Agar kliger

Permite un diagnóstico rápido orientativo del tipo de enterobacteria aislado. Las

enterobacterias mas patógenas no suelen fermentar (producir ácidos de) la lactosa. Se
detecta la producción de ácidos (acompañada o no del desprendimiento de gases) de
glucosa o lactosa y producción de SH2

Sim medio

SIM Medium es un medio diferencial utilizado en la confirmación presuntiva de miembros de la

familia Enterobacteriaceaea, a partir de cultivos puros, en base a la capacidad de producción de
SH2 ( Sulfuro de hidrógeno), formación de Indol, y manifiestación de movilidad, después de su
identificación presuntiva en otros medios diferenciales como Kligler o T.S.I.
MIO
Fundamento:
Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de
Indol a la descarboxilación de la ornitina.
Son tres pruebas, en esta prueba se evaluó la producción de indol, la descarboxilación de la
lisina por la enzima ornitina descarboxilasa y la movilidad del microorganismo.
La presencia de indol, degradación del tripotofano para la enzima triptofanasa libera indol, acido
pirúvico, amoniaco y energía.
Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de microorganismos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas
a 37ºC.
Reactivos:
A esta prueba se agregó 3-4 gotas de reactivo de kovack’s para determinar la producción de
indol.

Prueba de citrato
Esta prueba nos permite diferenciar un grupo de bacterias que son capaces de crecer con citrato
como única fuente de carbono y sales amónicas inorgánicas como única fuente de nitrógeno,
provocando la alcalinización del medio.
El medio a utilizar es agar Citrato de Simons, que contiene citrato de sodio, fosfato de amonio y
azul de bromotimol como indicador de pH.
Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán
iones amonio lo que, junto con el metabolismo del citrato, generará una fuerte basificación del
medio que será aparente por un cambio de color del mismo de verde a azul

Realización práctica

Inocular realizando una siembra por agotamiento en la superficie del agar inclinado.

Incubar a 37ºC durante 24 horas.

Tras el periodo de inbación se procede a la lectura de los resultados. Si el medio vira a color azul
será citrato positivo, de lo contrario será citrato negativo.
 Medio recién inoculado citrato + citrato –

Prueba de hidrolisis de urea

Caldo urea o agar urea de Cristensen.
Sustrato: Urea.
Enzima: Ureasa.
Producto: Amoníaco.
Indicador: Rojo de fenol.
La hidrólisis de la urea por la enzima ureasa libera dos moléculas de amoniaco que alcaliniza el
medio, entonces se vira el indicador de pH, en el caso del rojo de fenol una prueba positiva es
color bugambilia.

-+

Prueba de fenil-alanina

Usado para identificar M. morganii, proteus spp. Providencia spp. En presencia de fenilalanina
desaminasa

Determina la capacidad e la bacteria para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido

fenilpirúvico por acción de la enzima Fenilalanina desaminasa, esto va a producir una
acidificación del medio, que se va a poner de manifiesto mediante la aplicación de 0,2 - 0,3
mL de Cloruro férrico al 10 %, si hay en el medio ác. fenilpirúvico aparece una coloración
verde-azulada.
Instrucciones

Suspender 23g del polvo en 1 litro de agua purificada, Deja reposar 5 minutos. Calentar con
agitación frecuente y llevar a ebullición hasta disolución total. Distribuir en tubos y esterilizar en
autoclave a 121c durante 15 minutos

Enfriar y solidificar en posición inclinada para obtener picos de flauta alargados.

Siembra

A partir de un cultivo(18-24h) sembrar un inoculo denso estriando la superficie del medio

(agregar 4-5 de f reactivo)

Prueba de lisina-iron-agar

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp.

Basado en la descarboxilación y desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el

desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y desaminasa. Los
microorganismos fermentadores de glucosa acidifican el medio y provocan el viraje de color
purpura a amarillo

Suspender 35g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos. Calentar agitando con
frecuencia y hervir durante un minuto, distribuir en tubos y esterilizar(pico de flauta)
Picar el fondo y extender sobre la superficie

Prueba Voges proskauer

Si el microorganismo problema utiliza la glucosa por la vía butilén-glicólica originará un compuesto
que es la acetoína.

Esta acetoína es el acetil-metil-carbinol, que en presencia de oxígeno atmosférico, y con α-naftol

en un medio básico, produce un compuesto coloreado.

1. Coger un inóculo del microorganismo problema procedente de un cultivo con un asa de

siembra de platino.
2. Sembrar el microorganismo problema en un medio Clark y Lubs haciendo uso de la técnica
de agitación.
3. Incubar a 37ºC durante 48 horas.
4. Añadir 0,5 ml de α-naftol y 0,5 ml de KOH al 40%.
5. Agitar y poner en posición horizontal para que la superficie de contacto con el oxígeno
aumente.
6. Esperar 15 minutos.
7. Poner el tubo en posición vertical y comprobar el resultado.

Resultado e interpretación
No cambió el color comparado con el control. Por tanto, el microorganismo problema es Voges
Proskauer negativo, ya que no utiliza la glucosa por la vía butilén-glicólica.
 De izquierda
a derecha: tubo control, tubo Voges Proskauer positivo y tubo Voges Proskauer negativo.

Prueba de rojo metilo

El medio de cultivo Clark y Lubs es un medio que tiene lo mínimo necesario para el crecimiento de
un microorganismo problema.

Si el microorganismo consume el hidrato de carbono del medio (glucosa) habrá producción de

ácido, y ésto se pondrá de manifiesto mediante el indicador Rojo de Metilo.

1. Coger un inóculo del microorganismo problema procedente de un medio de cultivo.

2. Sembrar el microorganismo problema en el medio Clark y Lubs haciendo uso de la técnica
de agitación.
3. Incubar a 37ºC durante 48-72 horas.
4. Añadir al medio de cultivo unas gotas de Rojo de Metilo.
5. Observar y anotar el resultado.

Resultado e interpretación
Si el medio de cultivo se torna ácido es porque el microorganismo consume la glucosa por la vía
ácido-mixta. Esto se pone de manifiesto gracias al indicador, haciendo que el medio se vuelva de
color rojo. En caso negativo, el medio de cultivo mantendrá su color inicial cuando se añada el
indicador.
 Una vez
echado el indicador, aparece color rojo indicando positividad. El microorganismo problema
metaboliza la glucosa por la vía ácido-mixta.

Reactivo vp

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa

con producción de ácido por la vía ácido mixta o con producción de un producto final neutro
(acetoína) por la vía butanodiólica.

La prueba rojo de metilo y Vogues-Proskauer son dos pruebas en una. Las bacterias que siguen
principalmente la vía de fermentación ácidos mixtos a menudo producen suficiente ácido para
mantener un ph menor de 4.4.

A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita
para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si
permanece amarillo.
Reactivos: (Vogues P.)

A la otra porción de cultivo se le añade:

0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico absoluto). El medio adquiere un

aspecto lechoso.

0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita
fuertemente.

Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violáceo, más o menos
intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloración
alguna.

Inocule con el asa de platino transfiriendo una porción de cultivo puro. In-cube a 35°C por 24 a 48
horas. (para los dos medios)

Caldo de glucosa. Después de la incubación,

Reactivos: Añadir indicador rojo de metilo a la muestra