico, no entanto, são de uso mais restrito.
Em geral, as vitaminas atuam como um fator não proteico dentro de
enzimas, coenzimas, além de serem cruciais para que essas enzimas
possam catalisar reações importantes dentro do metabolismo primário
da célula. Assim, por exemplo, a tiamina atua na descarboxilação de α-
cetoácidos; a piridoxina, na transferência de grupos aminos; o ácido
nicotínico, em reações de óxido-redução; a biotina, na transferência de
CO2; o ácido pantotênico, na transferência de grupos acila, entre outros
(LEHNINGER, 1988).
As vitaminas do grupo das lipossolúveis, tais como as vitaminas A, D, E
e K, não são usadas. Não se tem conhecimento, por exemplo, de que a
vitamina A participe de alguma reação dentro da planta. Ela se origina a
partir dos betacarotenos, os quais são de origem isoprenoide, isto é,
derivados do isopreno, um hidrocarboneto com cinco carbonos
chamado também de 2-metilbutadieno.
As vitaminas E, K e D também são de origem isoprenoide, porém a
vitamina D possui um caráter mais esteroidal. Os esteroides são
moléculas complexas relacionadas ao colesterol.
Pelo fato de as vitaminas serem sintetizadas pela planta, fica a dúvida
em relação a seu requerimento pelo explante. Contudo, do ponto de
vista fisiológico, não há como saber se um explante em particular (raiz,

hipocótilo, etc) teria ou não a capacidade de sintetizar tiamina, ou se
essa capacidade ficaria restrita a outros órgãos que poderiam exportar
esse tipo de metabólito. Por exemplo, a capacidade de produzir tiamina
varia conforme as espécies. Assim, nos frutos, a goiaba-vermelha e a
graviola podem ter muito mais tiamina do que no mamão maduro e na
manga. A inclusão de algumas vitaminas ao meio nutritivo parte dos
seguintes pressupostos: o explante, por definição, é uma parte
separada da planta; e, na planta, a produção de vitaminas é diferente
nos órgãos. Portanto, a inclusão das vitaminas no meio nutritivo torna-
se necessária para nutrir o explante.
Inositol
Este composto orgânico de baixo peso molecular (180 g), e solúvel em
água, é rotineiramente usado na preparação de meios. Em muitos
casos, tem um efeito benéfico e não se conhecem respostas inibitórias
ou essenciais nas concentrações utilizadas (50 mg L-1 a 100 mg L-1).
Hormônios
Os hormônios são biomoléculas produzidas pela planta, cuja finalidade
é induzir respostas fisiológicas, tais como indução de raízes, indução de
brotos, alongamento de entrenós, etc.
A interação do hormônio com a membrana celular está sob intensa
pesquisa, cujo objetivo é conhecer melhor as características do receptor
(números de domínios, tipo de inserção na membrana celular, relação
com a proteína G, ubiquitinação, etc.), bem como canalizar o estímulo
ou o sinal até o núcleo das células-alvo (WOODWARD; BARTEL, 2005).
Nas plantas, existem vários tipos de hormônios, tais como: as auxinas,
as citocininas, as giberélicas, o etileno, o ácido abscísico e o ácido
jasmônico.
De um modo geral, as moléculas que têm seu efeito parecido com o dos
hormônios são denominadas reguladores de crescimento (RC). A
diferença é que os hormônios não são sintéticos, ou seja, são

produzidos pelas plantas. Incluem-se nos RC o Picloram, a
Benzilaminopurina, o TDZ, entre outros.
Os RCs e os hormônios atuam em baixíssimas concentrações, na
ordem de mg (miligramas) ou µM (micromolares), isto é, 10-6 molar.
É oportuno frisar que:
1 molar = 1 mol L-1 = 1 M
1 milimolar = 0,001 mol L-1 = 1 mM
1 micromolar = 0,000001 mol L-1 = 1 µM
(Um mol de qualquer substância orgânica tem o mesmo número de moléculas por
volume.)
Na cultura de tecidos, as auxinas e as citocininas, em formas naturais
ou sintéticas (RC), fazem parte do grupo de hormônios mais
frequentemente usados. As giberélicas são usadas ocasionalmente,
enquanto o etileno e o ácido abscísico são de uso muito raro.
Auxinas
As auxinas, em seu significado etimológico, exprimem a ideia de
crescimento, ou seja, desencadeiam vários processos fisiológicos, entre
os quais está a formação do fruto (PANDOLFINI et al., 2007). Entre as
auxinas hormonais, o ácido 3-indolacético (AIA) é o mais conhecido. Foi
isolado pela primeira vez em 1934 na urina de mulheres grávidas.
Alguns anos depois, na mesma década, foi isolado em leveduras e em
culturas de Rhizopus suinus. Em 1946, foi extraído de grãos de milho
imaturos e, posteriormente, de muitas outras plantas (HOPKINS, 1999).
Na cultura de tecidos, as auxinas são frequentemente usadas na
indução de calos a partir de um explante e no enraizamento a partir de
brotos. São exemplos de auxinas: o AIA (PM 175,2); o ácido
indolbutírico (PM 203,2); o ácido naftalenoacético (PM 186,2); o 2,4-
diclorofenoxiacético (PM 221,0); e o Picloram ou ácido 4-amino-3,5,6-
tricloro-picolínico (PM 241,5). Alguns RCs têm uma posição ambígua,
pois atuam como auxina ou como citocinina. Esse é o caso do

Tidiazuron ou TDZ [1-fenil-3-(1,2,3-tiadiazol-5-il) ureia].
A concentração usada depende da finalidade, que pode ser, por
exemplo, a indução de calo ou o enraizamento. Em geral, na indução de
calos, a concentração é maior, porém isso também depende do tipo de
composto usado. Assim, o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e o
Picloram são mais potentes como auxina que o ácido 3-indolacético
(AIA) e o ácido naftalenoacético (ANA).
A indução de calos em alho foi alcançada por meio de uma mistura de
2,4-D e de Picloram, na ordem de 5 µM cada (BARRUETO CID et al.,
1994). No entanto, em café, o Picloram foi usado sozinho, na ordem de
4 µM (BARRUETO CID et al., 2004). Para o enraizamento de brotos de
eucalipto, utilizaram-se 2,5 µM de ácido indolbutírico (AIB) (BARRUETO
CID, et al., 1999). Todavia, na indução de calos, quando o carvão
ativado estiver presente no meio nutritivo básico, a concentração de
auxina ainda é mais elevada, podendo chegar a 100 mg L-1
(REYNOLDS; MURASHIGE, 1979). Isso ocorre porque o carvão ativado
tem propriedades adsorventes (MOHAMED-YASSEEN, 2001).
As auxinas se comportam como ácidos fracos e não são solúveis em
água, por isso um aspecto importante em relação a elas é a
necessidade de que sejam dissolvidas para serem incorporadas ao
meio. Na prática, elas se dissolvem bem em meio básico (KOH ou
NaOH 0,1 N ou 1,0 N). É recomendável trabalhar com soluções
estoques guardadas no refrigerador e, a partir daí, usá-las para a
preparação do meio básico. Essas soluções estoques devem manter-se
livres de quaisquer impurezas, portanto devem apresentar-se
transparentes e límpidas. O TDZ é um pouco refratário e, uma vez
dissolvido, após alguns dias, volta a cristalizar-se. Por isso, é
recomendável prepará-lo e, em seguida, estocá-lo em freezer,
mantendo-o congelado. O TDZ, embora seja um derivado da ureia,
também pode agir como citocinina.
Citocininas
As citocininas pertencem a um grupo de substâncias que promovem a

divisão celular, e sua origem está relacionada com a adenina.
Historicamente, o descobrimento das citocininas está ligado ao DNA
autoclavado de esperma do arenque. As citocininas na cultura de
tecidos, em geral, são usadas para promover a indução de brotos
adventícios a partir de calos ou para induzir multibrotação a partir de
gemas axilares ou apicais (BARRUETO CID et al., 1994); no entanto,
podem inibir a indução de raízes em plântulas. De um ponto de vista
mais fisiológico, elas inibem a senescência foliar e a dominância apical.
Considerando-se o aspecto químico, as citocininas são compostas por
um anel adenílico e por uma cadeia lateral isoprenoide, a qual se origina
a partir do ácido mevalônico, e, depois, converte para isopentenil
pirofosfato (∆3 -iPP). Este último, por sua vez, converte-se em
dimetilalil-pirofosfato (∆2 -iPP ou DMAP). Existem outras derivações do
∆3 -iPP, a saber: o geranil pirofosfato, que dá origem aos monoterpenos
(mentol); o farnesil pirofosfato, que origina os sesquiterpenos (ác.
abscísico); e o geranilgeranil pirofosfato, que origina os diterpenos
(como giberelinas) ou os tetraterpenos (como carotenoides).
Entre as citocininas naturais, encontram-se a zeatina (ZEA) e o
isopentenil adenina (IPA) ({9R-5’P} IPA) (Figura 4). Entre as citocininas
sintéticas, destacam-se a cinetina (CIN) (6-furfurilaminopurina) e a 6-
benzilaminopurina (BAP). Nesse caso, a cadeia lateral isoprenoide foi
substituída por um anel cíclico de caráter furfural (cinetina) ou
benzênico (6-benzilaminopurina).
Figura 4. Estrutura química das citocininas. (A) ribotil-zeatina; (B) ribotil-

isopenteniladenina.
O sulfato de adenina é um composto púrico com efeito benéfico sobre o

crescimento e desenvolvimento de embriões e de gemas adventícias e
oferece a vantagem de ser solúvel em água. Foi introduzido no campo
da cultura de tecidos no laboratório de Skoog, com o objetivo de induzir
a organogênese a partir de medula de fumo (SKOOG; TSUI, 1948), ou a
embriogênese somática (VIBHA et al., 2009).
O TDZ também pode agir como citocinina, mas ele é um derivado da
ureia. Há relatos que informam a capacidade do TDZ, como citocinina,
para indução de brotos adventícios (BARRUETO CID et al.,1997;
THENGANE et al., 2001).
As citocininas são bases fracas, isto é, podem ser dissolvidas a partir de
ácido clorídrico 1 N ou 0,1 N. Com a aplicação de uma pequena
quantidade desse ácido as citocininas se dissolvem. Em seguida,
completa-se o volume com água. Após transferir a solução do béquer,
onde foi preparada, para um frasco de 50 mL, ela deve ser guardada no
refrigerador, não necessariamente no freezer.
Giberelinas
As giberelinas (AG) são hormônios de natureza diterpenoide (C-20),

originadas do geranilgeranil pirofosfato. Estão relacionadas,
notadamente, com o crescimento caulinar das plantas e com a
produção de a-amilase em sementes de gramíneas.
As giberelinas são um grupo vasto de compostos, que hoje chegam a
uma quantidade de aproximadamente 120. No entanto, na cultura de
tecidos, a mais usada é a AG3 (PM 384,5 g). Mesmo assim, seu uso na
cultura de tecidos é restrito e está relacionado com o alongamento de
brotos (BARRUETO CID, 1999).
Etileno
O etileno (C2H4) é um hormônio de caráter gasoso capaz de influenciar
a morfogênese das plantas em muitos aspectos (KUMAR et al., 1998).
Não é frequentemente usado na cultura de tecidos, porém pode ser
produzido pelo explante.
No tecido, pode promover efeitos indesejáveis, tais como: oxidação
fenólica, queda foliar, hiperhidricidade (vitrificação). Portanto, afeta
negativamente as duas maiores vias de regeneração de plantas: a
organogênese e a embriogênese somática. Contudo, o etileno também
pode favorecer esse tipo de morfogênese (HATANAKA et al., 1995;
KUMAR et al., 1998).
O metabolismo e a fisiologia do etileno foram desenvolvidos tanto a
partir das pesquisas relacionadas com duas enzimas de sua rota
metabólica – a ACC sintase e a ACC oxidase (MCKEON et al., 1995) –
quanto com o uso de inibidores de sua síntese, tais como: a aminoetoxi-
vinil-glicina (AVG), o ácido salicílico, o cloreto de cobalto (CoCl2), etc.;
além de inibidores de sua ação, tais como: o nitrato de prata (AgNO3), o
tiossulfato de prata (Ag2S2O3), o CO2 e o 2,5-norbornadieno. Essas
pesquisas visavam melhorar a performance da regeneração, como em
Brassica campestri (CHI; PUA, 1989). Por sua vez, o uso de cefotaxima,
de cefalosporina e de inibidores do etileno melhorou o potencial
regenerativo de calos de Pennisetum americanum (PIUS et al., 1993).
Nessa mesma linha de trabalho, é oportuno mencionar o incremento da

regeneração de plântulas por inibição da ACC oxidase, por meio da
construção antisense em plantas transgênicas de Brassica juncea
(PUA; LEE, 1995), por meio da qual foi possível verificar o papel
regulatório do etileno na organogênese.
Finalmente, é bom lembrar que as auxinas, em geral, têm a propriedade
de induzir síntese de etileno em muitas espécies. Em cultura de tecidos,
usam-se frequentemente auxinas na fase de indução de calos, porém é
bom ter em mente que elas poderão estimular a síntese de etileno e,
com isso, oxidar o explante ou o calo ou, até mesmo, inibir a
embriogênese somática, fato que ocorreu em Daucus carota, por meio
do uso de ethefon (TISSERAT; MURASHIGE, 1977).
O ethefon, ou ácido 2-cloroetilfosfônico, é um composto que, em pH
alcalino, libera etileno. Em escala comercial, por exemplo, é usado
pelos produtores de abacaxi (Ananas comosus) para antecipar e
uniformizar a floração. Na seringueira (Hevea brasiliensis), o ethefon é
utilizado para aumentar a produção de látex.
Ácido abscísico (AAB)

O ácido abscísico (AAB) é um sesquiterpeno (C15) que, nas plantas em
geral, está relacionado à dormência, ao estresse hídrico, ao fechamento
de estômatos, etc. Dessa forma, cumpre muitas funções na planta
(HIRAYAMA; SHINOZAKI, 2007; SEO; KOSHIBA, 2002). No entanto, na
cultura de tecidos, não tem sido usado frequentemente como hormônio
vegetal. Ao ser utilizado dessa forma, observa-se um efeito importante
na fase embrionária, o que impede tanto a germinação precoce de
embriões zigóticos (NAIDU; SREENIVASAN, 2004) quanto a
embriogênese somática (LEMUS, 2005), e, ainda, a poliembriogênese
(DURZAN et al., 1994).
Brassinosteroides (BRs)
Os brassinosteroides, ou brassinas, são hormônios vegetais de mesma
natureza dos fitoesteroides polioxigenados e são dotados de atividade
reguladora de crescimento vegetal (ZULLO; ADAM, 2002). Entre esses

fitoesteroides, cabe mencionar o sitosterol e o campesterol, os quais
foram descobertos, nas décadas de 1970 e de 1980, no pólen de
algumas plantas, como por exemplo, da espécie Brassica napus. Os
BRs caracterizam-se por sua capacidade de promover alongamento no
eixo caulinar da planta e promover a formação de traqueídes, por
exemplo, neste caso, em Zinnia elegans sob condições in vitro.
A partir da técnica de isolamento e de purificação, descobriram-se
brassinas em muitas famílias de plantas, entre as quais as crucíferas,
as leguminosas, as fagáceas, as rutáceas, etc. Sua presença já foi
verificada em 27 famílias de plantas superiores (SASSE, 2003).
Em geral, os efeitos das brassinas não têm sido muito relatados na
cultura de tecidos, porém alguns esparsos trabalhos que mostram
estimular a regeneração têm sido publicados (LU et al., 2003; SASAKI,
2002).
Triacontanol
Outro composto de caráter hormonal, mencionado com pouca
frequência na cultura de tecidos é o triacontanol (TRIA). Tal composto é
um álcool de 30 carbonos {CH3 (CH2)28 CH2OH} e é um componente
natural da cutícula de alfafa e de outras plantas. Algumas publicações
relatam umh efeito positivo na regeneração de plantas in vitro (REDDY
et al., 2002; TANTOS et al., 2001).
Ácido jasmônico
O ácido jasmônico, seu metil-éster e derivados estão amplamente
distribuídos no reino vegetal. São sintetizados a partir do ácido
linolênico e desempenham papéis importantes no desenvolvimento das
plantas e nas respostas destas aos estresses ambientais (PEÑA
CORTÉS, 2000). O uso desses compostos não tem sido
frequentemente relatado na literatura sobre cultura de tecidos. Seu
efeito parece mais indireto sobre a organogênese, porém apresenta
uma ação mais direta sobre a produção de metabólitos secundários,
como o diterpenoide paclitaxel (taxol), ou em calos induzidos por

Picloram (FURMANOWA et al., 1997).
Misturas complexas
Com respeito a outros ingredientes que podem estar presentes no meio
nutritivo, vale a pena mencionar alguns de estrutura complexa, tais
como o hidrolisado de caseína, (50 mg L-1 a 500 mg L-1), a água de
coco (5% a 20% v/v), o extrato de malte (400 mg L-1 a 500 mg L-1), o
extrato de levedura (100 mg L-1 a 500 mg L-1) e a banana passada no
liquificador (10% a 50% v/v), etc. Alguns, como a água do fruto do
coqueiro, podem ser esterilizados por filtração e depois adicionados ao
meio já autoclavado. Esse tipo de ingrediente, com quantidade e
composição não conhecidas (aminoácidos, sais, vitaminas, elementos
minerais, etc.), é usado para complementar os meios nutritivos normais
quando estes falham em produzir os resultados esperados.
Ágar
O ágar é um polissacarídeo de alto peso molecular usado na cultura de
tecidos para dar suporte a explantes e a plantas mantidas in vitro. O
ágar oferece a vantagem de ser solúvel em água, além de fundir-se a
100 oC e de permanecer semissólido à temperatura ambiente. Ademais,
é um produto relativamente inerte e pode conter impurezas orgânicas e
inorgânicas, entre as quais estão o sódio e o cloro (SCHOLTEN;
PIERIK, 1998). Por isso, às vezes é necessário lavá-lo com água antes
de utilizá-lo.
Pode ser usado numa faixa de concentração que varia de 0,5% a 0,7%,
embora, na faixa de 0,5% a 0,6%, o explante acomode-se melhor.
Também existem registros de uso em concentrações mais altas, como
1,1%, com o objetivo de evitar vitrificação do material. Nesse caso,
porém, a regeneração foi afetada (DEBERGH, 1983).
A concentração tem sua importância porque, em níveis mais altos, ela
pode afetar a disponibilidade e a difusão dos ingredientes. Além disso,
existe a possibilidade de ocorrer um efeito osmótico. O pH é um fator

que pode afetar a estabilidade do ágar gelificado. Em valores de 4 ou
abaixo de 4, sua solidificação é dificultada, ou impossibilitada.
O ágar pode ser substituído pelo Gelrite, que é um polissacarídeo obtido
de bactérias, altamente puro e transparente quando solidificado. Sua
consistência (gel strength) no meio de cultura está relacionada à
concentração de cátions, como cálcio e magnésio. A faixa de
concentração a ser usada na preparação de meios pode variar de
0,15% a 0,25%.
Uma alternativa para o uso de agentes gelificantes, como o ágar e o
Gelrite, são as pontes de papel ou suportes de espuma de plástico,
usados em meios líquidos; embora o uso de amido de milho também
tenha sido relatado (BARRUETO CID et al., 1994).
Carvão ativado (CA)

O carvão ativado tem sido incorporado ao meio nutritivo para melhorar o
crescimento ou promover a organogênese de uma ampla variedade de
espécies (PAN; STADEN, 1998). Seu efeito tem sido atribuído à sua
capacidade de adsorção de substâncias inibidoras liberadas pelo tecido
(fenóis) e pelo meio (5-hidroximetilfurfural), após sua passagem pela
autoclave. Contudo, nessa adsorção, vitaminas e hormônios também
pode ser retidos. Como já foi mencionado no item que trata das auxinas,
íons como cobre e zinco também podem ser retidos em alta proporção
(WINKLE et al., 2003). Outro detalhe prático é que, durante a
autoclavagem, o CA pode estimular a hidrólise da sacarose e promover
a formação de glicose e de frutose, mas esse fenômeno ocorre mais
frequentemente em concentrações mais altas de carvão (DRUART;
WULF, 1993). Contudo, há indicações de que o pH do meio seja um
fator decisivo nessa hidrólise, já que, em meios tamponados (pH = 5,5,
por exemplo), tal hidrólise foi reduzida (WANN et al., 1997). No entanto,
a realidade é que, nos laboratórios, os meios tamponados são
raramente usados. Uma das razões para isso é a presença dos
componentes adicionais que entram na composição desses tampões.
Normalmente, a concentração de CA varia de 0,1% a 0,3%, e é

adicionado ao meio cujo pH foi previamente ajustado para 5,7 ou 5,8.
Depois de o meio ser autoclavado, é conveniente agitar os tubos ou
frascos que contêm o CA para que haja uma melhor distribuição.
Embora, às vezes, essa prática não seja realizada, não tem sido
observado efeito negativo no crescimento do material.
Pelo fato de o CA possuir distintas fontes de origem (madeira, casca de
coco, etc.), alguns laboratórios, às vezes, costumam tratá-los com água
deionizada antes que seja adicionado ao meio. Esse procedimento visa
reduzir possíveis componentes inibitórios.
Luz
Em um laboratório de cultura de tecidos, é necessário cuidar da energia
radiante para promover um bom desenvolvimento de culturas in vitro.
Em relação à luz, existem três características principais que devem ser
observadas: fotoperíodo, irradiância e composição espectral. O
fotoperíodo necessita ser previamente ajustado para 12/12, 14/10 ou
16/8 (relação de horas de luz/escuro) (MORINI et al., 1991).
Normalmente, os tubos fluorescentes comuns são usados como fontes
luminosas. Eles são mais eficientes que as lâmpadas incandescentes,
embora sejam mais caros. Além disso, as lâmpadas fluorescentes
perdem menos energia na forma de calor.
É necessário colocar de três a cinco lâmpadas no teto das prateleiras
dos armários metálicos que são usados. O vão entre as prateleiras deve
ser de aproximadamente 50 cm. Nessas condições, geralmente a
irradiância no nível das placas ou tubos de ensaio é de
aproximadamente 30 µmol m-2 s-1. Essa é uma quantidade de energia
suficiente para os requerimentos normais de carbono das plantas, já
que a outra parte é complementada pela sacarose do meio nutritivo. A
energia que é emitida nessa irradiância deve conter radiação
fotossinteticamente ativa (PAR, em inglês), correspondente à faixa de

400 nm a 700 nm (nanômetros), que são os comprimentos mais efetivos
para a fotossíntese.
A questão da composição espectral está relacionada à característica
dos tubos fluorescentes que serão usados, ou seja, de sódio ou de
mercúrio. A descarga elétrica, em síntese, passa através das partículas
de vapor que estão dentro dos tubos e causam emissão de luz branca
com predominância de algum tipo de comprimento de onda: alaranjada,
no caso do sódio, e azulada, no caso do mercúrio.
A luz é uma forma de energia radiante e resulta da superposição de
campos magnéticos elétricos que se propagam como ondas ou como
“partículas” ou fótons. Os fótons têm diferentes valores de energia.
Assim, os fótons da região ultravioleta são mais energéticos que os da
região vermelha (Tabela 1). Um mol de fótons de qualquer comprimento
de onda tem 6,023 x1023 fótons.
Tabela 1. Comparação entre o conteúdo energético de três

comprimentos de ondas.
Comprimento de onda (λ) Energia (KJ mol-1)
UV (280 nm) 471
Azul (425 nm) 274
Vermelho (640 nm) 181
Para fins de cultura de tecidos, as unidades de iluminação lux e foot-

candles1 são atualmente pouco utilizadas. Prefere-se usar medidas de
energia como a irradiância, por exemplo, pelo fato de ser uma unidade
que se relaciona mais com a energia que com a sensibilidade do olho
humano.
A irradiância expressa a ideia de energia incidindo sobre uma superfície.
Suas unidades são W m-2 e Joule m-2 s-1, e ambas são equivalentes,
embora a segunda inclua a dimensão de tempo. Para essa finalidade,

não é aconselhável o uso das unidades de energia erg ou caloria.
A irradiância também pode ser expressa em termos de moles de fótons
por metro quadrado por segundo (mol m-2s-1), que também recebe o
nome de Einstein m-2 s-1. Um Einstein representa uma quantidade
muito grande de fótons (6,0 x1023), por isso utiliza-se o µEinstein ou
µmol m-2 s-1.
Embora a intensidade luminosa e a irradiância sejam, às vezes,
consideradas equivalentes, elas representam conceitos distintos.
A intensidade exprime a ideia de emissão luminosa de uma fonte, e não
necessariamente o fluxo de fótons ou a densidade de fótons
fotossinteticamente importantes para a planta (PAR).
Para se ter uma ideia dos valores da irradiância, basta lembrar que, no
topo da atmosfera, ou seja, onde não há nuvens, há aproximadamente
1.400 J m-2 s-1 ou W m-2 e 2.000 µE m-2 s-1. No entanto, depois que a
luz atravessa as nuvens, esse valor pode cair para aproximadamente
400 µEm-2s-1.
Com respeito ao laboratório, é conveniente conhecer a irradiância das
lâmpadas, tanto por uma questão do ponto de compensação luminosa
quanto para evitar aquecimento. Contudo, conforme já foi mencionado
anteriormente, aproximadamente 30 ± 10 µmoles m-2 s-1 podem ser
apropriados. Para evitar aquecimento da sala pelos reatores das
lâmpadas é conveniente colocá-los fora da sala de cultura.
Com respeito aos efeitos da composição espectral sobre a
morfogênese, os resultados têm sido variados. A luz da região azul
pode estimular um tipo de organogênese (raiz/brotos) e a luz vermelha,
outro.
Temperatura
A temperatura é um fator ambiental que regula o crescimento das

plantas. Esse controle ocorre de diferentes maneiras e depende do tipo
de planta, ou seja, se ela é de clima temperado ou tropical. No entanto,
no que diz respeito às culturas in vitro, essas diferenças são
minimizadas, pois as condições experimentais são padronizadas nos
laboratórios.
No laboratório de cultura de tecidos, é conveniente que a temperatura
seja mantida o mais estável possível. Em geral, a faixa de temperatura
a ser usada pode variar entre 23 °C e 27 °C, portanto é necessário
dispor de um sistema de refrigeração com controle automático de
temperatura, justamente para reduzir ao mínimo essas variações de
temperatura entre o dia e a noite. Ademais, embora não seja frequente,
existem laboratórios que usam temperaturas diferentes durante o dia e
a noite: 26 °C e 20 °C, respectivamente.
A uniformidade da temperatura dentro da sala de cultura constitui um
dos princípios básicos da experimentação – o controle local –, que
garante um tratamento térmico semelhante ao do material dentro das
unidades experimentais ou das parcelas durante a experimentação,
visando sua maior precisão. O controle local não somente deve ficar
restrito à temperatura senão também à irradiância nas prateleiras. Os
outros dois princípios básicos da experimentação são a repetição e a
casualização.
Referências
BARRUETO CID, L. P. El cultivo de tejidos. In: PRIETO, H.; JORDAN, M.; BARRUETO CID,
L. P.; CORDEIRO, M. C. R.; DURZAN, D. J. Biotecnologia vegetal. Santiago-Chile: Inia,
2005. p. 35.
BARRUETO CID, L. P.; CRUZ, A. R. R.; CASTRO, L. H. R. Somatic embriogenesis from

three coffee cultivars: ’Rubi’, Catuaí vermelho 81, and ‘IAPAR 59’. HortScience, Alexandria,
v. 39, n. 1, p. 130-131, 2004.
BARRUETO CID, L. P.; DURZAN, D. J. Efeito da cefotaxima na germinação,

crescimento e brotação de gemas axilares, sob condições in vitro. Brasília-DF:
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2003. 17 p. (Boletim de Pesquisa e
Desenvolvimento, 49).
BARRUETO CID, L. P.; GOMES, A. C. M.; COSTA, S. B. R.; TEIXEIRA, J. B.

Micropropagation of Miconia sp, a Woody Melastomacea from Brazil, using thidiazuron as
plant growth regulator. Brazilian Journal of Plant Physiology, Piracicaba, v. 9, n. 1, p. 21-
25,1997
BARRUETO CID, L. P.; ILLG, R. D.; PIEDRABUENA, A. E. Regeneration of garlic plants

(Allium sativum L., cv “Chonan”) via cell culture in liquid medium. In Vitro-Plant, [New York],
v. 30, p. 150-155,1994.
BARRUETO CID, L. P.; MACHADO, A. M. G.; CARVALHEIRA, S. B. R. C.; BRASILEIRO, A.

C. M. Plant regeneration from seedling explants of Eucalyptus grandis x E.urophylla. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture, The Hague, v. 56, p. 17-23,1999.
BASU, S.; GANGOPADHYAY, G.; MUKHERJEE, B. B.; GUPTA, S. Plant regeneration of salt
adapted callus of indica rice (var. Basmati 370) in saline conditions. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture, The Hague, v. 50, p. 153-159, 1997.
BAVARESCO, L.; WALKER, M. A. Techniques for successfully establishing Xiphinema index

in dual culture with grape. American journal of enology and viticulture, Davis, v. 45, n. 3,
p. 273-277,1994.
CHI,G. L.; PUA, E. C. Ethylene inhibitors enhanced de novo shoot regeneration from
cotyledons of Brassica campestris ssp. Chinensis (Chinese cabbage) in vitro. Plant
Science, Limerick, v. 64, p. 243-250, 1989.
COMPTON, M. E.; KOCH, J. M. Influence of plant preservative mixture (PPM)TM on

adventitious organogenesis in melon, petunia, and tobacco. In Vitro-Plant, [New York], v.
37, p. 259-261, 2001.
DEBERGH, P. C. Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium.
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 59, p. 270-276, 1983.
DHAR, U.; JOHSI, M. Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea
obvallata (DC.) Edgew (Asteraceae): effect of explant type, age, and plant growth
regulators. Plant Cell Reports, New York, v. 24, p. 195-200, 2005.
DRUART, P.; WULF, O. de. Activated charcoal catalyses sucrose hydrolysis during
autoclaving. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, The Hague, v. 32, p. 97-99,1993.
DURZAN, D. J.; JOKINEN, K.; GUERRA, M. P.; SANTERRE, A.; CHALUPA, V.; HAVEL, L.
Latent diploid partenogénesis and parthenote clevage in egg-equivalents of norway spruce.
International Journal of Plant Science, Chicago, v. 155, p. 677-688, 1994.
FURMANOWA, M.; GLOWNIAK, K.; BARANEK, K. S. Effect of picloram and methyl

jasmonate on growth and taxane accumulation in callus culture of Taxus x media var.
Hatfieldii. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, The Hague, v. 49, p. 75-79, 1997.
GAMBORG, O. L.; MILLER, R. A.; OJIMA, K. Nutrient requirements of suspension of
soybean root cells. Experimental Cell Research, New York, v. 50, p. 151-158, 1968.
GANDONOU, C. B.; ERRABII, T.; ABRINI, J.; IDAOMAR, M.; SENHAJI, N. S. Selection of
callus cultures of sugarcane (Saccharum sp.) tolerant to NaCl and their response to salt
stress. Plant Cell, Tissue Organ Culture, The Hague, v. 87, p. 9-16, 2006.
GOVIL, S; GUPTA, S. C. Commercialization of plant tissue culture in Índia. Plant Cell,

Tissue and Organ Culture, The Hague, v. 51, p. 65-73, 1997.
HATANAKA, T.; SAWABE, E.; AZUMA, T.; UCHIDA, N.; YASUDA, T. The role of ethylene in
somatic embryogenesis from leaf discs of Coffea canephora. Plant Science, Limerick, v.
107, p. 199-204, 1995.
HIRAYAMA, T.; SHINOZAKI, K. Perception and transduction of abscisic acid signals: keys to
the function of the versatile plant hormone ABA. TRENDS in Plant Science, Oxford, v. 8, p.
343-351,2007.
HOPKINS, W. G. Introduction to plant physiology. 2nd. ed. New York: John Wiley, 1999.
p. 311.
KANEKO, K; MOROHASHI, Y. Effect of sodium hypochlorite treatment on the development

of α-amylase activity in mung bean cotyledons. Plant Science, Limerick, v. 164, p. 287-
2ww92, 2003.
KRITZINGER, E. M.; VUUREN, R. J. van; WOODWARD, B.; RONG, I. H.; SPREETH, M.

H.; SLABBERT, M. M. Elimination of external and internal contaminants in rhizomes of
Zantedeschia aethiopica with commercial fungicides and antibiotics. Plant Cell, Tissue and
KUMAR, P. P.; LAKSHMANAN, P.; THORPE, T. Regulation of morphogenesis in plant tissue

culture by ethylene. In Vitro-Plant, [New York], v. 34, p. 4-103, 1998.
LANGENS-GERRITS, M.; ALBERTS, M.; KLERK, G. J. de. Hot-water treatment before

tissue culture reduces initial contamination in Lilium and Acer. Plant Cell, Tissue and
LEHNINGER, A. Princípios de bioquímica. São Paulo: Sarvier, 1988. 725 p.
LEMUS, E. E. P. Ácido abscísico em plantas superiores: síntese e propriedades fisiológicas.

In: BARRUETO CID, L. P. (Ed.). Hormônios vegetais em plantas superiores. Brasília,
DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2005. p. 167-188.
LIU, W.; CHEN, X.; LIU, G. Interspecific hybridization of Prunus persica with P. armericana
and P. salicina using embryo recue. Plant Cell, Tissue Organ Culture, The Hague, v. 88, p.
289-299, 2007.
LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially-feasible micropropagation of Moutain Laurel,

/Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. Proceedings of the International Plant
Propagators, Ashville, v. 30, p. 421-427, 1980.
LU, Z.; HUANG, M.; GE, D. P.; YANG, Y. H.; CAI, X. N.; QIN, P.; SHE, J. M. Effect of
brassinolide on callus growth and regeneration in Spartina patens (Poaceae). Plant Cell,
Tissue and Organ Culture, The Hague, v. 73,
p. 87-89, 2003.
MCKEON, T. A.; FERNANDEZ MACULET, J. C.; YANG, S. F. Biosynthesis and metabolism

of ethylene. In: DAVIS, P. J. (Ed.). Plant hormones. Dordrecht: Kluwer Academic
Publishers, 1995. p. 118-139.
MIYOSHI, K.; MII, M. Stimulatory effects of sodium and calcium hypochlorite, pre-chilling
and cytokinins on the germination of Cypripedium macranthos seed in vitro. Physiologia
Plantarum, Copenhagen, v. 102, p. 481-486, 1998.
MOHAMED-YASSEEN, Y. Influence of agar and activated charcoal on uptake of gibberellins

and plant morphogenesis in vitro. In Vitro-Plant, [New York], v. 37, p. 204-205, 2001.
MORINI, S.; MARZIALETTI, P.; BABUIERE, C. In vitro growth response of Prunnus

cerasifera shoots as influenced by different light-dark cycles and sucrose concentrations.
Plant Cell, Tissue Organ Culture, The Hague, v. 28, p. 245-248, 1991.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossays with tobacco
tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p. 473-497, 1962.
NAIDU, M. M.; SREENIVASAN, C. S. Effect of abscisic acid and cytokinins on cultured

zygotic embryos of Coffea Arabica cv. Cauvery (Catimor). Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, The Hague, v. 79, p. 279-284, 2004.
PAN, M. J.; STADEN, J. V. The use of charcoal in in vitro cultura- A review. Plant Growth
Regulation, The Hague, v. 26, p. 155-163, 1998.
PANDOLFINI, T.; MOLESINI, B.; SPENA, A. Molecular dissection of the role of auxin in fruit
initiation. TRENDS in Plant Science, Oxford, v. 12, n. 8, p. 237-238, 2007.
PEÑA CORTÉS, H. Ácido jasmônico. In: BARRUETO CID, L. P. (Ed.) Introdução aos
hormônios vegetais. Brasília, DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2000. p.
151-179.
PIERIK, R. L. M. In vitro culture of higher plants. Dordrecht: Martinus Nijhoff Publishers,

1987. 344 p.
PIUS, J.; GEORGE, L.; EAPEN, S.; RAO, P. S. Enhance plant regeneration in pearl millet
(Pennisetum americanum) by ethylene inhibitors and cefotaxime. Plant Cell, Tissue and
PUA, E-CH; LEE, J. E. E. Enhanced de novo shoot morphogenesis in vitro by expression of

antisense 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase gene in transgenic mustard plants.
Planta, New York, v. 196, p. 69-76, 1995.
REDDY, B. O.; GIRIDHAR, P.; RAVISHANKAR, G. A. The effect of triacontanol on

micropropagation of Capsicum frutescens and Decalepis hamiltonii W & A. Plant cell,
Tissue and Organ Culture, The Hague, v. 71, p. 253-258, 2002.
REYNOLDS, J. F.; MURASHIGE, T. Asexual embryogenesis in callus cultures of palm. In
Vitro-Plant, [New York], v. 15, p. 383-387, 1979.
ROMEIRO, R. da S. Antibióticos. In: ROMEIRO, R. da S. Bactérias fitopatogênicas.

Viçosa: UFV, 1995. p. 197-211.
SASAKI, H. Brassinolide promotes adventitious shoot regeneration from cauliflower

hypocotyls segments. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, The Haggue, v. 71, p. 111-
116, 2002.
SASSE, J. M. Physiological actions of brassinosteroids: and update. Journal of Plant

Growth Regulation, Berlin, v. 22, p. 276-288, 2003.
SCHOLTEN, H. J.; PIERIK, R. L. M. Agar as a gelling: chemical and physical analysis. Plant
Cell Reports, New York, v. 17, p. 230-235, 1998.
SEO, M.; KOSHIBA, T. Complex regulation of ABA biosynthesis in plants. TRENDS in Plant
Science, Oxford, v. 7, n. 1, p. 41-48, 2002.
SKOOG, F.; TSUI, C. Chemical control of growth and bud formation in tobacco stem
segments and callus cultured in vitro. American Journal of Botany, Bronx, v. 35, p. 782-
787, 1948.
STADTMAN, T. C. Selenium Biochemestry. Science, Washington, v. 183, p. 915-921,1974.
TANTOS, Á.; MÉSZÁROS, A.; FARKAS, T.; SZALAI,J.; HORVÁTH,G. Triacontanol-

supported micropropagation of woody plants. Plant cell Reports, New York, v. 20, p. 16-21,
2001.
THENGANE, S. R; KULKARNI, D. K.; SHRIKHANDE, V. A.; KRISHNAMURTHY, K. V. Effect

of thidiazuron on adventitious shoot regeneration from seedling explants of Nothapodytes
foetida. In Vitro-Plant, New York, v. 37, p. 206-207, 2001
TISSERAT, B.; MURASHIGE, T. Effects of ethefon, ethylene, and 2,4-diclorophenoxyacetic

acid on asexual embryogenesis in vitro. Plant Physiology, Bethesda, v. 60, p. 437-439,
1977.
VALOIS, A. C. C.; SALOMÃO, A. N.; ALLEM, A. C. Glossário de recursos genéticos

vegetais. Brasília, DF: Embrapa-SIP, 1996. 62 p.
VASIL, V.; HILDEBRANDT, A. C. Differentiation of tobacco plants from single, isolated cells
in microcultures. Science, Washington, v. 150,
p. 889-892, 1965.
VIBHA, J. B.; CHOUDHARY, K.; SINGH, M.; RATHORE, M. S.; SHEKHAWAT, N. S. An

efficient somatic embryogenesis system for velvet bean [Mucuna pruriens (L.) DC.]: a
source of anti Parkinson’s drug. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, The Hague, v. 99,
n. 3, p. 319-325, 2009.
VIDIGAL, S. M. ; PEREIRA, P. R. G.; PACHECO, D. D. Nutrição mineral e adubação da

cebola. Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v. 23, p. 36-50, 2002.
WANN, S. R.; ROBERT, L.; KAPHAMMER, J. Activated charcoal does not catalyze sucrose
hydrolysis in tissue culture media during autoclaving. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, The Haggue, v. 50, p. 221-224,1997.
WINKELMANN, T.; GEIER, T. Commercial in vitro plant production in Germany in 1985-

2004. Plant Cell, Tissue Organ Culture, The Haggue, v. 86, p. 319-327,2006.
WINKLE, S. C. van; JOHNSON, S.; PULLMAN, G. S. The impact of gelrite and activated
carbon on the elemental composition of two conifer embryogenic tissue initiation media.
Plant Cell Reports, New York, v. 21, p. 1175-1182, 2003.
WOODWARD, A. D.; BARTEL, B. Auxin: regulation, action and interaction. Annals of

Botanic, London, v. 95, p. 707-735, 2005.
ZHANG, L.; XU, T.; SUN, X.; ZHANG, H.; TANG, T.; TANG, K. Factors influencing shoot
regeneration from cotyledons of tetraploid Isatis indigotica F. In Vitro-Plant, New York, v. 39,
p. 459-462, 2003.
ZULLO, M. A. T.; ADAM, G. Brassinosteroid phythormones-structure, bioactivity and

applicatios. Brazilian Journal of Plant Physiology, Campinas, v. 14, p. 143-181, 2002.

Cultura de Células

Загружено:

Сведения о документе

Оригинальное название

Авторское право

Доступные форматы

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Доступные форматы

Cultura de Células

Загружено:

Авторское право:

Доступные форматы

IMPRESSO POR: Débora Jacomini <debora_jacomini@hotmail.com>. A impressão é apenas para uso pessoal e privado.

Explante, meio nutritivo, luz e

Do ponto de vista biológico, os organismos vivos reprodu​zem-se sexual

muitas vezes carregam uma herança indesejável que deve ser

técnica, permite o aumento da produção e causa menos danos

Nem todos os explantes reagem da mesma forma a uma determinada

Figura 1. Sementes de orquídea (Oncidium phimatochilum) submetidas

O trabalho com embriões tem dado origem a uma linha importante de

antissépticas do cloro (água de cloro) como profilático, para reduzir a

Em sua aplicação prática, o delineamento experimental do uso do

Figura 2. Estacas de café oriundas de casa de vegetação, submetidas à

Em geral, por serem oxidantes enérgicos, além de facilmente

submetidos a diferentes concentrações e marcas de fungicidas. Em

Figura 3. Leveduras (Saccharomyces boulardii) visualizadas em uma

A contaminação na cultura de tecidos pode ser o maior obstáculo para o

Outro problema relacionado com o explante é a oxidação fenólica. No

em lugares em que a concentração desse elemento no solo é muito

pH = - log [ H+] ⇒ - log (1x 10-7)

Existem várias formulações de meios nutritivos, entre os quais estão: o

browning, em que apenas açúcares participam. Essa reação é

vista fisiológico, não há como saber se um explante em particular (raiz,

diferença é que os hormônios não são sintéticos, ou seja, são

pois atuam como auxina ou como citocinina. Esse é o caso do

As citocininas pertencem a um grupo de substâncias que promovem a

Figura 4. Estrutura química das citocininas. (A) ribotil-zeatina; (B) ribotil-

O sulfato de adenina é um composto púrico com efeito benéfico sobre o

As giberelinas (AG) são hormônios de natureza diterpenoide (C-20),

Nessa mesma linha de trabalho, é oportuno mencionar o incremento da

Ácido abscísico (AAB)

reguladora de crescimento vegetal (ZULLO; ADAM, 2002). Entre esses

como o diterpenoide paclitaxel (taxol), ou em calos induzidos por

existe a possibilidade de ocorrer um efeito osmótico. O pH é um fator

Carvão ativado (CA)

Normalmente, a concentração de CA varia de 0,1% a 0,3%, e é

fotossinteticamente ativa (PAR, em inglês), correspondente à faixa de

Tabela 1. Comparação entre o conteúdo energético de três

Comprimento de onda (λ) Energia (KJ mol-1)

UV (280 nm) 471

Azul (425 nm) 274

Vermelho (640 nm) 181

Para fins de cultura de tecidos, as unidades de iluminação lux e foot-

embora a segunda inclua a dimensão de tempo. Para essa finalidade,

A temperatura é um fator ambiental que regula o crescimento das

BARRUETO CID, L. P.; CRUZ, A. R. R.; CASTRO, L. H. R. Somatic embriogenesis from

BARRUETO CID, L. P.; DURZAN, D. J. Efeito da cefotaxima na germinação,

BARRUETO CID, L. P.; GOMES, A. C. M.; COSTA, S. B. R.; TEIXEIRA, J. B.

BARRUETO CID, L. P.; ILLG, R. D.; PIEDRABUENA, A. E. Regeneration of garlic plants

BARRUETO CID, L. P.; MACHADO, A. M. G.; CARVALHEIRA, S. B. R. C.; BRASILEIRO, A.

BAVARESCO, L.; WALKER, M. A. Techniques for successfully establishing Xiphinema index

COMPTON, M. E.; KOCH, J. M. Influence of plant preservative mixture (PPM)TM on

FURMANOWA, M.; GLOWNIAK, K.; BARANEK, K. S. Effect of picloram and methyl

GOVIL, S; GUPTA, S. C. Commercialization of plant tissue culture in Índia. Plant Cell,

KANEKO, K; MOROHASHI, Y. Effect of sodium hypochlorite treatment on the development

KRITZINGER, E. M.; VUUREN, R. J. van; WOODWARD, B.; RONG, I. H.; SPREETH, M.

KUMAR, P. P.; LAKSHMANAN, P.; THORPE, T. Regulation of morphogenesis in plant tissue

LANGENS-GERRITS, M.; ALBERTS, M.; KLERK, G. J. de. Hot-water treatment before

LEHNINGER, A. Princípios de bioquímica. São Paulo: Sarvier, 1988. 725 p.

LEMUS, E. E. P. Ácido abscísico em plantas superiores: síntese e propriedades fisiológicas.

LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially-feasible micropropagation of Moutain Laurel,

MCKEON, T. A.; FERNANDEZ MACULET, J. C.; YANG, S. F. Biosynthesis and metabolism

MOHAMED-YASSEEN, Y. Influence of agar and activated charcoal on uptake of gibberellins

MORINI, S.; MARZIALETTI, P.; BABUIERE, C. In vitro growth response of Prunnus

NAIDU, M. M.; SREENIVASAN, C. S. Effect of abscisic acid and cytokinins on cultured

Do ponto de vista biológico, os organismos vivos reproduzem-se sexual