UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE BASADRE GROHMANN”-Tacna Dr.

CÉSAR JULIO CÁCEDA QUROZ

Facultad de Ciencias Agropecuarias – E. P. de Ingeniería Ambiental

PRÁCTICA 02
COLORANTES Y COLORACIONES

OBJETIVO:
Es propósito de esta práctica hacer una introducción preliminar al conocimiento de los colorantes y las técnicas
básicas de coloración, así como la de algunas coloraciones especiales.
La finalidad de las coloraciones es, entre otras, hacer visibles a los gérmenes y revelar su morfología.
El estudio microscópico de un germen puede ser realizado de diversas maneras, incluidas los preparados en fresco.
Pueden además utilizarse técnicas especiales, como el contraste de fases, el campo oscuro, la fluorescencia, etc.

MATERIAL:

Los colorantes son cuerpos o sustancias capaces de transmitir su color a otros cuerpos.

Una coloración es el proceso mediante el cual, un cuerpo toma color bajo la acción de otro cuerpo o sustancia
llamada colorante y, que no se decolora con lavados de agua o cualquier otra sustancia empleada como disolvente.

1. Colorantes: Clases:
A. Por su origen:
a) Naturales: Son aquellos que se obtienen de organismos naturales o vegetales, tales como:
 Carmín, Tornasol, Índigo, Azafrán, Orceína
 Hematoxilina, Hemateína, Brasilina

b) Artificiales: Llamados también sintéticos, son aquellos que se obtienen como productos derivados de
la destilación fraccionada de la hulla, generalmente se les conoce como anilina.

B. Por su afinidad tintórea:

Ehrlich los divide en colorantes ácidos, básicos y neutros.

a) Colorantes Ácidos: Son aquellos que tienen por afinidad especial colorear el citoplasma, por lo que se
les llama también colorantes citoplasmáticos. Los más usados son:
 Eosina, Fucsina ácida, ácido pícrico
 Naranja G, Azul de anilina, Safranina.

b) Colorantes Básicos: Son aquellos que tienen afinidad especial por colorear la cromatina nuclear,
llamándoseles por eso colorantes nucleares. Entre los más usados están:
 Hematoxilina, Azul de metileno, Fucsina básica, Azur “A”, Azur “B”
 Violeta de Genciana, Thionina, Azul de toluidina, Hemateína.

c) Colorantes Neutros: Aquellos que en su constitución lleva una parte ácida y otra básica que colorean.
Ejemplos:
 Eosinato azul de metileno
 Wright, Leishman, May Grunwald

d) Indiferentes:
 Sudan III
2. TIPOS DE COLORACIÓN
a) Coloración Simple
b) Coloración Doble
c) Coloración Neutra
d) Coloración Diferencial o Especial

COLORACIÓN SIMPLE

a) Material y Reactivos:
- Mucosa labial - Colorantes básicos
- Alcohol de 70° - Agua corriente, agua destilada
- Colorantes ácidos - Microscopio compuesto

b) Procedimiento:
 Realizar una extensión o frotis de la muestra (sustancia examen: mucosa labial) sobre un portaobjetos.
 Realizar la fijación de la muestra (alcohol, calor moderado del mechero, medio ambiente, etc.)
 Agregar un colorante (ácido o básico) y dejar actuar por 1 a 5 minutos.
 Lavar la muestra con agua corriente, a chorro tenue.
 Dejar secar la muestra al medio ambiente o a calor moderado.
 Observar la muestra, empleando el objetivo de inmersión (100X)

COLORACIÓN DOBLE

a) Material y Reactivos:
Los mismos de la coloración anterior, especificando que se utiliza como colorante ácido la Eosina y como
colorante básico la Hemateína.

b) Procedimiento:
 Realizar una extensión o frotis de la muestra (sustancia examen: mucosa labial) sobre un portaobjetos.
 Realizar la fijación de la muestra (alcohol, calor moderado del mechero, medio ambiente, etc.)
 Agregar el colorante Hemateína y dejar actuar por 3 a 5 minutos.
 Colocar el preparado en agua destilada, de 1 a 2 minutos.
 Luego agregar el colorante Eosina, hasta que cubra la muestra. Dejar actuar por 5 a 10 minutos.
 Lavar con agua corriente.
 Secar y observar en el microscopio con el objetivo de inmersión.

PASOS GENERALES DE UNA COLORACIÓN

a) Realizar la extensión de la muestra en una lámina portaobjetos con un asa bacteriológica (asa de Nicrom) u
otro instrumento. El asa debe ser esterilizada al calor con ayuda del mechero, antes y después de su empleo.

b) Realizar la fijación de la muestra: Lo que se quiere es adherir firmemente la preparación sobre la lámina. Se
emplea para este fin el calor suave de un mechero o el alcohol éter; este último es indispensable cuando se
trata der muestras serosas.

c) Realizar la tinción de la muestra con el colorante o con el grupo de colorantes elegidos.

d) Realizar el lavado con chorro tenue.

e) Realizar el secado de la muestra. Puede utilizarse el calor suave de un mechero o el aire a presión.

f) Realizar la observación de la muestra usando el objetivo de inmersión de un microscopio compuesto.

COLORACIÓN GRAM

 Hacer un frotis de la suspensión bacteriana (puede usarse sarro dentario, pus o esputo).
 Agregar el colorante violeta de genciana o la de Hucker, por 2 a 3 minutos.
 Cubrir la muestra con lugol y dejar actuar por 3 minutos.
 Posteriormente decolorar completamente con alcohol acetona).
 Lavar el portaobjeto con chorro de agua tenue.
 Contrastar con el colorante de safranina y dejar actuar por 1 a 2 minutos.
 Lavar, secar y observar a inmersión.

Al finalizar la coloración, según se verá al microscopio, los gérmenes pueden quedar teñidos de violeta o rojo.
Los que toman el color violeta se llaman Gram positivas y, los que toman el color rojo se llaman Gram negativos.

Los gérmenes Gram negativos son los que han cedido el color violeta por acción del alcohol acetona y, por
haber quedado son coloración, han estado aptos para tomar el segundo colorante.

La acción del lugol en esta coloración, es conseguir una mayor fijación del colorante violeta de genciana por
parte de los gérmenes Gram positivos, por unión del colorante con el yodo del lugol.

Son Gram positivos todos los cocos, a excepción de las Neisseria (diplococo) la cual es Gram negativo. Muchas
de las especies de este género son patógenos para el hombre, como por ejemplo: Neisseria gonorrhoeae
(gonococo), Neisseria meningitidis (meningococo).

Son Gram negativos todos los bacilos, a excepción de los miembros de la Familia Bacillaceae: Bacillus anthracis
(carbunco), B. cereus, B. subtilis (saprofito), Clostridium botulinum (botulismo), C. tetani (tétano), C. perfringens
(gangrena gaseosa).

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

(Para gérmenes ácido alcohol resistente, BAAR)

Técnica:
 Preparar el frotis de la muestra de esputo.
 Cubrir íntegramente con el colorante fucsina fenicada de Ziehl.
 Calentar a la llama de un mechero de alcohol, hasta desprendimiento de vapores por 3 a 5t veces consecutivas,
sin llegar a ebullición.
 Decolorar con alcohol ácido.
 Lavar con agua de caño.
 Aplicar el azul de metileno, como colorante de contraste, por 1 a 2 minutos (o ácido Pícrico).
 Lavar, secar y observar.
 Se observará bacilos rojos con pequeñas granulaciones (se observará BAAR)
 COLORACIÓN DE ESPORAS

Objetivos:

 Demostrar la tinción de la espora, en contraste con la célula vegetativa bacteriana.

 Observar la situación de las esporas dentro del cuerpo bacteriano.

Procedimiento de Wirtz (Modificado)

 Material de Estudio:

 Cultivo de bacilos esporulados, por ejemplo Bacillus subtilis.

 Reactivos colorantes:
 Verde de Malaquita (solución acuosa al 0,5%)
 Safranina "O” (solución acuosa)

 Procedimiento:
 Hacer el frotis bacteriano y fijar al calor.
 Añadir el colorante Verde de Malaquita.
 Calentar con mechero de alcohol hasta desprendimiento de vapores por 3 a 5 veces.
 Lavar con chorro de agua tenue
 Agregar el colorante Safranina y dejar actuar por 1 a 2 minutos.
 Lavar, secar y observar.
 Se observa: la espora de color verde y el cuerpo bacteriano de color rojo.

SOLUCIONES EMPLEADAS EN COLORACIONES

1. Azul de Metileno Alcalino de Loeffler:

- Azul de Metileno … 0,31 g.
- Alcohol etílico … 30,0 ml.
- Solución de KOH al 0,01% … 100,0 ml.

2. Cristal Violeta – Oxalato der Amonio de Hucker

Solución “A”:
- Cristal Violeta … 2,0 g.
- Alcohol etílico 95° … 20,0 ml.

Solución “B”:
- Oxalato de amonio … 0,8 g.
- Agua destilada … 80,0 ml.

3. Lugol para Gram (solución yodo – yodurada = lugol fuerte)

- Yodo … 1,0 g.
- Yoduro de Potasio (KI) … 2,0 g.
- Agua destilada … 200,0 ml.

Primero preparar el KI en agua destilada y posteriormente disolver el yodo.

 Evitar mezclar los ingredientes en forma simultánea.

4. Safranina “O” = Colorante de Contraste

Es una solución de Safranina “O” al 2,5% en alcohol etílico de 95°. De esto se toma 10,0 ml y se añade a 100,0
ml de agua destilada.

5. Alcohol acetona
- Alcohol de 95° … 80,0 ml.
- Acetona … 20,0 ml.

6. Alcohol ácido
- HCl … 3,0 ml.
- Alcohol etílico 95° … 97,0 ml.

7. Fucsina carbolada de Ziehl

Fucsina carbolada = Fucsina fenicada = fenol

Solución “A”:
- Fucsina básica … 0,3 g.
- Alcohol etílico 95° … 10,0 ml.

Solución “B”:
- Fenol o ácido fénico … 5,0 g.
- Agua destilada … 95,0 ml.

Luego mezclar la Solución “A” y la Solución “B”

8. Safranina “O” para esporas

- Es una solución acuosa al 0,5%.

9. Colorante de Maneval
- Ácido fénico (solución acuosa al 5%) … 30,0 ml.
- Ácido acético (solución acuosa al 20%) … 10,0 ml.
- Cloruro férrico (solución acuosa al 30%) … 4,0 ml.
- Fucsina ácida (solución acuosa al 1%) … 2,0 ml

10. Rojo de Congo

- Es una solución acuosa al 1%.

11. Verde de Malaquita

- Es una solución acuosa al 0,5%.

MEZCLA SULFOCRÓMICA:
1) K2CrO4 … 100,0 g.
2) H2SO4 … 100,0 ml.
3) Agua destilada … 1 000,0 ml.

Dr. CÉSAR JULIO CÁCEDA QUIROZ

11/IV/2019