Tesis Propagacion de Estacas PDF

Inducción del enraizamiento en estaquillas de olivo mediante el empleo de
bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR)

Área de Producción Ecológica y Departamento de
Recursos Naturales Microbiología y Parasitología
IFAPA Centro Las Torres-Tomejil. Facultad de Farmacia
Consejería de Agricultura
Inducción del enraizamiento en

estaquillas de olivo mediante el empleo
de bacterias promotoras del crecimiento
vegetal (PGPR)
Mª del
Carmen
Montero
Calasanz
TESIS DOCTORAL
Mª del Carmen Montero Calasanz
2011
Julio, 2011
Área de Producción Ecológica y Departamento de Microbiología
Recursos Naturales y Parasitología
Inducción del enraizamiento en

estaquillas de olivo mediante el empleo
de bacterias promotoras del crecimiento
vegetal (PGPR)
TESIS DOCTORAL
Mª del Carmen Montero Calasanz
Sevilla, 2011
Inducción del enraizamiento en estaquillas de

olivo mediante el empleo de bacterias promotoras
del crecimiento vegetal (PGPR)
Memoria presentada por la Licenciada en Biología Mª del Carmen Montero Calasanz

para optar al grado de Doctor en Biología por la Universidad de Sevilla.
Mayo, 2011.
Inducción del enraizamiento en estaquillas de

olivo mediante el empleo de bacterias promotoras
del crecimiento vegetal (PGPR)
Memoria realizada en el Área de Producción Ecológica y Recursos Naturales del

IFAPA Centro Las Torres-Tomejil, que presenta la Licenciada en Biología Mª del
Carmen Montero Calasanz para optar al grado de Doctor en Biología por la Universidad
de Sevilla.
La Directora: El Tutor:
Fdo.: María Camacho Martínez-Vara de Rey Fdo.: Manuel Megías Guijo
La Doctoranda:
Fdo.: Mª del Carmen Montero Calasanz
Sevilla, 2011
Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera
CONSEJERÍA DE AGRICULTURA Y PESCA
Fernando Romero Muñoz, Director del Centro IFAPA Las Torres-Tomejil,
CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral titulada “Inducción del enraizamiento en

estaquillas de olivo mediante el empleo de bacterias promotoras del crecimiento vegetal
(PGPR)”, presentada por la Licenciada en Biología Mª del Carmen Montero Calasanz
para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en este Centro, en el área “ Producción
Ecológica y Recursos Naturales” bajo la dirección de la Dra. María Camacho Martínez-
Vara de Rey.
Alcalá del Río, 9 de mayo de 2011

A mis padres,
Querido señor Potter:
Tenemos el placer de informarle de que

dispone de una plaza en el Colegio
Hogwarts de Magia.
Harry Potter y la Piedra Filosofal. Capitulo 4.

El guardián de las llaves.
AGRADECIMIENTOS
… y por fin terminé la Tesis!!
Parece mentira, pero hoy se cumple un sueño que tenía desde niña y que en
algún momento pensé que no realizaría. Hoy culminan 5 años y “pico” de trabajo en los
he disfrutado plenamente, con sus alegrías y sus penas, y la satisfacción que siento es
infinita. Sin embargo, este camino recorrido no hubiese sido posible sin las personas
que han estado a mi lado apoyándome incondicionalmente. Todos y cada uno de ellos
han aportado su granito de arena a esta Tesis y me gustaría mostrarles mi
agradecimiento, aunque un par de líneas se queden cortas.
En primer lugar, agradecer al Instituto Nacional de Investigación Agraria (INIA)
el haberme concedido una beca para la realización de esta Tesis Doctoral y al IFAPA
Centro Las Torres-Tomejil, de la Consejería de Agricultura y Pesca de la Junta de
Andalucía por poner a mi disposición todos los medios para su desarrollo.
Asimismo, me gustaría mostrar mi más profunda gratitud a mi directora de tesis,
a “mi jefa”, pero ante todo a una gran amiga, la Dra. María Camacho del IFAPA Centro
las Torres-Tomejil, por su dedicación a esta Tesis y la confianza que depositó en mí
desde el primer día, aquel 18 de enero de 2006. ¡No podría haber tenido una directora
mejor!. Muchísimas gracias María, de ti me llevo muchas cosas.
Al Dr. Manuel Megías, por aceptar la tutoría de este trabajo.
A los viveros Reypra, Plantas continental y A-92 por cedernos sus instalaciones
y cuidar nuestros ensayos. Gracias, especialmente, a Claudio, Víctor y Mario,
dispuestos siempre a echarnos una mano en el montaje de los ensayos.
Gracias al Prof. Bernie Glick de la Universidad de Waterloo (Waterloo, Canada)
y a todo su grupo, en especial a Jin, mi ángel de la guarda, por su cariñosa acogida y
haber puesto a mi disposición todos sus medios e instalaciones.
Igualmente, muchísimas gracias al Dr. Anton Hartmann y al Dr. Michael
Schmid por darme la oportunidad de trabajar durante unos meses dentro de su equipo en
el HelmholtzZentrum münchen (Munich, Alemania) y enseñarme tantas cosas. Gracias
al Dr. Mike Rothballer por toda su ayuda y dedicación.
A la Dra. Mery Jaizme-Vega del Instituto Canario de Investigaciones Agrarias
(ICIA) por hacerme sentir como en casa durante la pequeña estancia que realicé en su
laboratorio.
Al Dr. Juan Luis Ribas del CITIUS por enseñarme el manejo del microscopio
confocal. ¡Qué infinita paciencia!.
A mis compañeros del Departamento de Inoculantes del IFAPA Centro Las
Torres-Tomejil. Gracias Carmen por tu cariño, tu sensatez y tu sabios consejos… y
porque sin ti, la finalización de esta Tesis hubiese sido mucho más tediosa; Dulce, por
tu cariño, por aportar tu visión crítica y tu interés a esta tesis… y por enseñarme a ser
ordenada en el laboratorio; Antonio, por mostrarme la realidad del mundo de la ciencia
y hacer plantearme las cosas desde una perspectiva más práctica; Paco, por tu increíble
memoria, por ser capaz de explicarme cualquier duda desde el principio de los tiempos;
Marta, por toda tu ayuda en mis inicios, tu compañía y tu comprensión…aún se te echa
de menos; Pedro, amigo y compañero de desdichas, gracias por esas charlas
interminables; Mª Jesús, por animarme en muchos momentos; Y también, a Inma que
aunque estuviste poco tiempo, llegaste a ser un gran apoyo.
A Mari Velasco y Toni por hacerme la búsqueda de la bibliografía más fácil.
A todas las personas que con su tiempo, su dedicación y la desinteresada
contribución de sus conocimientos y recursos permitieron enriquecer este trabajo. Al
Dr. Carlos Camacho, por su orientación y asesoramiento con la estadística; A la Dra.
Belén Rodelas, por su gran ayuda y por sacar tiempo en un día que había tanto que
celebrar. A la Dra. Charo Espuny, por la amabilidad, predisposición, entusiasmo y
ayuda que me ha brindado cada vez que me ha hecho falta. A la Dra. Encarna
Velázquez, por su inestimable ayuda y disposición para resolver todas mis dudas. Al Dr.
Manolo Chamber, por permitirme utilizar sus instalaciones para la preparación y
montaje de algunos ensayos.
A mi familia por quererme, comprenderme, apoyarme incondicionalmente,
soportar mis silencios y, en ocasiones, el mal humor que me ha aquejado estos últimos
meses. Gracias Papá y Mamá, Paco y Carmela, por todo cuanto me habéis dado, por
hacer de mí la persona que soy hoy y por enseñarme la grandeza que puede encerrar
hasta la más pequeña de las criaturas…los sueños se hacen realidad; A Mi, mi hermana,
por todo su ánimo, por sonsacarme tantas veces para salir, por todos los discursos sobre
la Tesis que ha tenido que aguantar y ser siempre mi principal directora de marketing; A
mis abuelos, Mamabela y Pacololo, por cuidarme siempre y transmitirme vuestros
valores. A mis niñas, Isabel Ángela y María Elena, por alegrarme cuando todo se veía
oscuro, ¡gracias por todas vuestras llamaditas de ánimo!. A mi tíos, Fernando e Isa, por
su ayuda en la toma de algunas fotos y en todo cuanto les pedí. Y por supuesto, a
Alfredo, mi marido, sé que no querías que te nombrara, pero esta Tesis también es tuya.
Gracias por hacerme tan feliz.
Finalmente, a todas y cada una de las personas que durante este camino tuvieron
alguna palabra de aliento… y soportaron más de un monólogo.
Y a Ti.
La niña del bello
rostro
sigue cogiendo
aceituna
con el brazo gris del
viento
ceñido por la cintura.
Arbolé, arbolé
seco y verde.
Federico García
Lorca
Figura simbólica de Arahal, según los grabados que ilustran la crónica de la visita de Felipe II a
Sevilla en 1570, de Juan de Mal-Lara.
Índices
ÍNDICE
Página
I. Introducción.................................................................. 1
1. El cultivo del olivo ................................................................................... 3

1.1. El olivo ............................................................................................... 3
1.2. Origen del olivo .................................................................................. 5
1.3. Importancia actual .............................................................................. 6
1.4. Variedades de olivo ............................................................................ 9
2. Multiplicación vegetativa del olivo......................................................... 12
2.1. Métodos tradicionales......................................................................... 12
2.2. Propagación viverística del olivo mediante estaquillado
semileñoso bajo nebulización............................................................. 13
2.2.1. Antecedentes................................................................................. 13
2.2.2. Descripción del método .............................................................. 13
2.2.3. Factores que determinan el enraizamiento.................................. 18
2.2.3.1. Variables biológicas.......................................................... 18
2.2.3.2. Variables físicas ................................................................ 19
2.3. Propagación del olivo in vitro ............................................................ 22
3. La agricultura ecológica .......................................................................... 23
3.1. Antecedentes....................................................................................... 23
3.2. Estado actual de la AE ........................................................................ 24
3.2.1. Principios de la AE ..................................................................... 24
3.2.2. La AE en España......................................................................... 25
3.2.3. El olivar ecológico ...................................................................... 26
4. Bacterias promotoras del crecimiento vegetal ....................................... 28
4.1. La rizosfera ......................................................................................... 28
4.2. Bacterias que promueven el crecimiento vegetal (PGPR) ................. 29
4.2.1. Mecanismos de acción ................................................................ 31
4.2.1.1. Mecanismos indirectos ..................................................... 32
4.2.1.2. Mecanismos directos ........................................................ 32
4.3. Inoculantes microbianos ..................................................................... 38
4.3.1. Antecedentes ............................................................................... 38
Página
4.3.2. Selección de cepas ...................................................................... 38

4.3.3. Formulación de inoculantes ........................................................ 39
4.3.3.1. Inoculantes sólidos............................................................ 39
4.3.3.2. Inoculantes líquidos .......................................................... 41
4.3.4. Aplicación de inoculantes ........................................................... 41
II. Objetivos ...................................................................... 43
III. Materiales y métodos ................................................ 47
1. Material biológico .................................................................................... 49

1.1. Bacterias ............................................................................................. 49
1.2. Material vegetal .................................................................................. 50
2. Antibióticos, enzimas y oligonucleótidos ............................................... 51
3. Medios y condiciones de cultivo y conservación de las cepas
bacterianas ............................................................................................... 53
3.1. Condiciones de cultivo ....................................................................... 53
3.2. Descripción de los medios de cultivo ................................................. 54
3.2.1. Medio CAS (Chrome Azurol S) ................................................. 54
3.2.2. Medio mínimo salino DF ............................................................ 55
3.2.3. Medio Luria-Bertani (LB) .......................................................... 57
3.2.4. Medio NFb modificado .............................................................. 57
3.2.5. Medio PVK ................................................................................ 58
3.2.6. Medio Simmons Citrato ............................................................. 59
3.3. Mantenimiento y conservación de las cepas bacterianas .................. 59
4. Soluciones y tampones ............................................................................. 59
4.1. Soluciones nutritivas para las plantas ................................................ 60
4.1.1. Solución de Rigaud y Puppo ...................................................... 60
4.1.2. Solución de Hewitt ..................................................................... 61
4.2. Soluciones de dilución........................................................................ 62
4.2.1. Solución de sales minerales........................................................ 62
4.2.2. Tampón fosfato (PBS) ................................................................ 62
4.3. Soluciones para electroforesis de ADN .............................................. 62
4.3.1. Tampón TAE .............................................................................. 62
Página
4.3.2. Tampón de carga ........................................................................ 63

4.4. Soluciones de DGGE......................................................................... 63
4.4.1. Solución de 6% de acrilamida al 0% de agentes
desnaturalizantes ......................................................................... 63
4.4.2. Solución de 6% de acrilamida al 100% de agentes
desnaturalizantes ......................................................................... 63
4.5. Soluciones para la tinción de GRAM ................................................. 63
4.5.1. Solución de cristal violeta oxalato.............................................. 63
4.5.2. Solución de safranina ................................................................. 64
5. Reactivos ................................................................................................... 64
5.1. Reactivo Salkowski.............................................................................. 64
6. Colección bacteriana ............................................................................... 65
6.1. Aislamientos bacterianos .................................................................... 65
6.1.1. Procedentes de muestras de suelo de olivar ecológico ............... 65
6.1.2. Procedentes del agua de riego de vivero comercial de plantas
de olivo ........................................................................................ 67
6.2. Nomenclatura ..................................................................................... 67
7. Identificación bacteriana ........................................................................ 67
7.1. Caracterización morfológica .............................................................. 67
7.1.1. Morfología de la colonia ............................................................ 67
7.1.2. Morfología celular ...................................................................... 68
7.2. Caracterización bioquímica de PGPR ................................................ 69
7.2.1. Antibiograma .............................................................................. 69
7.2.2. Solubilización de fosfatos .......................................................... 69
7.2.3. Producción de sideróforos .......................................................... 69
7.2.4. Biosíntesis de AIA ..................................................................... 69
7.2.5. Actividad ACC desaminasa ....................................................... 70
7.3. Caracterización molecular .................................................................. 71
7.3.1. Extracción de ADN .................................................................... 71
7.3.1.1. Aislamiento de ADN genómico ........................................ 71
7.3.1.2. Aislamiento de ADN plasmídico ...................................... 71
Página
7.3.2. Determinación de la concentración y la calidad de ADN .......... 71

7.3.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa ............................... 72
7.3.4. Métodos de caracterización basados en la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) ............................................................... 72
7.3.4.1. Amplificación con cebadores específicos para elementos
consenso intergénicos reiterativos de enterobacterias
(ERIC-PCR) ....................................................................... 72
7.3.4.2. Amplificación, secuenciación y análisis filogenético del
ADNr 16S .......................................................................... 73
7.3.4.3. Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización
(DGGE) .............................................................................. 76
8. Ensayos de interacción planta-microorganismo ................................... 77
8.1. Desinfección y pregerminación de semillas ...................................... 77
8.2. Preparación del inóculo ..................................................................... 77
8.3. Monitorización bacteriana ................................................................. 79
8.3.1. Inserción de la proteína verde de fluorescencia ......................... 79
8.3.2. Recuentos de células viables ...................................................... 80
8.3.3. Observación de la colonización mediante microscopía ............. 81
8.4. Ensayos bajo condiciones gnotobióticas ........................................... 82
8.4.1. Enraizamiento de estaquillas de Vigna sp. ................................. 82
8.4.2. Elongación de raíces de Brassica napus L. ................................ 84
8.5. Ensayos de invernadero y vivero ....................................................... 86
8.5.1. Enraizamiento de estaquillas de olivo ........................................ 86
8.5.2. Persistencia bacteriana en plantas de olivo ................................ 90
8.5.3. Efecto de la inoculación bacteriana sobre plantas de olivo ........ 91
9. Análisis estadísticos ................................................................................. 92
IV. Resultados .................................................................. 93
1. Colección bacteriana ............................................................................... 95

1.1. Aislamientos y caracterización de bacterias de suelo de olivar
ecológico ............................................................................................ 95
1.1.1. Caracterización bioquímica y morfológica ................................ 96
Página
1.1.2. Caracterización basada en técnicas moleculares ........................ 101

1.1.2.1. ERIC-PCR ........................................................................ 101
1.1.2.2. DGGE ............................................................................... 109
1.2. Aislamiento y caracterización de cepas procedentes de agua de
riego de vivero comercial de plantones de olivo ................................ 111
2. Selección e identificación de cepas PGPR ............................................. 112
2.1. Actividad ACC desaminasa................................................................ 113
2.2. Caracterización taxonómica y análisis filogenético .......................... 115
3. Interacción planta-microorganismo ...................................................... 121
3.1. Marcaje de las cepas bacterianas con GFP ........................................ 121
3.2. Ensayos bajo condiciones gnotobióticas ........................................... 122
3.2.1. Enraizamiento y colonización bacteriana en estaquillas de V.
radiata ......................................................................................... 123
3.2.2. Enraizamiento de estaquillas de V. unguiculata......................... 129
3.2.3. Elongación radical y colonización bacteriana en B. napus ........ 134
3.3. Ensayos en condiciones no axénicas .................................................. 139
3.3.1. Antiograma ................................................................................. 139
3.3.2. Enraizamiento de estaquillas de olivo ........................................ 140
3.3.2.1. Ensayo 1 ............................................................................ 141
3.3.2.2. Ensayo 2 ............................................................................ 142
3.3.2.3. Ensayo 3 ............................................................................ 144
3.3.2.4. Ensayo 4 ............................................................................ 146
3.3.2.5. Ensayo 5 ............................................................................ 147
3.3.2.6. Ensayo 6 ............................................................................ 149
3.3.2.7. Ensayo 7 ............................................................................ 151
3.3.2.8. Ensayo 8 ............................................................................ 152
3.3.2.9. Ensayo 9 y 10 .................................................................... 153
3.3.2.10. Ensayo 11........................................................................ 154
3.3.3. Persistencia bacteriana en plantas de olivo ................................. 156
3.3.3.1. En invernadero .................................................................. 157
3.3.3.2. En vivero ........................................................................... 164
Página
3.3.4. Efecto de la inoculación bacteriana sobre plantas de olivo a lo

largo del tiempo ........................................................................... 166
V. Discusión ...................................................................... 169
1. Colección bacteriana ................................................................................ 172

1.1. Biodiversidad microbiana................................................................... 176
2. Selección e identificación de cepas PGPR .............................................. 179
3. Interacción planta-microorganismo ...................................................... 183
3.1. Monitorización de la colonización bacteriana in planta..................... 195
VI. Conclusiones .............................................................. 203
VII. Bibliografía ............................................................... 207
VIII. Apéndice .................................................................. 249

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
1.1. Visión global del cultivo del olivo ............................................................ 3

1.2. Principales países productores de aceite de oliva. Balance estimativo
Campaña 2010/2011................................................................................ 6
1.3. Principales países productores de aceite de oliva. Balance estimativo
Campaña 2010/2011................................................................................ 7
1.4. Superficie de olivar en España por comunidades. Año 2008 .................... 8
1.5. Plantación de olivos en seto....................................................................... 10
1.6. Aceitunas de la variedad arbequina ........................................................... 11
1.7. Aceitunas de la variedad picual ................................................................. 11
1.8. Aceitunas de la variedad hojiblanca .......................................................... 11
1.9. Aceitunas de la variedad koroneiki ........................................................... 11
1.10. Multiplicación vegetativa a través de estacas o garrotes ......................... 13
1.11. Multiplicación vegetativa a través de zuecas .......................................... 13
1.12. Formación del callo ................................................................................. 14
1.13. Esquema de la propagación viverística del olivo .................................... 15
1.14. Tipos de auxinas ...................................................................................... 20
1.15. Rutas de biosíntesis de auxinas en plantas dependientes de Try ............. 20
1.16. Propagación in vitro del olivo ................................................................. 23
1.17. Serie histórica de la superficie de AE en miles de ha .............................. 25
1.18. Superficie dedicada a AE por comunidades autónomas .......................... 26
1.19. Superficie dedicada al cultivo de olivar ecológico por comunidades
autónomas ............................................................................................... 27
1.20. Mecanismos de promoción de crecimiento vegetal (positivos y
negativos) asociados al suelo y a microorganismos rizosféricos
(PGPR) .................................................................................................... 31
1.21. Rutas de biosíntesis de AIA en bacterias................................................. 34
1.22. Representación esquemática del mecanismo de acción de una PGPR
que contiene la enzima ACC desaminasa cuando se une a una semilla
o una raíz ................................................................................................. 37
3.1. Parcela de laboreo...................................................................................... 65
Figura Página
3.2. Parcela con cubierta dirigida ..................................................................... 65

3.3. Parcela con cubierta espontánea ................................................................ 65
3.4. Esquema de la recogida de muestras de suelo de olivar ecológico y del
aislamiento bacteriano llevado a cabo..................................................... 66
3.5. Resultados obtenidos al realizar la tinción de Gram (a) y el test de KOH
(b) a una bacteria Gram negativa ............................................................ 68
3.6. Características de vector de clonación “TOPO TA Cloning Kit 2.1.” de
Invitrogen y secuencias cercadas al sitio de clonación ........................... 74
3.7. Esquema de la inoculación de las bolsas de turba ..................................... 78
3.8. Conjugación bacteriana triparental ............................................................ 80
3.9. Plantas y semillas de las especies de soja verde utilizadas en los ensayos
de enraizamiento de estaquillas en condiciones gnotobióticas ............... 83
3.10. Esquema del método empleado en los ensayos de enraizamiento de
estaquillas de Vigna sp. ........................................................................... 83
3.11. Planta y semillas de la colza .................................................................... 84
3.12. Esquema del método empleado en los ensayos de elongación radical
realizados en colza .................................................................................. 85
3.13. Esquema de los métodos de inoculación utilizados en los ensayos de
enraizamiento de estaquillas de olivo ..................................................... 89
3.14. Esquema del procedimiento seguido en el ensayo de persistencia en
olivo llevado a cabo en invernadero........................................................ 90
4.1. Vista aérea de la parcela de olivar ecológico donde se realizó la
recogida de muestras ............................................................................... 96
4.2. Detección in vitro de cepas productoras de sideróforos (a) y
solubilizadoras de fosfatos (b) ................................................................ 97
4.3. Resultados en porcentaje de la morfología observada en los
aislamientos Gram positivos ................................................................... 97
4.4. Resultados en porcentaje de la morfología observada en los
aislamientos Gram negativos .................................................................. 98
4.5. Número de aislamientos distribuidos según sus características PGP
mostradas in vitro .................................................................................... 99
Figura Página
4.6. Distribución de los aislamientos según zona de muestreo y manejo de

cubierta .................................................................................................... 100
4.7. Distribución de las cepas productoras de AIA y con características
relacionadas con la nutrición, según el manejo agrícola y la zona de
aislamiento .............................................................................................. 100
4.8. Dendrograma elaborado a partir de los perfiles electroforéticos de los
marcadores moleculares usados mediante la aplicación del coeficiente
de correlación de Pearson, el algoritmo UPGMA y CCC ....................... 103
4.9. Dendrograma elaborado a partir de los perfiles electroforéticos
obtenidos tras la amplificación con ERIC-PCR de las cepas PGPR
Gram positivas aisladas de las muestras de suelo de olivar ecológico
de acuerdo a la aplicación del coeficiente de correlación de Dice, el
algoritmo UPGMA y CCC ...................................................................... 105
4.10. Dendrograma elaborado a partir de los perfiles electroforéticos
obtenidos tras la amplificación con ERIC-PCR de las cepas PGPR
Gram negativas aisladas de las muestras de suelo de olivar ecológico
de acuerdo a la aplicación del coeficiente de correlación de Dice, el
algoritmo UPGMA y CCC ...................................................................... 107
4.11. Análisis de la biodiversidad microbiana presente en la colección
mediante la técnica DGGE ...................................................................... 110
4.12. Gel de electroforesis de la ERIC-PCR realizada para diferenciar los
distintos tipos bacterianos morfológicamente similares obtenidos del
agua de riego ........................................................................................... 112
4.13. Árbol filogenético construido mediante el método de ML (modelo de
Tamura-Nei, +G: 0,10; Tamura y Nei, 1993) para el análisis del ADNr
16S de los aislados CT285 y CT402 y las especies más próximas ......... 117
4.14. Árbol filogenético construido mediante el método de ML (modelo
Kimura 2 parámetros, +G: 0,4493; +I: 75,3610%; Kimura, 1980) para
el análisis del ADNr 16S de los aislados CT33, CT194, AG9 y M16 y
las especies más próximas....................................................................... 118
Figura Página

el análisis del ADNr 16S de los aislados CT348 y AG13 y las especies
más próximas .......................................................................................... 119
el análisis del ADNr 16S de los aislados CT42, CT363, CT364,
CT357 y CT387 y las especies más próximas ........................................ 120
4.17. Observación in situ de la colonización radical producida en Vigna
radiata por la cepa CT42 mediante CLSM a distintas profundidades
ópticas ..................................................................................................... 127
4.18. Observación in situ de la colonización de las cepas marcadas con
fluorescencia en soja verde mediante CLSM .......................................... 128
4.19. Efecto sobre el enraizamiento de estaquillas de V. unguiculata de la
cepa CT348 con respecto al control negativo ......................................... 130
4.20. Forma de aplicación frente a tratamiento bacteriano para el número de
raíces de Vigna unguiculata .................................................................... 132
4.21. Forma de aplicación frente a tratamiento bacteriano para la longitud
total de raíces de Vigna unguiculata ....................................................... 133
4.22. Forma de aplicación frente a tratamiento bacteriano para la tasa de
longitud radical media de Vigna unguiculata ......................................... 133
fluorescencia en colza mediante CLSM .................................................. 137
4.24. Observación in situ de la colonización radical en colza de la cepa AG9
mediante CLSM a distintas profundidades ópticas ................................. 138
4.25. Enraizamiento producido en el control negativo (agua de riego) en la
variedad arbequina .................................................................................. 142
4.26. Enraizamiento obtenido en la bandeja inoculada con la cepa A.
brasilense Cd en la variedad arbequina .................................................. 142
4.27. Callo producido en las estaquillas de la variedad hojiblanca en algunos
de los tratamientos................................................................................... 143
Figura Página
4.28. Enraizamiento producido en la bandeja inoculada con la cepa Cd en la

variedad arbequina .................................................................................. 144
4.29. Enraizamiento de las bandejas inoculadas con las cepas M16 y Sp7 en
la variedad arbequina .............................................................................. 145
4.30. Efectos negativos producidos en el Ensayo 5 por cambio del sustrato
en las bandejas inoculadas ...................................................................... 148
4.31. Permanencia de las cepas CT42, CT363, CT364, M16 y AG9
inoculadas en olivos de la variedad hojiblanca en condiciones de
invernadero en ectorizosfera y raíz ......................................................... 159
fluorescencia en olivo mediante CLSM .................................................. 162
4.33. Observación in situ de la cepa AG9 infectando un pelo radical de olivo
mediante CLSM a distintas profundidades ópticas ................................. 163
4.34. Permanencia de las cepas marcadas con fluorescencia inoculadas en
olivos de la variedad hojiblanca en condiciones de vivero en
ectorizosfera y raíz .................................................................................. 165
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Página
I.1. Superficie ocupada por las principales variedades de olivo cultivadas en

España ..................................................................................................... 10
III.1. Cepas bacterianas utilizadas en este trabajo ........................................... 49
III.2. Especies vegetales utilizadas en los distintos ensayos ............................ 50
III.3. Antibióticos utilizados en este trabajo .................................................... 51
III.4. Secuencia de los distintos oligonucleótidos usados en este trabajo ........ 52
III.5. Especificaciones de los ensayos de enraizamiento de olivo realizados
en vivero .................................................................................................. 88
IV.1. Principales características PGP y procedencia de las cepas bacterianas
seleccionadas ........................................................................................... 114
IV.2. Clasificación taxonómica y número de acceso en GenBank de las
cepas secuenciadas .................................................................................. 116
IV.3. Efecto sobre el enraizamiento de estaquillas de V. radiata producido
entre las cepas silvestres y sus homólogas marcadas con fluorescencia
para los parámetros número y longitud total de raíces ............................ 124
IV.4. Efecto sobre el enraizamiento de estaquillas de V. radiata de las cepas
PGPR ....................................................................................................... 125
IV.5. Cuantificación de las bacterias adheridas a las raíces adventicias
emergidas en las estaquillas de V. radiata a la finalización del ensayo .. 126
IV.6. Efecto sobre el enraizamiento de estaquillas de V. unguiculata de las
cepas PGPR seleccionadas usando dos métodos de aplicación
(sobrenadante y suspensión celular) y comparación de los efectos
forma de aplicación y tratamiento bacteriano sobre las variables
número y longitud total de raíces y tasa de longitud radical media ........ 131
IV.7. Comparación del efecto producido sobre la elongación radical en B.
napus entre las cepas silvestres y sus homólogas marcadas con
fluorescencia ........................................................................................... 134
IV.8. Evaluación de la capacidad de elongación radical en B. napus de las
cepas PGPR seleccionadas ...................................................................... 135
Página
Tabla
V.9. Cuantificación de las bacterias adheridas a las semillas y a las raíces en

los ensayos de elongación radical en B. napus ....................................... 136
IV.10. Antibiograma de las cepas marcadas con el gen de fluorescencia ........ 140
IV.11. Efecto de los tratamientos aplicados sobre el porcentaje de
estaquillas enraizadas de las variedades arbequina y picual en el
Ensayo 1 .................................................................................................. 141
estaquillas enraizadas de las variedades arbequina y hojiblanca en el
Ensayo 2 .................................................................................................. 143
estaquillas enraizadas de las variedades arbequina y hojiblanca en el
Ensayo 3 .................................................................................................. 145
IV.14. Efecto de los tratamientos bacterianos sobre el porcentaje de
estaquillas enraizadas de las variedades arbequina, picual y hojiblanca
en el Ensayo 4 ......................................................................................... 147
en el Ensayo 5 ......................................................................................... 149
estaquillas enraizadas de la variedad arbequina en el Ensayo 6 ............. 150
en el Ensayo 7 ......................................................................................... 151
estaquillas enraizadas de la variedad arbequina en el Ensayo 8 ............. 152
estaquillas enraizadas de las variedades arbequina y koroneiki en los
Ensayos 9 y 10 ........................................................................................ 153
Tabla Página
IV.20. Comparación del efecto producido por los tratamientos bacterianos

silvestres y sus homólogos marcados con fluorescencia sobre el
enraizamiento de estaquillas de olivo de la variedad arbequina en el
Ensayo 11 ................................................................................................ 154
estaquillas enraizadas de la variedad arbequina en el Ensayo 11 ........... 155
IV.22. Cuantificación de las bacterias adheridas a las raíces adventicias
emergidas en las estaquillas de olivo de la variedad arbequina ............. 156
IV.23. Parámetros biométricos de las estaquillas de olivo de la variedad
arbequina enraizadas en el Ensayo 11 tras un año bajo umbráculo ........ 167
IV.24. Crecimiento de las plantas de olivo de las variedades hojiblanca y
arbequina tras un año en vivero .............................................................. 168
Abreviaturas y Símbolos
ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
3D Tres dimensiones
α-kB α-cetobutirato
A Cepas productoras de AIA
AA Agar agua
a.C. Antes de Cristo
AC Usada para obtención de aceite
ACC 1-Aminociclopropano-1-carboxilato
ADN Ácido desoxirribonucleico
ADNr Ácido desoxirribonucleico ribosomal
AdoMet S-Adenosil-metionina
AE Agricultura Ecológica
AG Procedente de agua
AIA Ácido indolil-3-acético, ácido indolacético
AIB Ácido indol butírico
AM Fungi Hongo micorrícico arbuscular
ANOVA Análisis de la varianza
Ap Ampicilina
APS Solución de Persulfato de Amonio
AR Agua de riego
Ar Arbequina
BNI Fijación Biológica de Nitrógeno
C. Comunidad, cubierta (Figura 4.6. y 4.7.)
ºC Grados centígrados
Cap. Capítulo
CAS Chrome Azurol S
CCC Coeficiente de Correlación Cofenética
CE Suelo rizosférico de la parcela con cubierta espontánea

CEE Comunidad Económica Europea
CD Suelo rizosférico de la parcela con cubierta dirigida

Chx Cicloheximida
CLSM Microscopio Confocal de Escaneo Láser
Cm Cloranfenicol
cm Centímetro
CN Caldo nutritivo
COI Comité Oleícola Internacional
CRAE Consejo Regulador de la Agricultura Ecológica
CT Cepa tipo
Cv Cultivar
Da Dalton
Dcuello Diámetro de cuello
dest. Destilada
DF Dworin y Foster
DGGE Electroforesis en Gel con Gradiente de Agentes

Desnaturalizantes
DNTPs Desoxirribonucleótidos Trifosfatos
DOCE Diario Oficial de la Unión Europea
Dr. Doctor
et al. Y colaboradores
ed. Editor
eds. Editores
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
ERIC Elementos Consenso Intergénicos Reinterativos

de Enterobacterias
F Cepas solubilizadoras de fosfatos
Fe Hierro
FS Cepas con características relacionadas con la nutrición
+G Parámetro de la distribución gamma
g Gramo
GFP Proteína Verde de Fluorescencia
Gm Gentamicina
H Hojiblanca
h Hora
ha Hectárea
HDTMA Hexadecyltrimethylamonium bromide
Hr Humedad relativa
+I Sitios invariables
IAA Indol-Acetic Acid
IAAId Acetaldehido-3-Indol
IAM Acetamida-3-Indol
IFAPA Instituto Andaluz de Investigación y Formación

Agraria, Pesquera y Alimentaria y de la
Producción Ecológica
IFOAM Federación Internacional del Movimiento de
Agricultura Ecológica
IPDC Indol-3-piruvato descarboxilasa
ISR Inducción de la Resistencia Sistémica
K Koroneiki
kb Kilobase
Km Kanamicina
KmR Kanamicina resistente
λ Longitud de onda
L. Linneo
l Litro
LB Luria Bertani
LongPA Longitud de la parte aérea
LongR Longitud del sistema radical
M Molar, Marcador molecular
MARM Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y

Marino
MC Medios de cultivo
Método 1 Inoculación mediante mezcla de cultivo

bacteriano con el sustrato
Método 2 Inoculación a través de la inmersión del extremo
de la estaquilla en caldo de cultivo
Método 3 Inoculación mediante inmersión del extremo de

la estaquilla en una mezcla de inoculante sólido
(turba) y agua destilada estéril
Mg Miligramo
Mi Micosfera de P. pinaster
min Minuto
ML Máxima Verosimilitud
ml Mililitro
mM Milimolar
mm Milímetro
MS Usada para aceituna de mesa
Nº Número
n.d. No detectable
n.e. No evaluado
ng Nanogramo
nm Nanometro
nmol Nanomol
No Negativo
OCM Organización Común de Mercados
P. Principado
P Fósforo
p. Página
pb Pares de bases
PBS Tampón fosfato salino
PCA Plante Count Agar
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa
PGP Promoción del Crecimiento Vegetal
PGPR Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal

Pi Picual
PIPES Piperazina-1,4-bis (ácido 2-etanosulfónico)
pmol Picomol
ppm Partes por millón
PSPA Peso seco de la parte aérea
PSR Peso seco del sistema radical
p/v Peso/volumen
PVK Pikovskaya
R Resistencia a un antibiótico
R. Región
R Raíz
® Marca registrada
RAEA Red Andaluza de Experimentación Agraria
RCD Fracción r izoplánica de la parcela con cubierta

dirigida
RCE Fracción rizoplánica de la parcela con cubierta

espontánea
R(CEE) Reglamento europeo
Ref. Cepa de referencia
REP Elementos Palindrómicos Extragénicos Reiterativos

Rif Rifampicina
RL Fracción rizoplánica de la parcela de laboreo
rpm Revoluciones por minuto
s Segundo, ectorizosfera (Figura. 4.31. y 4.34.)
S Cepas productoras de sideróforos
SAM S-Adenosil-1-Metionina
S.A. Sociedad Anónima
SCD Fracción ectorizosférica de la parcela con cubierta

dirigida
SCE Fracción ectorizoférica de la parcela con cubierta

espontánea
SD Desviación típica
Sí Positivo
sig. Significación
SIGPAC Sistema de Información Geográfica de Parcelas

Agrícolas
SL Fracción ectorizosférica de la parcela de laboreo,
Suelo rizosférico de la parcela de laboreo (Figura
4.11.)
S.L. Sociedad Limitada
SOLIVD Suelo libre de olivos de la parcela con cubierta

dirigida
SOLIVE Suelo libre de olivos de la parcela con cubierta

espontánea
SOLIVL Suelo libre de olivos de la parcela de laboreo
Sp. Especie
Subsp. Subespecie
Tm Tonelada métrica
Tª Temperatura
TAE Tris-Acetate-EDTA
Tc Tetraciclina
TEMED Tetramethylethylenediamine
Transl. Translúcida
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
Trp Triptófano
Try Triptófano
TSA Tryptic Soy Agar
TSB Tryptic Soy Broth

TM
Trade Mark
µl Microlitro
µg Microgramo
µm Micrometro
µmol Micromol
U Unidades
UE Unión Europea
UFC Unidades Formadoras de Colonias
UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic

Mean
UTM Universal Transverse Mercator
v/v Volumen/volumen
V Voltio
X Media
+ Diámetro del halo de hidrólisis 1-3 cm, Gram positiva
(Apéndice)
++ Diámetro del halo de hidrólisis 4-6 cm
+++ Diámetro del halo de hidrólisis 7-9
++++ Diámetro del halo de hidrólisis > 9 cm
- Sensibilidad a un antibiótico, Gram negativa (Apéndice)
% Porcentaje
Introducción
Introducción
1. El cultivo del olivo
1.1. El olivo
El olivo, Olea europaea L. subsp. europaea es la única especie de la familia de

las oleáceas cuyo fruto, la aceituna u oliva, es comestible. El olivo (Figura 1.1.), es un
árbol típicamente mediterráneo adaptado a inviernos templados y veranos secos y
calurosos, es perennifolio y longevo, de tamaño mediano que posee un tronco y una
corteza de color gris a verde grisáceo. En su crecimiento pueden distinguirse una fase
juvenil y otra adulta diferenciadas por la capacidad reproductora, solamente en la
segunda, en el potencial para el enraizamiento, mayor en la fase juvenil, y en diferencias
morfológicas en hojas y ramos. La transición del estado juvenil al adulto no es
solamente temporal, a partir de los 5 años (dependiendo de la variedad), sino también
espacial, siendo las zonas más cercanas al suelo las más juveniles.
Figura 1.1. Visión global del cultivo del olivo.
Montero-Calasanz, M.C. 3
Introducción
Las hojas del olivo son simples, de forma lanceolada y con bordes enteros, que
se disponen de dos en dos en cada nudo de forma opuesta y presentan grandes
adaptaciones a ambientes de alta transpiración (haz con gruesa cutícula verde oscuro
brillante y envés blanco cubierto con escamas peltadas formando una capa protectora).
La morfología del sistema radical del olivo depende del sistema de
multiplicación utilizado y de las condiciones del suelo. Actualmente, la mayoría de las
plantas de olivo comercializadas provienen de estaquillas que dan lugar a la formación
de múltiples raíces adventicias que se comportan, en su mayoría, como raíces
principales. La profundidad, la extensión lateral y el grado de ramificación de éstas
dependerán del tipo y estructura del suelo.
Cuando llega la primavera, las inflorescencias se desarrollan en forma de
panícula presentando flores pequeñas y actinomorfas con corola blanca o blanca-
amarillenta, llamadas esquilmo. La polinización de éstas da lugar a frutos pequeños tipo
drupa de forma elipsoidal a globosa, llamados aceitunas, que en la madurez adquieren
un color negro, negro-violáceo o rojizo. Estos frutos son recogidos entre los meses de
septiembre a diciembre.
Las aceitunas tradicionalmente han sido destinadas a la obtención de aceite (90
%) y al consumo directo como aceituna de mesa. De la presión ejercida sobre la
aceituna se extrae el aceite de oliva (del árabe “Az-zait”), un zumo oleoso que desde la
antigüedad ha tenido un uso principalmente culinario. Este “oro líquido” posee
excepcionales características de aspecto, fragancia y sabor, gozando de altos contenidos
en vitaminas, ácidos grasos esenciales y otras sustancias naturales de importancia
dietética, que lo atesoran para su consumo en crudo. El aceite de oliva también se ha
empleado con propósitos cosméticos, así como cotidianos (lámparas de aceite) y
medicinales, llegando incluso en el Medievo, a ser designado por los alquimistas como
una entidad química distinta a las conocidas. Paralelamente, el consumo directo de la
aceituna es un hecho conocido desde la antigua Grecia donde a priori reducían la
amargura de su sabor mediante la aplicación de diversos procesos de curado que han
llegado hasta nuestros días.
4 Montero-Calasanz M.C.
Introducción
1.2. Origen del olivo
El olivo es una de las plantas cultivadas más antiguas junto con la vid, la higuera
y la palmera datilera, (Rallo, 1995). Los restos de endocarpio encontrados por Zohary y
Spiegel-Roy en 1975 en los yacimientos arqueológicos de Teleilat Ghassul (Valle del
Jordán) remontan su origen a los 4000-3000 años a.C. en la región geográfica que va
desde el sur del Cáucaso hasta las altiplanicies de Irán, Palestina y la zona costera de
Siria. Más tarde se extendió por Chipre hacia Anatolia y a través de Creta, hacia Egipto,
hasta poblar todos los países ribereños del mediterráneo, constituyéndose como la
especie autóctona más característica de la Cuenca Mediterránea y uno de los pilares
básicos de su agricultura y alimentación. La historia del olivo es, por tanto, la historia
del Mediterráneo.
Con el descubrimiento de America pasó y se extendió por el nuevo mundo
(California y Sudamérica) y en la actualidad se cultiva también en Sudáfrica, China,
Japón y Australia (Nico et al., 2002; Rallo, 2005).
A través de los tiempos, el olivo siempre ha estado vinculado con lo divino y lo
sobrenatural, aunque en permanente contacto con el ser humano, para beneficiarle en
todos los sentidos. Las referencias documentales y arqueológicas primigenias más
fiables acerca de la aparición y uso del aceite de oliva provienen de la época
correspondiente al Antiguo Egipto. Aquí, el árbol ya era empleado como un símbolo en
los sarcófagos y el aceite de oliva en los sacramentos, con tal importancia que, según su
mitología, es la misma diosa Isis quien enseña a los hombres el cultivo del olivo. Para la
civilización griega, éste había sido un regalo de la diosa Palas a la ciudad de Atenas y
estuvo relacionado con la vida, la paz, la victoria y la fertilidad, siendo junto a la
higuera los árboles del Paraíso Terrenal. En España, el cultivo del olivo, como tal, se
inició con la civilización fenicia (Rallo, 2005) fruto de las intensas relaciones
económicas entre fenicios y griegos, pero no fue hasta la ocupación romana de
Hispania, cuando la extensión olivarera empezó a cobrar cierta importancia,
especialmente en la Bética. Sin embargo, a pesar del enorme desarrollo del cultivo en
todo el Imperio Romano, reflejado en los restos arqueológicos hallados y en los tratados
de Catón, Columela, Plinio y Paladio, estos agrónomos clásicos no le dedicaron mucha
atención (Calero, 2006), ya que el olivar, a pesar de su importancia cuantitativa y
comercial, era considerado como un cultivo casi de relleno complementario a los otros
dos de la triada mediterránea (trigo y vid). Posteriormente, los árabes perfeccionaron las
Introducción
técnicas de obtención de aceite y consideraron a éste como un producto imprescindible

para la vida social y económica de los habitantes de la península, concepciones que han
llegado hasta nuestros días.
1.3. Importancia actual
En la actualidad, el sector del olivar se encuentra experimentando una fase de

expansión, en términos de producción y de nuevas tierras de cultivo. Esta expansión es
debida al incremento de la demanda de aceite de oliva por mercados nacionales e
internacionales, tras la comprobación de sus propiedades nutritivas y sus efectos
favorables sobre la salud, que ha sido acompañado con un aumento y modernización en
la actividad viverística (Fontanazza y Cipriani, 2001; Porras-Soriano et al., 2006). Así,
actualmente se dedican 9,5 millones de hectáreas al cultivo del olivar (969 millones de
pies de olivos plantados) que dan lugar a una producción de 2.948.000 Tm de aceite de
oliva y 2.266.500 Tm de aceituna de mesa, según datos estimativos del Comité Oleícola
Internacional para la Campaña 2010/2011 (COI, 2011), siendo la región mediterránea,
tal y como se observa en las figuras 1.2. y 1.3., donde se concentra el 93 % de la
producción global (Datos estimativos del COI para la Campaña 2010-2011), así como
casi el 98 % de la superficie cultivada (Kacem et al., 2009).
Marruecos
Otros 5%
6% Jordania Argelia Siria
Portugal 1% 2% 7%
2% Túnez
4%
Italia
16% Turquía
5%
Grecia
11%
España
41%
Figura 1.2. Principales países productores de aceite de oliva. Balance estimativo

Campaña 2010/2011 (COI, 2011).
Introducción
Otros países Israel

Túnez 1% Líbano 6% Albania 1%
1% 1% Argentina
Italia 4% 9%
Argelia
Grecia 6% 6%
Egipto Estados Unidos
13% 4%
España
21% Irán 2%
Turquía Marruecos 6% Jordania 1%
15%
Siria 7%
Figura 1.3. Principales países productores de aceituna de mesa. Balance estimativo

Campaña 2010/2011 (COI, 2011).
España es el primer país productor de aceituna del mundo (5.485.374 Tm;

Ministerio de Medio ambiente y Medio Rural y Marino - MARM, 2009), originando el
41 % del aceite de oliva (1.197.400 Tm) y el 21 % de la de aceituna de mesa (470.800
Tm), según datos estimativos del COI para la campaña 2010-2011. De ellas, 702.308 y
14.936 Tm, respectivamente, se exportaron a países de la Unión Europea (UE), como
Alemania, Italia, Francia o Portugal, y a Estados Unidos, Canadá o Australia generando
un comercio exterior de 326.125 millones de Euros en 2008 (MARM, 2009). La base de
estas cifras se encuentra en la gran extensión dedicada al olivar en España (2.450.471 ha
en plantación regular en 2008; MARM, 2009), donde constituye una de las principales
formaciones vegetales, ocupando más del 14 % de las tierras de cultivo y más del 51,4
% de este cultivar en la Comunidad Europea (CE) (MARM, 2009).
Desde el punto de vista histórico, dentro de España, la distribución del cultivo
está condicionada por las exigencias climáticas de la planta. Como consecuencia, la
superficie de cultivo del olivar se encuentra concentrada principalmente en el sur y este
de la península, mientras que su presencia es escasa en la Meseta Norte, la Cornisa
Cantábrica y Galicia (Figura 1.4.). De hecho, la Comunidad Autónoma andaluza posee
más del 17 % de su superficie total cubierta por olivos (más de 1,5 millones de ha),
representando el 63 % del olivar de España (MARM, 2009), y más del 15 % del total
mundial (MARM, 2009) situándose así, en la primera comarca mundial productora de
aceitunas.
Introducción
Ceuta 0
Melilla 11
Galicia 10
Canarias 68
Andalucía
Extremadura 262.700 1.511.687
R. de Murcia 23.225
C. Valenciana 94.808
Castilla-La Mancha 334.653
Madrid 25.467
Castilla y León 7.909
Baleares 8.101
Cataluña 122.805
Aragón 47.920
La Rioja 5.086
Navarra 5.640
País Vasco 192
Cantabria 0
P. de Asturias 0
0 500000 1000000 1500000 2000000

Extensión (ha)
Figura 1.4: Superficie de olivar en España por comunidades. Año 2008 (MARM,
2009).
El gran desarrollo del cultivo en la región andaluza se ha debido no sólo a las

características climáticas, sino también al aumento de la productividad y al incremento
de nuevas plantaciones en la última década propiciada por la Organización Común de
Mercados (OCM) al reformar el sector del aceite de oliva. Esto, asociado a la
innovación y mejora de la técnicas de propagación, facilitó la rápida producción de
plantas homogéneas (Nico et al., 2002), propulsando al olivar como uno de los cultivos
extensivos que más empleos genera por unidad de superficie (más de 46 millones de
jornales anuales) (Gómez del Campo y Barranco, 2009), lo que lo convierte en una
actividad vital para el tejido rural andaluz (Guzmán Álvarez, 2005). Pero para
Andalucía el olivar no es solo un cultivo, es paisaje, cultura, dieta e historia y también
un agroecosistema con alto valor medioambiental, constituyendo uno de sus sectores
más emblemáticos y vertebradores de la sociedad andaluza.
Introducción
1.4. Variedades de olivo
El práctico confinamiento al área mediterránea del cultivo del olivo ha impedido

que éste se beneficie, en la misma medida que otras especies frutales, de los avances
que la investigación agraria ha generado en otras áreas (Rallo, 2005). Esto, unido a la
alta propagación vegetativa que presenta el olivo (Bartual et al., 2000) ha determinado
que, las características de los cultivares que inicialmente seleccionaron los primeros
olivicultores de cada zona en sus bosques de acebuche y que, constituyeron las primeras
variedades, se hayan conservado hasta nuestros días. Así, en la actualidad, en la mayoría
de los países oleícolas, se siguen cultivando un gran número de variedades, todas ellas
muy antiguas, con unas zonas de difusión restringidas a sus posibles lugares de origen y
en muchos casos improductivas desde el punto de vista comercial.
El material vegetal del olivo cultivado en España está compuesto por 272
variedades, existiendo referencias de que las variedades más importantes de la
actualidad ya lo eran en el siglo XV (Rallo, 2005). Como se expuso anteriormente, el
desarrollo viverístico y la reforma del aceite por el OCM propició un incremento en la
rentabilidad del cultivo, motivando la modificación en distintos grados de la estructura
varietal española. De este modo, se seleccionaron las variedades más aptas en cuando a
aptitud al enraizamiento, rapidez de entrada en producción y rentabilidad
(productividad) y empezaron a cultivarse fuera de sus zonas de ubicación tradicional
(Estaún et al., 2003), dando lugar a una serie de variedades principales (Tabla I.1.),
entre las que destaca `Picual´ por la extensión que ocupa a nivel nacional con 860.000
ha.
A pesar de los cifras mostradas en cuanto a superficie e importancia de las
variedades, según datos de la Oficina Española de Variedades Vegetales del MARM, en
las últimas siete campañas la variedad de más implantación fue Àrbequina´ con un 66
%, una variedad que tradicionalmente no ha sido de gran importancia nacional, seguida
a una considerable distancia de „Picual‟ (12 %) y „Hojiblanca‟ (7 %).
Introducción
Tabla I.1.Superficie ocupada por las principales variedades de olivo cultivadas en

España (Barranco et al., 2008).
Superficie
Variedad Destino Difusión
( x 1000 ha)
Picual AC 860 Jaén, Córdoba, Granada
Conicabra AC 269 Ciudad Real, Toledo
Hojiblanca AC-MS 217 Córdoba, Málaga, Sevilla
Lechín Sevilla AC 105 Sevilla, Cádiz
Manzanilla Sevilla MS 85 Sevilla, Badajoz
Morisca AC 74 Badajoz
Zaragoza, Teruel,
Empeltre AC 72
Baleares
Arbequina AC 71 Lérida, Tarragona
Manzanilla cacereña MS-AC 64 Cáceres, Salamanca
AC: Usada para obtención de aceite, MS: Usada para aceituna de mesa.
El valor que está adquiriendo la variedad arbequina (toponímico de Arberca,

localidad de Lérida, donde se supone que se inició su cultivo) (Figura 1.6.) se debe a su
reducido vigor que permite su utilización en plantaciones intensivas (Figura 1.5.) tipo
seto, posibilitando su mecanización (abaratamiento de costes), unido a una capacidad de
enraizamiento elevada, una precoz entrada en producción y una productividad alta y
constante, con un rendimiento graso elevado y una calidad de aceite excelente por su
cualidades organolépticas, aunque presenta baja estabilidad.
Figura 1.5. Plantación de olivos en

seto (http://www.provedo.com).
Introducción
A pesar del gran auge que en estos momentos posee Àrbequina´, hoy por hoy,
la variedad picual (Figura 1.7.), cuya denominación hace referencia a la forma apuntada
que presentan sus frutos, continúa siendo la más importante de España. `Picual´ es
apreciada por su elevado rendimiento graso, por poseer un aceite con un alto índice de
estabilidad (resistencia al enranciado), un porcentaje de ácido oleico muy elevado y por
la facilidad de cultivo. Además, es una variedad de fácil propagación vegetativa con una
entrada en producción precoz y una productividad elevada y constante.
Figura 1.6. Aceitunas de la variedad Figura 1.7. Aceitunas de la variedad

arbequina (Barranco et al., 2005). picual (Barranco et al., 2005).
La variedad hojiblanca (Figura 1.8.) cuya denominación hace referencia al color

claro de sus hojas, es la tercera variedad española en cuanto a superficie cultivada
(217.000 ha) debido a la doble aptitud de su fruto, ya que puede utilizarse para la
obtención de aceite, siendo este muy apreciado por su calidad, o para aceituna de mesa.
Sin embargo, posee una precocidad de entrada en producción media, una productividad
elevada pero alternante, una capacidad de enraizamiento mediana y un contenido en
aceite bajo y con poca estabilidad.
Figura 1.8. Aceitunas de la variedad Figura 1.9. Aceitunas de la variedad

hojiblanca (Barranco et al., 2005). koroneiki (http://www.vitisnavarra.com).
Introducción
Por último, cabe resaltar la variedad griega `Koroneiki´ (Figura 1.9.) que aún sin
disponer de datos sobre su implantación en España, en un futuro cercano
previsiblemente será unas de las variedades más utilizadas debido a la tendencia actual a
emplear variedades con una entrada en producción precoz, productividad elevada
(durante los primeros años) y un reducido vigor (Barranco et al., 2008) que permiten la
plantación en seto y la mecanización. En Grecia, la variedad koroneiki abarca la mitad
de la superficie olivarera, destacando, además de por las características señaladas, por
presentar un alto rendimiento graso y un contenido en ácido oleico (gran estabilidad)
elevado, aunque una baja resistencia al frío.
2. Multiplicación vegetativa del olivo

La planta del olivo, como se ha mencionado, posee una buena capacidad para
multiplicarse vegetativamente. Esta característica es debida a las numerosas yemas
latentes presentes, que se desarrollan ante estímulos externos de diversa naturaleza,
facilitando la producción de raíces adventicias en propágulos de diverso tamaño
(Barranco et al., 2008) y por tanto, la posibilidad de aplicar diversas técnicas de
multiplicación.
2.1. Métodos tradicionales
El sistema tradicional de multiplicación del olivo más usado en España hasta los
años 70 ya se practicaba en la época romana (Cubero, 1993). Este método tradicional
consistía en el enraizamiento en suelo de grandes propágulos, estacas leñosas de 20-60
cm de longitud y de 5-10 cm de grosor, obtenidas de ramas de poda de olivares adultos.
Estas estacas recibían el nombre de garrotes o bien zuecas, cuando eran trozos de raíces
(Figuras 1.10. y 1.11.). El método presentaba como ventaja fundamental, la obtención
de individuos que mostraban todas las características de la planta madre. Sin embargo,
éste requería de gran cantidad de material vegetal, lo que dificultaba el control genético
y sanitario, limitando la propagación únicamente a la época de poda (Porras-Piedra et
al., 1998), además de una poda de formación más costosa (Centeno et al., 2008), del
daño producido en la planta madre y el retraso en el desarrollo que suponía el trasplante
de las plantas a raíz desnuda (Barranco et al., 2008).
Introducción
Figura 1.10. Multiplicación vegetativa Figura 1.11. Multiplicación vegetativa

a través de estacas o garrotes (Caballero a través de zuecas (Caballero y del Río,
y del Río, 1994). 1994).
. .
2.2. Propagación viverística del olivo mediante estaquillado

semileñosos bajo nebulización
2.2.1. Antecedentes
Desde el punto de vista comercial, los métodos tradicionales de propagación de

olivo, aún haciéndose en vivero, nunca hubiesen podido suministrar las plantas
necesarias para el aumento de superficie que ha tenido lugar durante estos últimos años.
De modo que en los años 40 se comienza la búsqueda de un nuevo sistema de
multiplicación, que culmina el profesor Hartman en 1946 con el desarrollo del método
de estaquillado semileñoso bajo nebulización, aunque no es hasta bien entrada la década
de los 70 cuando se empiezan a modificar los procedimientos tradicionales de
propagación vegetativa y se expande el viverismo. En la actualidad, esta técnica ha
llegado a ser la más empleada (İsfendiyaroğlu et al., 2009) en la Cuenca Mediterránea
(90 %), contribuyendo eficazmente a la mejora de la olivicultura y a la tecnificación de
la industria viverística del olivo, surgida como consecuencia de una mayor rentabilidad
del cultivo (del Río y Caballero, 2005; Barranco et al., 2008).
2.2.2. Descripción del método
El método de enraizamiento de estaquillas semileñosas bajo nebulización,

revisado y descrito posteriormente por Caballero y del Río en 1994, se basa en la
aplicación de reguladores de crecimiento favorecedores de la rizogénesis sobre
Introducción
estaquillas semileñosas de unos 10 cm de longitud, deshojadas en la zona basal y con

dos o tres pares de hojas apicales. Su éxito reside en mantener vivas estas estaquillas
clavadas a una profundidad de 3-4 cm en un medio inerte (Porras-Piedra et al., 1998).
Para ello son mantenidas en el interior de un túnel de nebulización a una temperatura
favorable al crecimiento y con un alto grado de humedad. Frente a los métodos
tradicionales, esta técnica ofrece como ventaja fundamental la posibilidad de enraizar
brotes del año, que poseen mayor capacidad para formar raíces que las estacas,
obteniendo así un gran número de plantas del mismo olivo (identidad varietal), con la
calidad y las características que exigen las modernas técnicas de cultivo (Porras-Piedra,
2005; Rallo, 2005; Porras-Soriano et al., 2006). Asimismo, permite el enraizamiento en
cualquier época del año (Barranco et al., 2008).
Básicamente, la propagación viverística del olivo mediante este método,
resumida en la figura 1.13., consta de tres fases: un enraizamiento, para provocar la
emisión de varias raíces adventicias en las bases de las estaquillas, un endurecimiento
para promover el funcionamiento de los sistemas radicales obtenidos y una crianza de
los plantones, cultivados en bolsa, a un solo tronco.
I. Enraizamiento
El enraizamiento es la fase más importante y delicada en la propagación del

olivo por encontrarse ligada a factores biológicos y físicos (Porras et al., 1999;
Sebastiani y Tognetti, 2004), que dan lugar al equilibrio hormonal-nutricional necesario
para que se produzca el proceso (Centeno et al., 2008).
La formación de raíces comienza con una desdiferenciación de células del tallo,
como respuesta a la herida producida. A continuación, algunas células cercanas a los
tejidos vasculares se dividen y forman inicios de raíz que se desarrollan, dando lugar a
los primordios de raíz. Éstos progresan y establecen las conexiones entre los tejidos
vasculares de las nuevas raíces y los del tallo, provocando la aparición externa de las
raíces. Estas raíces, a menudo, emergen a través de la
formación de un callo (Figura 1.12.), una masa
irregular de células parenquimáticas en distintos
estados de lignificación, que se desarrolla en la parte
basal de la estaquilla (Hartmann et al., 2002). Este
periodo ocupa unos sesenta días.
Figura 1.12. Formación del
callo.
Introducción
Figura 1.13. Esquema de la propagación viverística del olivo.
Introducción
Figura 1.13. (Continuación).
Introducción
Figura 1.13. (Continuación).
II. Endurecimiento
Cuando las estaquillas se encuentran enraizadas, se trasplantan a pequeñas

macetas que contienen un sustrato no inerte, pero ligero y con buen drenaje y se
mantienen en invernadero. Las plantas permanecerán en esta fase hasta la brotación de
un par de hojas, señal indudable de que el sistema radical recién formado cumple su
función. El riego se suele realizar por microaspersión.
III. Crianza
Pasadas unas semanas, se trasplantan a bolsas de plástico de 3 a 5 litros de

capacidad, para asegurar la formación de un buen sistema radical, que contienen arena
limosa con algo de turba y abono de liberación lenta, en las que las plantas completan su
crecimiento bajo umbráculo o al aire libre, dependiendo de la época del año y del clima
del lugar. Estos plantones se desarrollan de 12 a 18 meses tras los cuales, están
Introducción
dispuestos para su venta e implantación en el terreno (Soriano-Martín et al., 2006;

Porras-Soriano et al., 2006; Barranco et al., 2008). El riego se realiza por
microaspersión.
Después del trasplante a campo, los plantones requieren de 5 a 7 años, según
variedad, hasta que pueden considerarse productivos (Porras et al., 1999; Barranco et
al., 2008).
2.2.3. Factores que determinan el enraizamiento
Como se comentó anteriormente, la capacidad de enraizamiento de las

estaquillas semileñosas de olivo está condicionada tanto por variables biológicas (el
material vegetal), como físicas (factores de crecimiento externos, nebulización,
temperatura y sustrato), de modo que la rentabilidad de este método en las distintas
variedades vendrá determinada por el control de estos parámetros.
2.2.3.1. Variables biológicas
Material vegetal
Para asegurar el éxito del enraizamiento es necesario contar con material vegetal
proveniente de plantas con un buen estado fitosanitario, vigorosas, de características
productivas reconocidas, en activo crecimiento vegetativo, que no proceda ni de ramos
en descarga, ni de árboles en carga ni con inflorescencias o frutos (del Río et al., 1988).
Asimismo, a pesar de que mediante esta técnica es posible la multiplicación comercial
de casi todas las variedades de olivo (Barranco et al., 2008), en diversos estudios entre
cultivares se observaron importantes diferencias causadas por el particular equilibrio
endógeno que cada variedad tiene de fitohormonas (del Río y Caballero, 2005;
İsfendiyaroğlu et al., 2009).
Introducción
2.3.3.2. Variables físicas
Factores de crecimiento radical: Auxinas
A finales del siglo XIX, estudios realizados por Julios von Sachs y Charles
Darwin postularon la existencia de sustancias que se movían a través de la planta y que
eran responsables de la morfología definitiva de cada órgano y de la capacidad de
movimiento ante estímulos luminosos (tropismos). Este descubrimiento llevó a F.W.
Went en 1928 a establecer una relación entre la cantidad de estímulo aplicado y la
respuesta fisiológica observada. Admitida la existencia de una molécula estimuladora,
K.V. Timan en 1935, usando extractos de cultivos del hongo Rhizopus suinus, consiguió
obtener una sustancia a la que denominó auxina (del griego: hacer crecer, incrementar).
Las auxinas son hormonas vegetales (fitohormonas), señales químicas
sintetizadas en los tejidos meristemáticos que facilitan la comunicación entre las células
y coordinan sus actividades (Ali, 2009). Este control se realiza a través de cambios en la
concentración y la sensibilidad de los tejidos a éstas (Remans et al., 2008),
observándose mayor susceptibilidad en las raíces que en las yemas y en las segundas
que en los tallos, aunque esta respuesta puede variar con la edad de la planta o las
condiciones ambientales (Acosta Echevarría et al., 2008).
Las auxinas participan en muchos procesos del desarrollo vegetal como son el
crecimiento, la división celular del cambium, la diferenciación vascular, la dominancia
apical, el enraizamiento, la partenocarpia, los tropismos, la abscisión o el desarrollo de
frutos (Aloni et al., 2006). Éstas favorecen el desarrollo vegetal porque modifican la
expresión génica y producen una extensibilidad celular al inducir factores que
“ablandan” la pared de las células, siendo el principal factor la acidificación del espacio
apoplástico (hipótesis del crecimiento por acidificación) (Taiz y Zeiger, 2006). No
obstante, las funciones de las hormonas vegetales en el desarrollo de las plantas deben
contemplarse desde la perspectiva de una interacción entre distintos grupos de
hormonas (citoquinas, giberelinas, etileno y auxinas).
Las auxinas pueden dividirse en naturales y sintéticas. Entre las primeras
encontramos el ácido fenilacético, los cloro-indoles, el ácido indolbutírico (AIB) y la
más característica de todas, el ácido indolacético (AIA). Entre las auxinas sintéticas, con
naturaleza química muy diversa, localizamos ácidos indólicos, ácidos naftalénicos,
clorofenoxiácidos y derivados de los ácidos benzoico y picolínico (Figura 1.14.).
Introducción
Figura 1.14. Tipos de auxinas (Acosta Echevarría et al., 2008).
El ácido indolil-3-acético, ácido indolacético o AIA es la auxina natural más

característica y relevante en cuanto a actividad y cantidad, ya que se encuentra
ampliamente distribuida por todo el reino vegetal (Acosta Echevarría et al., 2008). Su
biosíntesis es llevada a cabo a través de varias rutas en plantas, siendo las más
frecuentes las mediadas por el aminoácido triptófano (Try) o uno de sus precursores,
principalmente la ruta del ácido indolpirúvico (Figura 1.15.), aunque, se han encontrado
rutas alternativas independientes del Try.
Figura 1.15. Rutas de biosíntesis de auxinas en plantas dependientes de Try (Taiz y

Zeiger, 2006).
Introducción
La multiplicación del olivo a partir de estaquillas semileñosas se basa, como ya

se ha comentado, en la utilización de productos que favorecen el enraizamiento. Ya en
la edad media, los jardineros holandeses envolvían las estacas de rosales con granos de
cereal para facilitar el enraizamiento, viéndose más tarde que las semillas cuando
germinan producen auxinas (Hartmann et al., 2002). La aplicación de auxinas en la
propagación vegetativa de las especies agrícolas y ornamentales es una práctica muy
común, aunque las necesidades que requiere cada especie o variedad y cada momento
del proceso de enraizado son diferentes. No obstante, esta aplicación en la base de los
esquejes, sin lugar a dudas, estimula la actividad de la planta para conseguir su
enraizamiento, completando la acción de las propias hormonas producidas en los tejidos
meristemáticos de las hojas (Porras-Piedra et al., 1998).
En el cultivo del olivo, la auxina usada por antonomasia y que mejores
resultados ha dado, ha sido el AIB (Hartmann, 1946; Weisman y Lavee, 1995; Porras-
Piedra et al., 1998; Centeno et al., 2008) desde que Zimmerman y Wilcoxon en 1935
demostraran que este producto de síntesis era más eficaz que la propia auxina natural,
AIA, en la estimulación artificial del enraizamiento. Además, el AIB no produce efectos
tóxicos en la planta en un amplio rango de concentraciones, es relativamente estable,
posee poca movilidad y puede conservarse en oscuridad y refrigeración durante largos
periodos (Barranco et al., 2008).
Nebulización
Durante la fase de enraizamiento, el riego se realiza por nebulización, que

consiste en la producción de niebla artificial mediante la pulverización de agua fría a
través de boquillas especiales colocadas convenientemente por toda la mesa de
propagación. Esta niebla origina una alta humedad relativa (80-90 % Hr) que produce el
depósito de finas gotas sobre las hojas de las estaquillas, formando una película. Esta
película disminuye la temperatura de la estaquilla y reduce la transpiración, evitando así
la deshidratación y, logrando mantener vivas las estaquillas hasta que enraízan.
Asimismo, el descenso en el ritmo de respiración y de la presión de vapor interna de las
hojas da lugar, a un saldo positivo de asimilados, necesario para la formación de raíces.
En todo momento, dicha nebulización ha de realizarse en habitáculos herméticos
y ser intermitente, para no mojar demasiado el sustrato, ni disminuir la temperatura y
para evitar la pérdida, por lavado de las hojas, de nutrientes o compuestos necesarios
Introducción
para la iniciación radical (Rallo y del Río, 1990; Barranco et al., 2008). Estos objetivos
se logran mediante la utilización de sistemas automáticos.
Temperatura
El mantenimiento de la humedad a nivel de saturación exige la instalación de

sistemas de calefacción y refrigeración automatizados que controlen de manera estable,
tanto la temperatura ambiental, entre 20 y 30 ºC, como la de de fondo, en 2-4 ºC por
encima de la ambiental (Barranco et al., 2008).
Sustrato
El sustrato debe ser poroso para evitar posibles encharcamientos accidentales,

pero lo suficientemente denso y firme para mantener las estaquillas en su lugar durante
el enraizamiento. Además, debe tener un volumen muy constante tanto húmedo como
seco, retener la suficiente humedad para no precisar riegos demasiados frecuentes y
estar libre de semillas, nematodos u otros organismos nocivos (Centeno et al., 2008). El
sustrato más usado es la perlita, aunque también es utilizada mezclada con fibra de coco
(İsfendiyaroğlu et al., 2009).
2.3. Propagación del olivo in vitro
La micropropagación es una técnica de propagación vegetativa basada en la

capacidad de multiplicación que poseen las células vegetales de las yemas cuando son
sometidas a condiciones nutritivas y ambientales adecuadas y son estimuladas con
determinados reguladores de crecimiento. Esta inducción da lugar a nuevos brotes que,
una vez enraizados, forman nuevas plantas (Figura 1.16.). Es un procedimiento
relativamente rápido que permite la obtención de plantas de las mismas características
genéticas que las de origen en cualquier época del año y que facilita la propagación en
aquellas variedades difíciles de enraizar por medio de técnicas convencionales (García-
Férriz, et al., 2003). Además, posee las ventajas de poder mantener las plantas por
tiempo indeterminado, para ser utilizadas en el momento requerido por el productor y la
capacidad de inducir características de interés agronómico mediante la realización de
microinjertos. Sin embargo, la propagación in vitro del olivo, desde el punto de vista
Introducción
comercial, aún encuentra serias dificultades en la mayoría de las variedades debido a

inadecuadas formulaciones de los medios de cultivos, a variaciones clonales (Peyvandi
et al., 2010) y a las frecuentes contaminaciones que se producen en los explantes
iniciales (Fernández-Aparicio et al., 2001).
a b
c d
Figura 1.16. Propagación in vitro del olivo.

Imagen a: obtención de las yemas. Imagen b: proliferación de brotes en un medio de
cultivo adecuado. Imagen c: Formación del Callo. Imagen d: Formación y
elongación de raíces (Fernández-Aparicio et al., 2001)
3. La agricultura ecológica
3.1. Antecedentes
Los orígenes de lo que hoy se conoce como agricultura ecológica (AE),

biológica u orgánica se remontan a principios del siglo XX, en el seno de algunos países
centroeuropeos. Su desarrollo estuvo marcado por la influencia de diversas corrientes de
pensamiento surgidas en un momento de plena expansión de la agricultura química y, a
contracorriente de ésta. Ya entonces, algunos científicos y sectores sociales percibieron
los posibles efectos negativos sobre la calidad de los alimentos y el medio ambiente del
modelo de agricultura que se iba imponiendo. Sin embargo, no fue hasta la década de
los 70 cuando la sociedad comenzó a ser consciente de la importancia de integrar el
concepto de sustentabilidad en los modelos de desarrollo económico. De este modo,
Introducción
resurgió la filosofía que inspiró a la AE y se creó en 1972, en Versalles, la Federación

Internacional del Movimiento de Agricultura Ecológica (Internacional Federations of
Organic Agriculture Movements), IFOAM, que sentó las bases de la actual AE. Aunque
no fue hasta 1991 cuando, ante la existencia de una demanda cada vez mayor de
productos agrarios y alimentarios obtenidos de forma ecológica, se adoptaron normas, a
nivel comunitario, a través del reglamento (CEE) 2092/91 del consejo, de 24 de junio
(DOCE nº L198 de 22/7/91), sobre la producción agrícola ecológica y su indicación en
los productos agrarios y alimenticios. Con posterioridad, desde el 1 de enero de 2009 la
producción ecológica está regulada por el Reglamento (CEE) 834/2007 por el que se
deroga el Reglamento (CEE) 2092/91 y por los Reglamentos: R(CEE) 889/2008 y
R(CEE) 1235/2008.
3.2. Estado actual de la AE
3.2.1. Principios de la AE
Según la reglamentación europea actual, el método de producción ecológica

constituye una forma específica de producción agraria que implica importantes
restricciones en la utilización de fertilizantes y pesticidas que puedan tener efectos
desfavorables sobre el medio ambiente (productos químicos de síntesis). Además, este
método de producción, conlleva una utilización menos intensiva de la tierra,
contribuyendo a la protección del medio ambiente y a la obtención de productos de
calidad (Centeno et al., 2008).
En la actualidad, la AE está adquiriendo cada vez un mayor reconocimiento e
importancia a nivel mundial, en consonancia con la mayor concienciación colectiva
sobre las consecuencias negativas derivadas de la aplicación del modelo de producción
agraria convencional y la creciente preocupación por los temas medioambientales.
Asimismo, la AE se contempla no sólo como una estrategia de acción sostenible sino
como un gran potencial para la agricultura mundial, ya que se considera que da
respuesta en un doble sentido a las exigencias sociales. Por un lado, como se dijo, se
producen alimentos de calidad de un modo respetuoso con el entorno, pero por otro, se
percibe como un instrumento de desarrollo rural que promueve el mantenimiento de la
población, contribuye a la calidad y conservación del paisaje y favorece la biodiversidad
(Guzmán Álvarez, 2005). De manera resumida, frente a la productividad y rentabilidad
Introducción
económica que impera en las explotaciones convencionales, la agricultura ecológica

propone la consideración conjunta de criterios económicos, técnicos, socioculturales y
medioambientales.
3.2.2. La AE en España
En el caso concreto de España no fue hasta a principios de la década de los 80,

cuando comenzó a interesarse por los problemas del medio ambiente y empezaron a
aparecer las primeas asociaciones biológicas, con el fin de dar respuesta a la demanda
de productos ecológicos proveniente de los países del norte. A pesar de este tardío
interés, España logró ser uno de los países pioneros de la actual UE en reglamentar la
producción de alimentos ecológicos. En la década de los 90, tras la reglamentación
europea, esta forma de producción despegó definitivamente (Figura 1.17.), pasando de
4.325 a 1.602.868 ha en el 2009 de las que 866.800 ha correspondieron a la comunidad
andaluza (Figura 1.18.) (MARM, 2009). Según estos datos, la AE se ha convertido en
uno de los sectores agrarios más dinámicos, con un índice de crecimiento anual de un
22 %, que presenta unas perspectivas halagüeñas para los próximos años y un mercado
en expansión que refleja las inquietudes de los consumidores por una alimentación sana
y una protección del medio ambiente.
1.800.000
1.600.000
1.400.000
Superficie (ha)
1.200.000
1.000.000
800.000
600.000
400.000
200.000
0
1998
2003
1991
1993
1994
1995
1996
1997
1999
2000
2001
2002
2004
2005
2006
2007
2008
2009
Figura 1.17. Serie histórica de la superficie de AE en miles de ha (MARM, 2009).
Introducción
Galicia 14.238
Canarias 4.232
Andalucía 866.800
Extremadura 115.018
R. de Murcia 60.742
C. Valenciana 38.754
Madrid 6.043
Castilla y León 22.154
Baleares 29.569
Cataluña 71.734
Aragón 66.730
La Rioja 8.634
Navarra 30.843
País Vasco 1.484
Cantabria 5.796
0 200.000 400.000 600.000 800.000 1.000.000

Extensión (ha)
Figura 1.18. Superficie dedicada a AE por comunidades autónomas (MARM,

2009).
3.2.3. El olivar ecológico
En este contexto de importante crecimiento de la producción ecológica en

España, destaca el desarrollo experimentado por el olivar ecológico (127.041 ha),
erigiéndose como el principal cultivo ecológico en cuanto a superficie, sin contar los
“pastos, praderas y forrajes” (MARM, 2009). Este desarrollo es bastante comprensible,
si se tiene en cuenta, las ventajas económicas (Gómez del Campo y Barranco, 2009) y
que es un cultivo cuya reconversión a la AE resulta relativamente fácil (Alonso Mielgo,
2001), ya que para su producción según las prácticas de la agricultura convencional,
precisa relativamente de poca cantidad de productos químicos de síntesis.
Precisamente por la gran importancia de la olivicultura en Andalucía, es en esta

comunidad donde se concentra la mayor superficie cultivada (46.648 ha), seguida de
Introducción
Extremadura (38.221 ha) (Figura 1.19.). Sin embargo, en términos relativos, esta forma
de producción olivícola es aún reducida, lo que convierte a esta comunidad en una
región con un importante potencial de desarrollo de la AE (MARM, 2009).
Galicia 12
Canarias 20
Andalucía 46.648
Extremadura 38.221
R. de Murcia 2.666
C. Valenciana 2.331
Madrid 2.241
Castilla y León 115
Baleares 705
Cataluña 3.176
Aragón 2.154
La Rioja 573
Navarra 316
País Vasco 1
Cantabria 0
P. de Asturias 0
0 10000 20000 30000 40000 50000

Superficie (ha)
Figura1.19. Superficie dedicada al cultivo de olivar ecológico por comunidades

autónomas (MARM, 2009).
A pesar de este crecimiento exponencial, los olivareros del sector ecológico se

encuentran con necesidades tecnológicas que actualmente no pueden resolver. Como ya
se ha mencionado, la actual multiplicación viverística del olivo se basa en el método de
estaquillado semileñoso bajo nebulización. Este método implica la utilización de una
hormona sintética, algo prohibido por uno de los pilares básicos de la AE. Así, en la
reglamentación vigente R(CEE) nº 889/2008 en su artículo 45 expone que podrán
utilizarse semillas y material de reproducción vegetativa procedentes de una unidad de
producción en fase de conversión a la agricultura ecológica; pero cuando esto no sea
posible los Estados miembros podrán autorizar de forma transitoria la utilización de
semillas o material de reproducción vegetativa no ecológicos si no se dispone de los
Introducción
mismos procedentes de la producción ecológica solamente en los cultivos en los que los
usuarios de dicho material de reproducción, puedan demostrar a entera satisfacción de
la autoridad o de los organismos de control del estado miembro que no les es posible
obtener en el mercado comunitario un material de reproducción obtenido de forma
ecológica para una variedad determinada de la especie en cuestión. Es por ello que,
estudios encaminados a encontrar sistemas alternativos para el enraizamiento de
estaquillas de olivos y en general, para la sustitución de compuestos químicos de
síntesis (fertilizantes, pesticidas, etc.) para la agricultura, son de total necesidad.
Actualmente, no existen productos que puedan sustituir al AIB en el
enraizamiento de estaquillas semileñosas de olivo, según los métodos de producción
ecológica, de forma rentable y eficaz (Suárez et al., 2002; Centeno et al., 2008).
4. Bacterias promotoras del crecimiento vegetal
4.1. La rizosfera
El término rizosfera fue utilizado por primera vez a principios del siglo XX por
Hiltner, agrónomo alemán, que acuñó este vocablo para referirse al “efecto”, traducido
en términos de mayor actividad microbiana, que las raíces de las leguminosas producían
sobre el suelo circundante. Sin embargo, hasta finales del siglo XX, ese “efecto”, no
pasó a considerarse como un ecosistema (Lynch, 1990). Así, la rizosfera, en general, es
el ecosistema comprendido en la porción de suelo adyacente a las raíces de las plantas
vivas, donde las propiedades de éste son influenciadas por la presencia y actividad de la
raíz. Asimismo, los cambios en las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo
rizosférico van a tener una repercusión significativa sobre el crecimiento y la salud de
las plantas (Remans et al., 2008; Richardson et al., 2009).
La rizosfera se divide en endorizosfera, tejidos radicales que incluyen la
endodermis y las capas corticales, rizoplana, superficie de la raíz con la epidermis y las
capas de polisacáraridos mucilaginosos, y ectorizosfera, el suelo asociado (Ali, 2009).
Esta pluralidad de ambientes da lugar a una franja muy dinámica que alberga una
amplia y diversa comunidad de procariotas y eucariotas, microbios que interaccionan
unos con otros y con las raíces de las plantas (Albareda et al., 2006), resultando en
asociaciones endofíticas, simbióticas, asociativas o parasíticas.
Introducción
El crecimiento y la composición de estas comunidades bacterianas y fúngicas

pueden ser selectivamente afectados por el estatus de nutrientes y el ambiente del suelo
(Glick et al., 2007; Richardson et al., 2009), así como por los nutrientes liberados por la
planta a través de sus exudados radicales, cuya composición y cantidad varía
dependiendo de la especie y las condiciones ambientales (Kumar et al., 2007). De este
modo, se crea un nicho muy selectivo donde la diversidad es baja (Marilley y Aragno,
1999; Ramos-Solano et al., 2003; Barriuso et al., 2005), resultado de una coadaptación
evolutiva (Wiehe y Höflich, 1995; Estévez, 2007), en el que proliferan especialmente
las bacterias (rizobacterias) (Barea et al., 2005). A su vez, las rizobacterias secretan
metabolitos hacia la rizosfera que son percibidos por las células radicales, produciendo
un incremento en sus exudados, y por otras bacterias presentes (van Loon, 2007),
desempeñando así, un papel crucial en el mantenimiento del balance ecológico del suelo
e influenciando en la salud de la plantas (Dwivedi et al., 2009) y en la calidad de los
suelos (Rodríguez-Romero et al., 2008). Por tanto, hay que considerar la existencia en
la rizosfera de una triple interacción entre planta-suelo-microorganismo (Lynch, 1990).
4.2. Bacterias que promueven el crecimiento vegetal (PGPR)
Hace casi 75 años, A. van Luijk, aislaba especies de Pythium que provocaban la
podredumbre en césped, cuando observó que las semillas germinaban en un mayor
porcentaje cuando no estaban estériles, demostrando por primera vez que los
microorganismos de suelo podían promover el crecimiento. Más tarde encontró que,
junto con las especies patogénicas de Pythium, también estaban presentes otras no
patogénicas que contrarrestaban las acciones llevadas a cabo por las primeras (supresión
de la enfermedad). Estas primeras observaciones dieron lugar al estudio de bacterias de
suelo con propiedades similares y de otras, que promovían el crecimiento vegetal en
ausencia de microorganismos patógenos (van Loon, 2007).
La promoción del crecimiento por microorganismos de suelo es algo frecuente y
se considera como parte de un continuo en el cual, las interacciones entre plantas y
microorganismos van desde deletéreas (patógenos) a beneficiosas (van Loon, 2007).
Entre las interacciones beneficiosas cabe resaltar las llevadas a cabo por las bacterias de
suelo de vida libre, usualmente denominadas rizobacterias que promueven el
crecimiento vegetal o PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) (Kloepper y
Schroth, 1978) (Figura 1.20.). Estas bacterias normalmente se localizan en la rizosfera,
Introducción
asociadas a las raíces de las distintas plantas (Lucas García et al., 2001; Gutiérrez-
Mañero et al. 2002; Khalid et al., 2004; Ahmad et al., 2008; Ali, 2009). En el amplio
grupo de microorganismos denominados PGPR se incluyen aquellas bacterias
rizosféricas que inducen el crecimiento de la planta mejorando su nutrición y/o
alterando su balance hormonal, aquellas que previenen o evitan el efecto de
microorganismos patógenos y las que ayudan en el establecimiento de micorrizas o
rizobios (Adesemoye et al., 2008; Barriuso et al., 2008 b; Kannan y Sureendar, 2009;
Glick, 2010). Así, las PGPR son componentes esenciales de la biomasa viva del suelo y
juegan un papel clave en los ciclos biogeoquímicos (Brown, 1974; Rekha et al., 2007;
Ashrafuzzaman et al., 2009).
El uso de PGPR representa una tecnología emergente diseñada para mejorar la
productividad de los sistemas agrícolas (Abbas-Zadeh et al., 2010) a largo plazo y
alineada con los principios de agricultura sostenible (Banchio et al., 2008; Shaharoona
et al., 2008; Felici et al., 2008; Naiman et al., 2009; Ramos-Solano et al., 2010), ya que
puede contribuir al establecimiento de una microbiota beneficiosa en la rizosfera
(Rodríguez-Romero et al., 2008). Los beneficios obtenidos con su aplicación han sido
ampliamente constatados en los rendimientos de diferentes cultivos (Shankar et al.,
2008), entre los que destacan: trigo y lechuga (Ali et al., 2009 b), colza (Glick et al.,
1997; Sergeeva et al., 2006), soja (Dashti et al., 1997; 1998), claveles (Li et al., 2005),
soja verde (Mayak et al., 1999), tomate (Ramos-Solano et al., 2010) o maíz (Mehnaz y
Lazarovit, 2006), pero también se han descrito mejoras en el enraizamiento de
estaquillas e incluso en micropropagación (Rodríguez-Romero et al., 2008), por lo que
la utilización de microorganismos en la industria viverística (Burdman et al., 2000;
Glick et al., 2007) del olivo puede ser de enorme importancia. Sin embargo, esta
promoción del crecimiento implica no sólo un efecto directo de una única cepa
bacteriana sino también, un dialogo molecular entre los distintos microorganismos del
suelo y entre éstos y la planta (Barriuso et al., 2008 a). Por tanto, un buen entendimiento
de los mecanismos de acción de las PGPR es fundamental para el manejo de la
rizosfera.
Introducción
Figura 1.20. Mecanismos de promoción de crecimiento vegetal (positivos y

negativos) asociados al suelo y a microorganismos rizosféricos (PGPR) (Richardson
et al., 2009).
IAA: ácido indolacético; BNI: fijación biológica de Nitrógeno; AM Fungi: hongos micorrícicos
arbusculares; ACC: 1-aminociclopropano-1-carboxilato.
4.2.1. Mecanismos de acción
Los mecanismos por los cuales las PGPR (Figura 1.20) pueden producir un
efecto positivo sobre el crecimiento de las plantas pueden clasificarse como directos e
indirectos (Glick et al., 1999; Lucy et al., 2004; Naveed et al., 2008 b; Ashrafuzzaman
et al., 2009), según se basen en procesos que ocurran dentro o fuera de la planta. No
obstante, la diferenciación entre ambos es, en ocasiones, difícil de establecer. Además,
una bacteria puede afectar al crecimiento y desarrollo vegetal usando uno o varios de
estos mecanismos y éstos, pueden ser utilizados en distintos tiempos del ciclo de vida de
Introducción
una bacteria (Hontzeas et al., 2006; Cheng et al., 2007; Naveed et al., 2008 a; Kaymak
et al., 2009; Ali et al., 2009 b). Asimismo, el impacto de los mecanismos usados por las
bacterias varía considerablemente dependiendo de la composición del suelo y de las
condiciones ambientales (Penrose y Glick, 2003; Glick, 2010).
4.2.1.1. Mecanismos indirectos
Las PGPR llevan a cabo una promoción indirecta del crecimiento por la acción
de una serie de mecanismos que, en última instancia, provocan una disminución o
prevención de los efectos adversos de los microorganismos patógenos (Kannan y
Sureendar, 2009). Entre estos mecanismos se incluyen: producción de antibióticos,
reducción de los niveles de hierro disponible en la rizosfera, inducción de la resistencia
sistémica (ISR, del inglés Induce Systemic Resistance; van Loon et al., 1998),
producción de enzimas líticas de la pared celular de hongos (quitinasas, β-1,3-
glucanasas, proteasas o lipasas), producción de ácido cianhídrico y competencia por
sitios de unión en la raíz (Glick et al., 2007; Ahmad et al., 2008; Ali et al., 2009 a).
4.2.1.2. Mecanismos directos
Directamente, las PGPR pueden facilitar el crecimiento vegetal debido a la

presencia de una serie de mecanismos entre los que se encuentran: la fijación de
nitrógeno atmosférico y la capacidad para suministrarlo a las plantas (Banchio et al.,
2008; Kannan y Sureendar, 2009); la síntesis de sideróforos que secuestran hierro del
suelo (Ashrafuzzman et al., 2009) y se lo proporcionan a las células vegetales; la
síntesis de fitohormonas como las auxinas, especialmente AIA (Rekha et al., 2007;
Dwivedi et al., 2009; Ali et al., 2009 b; Abbas-Zadeh et al., 2010), las citoquinas o las
giberelinas, que actúan incrementando el crecimiento vegetal; la solubilización de
minerales como el fósforo, haciéndolo más disponible para la planta (Güneç et al.,
2009) y la presencia de la enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC)
desaminasa, que puede disminuir los niveles de etileno en las plantas (Cheng et al.,
2007; Naveed et al., 2008 a; Glick, 2010).
De todos los mecanismos señalados, para la elaboración de este trabajo, nos
hemos centrado en los cuatro que se detallan a continuación:
Introducción
SÍNTESIS DE AUXINAS
Las auxinas son fitohormonas, implicadas en todos los aspectos de crecimiento y

desarrollo vegetal (Baca y Elmerich, 2007; Toklikishvili et al., 2010). La biosíntesis de
auxinas, además de en plantas, se ha descrito en algunos hongos, algunos protozoos y
ampliamente en las bacterias asociadas a plantas (Ona et al., 2005; Tsavkelova et al.,
2007), siendo cuantitativamente el AIA, la auxina natural más abundante sintetizada por
las rizobacterias (Bloemberg y Lugtenberg, 2001; Patten y Glick, 2002; Abbas-Zadeh et
al., 2010).
Como en plantas, en las rizobacterias se ha encontrado que el L-Try, proveniente
de los exudados radicales (Ahmad et al., 2008), es el principal precursor de AIA (Ona et
al., 2005; Ali et al., 2009 a) y la Vía del indolpirúvico la principal ruta de biosíntesis
(Patten y Glick 2002), aunque, igualmente, existen evidencias de rutas alternativas
independientes de Try (Spaepen et al., 2007) (Figura 1.21.).
Esta síntesis bacteriana de AIA desencadena cambios en los niveles endógenos
de fitohormonas de la planta que resultan en una regulación positiva que estimula los
procesos de crecimiento y diferenciación celular (Kamilova et al., 2006; Ali et al., 2009
a). La magnitud de esta estimulación dependerá de la concentración de los reguladores,
de la proximidad de la bacteria a la superficie radical, de la habilidad del regulador para
difundir en el suelo a través de la pared celular de la planta y al interior de las celulas
vegetales y de la competitividad de la bacteria para colonizar y sobrevivir en áreas de
alta exudación radical. En la misma proporción, la estimulación dependerá de la cepa
PGPR, de las condiciones de cultivo y fase de crecimiento de la misma y de la
disponibilidad de sustratos (Tsavkelova et al., 2005).
Uno de los procesos de mayor importancia que promueven las bacterias
productoras de AIA es el crecimiento radical (Tsavkelova et al., 2007; Idris et al.,
2007), que se traduce en un incremento en la longitud, en el peso y en el área de
superficie del sistema radical (Shaharoona et al., 2008). Sin embargo, también se ha
demostrado que, dependiendo de la concentración de AIA exógeno, sus efectos pueden
variar bien induciendo el crecimiento de raíces primarias por la aplicación de niveles
relativamente bajo, bien promoviendo la emergencia de raíces laterales y adventicias
con la aplicación de concentraciones medio-altas de AIA (100-3000 ppm), o bien
produciendo la inhibición del desarrollo del sistema radical de la planta con la
Introducción
aplicación de altos niveles de AIA (Lambrecht et al., 2000; Patten y Glick, 2002;
Spaepen et al., 2007; Remans et al., 2008).
En conclusión, la biosíntesis de AIA es considerada crucial en el crecimiento y
desarrollo de la planta. Por tanto, el potencial de cepas microbianas para mejorar el
contenido de AIA en plantas, puede ser usado como criterio básico de selección de
PGPR efectivas (Ali et al., 2009 b).
Figura 1.21. Rutas de biosíntesis de AIA en bacterias (Spaepen et al., 2007).

Los nombres subrayados indican el nombre de las rutas. IAAId: acetaldehido-3-indol; IAM:
acetamida-3-indol; IPDC: indol-3-piruvato descarbosilasa; Trp: triptofano
SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS
El Fósforo (P) es uno de los principales macronutrientes esenciales para el

crecimiento y desarrollo biológico. En el suelo, se encuentran importantes reservas de P
orgánico e inorgánico. Sin embargo, las deficiencias en este nutriente están
ampliamente distribuidas en los suelos de todo el mundo, ya que solamente un 10 % de
este P total es accesible para las plantas (Ali, 2009). Esto hace que sea necesario
aportarlo en forma de abonos químicos, representando los fertilizantes fosforados uno
de los principales costes en la agricultura (Pradhan y Sukla, 2005).
Los microorganismos juegan un papel central en el ciclo del P en la biosfera
(Rodríguez y Fraga, 1999). De hecho, muchas bacterias rizosféricas son conocidas y
Introducción
han sido aisladas por poseer la capacidad de solubilizar distintos fosfatos inorgánicos
(fosfatos tricálcicos, fosfatos dicálcicos, hidroxiapatitas y fosfatos de roca) (Güneç et
al., 2009). Esta solubilización se lleva a cabo por la excreción de ácidos orgánicos al
medio que disminuyen el pH, movilizando así, el fósforo (Abbas-Zadeh et al., 2010),
aunque también se ha encontrado producción de fosfatasas o fitasas extracelulares muy
eficientes en suelos básicos (Henri et al., 2008).
La utilización de PGPR solubilizadoras de fosfatos como biofertilizantes, mejora
la disponibilidad de fósforo en el suelo, promoviendo así, una alternativa ecológica (de
Freitas et al., 1997; Rodríguez y Fraga., 1999; Pradhan y sukla, 2005; Güneç et al.,
2009) y más económica que los fertilizantes químicos (Ali, 2009).
PRODUCCIÓN DE SIDEROFOROS
El hierro (Fe) es un nutriente esencial para todos los organismos vivos. A pesar
de que su concentración en los suelos suele ser alta, habitualmente se encuentra poco
accesible (Fe III), debido al pH neutro que normalmente acarrea un ambiente aeróbico
(Hider y Kong, 2010). En condiciones limitantes de Fe, las plantas desarrollan clorosis
en sus tejidos, una severa alteración metabólica, debido a su papel como cofactor en
enzimas esenciales de procesos fisiológicos tan importantes como la respiración o la
fotosíntesis (Barriuso, 2006). Con la evolución, las plantas han desarrollado distintas
estrategias para una absorción eficiente de hierro y al igual que éstas, las rizobacterias.
Así, muchas PGPR son capaces de sintetizar unos compuestos de bajo peso molecular
(500-1500 Da) que contienen grupos funcionales (hidroximatos, catecoles, α-
hidroxicarboxilatos,…) quelantes de hierro (Fe III) de forma reversible (Johnson y
Gehring, 2007) y con alta afinidad, llamados sideróforos (Alexander y Zuberer, 1991;
Abbas-Zadeh et al., 2010), similares a los sintetizados por la propia planta (Castignetti y
Smarrelli, 1986). Estos compuestos se excretan al medio y se anclan en el exterior de la
pared celular mediante receptores específicos. Tras la quelación son nuevamente
introducidos en el interior celular, a través de transportadores específicos, donde liberan
el hierro (Fe II).
Aunque diferentes factores ambientales pueden influir en la cantidad de
sideróforos producidos (Johnson y Gehring, 2007; Hider y Kong, 2010), se ha
comprobado que las rizobacterias productoras de sideróforos mejoran la salud vegetal,
ya que fomentan la nutrición de hierro y dificultan el crecimiento de patógenos
Introducción
(competencia por Fe) al ser éstos incapaces de absorber el complejo Fe-sideróforo

(Ramos-Solano et al., 2010).
PRESENCIA DE LA ENZIMA ACC DESAMINASA
El etileno es una hormona vegetal que juega un papel esencial en el crecimiento

y desarrollo de las plantas (Li et al., 2005; Naveed et al., 2008 b), en la germinación de
semillas, en la iniciación radical y la elongación, en la nodulación, en el transporte de
auxinas, en la inducción de hipertrofia, en la senescencia, en la abscisión y maduración
al igual que, en las señales de estrés, (Glick et al., 2007; Glick, 2010) como mediadora
hacia procesos adaptativos decisivos para la supervivencia de la planta (Ali, 2009). Sin
embargo, a altas concentraciones inhibe el crecimiento (Shaharoona et al., 2008) y
provoca efectos deletéreos (Hontzeas et al., 2006; Cheng et al., 2007).
La ACC desaminasa fue descrita por primera vez en 1978, en microorganismos
de suelo. Hoy se sabe, que está asociada a un amplio número de microorganismos, tanto
bacterias como hongos y levaduras, pero en ningún caso a plantas (Li et al., 2005; Glick
et al., 2007). La ACC desaminasa es una enzima multimérica dependiente de una
piridoxal-5-fosfato, que está localizada en el citoplasma y que cataliza la rotura del
ACC, el inmediato precursor del etileno en las plantas superiores, hacia α-cetobutirato y
amonio (Honna y Shimomura, 1978). Este sustrato debe encontrarse a altas
concentraciones para poder unirse a la enzima, ya que ésta no posee una alta afinidad
por él (Glick et al., 2007). Por tanto, las PGPR que poseen la enzima ACC desaminasa
pueden disminuir los niveles de etileno (Hao et al., 2010), algo muy interesante desde el
punto de vista de promoción del crecimiento.
Las PGPR que contienen esta enzima cuando se unen a la superficie de la planta
(Figura 1.22.), usualmente la semilla o la raíz de una planta en desarrollo, y en respuesta
al triptófano exudado, sintetizan y secretan AIA que igualmente puede afectar a la
planta (Glick, 2010). Este AIA exógeno junto con el endógeno (planta) puede estimular
la proliferación y elongación de las células vegetales y puede inducir la síntesis de la
ACC sintasa en la planta, la cual convierte S-adenosil-l-metionina (SAM) a ACC
(Kende, 1993; Penrose y Glick, 2001; Glick et al., 2007). Muchas de las moléculas de
ACC producidas por esta última reacción, son excretadas desde las semillas o las raíces
junto con los exudados. De modo que, el ACC exudado (alta concentración) puede ser
absorbido por la bacteria y subsecuentemente hidrolizado por la enzima ACC
Introducción
desaminasa. Esto reduce los niveles de ACC fuera de la planta, con lo que la planta
exuda más ACC para mantener el equilibrio interno y externo. A causa de que los
niveles de ACC dentro de la planta son entonces más bajos, la concentración interna de
etileno se reduce dando lugar a una mayor elongación de raíces y tallos (Penrose y
Glick, 2003; Belimov et al., 2007; Naveed et al., 2008 a b), un incremento de la
biomasa (Cheng et al., 2007; Shaharoona et al., 2008) y protección de la planta frente a
los efectos inhibitorios producidos por el estrés. Es decir, la planta inoculada con PGPR
que contienen la enzima ACC desaminasa, presumiblemente, son más resistentes a
distintas situaciones ambientales, como un aumento de temperatura, salinidad o déficit
hídrico, entre otros (Glick, 2010).
Figura 1.22. Representación esquemática del mecanismo de acción de una PGPR

que contiene la enzima ACC desaminasa cuando se une a una semilla o una raíz
(Glick et al., 1998).
El Símbolo ┴ indica inhibición. IAA: Ácido indolacético, ACC: Ácido 1-aminociclopropano-1-
caboxílico, AdoMet: S-adenosil-metionina, α-kB: α-cetobutirato.
Introducción
4.3. Inoculantes microbianos
4.3.1. Antecedentes
Desde la antigüedad es conocida la inoculación con microorganismos

beneficiosos. Los agricultores sabían de manera empírica que una forma de mejorar las
cosechas era mezclar el suelo que quedaba de cosechas anteriores de leguminosas con
suelo en el que no habían crecido (Bashan, 1998). A finales del siglo XIX, esta práctica
tradicional se convirtió en el método recomendado para inocular legumbres en Estados
Unidos (Smith, 1992), registrándose una década después la primera patente para
inocular plantas con Rhizobium sp. (Nobbe y Hitner, 1896). En los años treinta y
cuarenta, la inoculación microbiana se extendió masivamente en Rusia y Europa del
Este hacia bacterias no simbióticas. Sin embargo, estas prácticas no dieron resultados
concluyentes y fueron abandonadas en la segunda Guerra Mundial (Rubenchik, 1963).
Hoy día, existe una optimizada tecnología que, aplicada a la formulación de inoculantes
de microorganismos fijadores de nitrógeno, proporciona productos con altas calidades,
con unas garantías mínimas de 2 x 109 UFC/g y dos años de disponibilidad de uso.
Estos avances han empezado a aplicarse a otros organismos beneficiosos como las
PGPR (Smith, 2003), apareciendo, recientemente, las primeras preparaciones
comerciales.
4.3.2. Selección de cepas
Para hacer uso de los efectos beneficiosos que las PGPR pueden proporcionar,
en primer lugar, se requiere comprobar que éstas posean una serie de características que
las hagan candidatas a constituir un buen inoculante microbiano. A continuación, se
requiere una selección preliminar de éstas en invernadero o cámara de cultivo en
condiciones bacteriológicamente controladas. Finalmente, se realizan ensayos de campo
y se determina su comportamiento en condiciones similares a las que van a estar
expuestos los inoculantes durante su empleo (Roughley, 1970; Somasegaran y Hoben,
1994; Albareda, 2007).
Así, una PGPR debe poseer la habilidad de sobrevivir (Rekha et al., 2007) y
multiplicarse (Albareda et al, 2006) en la rizosfera y la capacidad de colonizar
eficientemente las raíces de las plantas huésped, de lo que dependerá en gran medida su
Introducción
eficacia (Kumar et al., 2007; Barriuso et al., 2008 a; Ahmad et al., 2008; Naiman et al.,
2009). Secundariamente, si la rizobacteria es móvil, podrá llevar a cabo una
colonización más profusa y una eliminación de rizobacterias deletéreas de la rizosfera
por exclusión del nicho (Ali, 2009). No obstante, la respuesta inmediata a su
inoculación en un suelo o sustrato va a variar considerablemente dependiendo de la
bacteria, la especie de planta, el tipo de suelo o sustrato, la densidad del inóculo y las
condiciones ambientales (Príncipe et al., 2007; Fisher et al., 2007).
4.3.3. Formulación de inoculantes
Cuando un microorganismo se ha seleccionado para ser aplicado a un cultivo, es

importante desarrollar la formulación adecuada para su empleo en condiciones de
campo, de la que dependerá su éxito (Chebotar y Kang, 2003). Esta formulación debe
proporcionar a la bacteria introducida un microambiente que asegure su supervivencia
en el suelo (Bashan et al., 2008), es decir, una protección frente a estreses ambientales y
una fuente de nutrientes, a la vez que debe ser totalmente inocua (Rekha et al., 2007).
Asimismo, una buena formulación debe mantener la viabilidad del microorganismo
durante el almacenamiento (Jones y Burges, 1998) y permitir una liberación adecuada
de células viables en buenas condiciones en el momento adecuado (Bashan et al., 2005).
La formulación del inoculante y su optimización depende de cada cepa, con
ligeras modificaciones dentro de una misma especie (Bashan et al., 2008), del clima y
de la planta objetivo. De modo que un mismo microorganismo puede formularse de
diferentes formas, que pueden ser divididas en inoculantes que utilizan un soporte
sólido y en inoculantes líquidos (Bashan, 1998).
4.3.3.1. Inoculantes sólidos
Actualmente, la mayor parte de los inoculantes de PGPR se elaboran mezclando

un cultivo líquido, altamente concentrado, con un soporte sólido pulverulento o
granular, sobre el que van absorbidas o encapsuladas las células microbianas.
El soporte más utilizado en la producción de inoculantes comerciales de
Rhizobium y otras bacterias es la turba (Ruíz-Argüeso et al., 1979; Thompson, 1980;
Albareda, 2007). La turba es barata, tiene una gran capacidad de absorción de agua y las
poblaciones microbianas sobreviven muy bien en ella (McIntyre y Press, 1991). Sin
Introducción
embargo, presenta ciertas dificultades en la liberación bacteriana (Bashan, 2008) y

algunas partidas pueden contener sustancias que inhiben el crecimiento bacteriano.
Además, el uso de la turba tiene una serie de limitaciones medioambientales, ya que las
turberas son, en muchos países, lugares de interés ecológico, y su explotación está cada
vez más restringida. Así que, la búsqueda de otros soportes alternativos a la turba, como
pueden ser el corcho, la vermiculita, la perlita, la sepiolita, entre otros, ya se están
realizando (Albareda, 2007).
Los soportes se han de acondicionar antes de su mezcla con el cultivo de la
bacteria de que se trate. En general, según las circunstancias, hay que secarlos, molerlos
(malla 200-400 µm) y finalmente, esterilizarlos, bien por autoclave (Ormeño-Orrillo y
Zúñiga-Dávila, 1999), bien por irradiación gamma (Strijdom y van Rensburg, 1981).
Por este motivo, la tendencia actual es la utilización de sustratos estériles compuestos
por polímeros, como alginatos (Bashan et al., 2002), goma xantano (Denardin y Freire,
2000) y geles de poliacrilamida (Dommergues et al., 1979) y celulosa (Jawson et al.,
1989), donde las bacterias quedan atrapadas en su interior y el conjunto se solidifica,
presentándose como polvo fino, gránulos o cápsulas con distintos grados de humedad.
Los inoculantes basados en polímeros han demostrado su potencial como
portadores bacterianos, presentando ciertas ventajas sobre la turba. La encapsulación en
polímeros proporciona una protección contra estreses ambientales que tras ser
superados, poseen la capacidad de degradarse mediante la acción de los
microorganismos del suelo, produciendo así una liberación de los microorganismos
encapsulados de manera gradual pero en grandes cantidades. Además, estas
formulaciones pueden almacenarse secas a temperatura ambiente por periodos
prolongados, pueden ser manipuladas fácilmente de acuerdo con las necesidades
específicas de las bacterias e incluso complementadas con nutrientes que mejoren la
supervivencia a corto plazo. No obstante, los polímeros son costosos comparados con
los inoculantes basados en turba y requieren de una mayor manipulación industrial, por
tanto este tipo de formulación, por el momento, no es una técnica comercial totalmente
adoptada (Bashan, 2008).
Introducción
4.3.3.2. Inoculantes líquidos
En la actualidad, los inoculantes líquidos están adquiriendo un gran interés

porque permiten la simplificación del proceso de producción al no tener que preparar y
adecuar un soporte, facilitándose así, la aplicación a semillas o suelo. Sin embargo, la
supervivencia bacteriana en este tipo de inoculantes y sobre la semilla inoculada es
inferior, ya que carecen de la protección del soporte (Deaker et al., 2004).
Para su formulación se emplean cultivos líquidos con una alta concentración de
bacterias, incorporando ciertos aditivos que permiten una alta supervivencia durante el
almacenamiento del producto y una buena adherencia sobre la semilla (Singleton et al.,
2002; Bashan et al., 2008), así como una alta capacidad de retención de agua y
protección a la bacteria frente a la desecación (Deaker et al., 2004). Aunque
actualmente hay numerosas industrias que producen inoculantes líquidos comerciales,
las fórmulas de fabricación no son conocidas y existe poca información al respecto
(Albareda, 2007).
4.3.4. Aplicación de inoculantes
La aplicación del inoculante en formulación sólida o líquida depende de la

supervivencia de la PGPR sobre el soporte elegido y su modo de acción, y puede
llevarse a cabo de distintas formas, dependiendo del efecto que se quiera producir en el
cultivo tras su empleo (Bashan, 1998; Nakkeeran et al, 2005). Asimismo, se ha visto
que la aplicación conjunta de distintos inoculantes bacterianos sobre diversas partes de
una planta maximiza el efecto de promoción del crecimiento de la misma (Nakkeeran et
al., 2004).
Habitualmente, las semillas se inoculan directamente sumergiéndolas en el
inoculante bacteriano o bien produciendo la dispersión bacteriana sobre éstas mediante
el uso de sprays. En estos casos se usan inoculantes líquidos o sólidos elaborados con
un soporte finamente molido (Albareda, 2007). También, puede realizarse la adición
directa del inóculo al surco de siembra para el que se suele utilizar un inoculante
granular o líquido (Stephens y Rask, 2000). Con los tres métodos, la colonización
radical se produce inmediatamente después de la germinación, mejorando de este modo
los procesos de promoción vegetal para los que fueron formulados (Amer y Utkhede,
2000; Zhender et al, 2001). No obstante, hoy día, resulta interesante el empleo de
Introducción
inoculantes microbianos tras la germinación de la semilla, aplicándolos bien en sus

sistemas radicales, en sus follajes o en sus frutos, o incluso su utilización en los esquejes
obtenidos para la reproducción vegetativa, ya que se ha comprobado que actúan
incrementando, mejorando, y en su caso protegiendo, el establecimiento de la plántula
en el suelo (Callan et al., 1990). Así, las aplicaciones radicales en las plántulas o en los
esquejes suelen realizarse mediante inmersión o adición de determinados volúmenes de
inoculante líquido o sólido disuelto en agua, mientras que las inoculaciones foliares y
sobre los frutos los inoculantes se suelen aplicar mediante sprays, resultando muy
efectivas en tratamientos de biocontrol (Vivekananthan et al., 2004).
Objetivos
Objetivos
El sector de la AE ha experimentado un gran desarrollo a nivel mundial en los

últimos años. En España, y muy especialmente en la región andaluza, esta expansión se
ha centrado, principalmente, en el cultivo del olivar desde el punto de vista económico.
Así, es cada vez mayor el número de olivareros que inician la transformación ecológica
de sus explotaciones, buscando una mayor rentabilidad e, implícitamente una reducción
de los impactos negativos sobre el medio ambiente.
La conversión del olivar convencional a ecológico implica el desarrollo de una
actividad viverística en consonancia con los baluartes de la AE, que restringe la
aplicación de productos de síntesis. Como se comentó, la actual propagación comercial
del olivo se realiza a través del método de estaquillado semileñoso bajo nebulización
que implica la utilización de una hormona sintética. De este modo, los agricultores de
este tipo de producción se enfrentan a una serie de necesidades tecnológicas que no
pueden solventar.
El desarrollo de la biotecnología plantea alternativas viables y prometedoras de
aplicación en este tipo de producción, como es el empleo de biofertilizantes (Bloemberg
y Lugtenberg, 2001) compuestos por hongos o bacterias beneficiosas para la planta,
denominadas PGPR.
El Instituto Andaluz de Investigación y Formación Agraria, Pesquera, Alimentaria
y de la Producción Ecológica (IFAPA), perteneciente a la Consejería de Agricultura y
Pesca, tiene desde su creación el objetivo de proporcionar las bases científicas y
tecnológicas para el fomento del desarrollo sostenible de la agricultura, siendo una de
sus líneas prioritarias, por ser un sector estratégico en la comunidad, el cultivo del
olivar.
En base a estos antecedentes, el Objetivo General de este trabajo fue buscar una
alternativa ecológica al uso de hormonas en el estaquillado bajo nebulización del
olivo basada en la utilización de PGPR. Sobre éste se desarrollaron los siguientes
Objetivos Concretos:
1. Aislamiento y clasificación de cepas PGPR de un olivar en producción

ecológica según sus capacidades de promoción del crecimiento vegetal
(PGP) in vitro.
Objetivos
2. Estudio de la biodiversidad de la colección de PGPR aislada.
3. Determinación y seguimiento de la promoción del crecimiento llevado a

cabo en plantas modelo por las cepas PGPR seleccionadas in vitro, en
condiciones bacteriológicamente controladas.
4. Evaluación del enraizamiento de estaquillas de olivo de distintos cultivares

producido por las cepas seleccionadas en condiciones de vivero, aplicando
distintas formas de inoculación.
5. Identificación a nivel molecular de las cepas PGPR más aptas.
6. Análisis de la persistencia y colonización de estas cepas en la rizosfera de

varias especies vegetales tanto en condiciones controladas como en vivero.
46 Montero-Calasanz, M.C.
Materiales y Métodos
1. Material biológico
1.1. Bacterias
Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo se recogen en la tabla III.1.
Tabla III.1. Cepas bacterianas utilizadas en este trabajo.
Cepas Características Referencias
Escherichia coli
Cepa derivada, donadora

DH5α p519ngfp Mattlysse et al., 1996
GFP, KmR
Cepa derivada,
HB101 pRK2013 Ditta et al., 1980
movilizadora
Azospirillum brasilense
Sp7 Cepa silvestre, PGPR Tarrand et al., 1978
Cd Cepa silvestre, PGPR ATCC 29729
Enterobacter cloacae UW4 Cepa silvestre, Control Shah et al., 1998

positivo ACC
M16 Cepa silvestre, PGPR Barriuso et al., 2005
AG9 Cepa silvestre, PGPR Esta Tesis
AG13 Cepa silvestre, PGPR Esta Tesis
CT33 Cepa silvestre, PGPR Esta Tesis
Cepas Características Referencias
1.2. Material vegetal
En los ensayos de interacción planta-microorganismo se utilizaron las especies

vegetales que se detallan en la tabla III.2.
Tabla III.2. Especies vegetales utilizadas en los distintos ensayos.
Especie Características Procedencia
Olea europea L. subsp., Estaquillas semileñosas

Viveros Reypra, S.L .
europaea cv. Picual comerciales
Olea europaea L. subsp., Estaquillas semileñosas Viveros Reypra, S.L .

europaea cv. Arbequina comerciales Plantas Continental, S.A.
Olea europaea L. subsp., Estaquillas semileñosas Viveros Reypra, S.L .

europaea cv. Hojiblanca comerciales Viveros A-92, S.L.
Olea europaea L. subsp., Estaquillas semileñosas

Plantas Continental, S.A.
europaea cv. Koroneiki comerciales
Dr. Bernard Glick.

Brassica napus L. cv.
Semillas Universidad de Waterloo
Thunder
(Canadá)
Especie Características Procedencia
Vigna radiata L. Legumbres Penelas, S.L.

Semillas Comerciales
cv. Wilczek (León, España)
Vigna unguiculata L. IFAPA Centro Las

Semillas
walp. cv. Red Caloona Torres-Tomejil
2. Antibióticos, enzimas y oligonucleótidos

Se usaron antibióticos suministrados por Sigma-Aldrich (USA). Las condiciones
de preparación y las concentraciones de trabajo empleadas para cada uno de ellos se
recogen en la tabla III.3.
Tabla III.3. Antibióticos utilizados en este trabajo.
Concentración de Concentración de la
Antibiótico
trabajo solución madre
Ampicilina (Ap) 50 µg/ml 25 mg/ml en H2Odest.
Cloramfenicol (Cm) 30 µg/ml 30 mg/ml en etanol
Kanamicina (Km) 50 µg/ml 25 mg/ml en H2Odest.
Gentamicina (Gm) 25 µg/ml 25 mg/ml en H2Odest.
Tetraciclina (Tc) 12,5 µg/ml 12,5 mg/ml en etanol 50 %
Rifampicina (Rif) 50 µg/ml 15 mg/ml en metanol
Las soluciones de los antibióticos disueltas en H2Odest. se esterilizaron por

filtración con membranas de 0,22 µm de diámetro de poro (Millpore ®). Las soluciones
madre se conservaron a -20 ºC hasta su uso.
La cicloheximida (Chx), proporcionada por Sigma-Aldrich (USA), se utilizó a
una concentración de trabajo de 100 mg/l. Para la disolución inicial se utilizó el 10 %
del volumen de etanol al 96 %. Se almacenó a -20 ºC.
La enzima lisozima (Sigma-Aldrich, USA) se preparó en solución acuosa a una
concentración de 10 mg/ml. Se conservó a -20 ºC.
Los oligonucleótidos usados en los estudios de reacción en cadena de la

polimerasa (PCR), suministrados por Roche (España) y Sequiserve (Alemania), se
prepararon según recomendaciones del fabricante. Sus secuencias se especifican en la
tabla III.4.
Tabla III.4. Secuencia de los distintos oligonucleótidos usados en este trabajo.
Oligonucleótido Secuencia (5´ 3´) Referencia
AGA GTT TGA TYM TGG

616V Juretschko et al., 2002
CTCAG
630R CAK AAA GGA GGT GAT CC Juretschko et al., 2002
27F AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG Lane, 1991
1492R ACC TTG TTA CGA CTT Lane, 1991
341F CCT ACG GGA GGC AGC AG Smits et al., 2004
M13F GTA AAA CGA CGG CCA G Messing, 1983
M13R CAG GAA ACA GCT ATG AC Messing, 1983
ERIC1R ATG TAA GCT CCT GGG GAT Versalovic et al., 1994
AAG TAA GTG ACT GGG GGT

ERIC2 Versalovic et al., 1994
GAG C
CCG AAT TCG TCG ACA ACA

fD1 Weisburg et al., 1991
GAC TTT GAT CCT GGCTCA G
CCC GGG ATC CAA GCT TAA

rD1 Weisburg et al., 1991
GGA GGT GAT CCA GCC
CGG TGT GTA CAA GGC CCG

R1378 Heuer et al., 1997
GGA ACG
CGC CCG GGG CGC GCC CCG

GGC GGG GCG GGG GCA CGG
F984GC Heuer et al., 1997
GGG GAA CGC GAA GAA CCT
TAC
3. Medios, condiciones de cultivo y conservación

de las cepas bacterianas
3.1. Condiciones de cultivo
En la multiplicación de todas las cepas PGPR en medio líquido se empleó como

medio estándar Caldo Nutritivo (CN) de Pronadisa al que se le añadió 100 mg/l de L-
Try para optimizar la producción de AIA. Para la elaboración de los inoculantes sobre
sustrato sólido, se usó el medio TSB (Tryptic Soy Broth) de Difco .
Para favorecer la inducción de la actividad de la ACC desaminasa en las cepas
PGPR se crecieron, en primer lugar, en medio TSB durante 48 h. A continuación, se
realizaron dos lavados con 0,03 M de MgSO4, centrifugando a 12000 rpm durante 10
min y resuspendiendo en medio mínimo DF con (NH4)2SO4. Tras 24 h de incubación, se
lavaron las células, siguiendo el mismo procedimiento anterior, pero resuspendiendo en
medio mínimo DF con 3mM de ACC como única fuente de nitrógeno, y se incubó 24 h.
Las estirpes de E. coli se cultivaron en medio de Luria-Bertani (LB).
Las cepas de A. brasilense se inocularon en medio NFb (Döbereiner, 1980)
modificado (disminución de ácido málico de 5 a 2,5 g).
Los cultivos en medio líquido se inocularon mediante asa a partir de un cultivo
crecido en medio sólido o de un 1% (v/v) de un cultivo líquido crecido hasta fase
exponencial o inicio de fase estacionaria.
La incubación se llevó a cabo en agitador orbital a 180 rpm y 28 ºC, a excepción
de las estirpes de E. coli que se incubaron a 37 ºC. El tiempo de incubación, en general,
fue de 48-72 h para las PGPR y de 24 h para las estirpes de E. coli
Todos los medios se esterilizaron en autoclave a 120 ºC durante 20 min, tras el
ajuste de pH. Para la preparación de los medios sólidos se adicionó 16 g/l de agar
bacteriológico (Bacto TM Agar de BD).
3.2. Descripción de los medios de cultivo
3.2.1. Medio CAS (Chrome Azurol S) (Alexander y Zureber, 1991) (por litro)
 Solución 1: solución indicadora Fe-CAS
FeCl3.6H2O 1 mM (en 10 mM HCl) 10 ml
Solución acuosa de CAS (1,21 mg/ml) 50 ml
Solución acuosa de HDTMA (1, 82 mg/ml) 40 ml
Las dos primeras se mezclaron dando como resultado un color violeta oscuro.
Lentamente, se añadió la tercera, que dio lugar a una solución azul oscura que se
autoclavó y enfrío a 50 ºC. Esta solución se prepara inmediatamente antes de ser
incorporada al medio CAS.
 Solución 2: solución tampón
PIPES (Piperazina-1,4-bis(ácido 2- etanosulfónico)) 30,24 g
KH2PO4 0,3 g
NaCl 0,5 g
NH4Cl 1g
Agua destilada 800 ml
Agar 15 g
pH (ajustado con KOH al 50 %) 6,8
Las sales se disolvieron en el agua destilada y a continuación, se añadió el

tampón. La solución se autoclavó y enfrío a 50 ºC.
 Solución 3
Glucosa 2g
Manitol 2g
MgSO4.7H2O 493 mg
CaCl2 11 mg
MnSO4.H2O 1,17 mg
H3BO3 1,4 mg
CuSO4.5H2O 0,04 mg
ZnSO4.7H2O 1,2 mg
Na2MoO4.2H2O 1 mg
Se autoclavó y enfrío a 50 ºC.
 Solución 4
Casaminoácidos 3g
La esterilización se realizó mediante filtración con membranas de 0,22 µm de

diámetro de poro.
Finalmente, todas las soluciones se mezclaron, añadiendo la solución indicadora
en último lugar con agitación, pero sin que se formaran burbujas.
3.2.2. Medio mínimo salino DF (Dworkin y Foster, 1958)
KH2PO4 4g
Na2HPO4 6g
MgSO4.7H2O 0,2 g
Ácido glucónico 2g
Glucosa 2g
Ácido cítrico 2g
Agua destilada 1l
Solución de microelementos A * 0,1 ml
Solución de microelementos B ** 0,1 ml
pH 7,2
Fuentes de Nitrógeno (alternativas):
 (NH4)2SO4 2g
 Solución de ACC 6 ml
Los ingredientes se incorporaron uno por uno, procurando no adicionar el

siguiente hasta no estar el anterior completamente disuelto. En último lugar, se añadió
0,1 ml de cada una de las soluciones de microelementos.
La solución de ACC se preparó a una concentración de 0,5 M que se esterilizó
mediante filtración, se alicuotó y se congeló a –20 ºC. Inmediatamente antes de la
inoculación se descongeló y se añadió al medio.
*
Solución de microelementos A
H3BO3 10 mg
MnSO4.H2O 11,19 mg
ZnSO4.7H2O 124,6 mg
CuSO4.5H2O 78,22 mg
MoO3 10 mg
Agua destilada estéril 100 ml
Se almacenó a 4 ºC.
**
Solución de microelementos B
FeSO4.7H2O 100 mg
Agua destilada estéril 10 ml
Se almacenó a 4 ºC
3.2.3. Medio Luria-Bertani (LB) (Sambrook et al., 1989)
Triptona 10 g
ClNa 5g
Extracto de levadura 5g
Agua destilada 1l
pH 6,8-7,0
3.2.4. Medio NFb modificado (Döbereiner, 1980)
L- ácido málico 2,5 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
NaCl 0,1 g
CaCl2 0,02 g
KOH (en lentejas) 4,5 g
NH4Cl 0,5 g
Solución de microelementos* 2 ml
Fe EDTA (1,64 p/v, acuoso) 0,4 ml
Biotina 0,1 mg
Agua destilada 1l
pH 6,8 ± 0,2
*
Solución de microelementos
Na2MoO4.2H2O 0,2 g
MnSO4.H2O 1g
Se almacenó a 4 ºC.
La biotina se preparó en solución y se esterilizó mediante filtración. Se agregó al
medio una vez frío.
3.2.5. Medio PVK (Pikovskaya, 1948)
Glucosa 10 g
(NH4)2SO4 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
Extracto de levadura 0,5 g
KCl 0,2 g
NaCl 0,2 g
FeSO2.7H2O 0,002 g
MnSO4.H2O 0,002 g
Ca2(PO4)5 5,0 g
Agua destilada 1l
pH 7,0 ± 0,2
El medio se agitó para realizar un plaqueo homogéneo.
3.2.6. Medio Simmons Citrato (Simmons, 1926)
Citrato de Sodio 2g
NaCl 5g
K2HPO4 1g
KH2PO4 1g
MgSO4.7H2O 0,2 g
Azul de Bromotimol 0,08 g
pH 6,9 ± 0,2
3.3. Mantenimiento y conservación de las cepas

bacterianas
El mantenimiento rutinario de las cepas se llevó a cabo en placas de Petri de 90

mm de diámetro que contenían aproximadamente 20 ml de medio TSA (Tryptic Soy
Agar) de Difco diluido al 10 %.
Para la conservación a largo plazo de las cepas, se usaron tubos criogénicos en
los que se mezcló una solución estéril de peptona y glicerol (0,5 y 15 %,
respectivamente) con la biomasa recogida de un cultivo en placa de medio CN
sembrada en césped y crecida durante 48 h. Los tubos se vortearon hasta la
homogeneización y se congelaron a – 80 ºC.
4. Soluciones y tampones
La composición de las soluciones y los distintos tampones empleados en este
trabajo se muestran a continuación. Las soluciones nutritivas de plantas y las de
dilución se esterilizaron a 120 ºC durante 20 min. Todas se conservaron a temperatura
ambiente.
4.1. Soluciones nutritivas para plantas
4.1.1. Solución de Rigaud y Puppo (original) (Rigaud y Puppo, 1975)
KH2PO4 100 mg
K2SO4 100 mg
MgSO4.7H2O 100 mg
CaCl2 50 mg
Sequestrene 138 Fe G-100 de Novartis Internacional 10 mg

AG, Suiza.
Solución de microelementos de Gibson * 0,5 ml
Agua destilada 1l
pH 7,0 ± 0,2
*
Solución de microelementos de Gibson (Turner y Gibson, 1980)
BH3O3 2,86 g
MnSO4.H2O 2,08 g
ZnSO4.7H2O 0,22 g
CuSO4.5H2O 0,08 g
Na2MoO4.H2O 0,13 g
Agua destilada 1l
4.1.2. Solución de Hewitt (Hewitt, 1952)
Para la preparación de la solución final se añadió por litro:
Solución I 10 ml
Solución II 20 ml
Solución III 10 ml
Solución IV 10 ml
Solución V 1 ml
pH 7,0
 Solución I
NO3 40,44 g/l
 Solución II
NO3Ca.4H2O 47,23 g/l
 Solución III
SO4Mg.7H2O 36,97 g/l
PO4H2K 0,272 g/l
 Solución IV
Na EDTA Fe 4,21 g/l
 Solución V
SO4Mn.4H2O 2,23 g/l
BO3H3 3,09 g/l
SO4Zn .2H20 0,288 g/l
SO4Cu.5H2O 0,250 g/l
4.2. Soluciones de dilución
4.2.1. Solución de sales minerales (Vincent, 1970)
K2HPO4 0,50 g
MgSO4.7H2O 0,20 g
NaCl 0,10 g
CaCl2 0,05 g
Agua destilada 1l
4.2.2. Tampón fosfato salino (PBS) 1X
NaCl 8,00 g
KCl 0,02 g
Na2HPO4 0,142 g
KH2PO4 0,027 g
Agua destilada 1l
pH 7,2 - 7,4
4.3. Soluciones para electroforesis de ADN
4.3.1. Tampón TAE
Tris-acetato 40 mM
EDTA, pH 8,0 1 mM
4.3.2. Tampón de Carga
Azul de bromofenol (p/v) 0,25 %
Glicerol (v/v) 30 %
4.4. Soluciones para DGGE
4.4.1. Solución de 6 % de acrilamida al 0% de agentes desnaturalizantes
Acrilamida 40 % 29,2 ml
Bis acrilamida 2% 15,75 ml
TAE 50X 2 ml
H2O MiliQ 150 ml
4.4.2. Solución de 6 % de acrilamida al 100% de agentes desnaturalizantes
Acrilamida 40 % 29,2 ml
Bis acrilamida 2 % 15,75 ml
TAE 50X 2 ml
H2O MiliQ 15 ml
Formamida 80 ml
Urea 84 g
4.5. Soluciones para la tinción de GRAM
4.5.1. Solución de cristal violeta oxalato
 Solución A
Cristal Violeta 10 g
Etanol 96 % 100 ml
 Solución B
Oxalato Amónico 1g
Agua destilada 1l
Se mezclan 20 ml de la solución A con 80 ml de la solución B.
4.5.2. Solución de Safranina
Safranina 2g
Etanol 96 % 100 ml
5. Reactivos
5.1. Reactivo Salkowski (Patten y Glick, 2002)
H2SO4 96 % 150 ml
FeCl3 0,5 M 7,5 ml
Se añadió lentamente el ácido sulfúrico sobre el agua, se dejó enfriar y

posteriormente, se sumó el cloruro férrico.
6. Colección bacteriana
6.1. Aislamientos bacterianos
6.1.1. Procedentes de muestras de suelo de olivar ecológico
En la primavera de 2006 en la finca localizada en Mairena del Aljarafe (Sevilla)

con coordenadas UTM (758.176, 4.136.420) referidas al Huso 29, se recogieron
muestras de suelo de un olivar de la variedad arbequina certificado para la producción
ecológica desde 2002.
En este olivar se diferenciaron tres parcelas sometidas a manejos de cubierta
distintos: cubierta espontánea, cubierta dirigida de leguminosas y laboreo. Las figuras
3.1., 3.2. y 3.3. muestran una vista general de las parcelas.
Figura 3.1. Parcela de Figura 3.2. Parcela con Figura 3.3. Parcela con
laboreo. cubierta dirigida. cubierta espontánea.
De cada parcela se tomaron 3 muestras a una profundidad de 30-40 cm, dos

procedentes del volumen que rodea al sistema radical del árbol (rizosfera) y una tercera
del suelo libre. De las fracciones correspondientes a la rizosfera, por duplicado y en dos
momentos de muestreo, se cogió 1 g de raíces de pequeño diámetro, para el aislamiento
de bacterias de la rizoplana y 2 g de la fracción libre de raíces para aislar las bacterias
contenidas en la ectorizosfera. Del mismo modo, se tomaron 2 g de cada muestra de
suelo libre. A continuación, las muestras rizoplánicas, ectorizosféricas y de suelo libre
se suspendieron en 9, 8 y 8 ml de solución de sales minerales (Apartado 4.2.1.),
respectivamente, se batieron hasta la completa homogeneización y se realizaron
diluciones decimales seriadas. La siembra se hizo en superficie en placas de medio NFb
(Apartado 3.2.4.) y PCA (Plate Count Agar) de Difco al 50 % suplementados con Chx,
incubando a 28 ºC. A partir de estas placas, se aislaron las bacterias más abundantes,
tomando 10 colonias de cada muestra a las 72 h (crecimiento rápido) y otras 10, a los 5
días (crecimiento lento). Las cepas aisladas se sembraron por agotamiento en medio
TSA diluido al 10 % para comprobar su pureza y posteriormente, en un medio rico para
su conservación a largo plazo (Apartado 3.3.). La figura 3.4. muestra un esquema de la
recogida de muestras de suelo de olivar ecológico y del aislamiento bacteriano llevado a
cabo.
Figura 3.4. Esquema de la recogida de muestras de suelo de olivar ecológico y del

aislamiento bacteriano llevado a cabo.
La población bacteriana presente en la rizoplana y la ectorizosfera se determinó

mediante recuento de viables (Apartado 8.3.2.). Asimismo, la biomasa crecida en las
diluciones 10-4 y 10-5 se recogió mediante asa y se conservó a –80 ºC, tal y como se
indica en el epígrafe 3.3., para estudios de biodiversidad (Apartado 7.3.4.2.).
6.1.2. Procedentes del agua de riego de vivero comercial de plantas de

olivo
Se tomaron 2 muestras de agua de riego del vivero comercial Viveros Reypra,

S.L., se efectuaron diluciones seriadas con sales minerales (Apartado 4.2.1.) y se
sembró en superficie en placas con medio NFb (Apartado 3.2.4.) y PCA diluido al 50 %
y suplementadas con Chx. Las placas se incubaron a 28 ºC durante 5 días, tras los que
se realizó un aislamiento bacteriano. Cada colonia aislada se sembró por agotamiento en
medio TSA diluido al 10 % para comprobar su pureza y posteriormente, en medio rico
para su conservación a largo plazo (Apartado 3.3.).
6.2. Nomenclatura
Las bacterias aisladas de las muestras de suelo y de agua se denominaron con las
siglas CT (Cepa Tipo) y AG, respectivamente, seguidas de un número que indicaba el
orden el que se congelaron.
7. Identificación bacteriana
7.1. Caracterización morfológica
7.1.1. Morfología de la colonia
El aspecto de la colonia (color, morfología,…) se determinó a partir de colonias

aisladas en placas con medio TSA diluido al 10 %.
7.1.2. Morfología celular
La diferenciación de las cepas según su pared celular, así como su morfología, se

determinó mediante la tinción diferencial de Gram (Halebian et al., 1981). Se depositó
una gota de agua destilada estéril sobre un porta en el que se suspendió y extendió la
biomasa procedente de una colonia aislada de un cultivo joven en placa de medio TSA
diluido al 10 %. Esta extensión celular se fijó con calor y se cubrió con solución cristal
violeta oxalato (Apartado 4.5.1.) durante 1-2 min, tras los cuales se tiró el exceso de
colorante y se cubrió con lugol (Panreac Química S.A.U.), durante 1 min. El exceso de
lugol se descartó y el frotis se decoloró con etanol al 96 % durante 20 s. A continuación,
se lavó con agua y se aplicó solución de safranina (Apartado 4.5.2.) durante 1-2 min.
Por último, se enjuagó con agua y se dejó secar. Las bacterias teñidas se observaron
bajo microscopio óptico a 100X, considerando Gram positivas, las células teñidas de
color azul y Gram negativas, las de color rojo. La figura 3.5.a. muestra el resultado
obtenido en una bacteria Gram negativa al realizar la tinción de Gram.
La confirmación de la tinción diferencial se realizó a través del test del KOH
(Gregersen, 1978). La biomasa procedente de una colonia de las mismas características
anteriores se depositó sobre una gota de KOH al 3 % y se mezcló. El test consideró
bacteria Gram negativa cuando la suspensión celular adoptó un aspecto viscoso. La cepa
Azospirillum brasilense Cd, cepa Gram negativa, se utilizó como control positivo. En la
figura 3.5.b. se observa el resultado de un test de KOH en una bacteria Gram negativa.
a b
Figura 3.5. Resultados obtenidos al realizar la tinción de Gram (a) y el test de KOH
(b) en una bacteria Gram negativa.
7.2. Caracterización bioquímica de PGPR
7.2.1. Antibiograma
Para medir la sensibilidad de las cepas bacterianas al grupo de antibióticos

citados en la tabla III.3, se depositaron gotas de 10 l procedentes de cultivos líquidos
frescos sobre placas de medio TSA suplementadas con el antibiótico correspondiente.
Las placas se dejaron secar y se incubaron a 28 ºC durante 48 h, tras las cuales se
procedió a la lectura del antibiograma. El crecimiento de la cepa en placa de medio TSA
sin antibióticos se utilizó como control.
7.2.2. Solubilización de fosfatos
La capacidad de solubilizar fosfatos se determinó mediante la adición de gotas

de 10 l de las distintas cepas bacterianas crecidas en medio líquido, sobre placas de
medio PVK (Apartado 3.2.5.) y TSA. Las placas se incubaron durante 5 días a 28 ºC,
evaluando la solubilización de fosfato a través de la determinación del diámetro del halo
de hidrólisis formado. La cepa M16 (Barriuso et al., 2005), solubilizadora de fosfatos,
se utilizó como control positivo.
7.2.3. Producción de sideróforos
Para la detección de la producción de sideróforos en las distintas cepas

bacterianas, se añadieron gotas de 10 l de los distintos cultivos bacterianos crecidos en
medio líquido sobre placas de medio CAS (Apartado 3.2.1.) y TSA. Se incubaron 3 días
a 28 ºC y se valoró la aparición de los halos hidrolíticos producidos, categorizando
según sus diámetros. La cepa M16 (Barriuso et al., 2005), productora de sideróforos, se
utilizó como control positivo.
7.2.4. Biosíntesis de AIA
La capacidad de síntesis de AIA de las cepas bacterianas se testó mediante un

método espectrofotométrico descrito por Patten y Glick en 2002. Se tomó 1 ml de un
cultivo crecido convenientemente para la estimulación de la síntesis de AIA (Apartado
3.1.) y se centrifugó a 13000 rpm durante 2 min en tubo eppendorf. El sobrenadante se
trasvasó a un tubo de cristal y se añadieron 4 ml de reactivo Salkowski (Apartado 5.1.).

El tiempo de reacción fue de 20 min y la absorbancia se midió a una λ=535 nm. La cepa
Azospirillum brasilense Cd, productora de AIA, se usó como control positivo. La
cuantificación de AIA de cada muestra se determinó mediante interpolación de la
absorbancia medida en una recta patrón.
Para la realización de la recta patrón se preparó una solución madre de 200 mg/l
de AIA sintético (Panreac 15A262) disuelto previamente en etanol al 10 %. A partir de
esta solución, se efectuaron las diluciones apropiadas (de 0 a 150 ppm) en medio CN
para construir los patrones de la recta. A continuación, se tomó 1 ml de cada solución,
se añadió el reactivo y transcurrido el tiempo de reacción, se determinó la absorbancia.
La ecuación de la recta de calibrado se calculó mediante el programa de estadística
SPSS v.11.0.
7.2.5. Actividad ACC desaminasa
La actividad de la ACC desaminasa se determinó usando el método

colorimétrico definido por Honna y Shimomura en 1978, modificado posteriormente
por Penrose y Glick (2003), que mide la concentración de -cetobutirato que la enzima
produce al romper la molécula de ACC.
Para la preparación de las muestras, se tomó 1 ml de un cultivo bacteriano
crecido en las condiciones adecuadas para estimular la actividad de la ACC desaminasa
(Apartado 3.1.), se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min, se descartó el sobrenadante
y el pellet obtenido se suspendió en 1 ml de Tris-HCl 0,1 M a pH 7,6, centrifugando
nuevamente y descartando el sobrenadante. Inmediatamente, el pellet se resuspendió en
600 l de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5, añadiendo 30 l de tolueno y vorteando durante 30 s.
Por duplicado, se añadieron 200 l de células toluenizadas a un tubo eppendorf y
solamente en uno de ellos, 30 l de ACC 0,5 M. Ambos tubos, se vortearon brevemente
y se incubaron a 30 ºC durante 15 min, tras los cuales, se añadió 1 ml de HCl 0,56 M, se
vortearon y se centrifugaron durante 5 min a 12000 rpm a temperatura ambiente.
Finalmente, se tomó un tubo de cristal por muestra y se añadió 1 ml de sobrenadante
junto con 800 l de HCl 0,56 M, se vorteó y se adicionó 300 l del reactivo 2,4-
dinitrofenil-hidrazina al 0,2 % en HCl 2 M, vorteando nuevamente e incubando a 30 ºC
durante 30 min. Durante este tiempo, el -cetobutirato derivó a fenilhidrazona, cuyo
color se puso de manifiesto al añadir 2 ml de NaOH y mezclar. La absorbancia se midió
a una λ=540 nm. La cepa Enterobacter cloacae UW4 (Shah et al., 1998), poseedora de
esta enzima, se utilizó como control positivo.
La curva patrón de -cetobutirato se preparó, inmediatamente antes del análisis,
en un rango entre 0,1 y 1,0 mol a partir de una solución madre de -cetobutirato 100
mM en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5 almacenada a 4 ºC. Para cada punto de la curva se tomó
200 l de muestra, se mezcló con 300 l de reactivo y se incubó a 30 ºC durante 30 min,
tras los cuales se adicionó 2,0 ml de NaOH 2 M y se mezcló, midiendo seguidamente la
absorbancia. La cantidad de -cetobutirato producido por las distintas cepas bacterianas
se calculó por interpolación en la ecuación de la curva patrón calculada por el programa
de estadística SPSS v.11.0.
7.3. Caracterización molecular
7.3.1. Extracción de ADN
7.3.1.1. Aislamiento del ADN genómico
Las bacterias se crecieron en medio TSB en agitación durante 24 h a 28 ºC. La

extracción y purificación del ADN genómico se realizó siguiendo las instrucciones del
“Wizard Genomic DNA Purification Kit” de Promega. El ADN se conservó a –20 ºC.
7.3.1.2. Aislamiento de ADN plasmídico
Para la extracción del ADN plasmídico de las cepas de E. coli transformadas se

empleó el “Pure Link Quick Plasmid Miniprep Kit” de Invitrogen. Los cultivos
bacterianos se crecieron según se indica en el Apartado 3.1. durante 24 h. El ADN se
conservó a –20 ºC.
7.3.2. Determinación de la concentración y la calidad del ADN
La concentración del ADN se determinó mediante espectrofotometría a 260 nm

(NanoDrop ND-100). La calidad se estimó calculando la relación A260/A280 y
A230/A260, considerándose valores adecuados 1,8-2,00 y 0,3-0,9, respectivamente
(Moore et al., 2004).
7.3.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa
Las electroforesis de ADN se realizaron en geles de agarosa (“Peq Gold Universal

Agarose 35-1020” de Peqlab) con tampón TAE 1X (pH 8,0) (Apartado 4.3.1.) a los que
se aplicó un voltaje de 6 V/cm. La concentración de agarosa usada fue de 0,8 % para
ADN genómico, 1 % para ADNr 16S y 1,5 % para ERIC-PCR. Se utilizaron geles de 6
cm de longitud en todos los casos, salvo para ERIC-PCR donde se utilizaron geles de 10
cm para obtener una mejor resolución de los patrones de bandeo (Rademaker y de
Bruijn, 1997).
La tinción de los geles de ADN genómico y ADNr 16S se produjo mediante
inmersión en una disolución acuosa de bromuro de etidio a 0,1 µg/ml durante 30 min,
lavando posteriormente con agua destilada para eliminar los restos. En el caso de ERIC-
PCR se utilizó SYBR® Green comercial diluido 1:1.000.000, añadiendo 1 µl por
muestra. En ambos casos, la relación muestra: tampón de carga fue 4:1. Para estimar el
tamaño de la molécula de ADN, se utilizaron como patrones de referencia los
marcadores de peso molecular de 100 pb (Flavorgen) y 1 kb (Fermentas).
Los fragmentos de ADN se visualizaron con un transiluminador de luz
ultravioleta (λ = 300 nm) acoplado a un sistema fotográfico.
7.3.4. Métodos de caracterización basados en la reacción en cadena de

la polimerasa (PCR)
7.3.4.1. Amplificación con cebadores específicos para elementos consenso

intergénicos reiterativos de enterobacterias (ERIC-PCR)
Para la reacción de PCR se usaron los cebadores ERIC1 y ERIC2 cuyas

secuencias se muestran en la tabla III.4.
La amplificación se llevó a cabo en un termociclador MyiQTM (Bio-rad) en un
volumen final de 25 l que contenía: 18,76 l de agua MiliQ, 2,5 l de Tampón (10X),
1 l de MgCl2 (50 mM), 0,5 l de dNTP (10 mM), 0,5 l de cada cebador (10 M), 0,15
l de Taq polimerasa (“BIOTAQ DNA polymerase” de Bioline; 5 U/ l) y 2 l de ADN
(aprox. 50 ng/ l).
Las condiciones de amplificación fueron 5 min a 95 ºC seguidos de 35 ciclos de:
30 s a 94 ºC, 30 s a 50 ºC, 1 min a 52 ºC y 1 min a 72 ºC, finalizando con 7 min a 72 ºC.
En los ensayos en los que se evaluó la permanencia bacteriana, la amplificación

de ERIC-PCR se realizó empleando la biomasa bacteriana procedente de una colonia.
En este caso, una pequeña porción de biomasa se suspendió en 1 ml de agua MiliQ
estéril, añadiendo una alícuota de 1-2 l a la mezcla de reacción.
La separación y la visualización de los fragmentos amplificados se llevaron a
cabo según se describe en el apartado anterior.
Para el análisis de datos, las imágenes digitales obtenidas se almacenaron en
formato TIFF y se analizaron y normalizaron con el programa GelCompar II v. 6.0. de
Applied Maths (Bélgica), aplicando el método de substracción de fondo Rolling Disk.
Para mejorar la reproducibilidad del bandeo se definieron las zonas activas del gel,
eliminando el 10 % del mismo por ambos lados y se calcularon las correspondientes
matrices de similaridad de las curvas densitométricas (Rademaker y Bruijn, 1997),
usando el coeficiente de correlación de Dice (Dice, 1945) y de Pearson. Para la
construcción de los dendrogramas correspondientes se aplicó el método UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) (Sokal y Michener, 1958) con
una tolerancia del 2 %. El coeficiente de correlación cofenética (CCC) se utilizó para
evaluar la fiabilidad del dendrograma (Sneath y Sokal, 1973).
7.3.4.2. Amplificación, secuenciación y análisis filogenético del ADNr 16S
Para la mayoría de las cepas se utilizó el par de cebadores 616F y 630R y sólo en
los casos de no amplificación de estos, el par 27F y 1492R (Tabla III.4).
La amplificación del ADNr 16S se llevó a cabo en un termiciclador MyiQTM
(Bio-rad) empleando una Master Mix de Qiagen (“Master Mix Top Taq PCR”) en un
volumen final de 50 l, según las concentraciones indicadas por el fabricante, y
añadiendo 0,5 l de cada cebador (10 M) y 1 l de ADN (aprox. 50 ng/ l). Las
condiciones de amplificación fueron 3 min a 94 ºC seguidos de 33 ciclos de: 45 s a 94
ºC, 45 s a 55,5 ºC y 1 min a 72 ºC, finalizando con 10 min a 72 ºC.
El producto de amplificación (aproximadamente 1,5 kb) se comprobó mediante
electroforesis en gel de agarosa, según las condiciones descritas en el epígrafe 7.3.3.
Tras la verificación, el producto amplificado se clonó en el vector de clonación
comercial “TOPO TA Cloning Kit 2.1.” de Invitrogen siguiendo las instrucciones del
fabricante, cuyas características se muestran en la figura 3.6. A continuación, el vector
se transformó usando el kit “One Shot TOP TEN” de Invitrogen, según las indicaciones
del kit. Finalmente, se extendieron alícuotas de 10 a 50 µl de cada transformación en

placas selectivas adecuadas que se incubaron a 37 ºC durante 24 h.
Figura 3.6. Características del vector de clonación “TOPO TA Cloning Kit 2.1.” de
Invitrogen y secuencias cercadas al sitio de clonación.
Pasado el tiempo de incubación, se picaron 5 colonias que presuntamente

poseían el inserto y se inocularon en medio LB líquido, incubando a 37 ºC durante 24 h.
De cada tubo crecido, se tomó 1 ml de cultivo y se aisló el ADN plasmídico usando el
kit comercial “Pure Link Quick Plasmid Miniprep Kit” de Invitrogen (Apartado
7.3.1.2.). Con la finalidad de verificar la presencia del producto de amplificación en el
ADN plásmidico extraído, se realizó un análisis de restricción y electroforesis de la
misma, usando la enzima EcoRI (Fermentas).
En cada reacción de restricción se añadió 6,5 µl de agua MiliQ, 2 µl de ADN
plasmídico (concentración 100-150 ng), 1 µl de tampón (10X) y 0,5 µl de la enzima
EcoRI (10 U/ l), y se incubó a 37 ºC durante 3 h. Tras la digestión, la existencia del
inserto (aproximadamente 1,5 kb) se comprobó mediante electroforesis en gel de
agarosa según se describe anteriormente (Apartado 7.3.3.)
Para la secuenciación del ADNr 16S, se usó el kit “BigDye Terminator v.3.1
cycle sequencing kit” de Applied Biosystem, los cebadores universales M13F y M13R,
cuyas secuencias dianas fueron previamente introducidas a través de la clonación, el
cebador interno 341F y los cebadores utilizados en la amplificación de ADNr 16S
(616F-630R y 27F-1492R) (Tabla III.4.), con una concentración de ADN plasmídico

que osciló entre 100-200 ng.
Las condiciones de la PCR de secuenciación fueron las recomendadas por el
fabricante, salvo las siguientes especificaciones: 50 ciclos de amplificación y
temperatura de alineamiento de 55,5 ºC.
Tras la reacción de PCR de secuenciación, la purificación de los fragmentos se
llevó a cabo por precipitación con etanol, según recomendaciones de la casa comercial.
Los fragmentos purificados se secuenciaron usando el analizador ABI PRISM 3730
DNA analyzer (Applied Biosystems, USA) del servicio de secuenciación de
HelmholtzZentrum München (http://www.helmholtz-muenchen.de ).
Para la edición y ensamblaje de secuencias se empleó el programa BIOEDIT
(Sequence Alignment Editor) v.7.0.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit) (Hall,
1999) y el paquete de aplicaciones del servidor público EMBOSS + EMBASSY
(http://emboss.sourceforge.net/index.html). La identificación taxonómica se llevó a
cabo por comparación de las secuencias obtenidas con las existentes en la base de datos
de cepas tipo de EzTaxon server 2.1. (http://www.eztaxon.org/) (Chun et al., 2007). El
análisis filogenético se realizó mediante MEGA v.5.03 (Tamura et al., 2011). A través
de esta aplicación informática se llevó a cabo un alineamiento múltiple con ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2) (Thompson et al., 1994) entre cada una de
las secuencias obtenidas, las secuencias de referencia relacionadas y una secuencia de
referencia no íntimamente ligada a la secuencia problema (outgroup), con el objetivo de
dar valor evolutivo al análisis filogenético posterior. Para la construcción de los árboles
filogenéticos se usó el método de Máxima Verosimilitud (Maximun Likelihood, ML),
aplicando una búsqueda heurística, y el modelo de sustitución nucleotídica sugerido por
la aplicación de ModelTest (Nei y Kumar, 2000) que recoge MEGA 5.03. La fiabilidad
de las ramas del árbol se determinó mediante el método de Bootstrapping no
paramétrico (muestreo por reemplazamiento) con un valor de 1000 réplicas
(Felsenstein, 1985).
Todas las secuencias se depositaron en la base de datos pública GenBank NCBI
(National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)
para la obtención de un número de acceso.
7.3.4.3. Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE)
En una primera reacción de PCR se amplificó el ADNr 16S completo (1,5 kb) y
sobre el producto obtenido, se realizó una segunda amplificación de un fragmento
interno de aproximadamente 400 pb, al que se añadió una cola de nucleótidos GC para
poder separar la muestra por electroforesis en un gel de acrilamida con gradiente de
agentes desnaturalizantes (DGGE).
En la primera reacción (PCR1), para 50 l, se mezcló 37,8 l de agua MiliQ, 1,5
l de dNTPs (1,5 mM), 1,5 l de MgCl2 (50 mM), 5 l de tampón 10X, 1,5 l de
cebador fD1 (10 pmol/l), 1,5 l de cebador rD1 (10 pmol/l), 0,2 l de Taq polimerasa
(“BIOTAQ DNA polymerase” de Bioline; 5 U/ L) y 1 l de ADN (20 pmol/ l). El ciclo
del termociclador fue 2 min a 95 ºC seguidos de15 ciclos de: 15 s a 94 ºC, 45 s a 93 ºC,
45 s a 55 ºC, 2 min a 72 ºC.
En la segunda reacción (PCR2), para 25 l, se mezcló 17 l de agua MiliQ,
1,5 l de MgCl2 (50 mM), 1,5 l de dNTPs (1,5 mM), 2,5 l de tampón 10X, 0,5 l
de cebador F984 (10 pmol/ l), 0,5 l de cebador R1378 (10 pmol/ l), 0,5 l de Taq
polimerasa (5 U/ l) y 1 l del producto de la primera PCR. Las condiciones de
amplificación fueron: 2 min a 94 ºC, (30 s a 92 ºC, 1min a 65 ºC, 2 min a 68 ºC) x
2, (30 s a 92 ºC, 1 min a 63 ºC, 2 min a 68 ºC) x 2, (30s a 92 ºC, 1 min a 61 ºC, 2
min a 68 ºC) x 2, (30 s a 92 ºC, 1 min a 59 ºC, 2 min a 68 ºC) x 2, (30 s a 92 ºC, 1
min a 57 ºC, 2 min a 68 ºC) x 2, (30 s a 92 ºC, 1 min a 55 ºC, 1 min a 68 ºC ) x 25,
10 min a 68 ºC, 4 ºC. El producto de la segunda amplificación se comprobó en un
gel de agarosa 1 % (Apartado 7.3.3.) antes de ser corrido en la DGGE.
Los geles de acrilamida con gradiente de agentes desnaturalizantes (formamida y
urea) del ADN se prepararon usando dos soluciones de 65 % y 45 % de agentes
desnaturalizantes, preparadas a partir de las soluciones del epígrafe 4.4., a las que se
añadieron 90 l de APS (10 %) y 9 l de TEMED para producir la polimerización. Para
crear el gel en gradiente, las soluciones se añadieron mediante una bomba peristáltica a
una estructura vertical, consistente en dos cristales con una separación de 0,75 mm entre
los que se formó el gel.
Para la zona de los pocillos libre de agentes desnaturalizantes se tomaron 10 ml
de la solución al 0 % (Apartado 4.4.1.) y se adicionaron 90 l de APS y 9 l TEMED.
El gel se dejó polimerizar durante 2 h. Tras las cuales, se sumergió en tampón

TAE 0,5X (Apartado 4.3.1.), previamente calentado al 60 ºC, se cargaron los pocillos
con 20 l del producto PCR, mezclado con 6 l de tampón de carga y se aplicó una
corriente de 200 V durante 15 min, seguido de 16 h a 70 V a una temperatura de 60 ºC.
Tras la eletroforesis, los geles se tiñeron en una solución de bromuro de etidio a
0,1 µg/ml, manteniéndolos durante 30 min en agitación. A continuación, se lavaron con
agua destilada hasta alcanzar una buena resolución de las bandas y eliminar el exceso de
bromuro.
Los geles se visualizaron con un transiluminador de luz ultravioleta (λ = 300
nm) acoplado a un sistema fotográfico.
8. Ensayos de interacción planta-microorganismo
8.1. Desinfección y pregerminación de semillas
Las semillas de colza (Brassica napus L.) se desinfectaron sumergiéndolas en

etanol al 70 % durante 1 min y a continuación, en hipoclorito sódico al 1 % durante 10
min. Posteriormente, se lavaron 6 veces con agua destilada estéril.
Las semillas de soja verde (Vigna sp. L.) se sumergieron en etanol al 96 %
durante 30 segundos, seguidos de 6 min en hipoclorito sódico al 6 %. Las semillas se
lavaron 6 veces con agua destilada estéril.
En todos los ensayos, la pregerminación de semillas se realizó colocando éstas,
previamente esterilizadas, en placas de agar agua (AA) al 1 %. Estas placas se
mantuvieron durante 24-48 h a 28 ºC en oscuridad para estimular su germinación.
8.2. Preparación del inóculo
Las cepas bacterianas se crecieron según se describe en el apartado 3.1. durante

72 h para la inoculación de todos los ensayos de interacción planta-microorganismo.
Tras el crecimiento, salvo para los ensayos de enraizamiento de estaquillas de olivo en
los que se utilizó el cultivo bacteriano, las células se recogieron por centrifugación y se
lavaron dos veces con agua destilada estéril. Finalmente, las células lavadas se
resuspendieron en agua destilada estéril para los ensayos realizados con soja verde y
olivo y en MgSO4 0,03 M para los ensayos de colza.
En los ensayos en los que se inoculó mediante la introducción de las estaquillas

en una mezcla de inoculante y agua, se emplearon por cada bacteria inoculada 2 bolsas
de polietileno de baja densidad (50 m), esterilizadas con corriente acelerada de
electrones (Albareda, 2007), que contenían 30 g de turba. A cada bolsa se le inyectó, en
condiciones estériles, 20 ml de un cultivo bacteriano líquido crecido hasta 109 UFC/ml,
cerrando, posteriormente, las perforaciones producidas con una cinta adhesiva plástica
estéril. El contenido de las bolsas se mezcló hasta lograr la impregnación homogénea
del sustrato. Las bolsas se mantuvieron a 28 ºC hasta su utilización. Un esquema de la
inoculación de las bolsas de turba se muestra en la figura 3.7.
Figura 3.7. Esquema de la inoculación de las bolsas de turba.
8.3. Monitorización bacteriana
8.3.1. Inserción de la proteína verde de fluorescencia
El seguimiento del inóculo en condiciones no estériles se llevó a cabo mediante

la inserción en las cepas bacterianas de la proteína verde de fluorescencia (Green
Fluorescent Protein, GFP) a través de una conjugación bacteriana triparental, cuyo
esquema se observa en la figura 3.8. Este método se fundamenta en la utilización de una
cepa donadora (E. coli DH5α p519ngfp KmR) que contiene un plásmido movilizable
con el gen gfp, una cepa movilizadora que posee un plásmido transferible (E. coli
HB101 pRK2013) y una cepa receptora que recibe el plásmido movilizable.
Para ello, se prepararon cultivos líquidos crecidos sin antibióticos durante 24 h
en medio LB de las cepas donadora y movilizadora (Tabla III.1.) y en medio TSB para
la cepa receptora. Se pipeteó 1 ml de una de las cepas en un tubo ependorf estéril, se
centrifugó durante 1 min a 14000 rpm y se descartó el sobrenadante. Seguidamente, el
pellet se resuspendió en 500 µl de solución salina estéril a 0,85 % para eliminar los
restos de medio y se centrifugó nuevamente. A este pellet, se añadió 1 ml de otra de las
cepas y tras el mismo procedimiento de lavado con solución salina, la tercera que
igualmente se lavó. El pellet de los tres microorganismos mezclados se resuspendió en
75 µl de solución salina y se extendió en una placa de medio TSB, que se incubó a 28
ºC para permitir la conjugación. Tras 24 h de crecimiento, se recogió la biomasa y se
transfirió a un tubo ependorf estéril que contenía 1 ml de solución salina, se vorteó hasta
la homogeneización y se realizaron diluciones seriadas de las que se sembraron
alícuotas de 100 µl en un medio selectivo para la cepa receptora, al que se le había
añadido 50 µg/ml de Km. Las placas se incubaron a 28 ºC hasta la aparición de colonias
aisladas.
Las colonias transconjugantes de las cepas receptoras se distinguieron mediante
crecimiento en el medio selectivo Simmons Citrato, tras comprobar que éstas
efectivamente eran capaces de utilizar el citrato como única fuente de carbono a
diferencia de las cepas donadora y movilizadora. Asimismo, para verificar la
transferencia del plásmido, se seleccionaron colonias conjugantes mediante su
observación con el microscopio de epifluorescencia (Apartado 8.3.3.). Las colonias
seleccionadas se plaquearon en varias ocasiones sin antibióticos para comprobar la
estabilidad del marcaje.
Figura 3.8. Esquema de la conjugación bacteriana triparental.
8.3.2. Recuentos de células viables
Para la determinación de la concentración de células viables en los inoculos se

utilizó el método de conteo de colonias en placa (Vincent, 1970). A partir de 1 ml de
suspensión celular o cultivo puro o 1 g de inoculante sólido, se efectuaron diluciones
decimales en una solución de sales minerales (Apartado 4.2.1.). Las diluciones
apropiadas (aquellas que se esperaba entre 30-300 colonias/ml) se sembraron en masa
en placas (2 placas por dilución) de medio TSA diluido al 10 %. Se incubaron a 28 ºC
durante 48 h, tras las cuales, se procedió al conteo de las colonias crecidas.
En los ensayos de interacción planta-microorganismo, se realizaron recuentos de
células fluorescentes viables, tomando 1 ml de suspensión celular o cultivo puro o 10 g
de sustrato ectorizosférico (sustrato adherido al sistema radical), realizando, a
continuación, un banco de diluciones decimales con la solución de sales minerales.
Asimismo, el sistema radical de las plantas inoculadas se lavó con agua destilada estéril
hasta eliminar todos los restos de sustrato, así como las bacterias no adheridas
firmemente a ella. Posteriormente, las raíces se secaron ligeramente usando papel de
filtro y se cortaron con un bisturí. Por cada planta, se maceraron en mortero 2 muestras
de 1 g o de 100 mg de raíz, dependiendo de si provenían de plantas de soja verde u olivo
o de colza, que se suspendieron en una solución de dilución (Apartado 4.2.1.). Por
último, para precisar la concentración de bacterias fluorescentes viables inicialmente
adheridas a las semillas de colza, se maceraron 10 semillas previamente inoculadas y se

suspendieron en una solución de sales minerales. En todos los casos, las suspensiones se
agitaron durante unos minutos y se realizaron diluciones decimales. La siembra de las
diluciones adecuadas se produjo en superficie, en placas de medio selectivo Simmons
Citrato suplementado con sus respectivos antibióticos y Chx, si se esperaba la presencia
de hongos. Las placas se incubaron durante 72 h a 28 ºC y se determinó el número de
bacterias fluorescentes viables por recuento de colonias y observación bajo microscopía
de epifluorescencia (Apartado 8.3.3.).
8.3.3. Observación de la colonización mediante Microscopía
Para la observación de los cultivos puros de las cepas a las que se les había
introducido el plásmido GFP, se prepararon portas sobre los que se depositó una gota de
cultivo líquido o una gota de PBS 1X (Apartado 4.2.2.) estéril mezclada con la biomasa
procedente de una colonia. Posteriormente, cada preparación se tapó con un cubre y se
observó con el microscopio de epifluorescencia DM LB2 (Leica) con filtro 3.I3 y
objetivo de 40X ph2.
La visualización de la colonización radical producida por las bacterias marcadas
con fluorescencia se llevó a cabo cortando trozos de raíz de pequeño diámetro (máx. 20
m) con una longitud aproximada de 1 cm o bien realizando cortes longitudinales de
raíces de mayor grosor mediante el empleo de una cuchilla estéril sobre una base de
poliespan. Las muestras se lavaron ligeramente con PBS 1X, se secaron con papel de
filtro y se colocaron sobre un porta al que se le añadió el medio de montaje Citifluor
AF1 (Citifluor Ldt.). Las preparaciones se taparon con un cubre y se observaron
mediante microscopía confocal de escaneo láser (Confocal Laser Scanning Microscopy,
CLSM).
En los ensayos de soja verde se usó el microscopio confocal de escaneo láser
LSM510-Meta (Zeiss), utilizando el modo de escaneo XYZ, los filtros Ch3-1: LP 650,
Ch3-2: LP560 y Ch3-3: BP 500-550 IR, el objetivo C-Apochromat 63X/1.2 W corr. y
tres líneas de láseres a 633 nm, 543 nm y 488 nm. En cambio para los ensayos de colza
y olivo se empleó el microscopio confocal de escaneo láser TCS-SP2 (Leica) usando el
modo de escaneo XYZ, el filtro sintonizable óptico-acústico AOTF, el objetivo PL APO
63X/1.32-0.6 OIL UV y tres líneas de láseres a 633 nm, 543 nm y 488 nm. Las
imágenes obtenidas se analizaron con sus respectivos programas de edición de imágenes

(Zeiss LSM Image Browser v. 4,2,0,121. y Leica Confocal Software v. 2.61.).
8.4. Ensayos bajo condiciones gnotobióticas
8.4.1. Enraizamiento de estaquillas de Vigna sp.
Para los ensayos de enraizamiento de estaquillas de soja verde se siguieron los

protocolos de Mayak et al. (1999) y Tsavkelova et al. (2007) con algunas
modificaciones. La figura 3.9. muestra las plantas y las semillas de las dos especies de
soja verde utilizadas.
Las semillas de Vigna unguiculata y V. radiata, se esterilizaron, pregerminaron
(Apartado 8.1.) y se sembraron individualmente, en condiciones de asepsia, en tubos de
vidrio transparente de 3 x 25 cm con tapón de algodón, previamente esterilizados, que
contenían arena de cuarzo y solución nutritiva de Rigaud y Puppo 1/2X (Apartado
4.1.1.). Los tubos se mantuvieron durante 1 semana en una cámara de crecimiento
(Sanyo Electric Co., Japan) a 20-25 ºC, 80 % Hr, con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h
(4 LS). Pasado este periodo, las plántulas con 2 hojas simples se extrajeron y se cortaron
por encima del cuello con bisturí. Cada estaquilla recién cortada, se colocó
individualmente en el interior de tubos de vidrio transparentes de 2,5 x 15 cm tapados
con algodón que contenían 6 ml de una suspensión bacteriana preparada según el
epígrafe 8.2. o 6 ml de agua destilada estéril (control negativo). Las estaquillas se
mantuvieron durante 10 días en cámara de crecimiento en las condiciones descritas
anteriormente. La figura 3.10. recoge esquemáticamente el método empleado en los
ensayos de enraizamiento de estaquillas de Vigna sp.
Vigna radiata L. Vigna unguiculata L.
Figura 3.9. Plantas y semillas de las especies de Soja verde utilizadas en los ensayos
de enraizamiento de estaquillas en condiciones gnotobióticas (Blanco, 1877).
Cámara de crecimiento
(1 semana)
Siembra de semillas en tubos Crecimiento de las plántulas

que contienen arena de cuarzo
y solución nutritiva
Corte de estaquillas
Determinación del número Inducción del Introducción de las estaquillas en

de raíces y longitud total enraizamiento una suspensión bacteriana
Figura 3.10. Esquema del método empleado en los ensayos de enraizamiento de

estaquillas de Vigna sp.
Con V. unguiculata se llevaron a cabo tratamientos adicionales donde las

estaquillas recién cortadas se sumergieron durante 1 h en el sobrenadante obtenido de la
primera centrifugación o en una solución de AIA, 50 ppm (control positivo),
colocándolas posteriormente, en tubos con 6 ml de agua destilada estéril.
Al finalizar los ensayos, se determinaron los efectos producidos por las bacterias
inoculadas sobre la iniciación y elongación radical. Para ello, se contó el número de
raíces, se midieron sus longitudes y se calculó la tasa de longitud radical media.
Además, en los tratamientos llevados a cabo con cepas marcadas, se realizaron
recuentos de bacterias viables asociadas a las raíces (Apartado 8.3.2.) y se observó la
colonización radical mediante CLSM (Apartado 8.3.3.).
8.4.2. Elongación de raíces de Brassica napus L.
Para evaluar la capacidad de las cepas sobre la elongación de las raíces se utilizó
una planta modelo con alta sensibilidad a los cambios hormonales, la colza (Brassica
napus L.) y se aplicó el método de Lifshitz et al. (1987)
modificado por Patten y Glick (2002). La figura 3.11.
muestra la planta y las semillas de la colza.
Para cada tratamiento y repetición, se utilizaron 13
bolsas de crecimiento (seed-pack growth pouches) de
Northrup King Co. (USA) a las que se añadió 12 ml de
agua destilada. Cada grupo de 13 se envolvió con papel de
aluminio y se esterilizó en autoclave a 120 ºC durante 15
min. Una vez frías, las bolsas se dispusieron en una gradilla
especial (Northrup King Co., USA) que evitó que las
bolsas se tocasen unas con otras, colocando 2 bolsas en
cada extremo como protección frente a luz extrema y
corrientes de aire.
Se pesaron 0,2 g de semillas de colza para cada
tratamiento y repetición, se esterilizaron (Apartado 8.1.)
y se añadieron a 4 ml de la suspensión bacteriana Figura 3.11. Planta y
semillas de la colza.
preparada como se expone en el epígrafe 8.2., incubando (Watson y Dallwitz,
a temperatura ambiente durante 1 h. Para el control 1992).
negativo, las semillas se incubaron en MgSO4 0,03 M estéril. Tras la incubación, las
semillas se colocaron en condiciones asépticas en las bolsas de crecimiento (8

semillas/bolsa).
Las gradillas se colocaron en bandejas de plástico que contenían 1 l de agua
destilada estéril, se taparon con film transparente y papel de aluminio, para evitar la
deshidratación y la luz durante la germinación y se mantuvieron en cámara de
crecimiento (Sanyo Electric Co., Japan) a 20-25 ºC, 80 % Hr, con un ciclo de luz-
oscuridad de 12 h (4 LS) durante 7 días. Las semillas que no germinaron el segundo día
se marcaron para descartarlas en el análisis estadístico. El papel de aluminio se retiró el
tercer día y el film transparente el cuarto o el quinto, dependiendo del crecimiento de los
tallos. Pasada la semana, se midió la longitud de las raíces primarias. De forma
adicional, en los tratamientos llevados a cabo con bacterias marcadas se realizaron
recuentos de las bacterias viables asociadas inicialmente a las semillas y a las raíces
(Apartado 8.3.2.). La colonización radical se observó mediante CLSM (Apartado
8.3.3.). La figura 3.12. recoge esquemáticamente el método empleado en los ensayos de
elongación radical realizados en colza.
Figura 3.12. Esquema del método empleado en los ensayos de elongación radical
realizados en colza.
8.5. Ensayos de invernadero y vivero
8.5.1. Enraizamiento de estaquillas de olivo
En el periodo comprendido entre noviembre de 2005 hasta septiembre de 2009

se realizaron 11 ensayos en los viveros comerciales Viveros Reypra, S.L. y Plantas
Continental, S.A. (http://www.plantascontinental.com/ ). Las especificaciones de cada
ensayo se resumen en la tabla III.5.
En estos ensayos se utilizaron 4 variedades de olivo: arbequina (Ar), hojiblanca
(H), picual (Pi) y koroneiki (K). En todos los casos, las estaquillas procedieron de
plantas madres seleccionadas por su productividad, con certificación sanitaria y varietal
y con características similares a las que usaban en el vivero comercial.
Para todos los ensayos se emplearon bandejas de 273 alveolos de 2 x 3,5 cm que
contenían como sustrato una mezcla de fibra de coco y perlita en una proporción de 3:1,
salvo para el Ensayo 5 que sólo se llenaron con fibra de coco. El sustrato se humedeció
24 h antes del llenado de las bandejas con agua de riego, excepto en las bandejas cuya
inoculación de realizó mediante la mezcla de 2,7 l de sustrato con 500 ml de cultivo
bacteriano (Método 1) (Apartado 8.2.). Además de la inoculación por mezcla, se probó
una inoculación por inmersión del extremo de la estaquilla, unos 2 cm, bien en un
cultivo bacteriano a distintos tiempos (24, 2 y 1 h) (Método 2) o bien durante unos
segundos en una mezcla de inoculante en turba con agua destilada estéril (Método 3).
La figura 3.13. muestra los métodos de inoculación utilizados en los ensayos de
enraizamiento de estaquillas de olivo de forma esquematizada.
Para el control positivo, las estaquillas bien se sumergieron durante unos
segundos en una solución acuosa de AIB a una concentración que varió, según el
criterio profesional del viverista, entre 1000-3000 ppm, dependiendo del estado
fisiológico de la planta madre (Ensayos 1-8) o bien se introdujeron en AIB en polvo
mezclado a partes iguales con talco (Ensayos 9-11). Para los controles negativos las
estaquillas se clavaron sobre sustratos humedecidos con agua de riego o medios de
cultivo (500 ml), dependiendo de las características del ensayo.
Tras la inoculación de las estaquillas o del sustrato, en cada alveolo se pinchó
una estaquilla y se mantuvo durante 60 días en un túnel de nebulización, a temperatura y
humedad constante (Tª 22-28 ºC y Hr 85-90 %). Durante este periodo y de forma
regular, se realizaron distintos tratamientos fitosanitarios (cobre, aminoácidos, y
enraizantes) vía foliar, cuya aplicación y frecuencia, en todos los casos, quedaron bajo
supervisión del viverista.
En los ensayos en los que se utilizó más de una variedad, se evitó que en una
misma bandeja coexistieran distintos tratamientos bacterianos. En los casos en los que
esto no fue posible, los distintos tratamientos bacterianos se separaron físicamente
dejando filas libres entre los mismos, con el fin de preservar la independencia de las
repeticiones.
Al finalizar los ensayos, se evaluó el porcentaje de enraizamiento obtenido en
los distintos tratamientos bacterianos.
De forma complementaria, en el Ensayo 11 se realizaron recuentos de bacterias
fluorescentes viables (Apartado 8.3.2.), confirmando la presencia de éstas bajo
microscopía de epifluorescencia (Epígrafe 8.3.3.).
88
Tabla III.5. Especificaciones de los ensayos de enraizamiento de olivo realizados en vivero.
Características de los ensayos de vivero
Nº estaquillas/ Repeticiones/
Ensayos Fecha Vivero Variedad Método de inoculación Controles negativos
Repetición Tratamiento
1 Noviembre 2005 Reypra Ar / Pi 273 1 Método 1 AR / MC
2 Marzo 2006 Reypra Ar / H 273 1 Método 1 AR / MC
Método 1
3 Junio 2006 Reypra Ar / H 126 1 AR / MC
Método 2: 24 h
Método 2: 24 h
4 Septiembre 2006 Reypra Ar / H / Pi 126 2 AR
Método 3
G3960’0’0’DH
Método 2: 24 h
5 Enero 2007 Reypra Ar / H / Pi 126 2 AR
Método 3
4 Método 2: 24 h
6 Junio 2007 Reypra Ar 273 AR
2 Método 3
7 Septiembre 2007 Reypra Ar / H / Pi 78 3 Método 2: 24 h AR
8 Abril 2008 Reypra Ar 78 3 Método 2: 2 h AR

Montero-Calasanz, M.C
Mayo y septiembre
9 y 10 Continental Ar / K 52 3 Método 2: 2 h
2009
39
11 Septiembre 2009 Continental Ar 52 4 Método 2: 1 h AR
Ar: arbequina, H: hojiblanca, Pi: picual, K: koroneiki, AR: agua de riego, MC: medios de cultivo, Método 1: inoculación mediante mezcla del cultivo bacteriano con el
sustrato, Método 2: inoculación a través de la inmersión del extremo de la estaquilla en caldo de cultivo, Método 3: inoculación mediante inmersión del extremo de la
33
estaquilla en una mezcla de inoculante sólido (turba) y agua destilada estéril.

Figura 3.13. Esquema de los métodos de inoculación utilizados en los ensayos de

enraizamiento de estaquillas de olivo.
8.5.2. Persistencia bacteriana en plantas de olivo
Para hacer el seguimiento de la colonización de las cepas marcadas en las raíces

de plantas de olivo, se realizaron dos ensayos simultáneos en invernadero y vivero
durante los meses de septiembre a junio.
En ambos ensayos se utilizaron, por cada tratamiento bacteriano 30 plantas de la
variedad hojiblanca, crecidas durante un año en turba, procedentes de Viveros A-92,
S.L. (http://www.viverosa92.com ).
El ensayo de invernadero se llevó a cabo en el IFAPA Centro Las Torres-
Tomejil. En este estudio, las plantas con las raíces intactas se extrajeron cuidadosamente
de los alveolos y se lavaron con abundante agua del grifo hasta eliminar todos los restos
de sustrato adherido. A continuación, se trasplantaron a macetas estériles de 6,5 x 7 cm
que contenían arena de cuarzo y solución nutritiva Hewitt (Apartado 4.1.2.) y se
inocularon con 10 ml de una suspensión bacteriana (Apartado 8.2.). La figura 3.14.
muestra un esquema del procedimiento seguido en el ensayo de persistencia en olivo
llevado a cabo en invernadero.
Las macetas se regaron entre 1-3 veces por semana, dependiendo de la
temperatura ambiental, hasta la capacidad de campo con solución nutritiva Hewitt,
alternando con agua destilada estéril con el fin de evitar una excesiva concentración de
sales en el sustrato.
Figura 3.14. Esquema del procedimiento seguido en el ensayo de persistencia en

olivo llevado a cabo en invernadero.
El ensayo de vivero tuvo lugar en las instalaciones de Viveros A-92, S.L. (La
Puebla de Cazalla, Sevilla). En este caso, las plantas se extrajeron de los alveolos, se
trasplantaron con cepellón a bolsas de polietileno negro de 3 l de capacidad que
contenían un suelo limoso y se inocularon con 10 ml de una suspensión bacteriana. Los

olivos permanecieron al aire libre en condiciones convencionales.
En ambos ensayos, se realizaron recuentos de bacterias viables presentes en las
raíces del olivo y en la ectorizosfera (Apartado 8.3.2.) a los 3, 7, 15, 30, 60, 90 y 120
días, ampliando a 150 días en el ensayo de invernadero. Las identidades de las estirpes
se comprobaron mediante amplificación con ERIC-PCR (Apartado 7.3.4.). Los patrones
de colonización radical se observaron mediante CLSM (Apartado 3.3.3.) a los 3, 7 y 15
días en el ensayo de invernadero.
8.5.3. Efecto de la inoculación bacteriana sobre plantas de olivo
Para evaluar los efectos que la bacteria inoculada puede ejercer sobre las plantas
de olivo a lo largo del tiempo, se llevó a cabo un ensayo en el que se tomaron 25
estaquillas enraizadas procedentes de cada tratamiento bacteriano marcado con
fluorescencia del Ensayo 11, así como las correspondientes a los controles positivo y
negativo. Éstas se trasplantaron a macetas de 6,5 x 7 cm que contenían como sustrato
una turba comercial y se mantuvieron durante un año bajo umbráculo, según el manejo
del vivero Plantas Continental, S.A. Pasado este periodo, se realizaron recuentos de
bacterias fluorescentes viables de muestras radicales y rizosféricas, tal y como se
describe en el apartado 8.3.2. Asimismo, las plantas se extrajeron de las macetas con su
sistema radical intacto, se lavaron con abundante agua del grifo hasta eliminar todos los
restos de sustrato adherido y, tras su secado en estufa a 80 ºC durante 24 h, se
determinaron los parámetros biométricos (diámetro de cuello, longitud de la parte aérea,
longitud del sistema radical, peso seco de la parte aérea y peso seco del sistema radical).
Además, para complementar el ensayo anterior se dispusieron 15 plantas de un
año de las variedades arbequina y hojiblanca, procedentes de Viveros A-92, S.L, para
cada tratamiento bacteriano marcado con fluorescencia y el control negativo. Éstas se
inocularon y manejaron tal y como se ha descrito anteriormente para el ensayo de
persistencia en vivero (Apartado 8.5.2), pero se mantuvieron durante un periodo de un
año en el mismo. Transcurrido este tiempo, se determinó la longitud de la parte aérea de
las plantas y se realizó un recuento de bacterias fluorescentes viables de muestras
radicales y rizosféricas (Apartado 8.3.2.).
9. Análisis estadístico
Los datos obtenidos en los diferentes ensayos se analizaron mediante el
programa SPSS v. 10.0 para Windows.
Los datos obtenidos en los ensayos de interacción planta-microorganismo se
analizaron siguiendo en cada caso un análisis de la varianza adecuado al modelo del
diseño experimental previamente establecido (Steel y torrie, 1980):
Para la comparación múltiple entre las medias de los tratamientos de los
ensayos de enraizamiento de estaquillas de Vigna sp. y olivo y de
persistencia en plantas de olivo, en base al alto número de tratamientos a
comparar, se aplicó el test de rango múltiple de Duncan, con un nivel de
significación para rechazar la independencia u homogeneidad de los
tratamientos del 5%.
Para analizar estadísticamente el efecto producido sobre las medias de las
distintas variables, entre las dos formas de aplicación de los tratamientos
bacterianos en los ensayos de enraizamiento de V. unguiculata, se usó un
ANOVA Factorial, utilizando el test de comparaciones múltiples de
Bonferroni con un nivel de significación del 5%. Para facilitar la
compresión de los efectos de las interacciones de las variables
comparadas por el análisis factorial de la varianza se representaron los
correspondientes gráficos de perfil.
La prueba t de Student para dos muestras independientes con un nivel de
significación del 5%, aplicando el contraste de Levene sobre la homogeneidad o
igualdad de las varianzas, se utilizó para comparar las medias de los efectos producidos
en las distintas especies vegetales por la inoculación de las cepas silvestres y las
marcadas con fluorescencia. Asimismo, esta prueba se empleó en los ensayos de
elongación radical realizados con colza, ya que cada tratamiento bacteriano se testó con
un control negativo independiente debido a la falta de espacio en condiciones
controladas para el montaje de cada ensayo completo.
En los ensayos de permanencia bacteriana en raíces de olivo, previa a la
realización del correspondiente análisis estadístico, las poblaciones de microorganismos
viables se transformaron a logaritmo decimal.
Resultados
Resultados
1.1. Aislamiento y caracterización de bacterias de suelo de

olivar ecológico
La producción ecológica es un tipo de agricultura sostenible que tiene como

objetivo fundamental el respeto del medio ambiente y la conservación de la fertilidad de
tierra y de la diversidad genética (Consejo Regulador de la Agricultura Ecológica -
CRAE, 1990), pudiendo considerarse a este sistema agrario como un medio natural
idóneo para la selección de bacterias beneficiosas.
En el cultivo ecológico del olivar, una de las estrategias fundamentales para
aumentar su sostenibilidad a nivel predial es el uso de cubiertas vegetales de manera
temporal, bien con especies cultivadas o con la flora adventicia presente. Esta práctica
agrícola posee un doble propósito, por un lado mantiene el suelo vivo, protegido de la
erosión, y por otro promueve la restauración de la diversidad en el olivar, favoreciendo
las interacciones beneficiosas (Gliessman, 2001) y por tanto, influyendo decisivamente
sobre la comunidad microbiana (Wenhui et al., 2007).
La rizosfera de las plantas se describe como el área del suelo próxima a las
raíces, donde las propiedades de éste son influenciadas por la presencia y actividad de la
raíz (Remans et al., 2008; Richardson et al., 2009), proponiéndose esta zona, por tanto,
como una de las mejores fuentes donde aislar bacterias beneficiosas para plantas
(Marilley y Aragno, 1999; Barriuso, 2006), las denominadas PGPR.
Así, para la constitución de una colección bacteriana de PGPR aisladas de olivo
se optó por una recogida de muestras de suelo en un olivar de la variedad arbequina
certificado para la producción ecológica desde 2002. Este muestreo se llevó a cabo en
primavera (2006), por ser la época de mayor actividad biológica del suelo (Perrot et al.,
1992; Murphy et al., 1998). La parcela de estudio presentaba tres zonas diferenciadas en
base al tipo de manejo de cubierta vegetal: cubierta espontánea, cubierta dirigida de
leguminosas y laboreo (Figura 4.1.).
De cada zona se recogieron muestras de las fracciones rizosféricas, definiendo
como tales las procedentes del volumen que rodea al sistema radical del árbol, y de
suelo libre. Para realizar los aislamientos bacterianos, las muestras rizosféricas se
separaron en ectorizosfera y rizoplana. Éstas junto con las correspondientes al suelo
Resultados
libre, se utilizaron para realizar diluciones seriadas y recuentos de bacterias aerobias

viables.
En todos los casos, las muestras rizosféricas revelaron una diferencia de un
orden de magnitud entre la población bacteriana ectorizosférica (10 6 UFC/ g de suelo) y
la rizoplánica (107 UFC/ g de raíces).
El aislamiento bacteriano de las
colonias crecidas en las placas
sembradas con diluciones de la
ectorizosfera, de la rizoplana y del suelo
libre se efectuó siguiendo una estrategia
basada en la recogida del máximo
número de colonias con el fin de evitar
pérdidas en la variabilidad (Barriuso,
2006). Esta estrategia dio lugar a una Figura 4.1. Vista aérea de la parcela de
colección de 378 cepas bacterianas, que olivar ecológico donde se realizó la
recogida de muestras.
en su totalidad se encuentra conservada Coordenadas UTM: Huso 29, X: 758.176, Y:
4.136.420. Fuente: Sistema de Información
en el Departamento de Recursos Geográfica de Parcelas Agrícolas (SIGPAC).
MARM.
Naturales y de la Producción Ecológica
del Centro IFAPA Las Torres-Tomejil de Alcalá del Río (Sevilla).
1.1.1. Caracterización bioquímica y morfológica
La selección in vitro de bacterias con características PGP se ha demostrado que

puede ser útil en la selección de cepas con una posible aplicación, tanto en condiciones
de vivero como de campo (Khalid et al., 2004; Barriuso et al., 2005), proporcionando
ventajas económicas y ecológicas (Fuentes-Ramírez y Caballero-Mellado, 2005).
Según los objetivos marcados en esta tesis, la selección de las cepas aisladas se
centró sobre las actividades que potencialmente pueden determinar que una bacteria
promueva el crecimiento vegetal (Cattelan et al., 1999). Para ello, se determinaron in
vitro capacidades bioquímicas, relacionadas con la mejora de la nutrición de la planta
(solubilización de fosfato y producción de sideróforos) y con la producción de la
hormona vegetal AIA (Figura. 4.2.). Se ha demostrado que las rizobacterias
solubilizadoras de fosfato juegan un papel fundamental en el ciclo del P (Rodríguez y
Fraga, 1999) que se traduce en una mejora de la disponibilidad del elemento químico en
Resultados
el suelo y en la posibilidad de utilizar este tipo de microorganismos como

biofertilizantes (Ali, 2009). Igualmente, el uso de cepas con la habilidad de producir
sideróforos promueve una mejora en la nutrición de hierro en la planta y dificulta el
crecimiento de patógenos (Ramos-Solano et al., 2010), constituyéndose por tanto como
otro de los criterios básicos de selección a tener en cuenta. Asimismo, la biosíntesis de
auxinas, especialmente AIA, es considerada crucial en el crecimiento y desarrollo de la
planta. De este modo, la caracterización de los aislados como productores de AIA es de
suma importancia.
Figura 4.2. Detección in vitro de cepas productoras de sideróforos (a) y

solubilizadoras de fosfatos (b).
De forma complementaria, cada cepa se caracterizó morfológicamente según el

aspecto de la colonia y el tipo celular. Así, de las 378 cepas aisladas se obtuvo que el 75
% se diferenciaban como Gram negativas, presentando morfología bacilar el 81 % de
las mismas (Figuras 4.3 y 4.4.).
Gram Positivas (%)
4,4% Coco
48,4%
82,6% Cocobacilo
13,0%
Bacilo
34,2%
Bacilo esporulantes
Figura 4.3. Resultados en porcentaje de la morfología observada en los

aislamientos Gram positivos.
Resultados
Gram Negativas (%)
Cocos
8,6%
Coco-bacilos
10,8%
Bacilos
80,6%
Figura 4.4. Resultados en porcentaje de la morfología observada en los

aislamientos Gram negativos.
En cuanto a la caracterización bioquímica como PGPR, se encontró que el 49 %

(176 cepas) poseía alguna característica PGP. De éstas, el 62 % demostró ser productora
de AIA, observándose una producción superior a 25 ppm en el 18,7 % de las mismas,
mientras que las características relacionadas con mejoras en la nutrición las presentaron
el 78 % de los aislados. El análisis de la distribución por características PGP que refleja
la figura 4.5. reveló que, entre las bacterias Gram positivas, abundaban cepas que
poseían como única característica PGP la producción de auxinas (18 %). En cambio,
para las bacterias Gram negativas, el grupo mayoritario resultó estar constituido por las
cepas que mostraban las tres características estudiadas (39,1 %), seguidas de las que
presentaban capacidad para solubilizar fosfatos y producir sideróforos (28,5 %) y de las
que producían AIA como única habilidad PGP (22 %).
Las características individuales de cada cepa PGPR aislada pueden observase en
el Apéndice I de este trabajo.
Resultados
120
100
Nº de aislamientos
80
60
40
20
0
Gram + Gram -
AFS AF AS FS A F S A total FS total
Figura 4.5. Número de aislamientos distribuidos según sus características PGP

mostradas in vitro.
A: cepas productoras de AIA. F: cepas solubilizadoras de fosfatos. S: cepas productoras de
sideróforos. FS: cepas con características relacionadas con la nutrición.
Teniendo en cuenta las distintas zonas de aislamiento (Figura 4.6.), se halló que
las cepas PGPR estudiadas se distribuían principalmente y con porcentajes similares, en
la zona de la rizoplana y la ectorizosfera (45,5 y 47,7 %, respectivamente) y, que sólo
un pequeño porcentaje (6,7 %) habían sido aisladas del suelo libre. No se encontraron
diferencias fenotípicas significativas entre la microflora aislada de las zonas
muestreadas. En función del manejo de cubiertas (Figura 4.7.), se observó que el 50 %
de los aislados con características PGP correspondían a la zona de laboreo. Asimismo,
tanto las cepas productoras de AIA y sideróforos, como las solubilizadoras de fosfatos,
se concentraron en esta zona, tanto en ectorizosfera como en rizoplana.
Resultados
30
Porcentaje (%)
25 Laboreo
20
15 C. Espontánea
10
5 C. Dirigida
0
Rizoplana Ectorizosfera Suelo libre
Zonas de aislamiento
Figura 4.6. Distribución de los aislamientos según zona de muestreo y manejo de

cubierta.
30
Porcentaje (%)
20
10
Laboreo
C. Espontánea
C. Dirigida
Manejo de cubiertas
Rizoplana A Rizoplana FS Ectorizosfera A

Ectorizosfera FS Suelo libre FS Suelo libre A
Figura 4.7. Distribución de las cepas productoras de AIA y con características

relacionadas con la nutrición, según el manejo agrícola y la zona de aislamiento.
C.: cubierta. A: cepas productoras de AIA. FS: cepas con características relacionadas con la
nutrición.

Resultados
1.1.2. Caracterización basada en técnicas moleculares
1.1.2.1. ERIC-PCR
La identificación de las cepas llevada a cabo mediante criterios morfológicos y

bioquímicos plantea ciertas dificultades en el establecimiento de diferencias o
similitudes concluyentes entre microorganismos (Coll, 2004). Así, para complementar
los datos obtenidos, eliminar las cepas redundantes y conocer la biodiversidad presente
en la colección aislada del olivo, se usaron técnicas de tipificación molecular basadas en
la amplificación del ADN (Prosser, 2002). Este grupo de técnicas, además de posibilitar
la comparación entre aislados, permite conocer las relaciones existentes entre ellos (de
Bruijn et al., 1996), presentando como principales ventajas, una estabilidad
independiente de las condiciones de crecimiento bacteriano, rapidez y la aplicación
universal a distintos géneros y especies de microorganismos (Coll, 2004). Entre estos
métodos se incluye una técnica que en conjunto recibe el nombre de Rep-PCR, basada
en el uso de cebadores complementarios a fragmentos de regiones que están muy
conservadas y que aparecen repetidas en el genoma bacteriano (Versalovic et al., 1991;
Rademaker y de Bruijn, 1997; Rivas et al., 2001). Estos elementos Rep se componen de
tres familias de secuencias: los elementos REP (PCR sobre elementos palindrómicos
extragénicos reiterativos) de 35-40 pb, ERIC (PCR sobre elementos consenso
intergénicos reiterativos de enterobacterias) de 124-127 pb y BOX (PCR sobre
elementos box) de 154 pb (Versalovic et al., 1994). Estas familias de secuencias se
encuentran en muchas bacterias, si no en todas, en distintas e intergénicas posiciones
alrededor de todo el cromosoma, en ambas orientaciones, y pueden servir como sitios de
hibridación de cebadores para la amplificación de ADN (Valverde, 2003).
Según los objetivos marcados al inicio de este epígrafe para la amplificación del
ADN de las cepas se eligió la técnica de ERIC-PCR usada frecuentemente para la
clasificación e identificación de cepas de suelo (Schneider y de Bruijn, 1996; Donate-
Correa et al., 2004), ya que es una técnica extremadamente fiable y altamente
discriminatoria a nivel de estirpe (Versalovic et al., 1994; Rademaker y de Bruijn, 1997;
Reyes-Ramírez e Ibarra, 2005).
Para optimizar la reproducibilidad del método se estandarizaron las condiciones
experimentales (Coll, 2004), verificando los resultados mediante la amplificación de
cada cepa por duplicado y en dos reacciones independientes.

Resultados
Las matrices de similaridad de los patrones de bandeo generados entre cada par
de cepas se calcularon a través de un modelo basado en bandas (Coeficiente de Dice) y
mediante un modelo basado en curvas (Coeficiente de Pearson) (Rademaker y de
Bruijn, 1997). Los resultados de similaridad obtenidos a través de estos coeficientes se
representaron gráficamente como un dendrograma de homologías a través del método
de agrupación por pares no ponderado, utilizando promedios (UPGMA) (Sneath y
Sokal, 1973). Este método es frecuentemente usado para el estudio de rep-PCR
(Donate-Correa et al., 2004) y asume que el número de diferencias entre dos secuencias
de ADN es idéntico para todas las cepas, dando lugar a un árbol “con raíz” (o punto de
partida) a partir del cual tienen lugar las divisiones. Asimismo, para medir la fiabilidad
de los agrupamientos se utilizó el coeficiente de correlación cofenética (CCC) (Rohlf y
Sokal, 1981), considerando un valor por encima de 50 % como estable (Coll, 2004).
Los dendrogramas obtenidos de la aplicación del coeficiente de correlación de
Pearson y el algoritmo UPGMA presentaron una desviación de la similitud en los
marcadores moleculares cercana al 10 % que imposibilitó un análisis fiable de la
biodiversidad bajo estos parámetros (Figura 4.8.). Debido a la dificultad encontrada para
obtener unas condiciones estandarizadas óptimas, que dieran lugar a intensidades de
banda reproducibles para la aplicación del coeficiente de Pearson, se optó por la
aplicación del coeficiente de Dice y el algoritmo UPGMA.
Los dendrogramas de las cepas Gram positivas y Gram negativas derivados de
los patrones electroforéticos, se muestran en las figuras 4.9. y 4.10. La amplificación
mediante ERIC-PCR de las cepas PGPR aisladas, dio lugar a la obtención de perfiles
complejos bien definidos con una buena distribución de bandas a lo largo de toda la
zona activa delimitada. Asimismo, este análisis reveló una alta discriminación por
debajo del nivel de especie y una alta reproducibilidad, permitiendo la eliminación de
11 cepas redundantes, 1 Gram positiva y 10 Gram negativas, que presentaban una
similaridad del 100 %, poniendo de manifiesto la alta diversidad genética presente en la
colección aislada de la rizosfera del olivo.
Los dendrogramas definidos presentaron una alta fiabilidad, expresada en
valores de CCC superiores o iguales al 50 %. Las cepas Gram positivas se segregaron,
por encima del 50 % de similitud, en 7 grupos distintos, distribuyéndose principalmente
en uno de ellos. Las bacterias Gram negativas, a pesar de ser el grupo más numeroso,
demostraron una menor dispersión, agrupándose solamente en 5 conjuntos por encima
del 50 %. A nivel particular, las cepas, salvo en contadas ocasiones y dentro de los

ERIC1
Resultados
100
10
20
30
40
50
60
70
80
90
CT87
grupos segregados, no se agruparon de acuerdo a su procedencia, encontrándose cepas
CT304 93
91 CT198
muy relacionadas e incluso idénticas aisladas de zonas de muestreo distintas. CT184
77
CT247
93
CT15
81
CT344
CT250
76
CT331
CT90
71
CT345
CT45
CTN3
ERIC1 ERIC1
81 CT50
CT276
76 CT241
81
CT207
82
CT137
100
CT18
10
20
30
40
50
60
70
80
90
CT87
M
93
CT304
M
91 CT198
M
72
CT184
M
80
77
73
CT247
M
93
CT15
M
81
CT344
M
CT250
M
92
76
CT331
M
68
86 CT90
M
71
CT345
M
76
CT45
M
CTN3
M
81 CT50
M
CT276
M
59 78
76 CT241
M
85
99 81
CT207
M
82
89
CT137
M
89 CT18
M
93
M
61 M
99
72 92
M
88
80
M
73 M
M
CT174
97 M
CT205
92
M
M
Figura 4.8. Dendrograma elaborado a partir de los perfiles electroforéticos de
86 M
los90 68
86
marcadores moleculares usados mediante la aplicación del coeficienteM de

76
correlación de Pearson, el algoritmo UPGMA y CCC. 75
M
La barra superior muestra el porcentaje de similitud entre los perfiles de bandas. Los números Mde los
97
98
nodos de las ramas representan el CCC. M: Marcador molecular. M

M
59 78
M
85
99 94
M
96 89
M
83 89
M
93
85 M
61 M
99
92
M
88 M
M
95
96 CT174
97 98 CT205
88
97
90
94
86
Montero-Calasanz, M.C. 92 103

75
97 74
98
95
Montero-Calasanz, M.C.
ERIC1
ERIC1 ERIC1
ERIC1
100
100
30
40
50
60
70
80
90
30
40
50
60
70
80
90
MM
MM
MM
MM
MM
MM
MM
Leyenda MM
MM
MM
SL MM
MM
RL MM
MM
SOLIVL MM
MM
SCE MM
MM
RCE MM
100
100
MM
98
SOLIVE MM
98
100
MM
100100
MM
SCD 98 98 100
9898 98100
98
100100
100 MM
97
98 98 CT18
CT18
RCD 98 98
98 98
94 97
CT198
CT198
98 98 98 94
98
97 CT276
CT276
SOLIVD 97
98
98 98
98 98
94 97 97 CT205
CT205
97 97
98 98 94 94 CT304
98 97 97
94
97 97
CT304
Marcador molecular 97 98 98
98 98
94 94 CT166
CT166
94 94
94 97 97
97 CT345
CT345
94
97 97
97 97 78
CT133
CT133
78
94 CT157
CT157
94 78
94
94 CT31
CT31
78 78
94 94
94 94
78
78 CT20
CT20
78
78 CT250
CT250
78 78
78 78 78
78
78 CT117
CT117
90
90 78 78
78 78 100
CT9
CT484
CT484
100
CT9
87 CT404
CT285
CT285
90 87 CT404
90 68
CT274
CT9
CT462
CT462
100
90
68
CT274
CT9
90 100 CT9
CT182
CT404
CT344
CT344
87 100 CT9
CT182
90 90
90 90 87
100 CT404
CT404
62 87
100100
CT203
CT9
CT274
CT9
CT9
CT404
62 68 87
100100 CT203
CT274
90
90
68
68 87
87 87 CT402
CT274
CT404
CT340
CT182
CT404
CT404
CT274
CT340
68 CT182
CT182
56 62
68
CT274
CT6
CT203
CT274
CT274
CT182
56 62 68 68 CT6
CT203
90
62 CT203
CT182
CT340
CT184
CT182
CT182
62 CT203
CT184
90 CT340
90 56
62 62
62 CT340
CT203
CT6
CT247
CT203
90 100 CT340
CT247
56 100 CT6
90 90 56 CT6
CT340
CT184
CT15
CT340
90 56 CT6
CT15
89 CT184
56 56 CT184
CT6
CT247
CT174
CT6
89 56 100 CT184
CT174
CT247
100 CT247
CT184
CT15
CT34
CT184
100 CT247
CT34
89
100 CT15
CT15
CT247
CT174
CT325
CT247
89 100100
100 CT15
CT325
CT174
89
89 CT174
CT15
CT34
CT410
CT15
96 CT174
CT410
CT34
89 89
89 89 96
89 CT34
CT174
CT325
CT174
CT90
76
CT34
CT90
CT325
76 CT325
CT34
CT410
CT34
CT188
96 CT325
CT188
CT410
89 96
89 CT410
CT325
CT90
CT325
CT99
89 76
96
96
CT410
CT99
CT90
89 76 CT90
CT410
CT188
CT410
87 76 96 96
96 CT137
CT90
CT137
CT188
8987 76
89 89
CT188
CT90
CT99
CT90
76 76
76
CT50
CT188
CT50
CT99
87 CT99
CT188
CT137
CT188
87
CT12
CT99
CT12
CT137
87 CT137
CT99
CT50
CT99
87 CT379
CT137
CT379
CT50
82
87 87
86 82 CT50
CT137
CT12
CT137
87 86 CT50
CT193
CT12
CT193
CT12
CT50
CT379
CT50
82
CT12
CT7
CT379
CT7
86 82 CT379
CT12
CT193
CT12
86
82 CT379
CT353
CT193
CT353
86 82
86 CT193
CT379
CT7
CT379
86 86 82 82 CT193
CT73
CT7
CT73
86 86 82
86 80 80 CT7
CT193
CT353
CT193
CT7
CT241
CT353
CT241
CT353
CT7
CT73
CT7
86
86 80
CT353
CT331
CT73
CT331
86 80 CT73
CT353
CT241
CT353
87 87
86 80 CT73
CT491
CT241
CT491
80
86 86 CT241
CT73
CT331
CT73
86 80 80 CT241
CT331
CTN3
CTN3
80
CT331
CT241
CT491
CT241
87
87
CT331
CT491
CT207
CT207
87 CT491
CT331
CTN3
CT331
87 CT491
CTN3
CT45
CT45
100100
CTN3
CT491
CT207
CT491
87 87
87 87 CTN3
CT207
CT87
CT87
CT207
CTN3
CT45
CTN3
100
100
CT207
CT45
CT45
CT207
CT87
CT207
100
100
CT45
CT87
CT87
CT45
CT45
100100
100100 CT87
CT87
CT87
Figura 4.9. Dendrograma elaborado a partir de los perfiles electroforéticos obtenidos tras la amplificación con ERIC-PCR de las
cepas PGPR Gram positivas aisladas de las muestras de suelo de olivar ecológico de acuerdo a la aplicación del coeficiente de
correlación de Dice, el algoritmo UPGMA y CCC.
La barra superior muestra el porcentaje de similitud entre los perfiles de bandas. Los números de los nodos de las ramas representan el CCC. El color de la
rama indica la zona de donde fue aislada: ectorizosférica (verde) o rizoplánica (morado). El color del cuadro indica la zona de la que fue aislada. Leyenda:
SL, fracción ectorizosférica de la parcela de laboreo; RL, fracción rizoplánica de la parcela de laboreo; SOLIVL, suelo libre de la parcela de laboreo; SCD,
fracción ectorizosférica de la parcela con cubierta dirigida; RCD, fracción rizoplánica de la parcela con cubierta dirigida; SOLIVD, suelo libre de la parcela
con cubierta dirigida; SCE, fracción ectorizosférica de la parcela con cubierta espontánea; RCE, fracción rizoplánica de la parcela con cubierta espontánea;
SOLIVE, suelo libre de la parcela con cubierta espontánea. Errata: CT18 se aisló de SOLIVD.
Resultados
105
ERIC1 ERIC1
ERIC1 ERIC1
ERIC1
ERIC1
ERIC1 ERIC1
ERIC1
ERIC1 ERIC1
ERIC1 84
ERIC1
ERIC1
84
84
84
84
84 100
84
84 100
84
84
84 100
100
70 100
100
70 100
100
84 100
70
70 84 100
100
84
84
100 100 100

10 10 10
20 20 20
30 30 30
40 40 40
50 50 50
60 60 60
70 70 70
80 80 80
90 90 90
70
70
100100
0 0 0
70
1010 10
2020 20
3030 30
4040 40
5050 50
6060 60
7070 70
8080 80
9090 90
70 84
84 100
00 0
70 100
100
70
70 100
100 CT341
100
100
100
70 100
100 CT341
10
20
30
40
50
60
70
80
90
70 84
73
84
0
73
70
7070
84
84
84
100
100
100 100
100 CT341
CT341
CT341
CT466
70 73
73 100
70
7070
70
100
100
100
CT341
CT466
CT341
70
70
7070
70
84
84
73
73
73
84
73
100
100 CT466
CT466
CT466
CT145
100
70
70 8473
73
73 100
100 CT466
CT145
CT466
70
70
84
84
84 100
100 CT145
CT145
CT145
CT41
100
100 100
70
70
70 84
84 100
100
100
CT145
CT41
CT145
70
70
70
70 73
73
73
73
100
100 100
100
CT41
CT41
CT41
CT60
70
70
70
7070
100
100
CT60
CT41
CT41
70 73
73 100 100
100 CT60
CT60
CT60
CT334
100
70
70
7070
70 73 9595 100
100 CT334
CT60
CT60
70
70
70
70 73
73
CT334
CT334
CT334
CT433
CT334
CT433
Leyenda 70
70
70
70 73
73 95
73
73 95
73
95
95
95
95
100
100
100
100
100
100
CT334
CT433
CT433
CT433
CT496
70 73 9595
95
100
100
CT496
CT433
CT433
70
70
70 73
73 65
65 100 CT496
CT496
CT496
CT416
73
70
70 73
65
65 60 CT496
CT416
CT496
73 95
95
6595
65
60 CT416
CT416
CT416
CT323
95
65 CT323
CT416
SL 65
65
6595
65 95
60
55 60
55 60
60
60
60
CT416
CT323
CT323
CT323
CT403
60
60
CT403
CT323
CT323
95 55
95 55 60 CT403
CT403
65
65 95 55 CT403
CT359
CT359
CT403
95 55
RL 6595
65
65
65
55
55
55 60
55 60
55
60
65
65
60 65
CT403
CT359
CT359
CT359
CT388
95
95
95
95
65 CT388
CT359
CT359
65
65 95
95
60
60 65
65
65
CT388
CT388
CT388
CT47
65
6595 55 CT388
CT47
SOLIVL 65
6595
95
55
55
55 60
60
60
65
65
65 CT388
CT47
CT47
CT47
CT329
65
65
65
55 60
55 60 CT329
CT47
CT47
65 65
65 CT329
CT329
CT329
CT363
65
65
65 60 65
60
55 60
55 CT363
CT329
CT329
SCE 65
65
65
55 60
55 60 65
55 60
60
65 CT363
CT363
CT415
CT363
CT415
CT363
55
5555 60
6065
65
CT363
CT415
CT415
55 65
65
CT317
CT415
CT317
CT415
5555 65 CT415
RCE 55
55
55 65
6565
65
CT317
CT317
CT317
CT387
CT317
CT387
CT317
6565
CT387
CT387
CT194
CT387
65
65
CT194
CT387
CT387
CT194
SCD 65 CT194
MCT194
MCT194
CT194
M
MM
M
MMM
MM
RCD M
M
M
MM
MM
MM
MM
M
MM
Marcador molecular M
M
M
M
M
M
M
MM
MMM
MM
87
87 MM
MM
87
87
M
MM
87
87
MM
MM
87
87
87
M
MM
87
87 MM
MM
M
MM
87
87
MM
MM
87
87 M
MM
MM
MM
87
87 M
MM
87
87
MM
MM
87 M
MM
87
87 MM
MM
87
87
87
M
MM
87 MM
MM
87
87
87
M
MM
87
87 MM
MM
M
MM
MM
MM
M
MM
86 MM
MM
86
M
MM
86
86 MM
MM
95
95 86
86
86 M
MM
86
95
95
86
86
86
MM
MM
95
95
M
MM
92
92
95
95
95
MM
MM
95
95 86
86 M
MM
92
92 86
86 M
MM
M
92
92
MMM
9392
9392 95
95 86
86
M
MM
M
92
92
92 95
95 M
MM
MM
93
93 86
86 M
MM
93
93
94 9392
95
95 86
86 M
M
MM
M
94 93
9392
86
MMM
9392
94 9392
95
95 M
MM
CT350
94 86
86
86
86
95
95
M
MM
CT350
MM
94 92
94
94
92
86
95 M
MM
94
94 93
93 86
86 CT309
CT350
CT350
CT350
M
CT309
93
93
94
94 93
93 92 95
92
95
95 86
MCT350
M
92
95 86 CT350
CT350
CT457
CT309
9392
93 9392 95
93
94
94
95
95
CT309
CT350
CT457
CT350
93
93 95 CT350
9394 92
94 93
92
93 9392
93 92 95 CT186
CT457
CT457
CT186
93
93 9370
94 93
94 93
70
9292
77
77 92
7092
CT2
CT186
CT186
CT2
9370
939493
94 92
93
77 93
77
94 9370
70 CT459
CT2
77 93
77
77
9394 70
93
949370
70 CT2
CT459
77 93
77 93 9370
70
77 94
77 94
9493
93 CT389
CT459
CT459
CT389
94
93
9394 7070
94
93
77 93
77 94 70 80 CT405
CT389
CT389
CT405
93 94 70 80
77 94
77
93
93
93
70
70 80
80 CT22
CT405
CT405
CT22
77
77 80 90
80
93
70 7480 90
93
93
77 93
77
70 80
80
70 74 80
80 90
90
CT364
CT22
CT22
CT364
70
77 93 93 70 74 74 90
77
77 90
90 CT367
CT364
CT364
CT367
70
70
70 74 80 90
7480
74 90
77
77 71 74
70 7480 90
90
77 71
77 70 74
70 74
80 CT234
CT367
CT367
CT234
77
77 71
71
70 80
70 80 90
90
67
77
77
77
7071
71
71 74 74 90
90
CT319
CT234
CT234
CT319
67 71
71 80
80
74
71 74 80 90
71
67
67 80
80 90 CT115
CT319
CT319
CT115
74
74
67
67
67 71
71 90
67
67
5771 74
80 90
80
80
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CT223
CT223
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CT266
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CT195
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50
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CT372
CT320
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CT372
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CT51
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CT372
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94
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CT80
CT372
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100
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CT470
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CT80
CT471
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CT470
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CT471
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100
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CT80
CT80
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93
80 CT470
CT160
CT471
CT306
CT306
67 76
76
93
93 80
9380 CT160
CT80
CT470
67
94
94 CT470
CT471
CT204
76 948989
80
80
80 CT80
CT160
CT80
67
67 76 94
94
94
93
9393 80
93 80 CT204
CT470
CT471
9380
80 CT471
CT177
CT160
67 76
76
89
89 93 CT470
CT204
CT470
67 94
94 89
9489 93 80 CT177
CT471
CT160
76 94
76 9489
89 93
80
93 CT160
CT204
CT407
CT177
67
67 89
94 89
89
CT471
CT471
CT407
67
67
67
67 76 94
76 94
80
80 CT160
CT204
CT204
76 94 89
89 80 CT177
CT338
CT160
CT407
CT160
67
67
67
76
76
76 80 CT338
CT204
CT177
67 CT177
CT407
CT348
67
76
89
89 80
80 CT204
CT338
CT204
67 76
76
76 89 80
80 98
98
CT348
CT177
CT407
6767
76 89 80
80 CT407
CT338
CT322
67 76 98 CT177
CT348
CT177
7676 89 94
89 80
80
80
98 CT322
CT407
CT338
76 89
94 80
80
98
98
98 CT338
CT348
CT81
CT322
CT407
89
89
89 94
94 80
98
98 CT407
CT81
80 98
98 CT338
CT348
CT348
89
76
89
89
94
94
94 80
80 CT322
CT409
CT338
CT81
CT338
76
89
89
94
94 98
98 CT409
CT348
CT322
89
76
76
94
94 CT322
CT81
CT355
CT409
98
98 CT348
CT409
CT348
89
76
89
76
94
76 8994 CT355
CT322
CT81
76
76 98 CT81
CT409
CT72
CT355
CT322
76
76 94
94
98 CT355
CT322
CT72
98 CT81
CT409
CT409
76
76 94
94
98
98
CT355
CT33
CT72
CT81
CT72
CT81
69
98
98
98 CT33
CT409
CT355
69 76
76 94
94 CT355
CT72
CT414
CT33
CT409
98 CT33
CT409
CT414
69
69 76 94
94
94
94
98
98
98 CT355
CT72
67
67 69
69
76 77
77 98 CT72
CT33
CT314
CT414
CT355
69
69
69 76 9494
98 CT414
CT355
CT314
67
67
69
69
76 94
94
77
77 9898 CT72
CT33
CT33
67
67
76
76 94
76 9477
76
77 77
77
77
98 CT414
CT431
CT314
CT72
CT314
CT424
CT72
67
67
67 69
69 77
77 CT424
CT431
CT33
CT414
67
9477
77
94 77
77 CT414
CT424
CT314
CT347
CT431
CT424
CT33
67 67
67
76
76
76
75
7675 94
77
77 CT431
CT148
CT33
CT148
CT347
67 69
69 76 77 77
77 77
CT424
CT424
CT414
CT314
CT424
67 67
67 75 77
76 75 CT314
CT148
CT431
CT347
CT424
CT148
CT414
67
69
69 76 77
77 CT347
CT248
CT414
CT248
CT424
67
67
67
67
75
76
75
76 75 77 77 77 CT148
CT314
CT148
CT431
CT148
67
67 69
69 75 77
75 CT431
CT248
CT424
CT347
CT148
CT248
CT314
CT424
67 67
67 75
75
77
77 CT40
CT314
CT40
CT148
CT248
67 69
69
69
69 CT248
CT431
CT347
CT248
67
67 75 77
75
77
77 CT347
CT40
CT148
CT424
CT248
CT40
CT148
CT431
67
67
77
77 CT453
CT431
CT453
CT248
CT40
67
67
67
67 67
69
69
69
69
100
100 77 7777
77
77 CT40
CT347
CT424
CT40
CT424
67 69
100
75
75 CT453
CT248
CT148
CT40
CT453
CT248
CT347
CT58
CT347
67 69 100 77
75 77 77 CT58
CT40
CT453
CT453
CT424
CT148
67
67
67 67 6969 100
10075 77 77
77 77 CT453
CT148
CT453
CT58
CT40
CT248
67
67 69 100
100
77 77
77 77 CT58
CT40
CT424
CT368
CT424
67 67
67 10075
75 77 CT368
CT58
CT148
CT58
CT248
67 100
100 77
75 77 77 CT58
CT248
CT58
CT368
CT40
67
67
67 67
67
67 100
75
75
77
75 7777 77
77 CT368
CT148
CT402
CT148
100 100 CT402
CT368
CT368
CT248
CT40
77 100 CT368
CT40
CT368
CT402
67
67
67
6789
75
7575 77 77
100 CT402
CT248
CT277
CT248
6789
100
10075 77 100
75 CT277
CT402
CT402
CT40
68 67 75
100 100
100 CT402
CT402
CT277
68
6789
89 10075
100
100 CT277
CT40
CT367
CT40
68
68
67
67 89 75
75 100 CT367
CT277
CT277
89
89 100
100
100
100 CT277
CT277
CT367
68
68 89
89 100 CT367
CT36
68
68
68 89
89
100
100
100
100 100 CT36
CT367
CT367
CT367
CT367
CT36
68
68 89
89 CT36
CT432
68 100
100
100
100
100
100 CT432
CT36
CT36
68 100
100
100 100 CT36
CT36
CT432
89
89 100
100 100 CT432
CT37
68
68
100 CT37
CT432
CT432
89 100
100
100
100 100
100 CT432
CT432
CT37
68
89 100
100
100 CT37
CT163
68 100 100
100
100
100 CT163
CT37
CT37
86
89
89 100
100 CT37
CT37
CT163
68
68 8689
89 100 CT163
CT393
71 68 89
89 100 100
100
100 100 CT393
CT163
CT163
71 68
68
68 86
86 100
100 100 CT163
CT163
CT393
71 86
86
89 100 100 CT393
CT271
71 89
8689
89
100
100 71
71
100 CT271
CT393
CT393
71
71
68
68
68 86
8689
100
100
100 100
100 CT393
CT393
CT271
71
71
68
68 89
86
86 100 82
100 71
71
100
100 CT271
CT465
71
68 89 82
100 CT465
CT271
CT271
71
71 86
86
89
89 100
100
71
71
71
100
100 CT271
CT271
CT465
71
68
68
68 82
82 71
71 100 CT465
CT84
71 100
100
100
100 82
82 71
71
100 CT84
CT465
CT465
74 86
86 82 CT465
CT465
CT84
74 82
82 71
71 CT84
CT168
71
71 86
86 100
100 82
100 82
100
100 CT168
CT84
CT84
74
74
71
100
100 100 CT84
CT84
CT168
74
71
74 86
82
100 82 71
71 100 CT168
CT169
74
74
86 CT169
CT168
CT168
74
71
71
86
86 100
100 71 100
100 CT168
CT168
CT169
76
74
74
76
86
86 100 82
82 71 CT169
CT127
71
71
71
71
74
100
100
100
100 CT127
CT169
CT169
74
76
76 86
86
86 82 71
71 CT169
CT169
CT127
86
86
82
71 CT127
CT243
76
76
71
71
71
76 82
71
71
71 100
100
100 CT243
CT127
CT127
77
74
74
71
76
71
77
76
86 82 100
100 CT127
CT127
CT243
71
76
8686 82
82 71 100 CT243
CT380
74
76
77
77
74 86 82
82 71
71
71 CT380
CT243
CT243
71
76
76
7771 71 100
100 CT243
CT243
CT380
77
71
77
74 82 71 100 CT380
CT59
74
77
77
82
82
82
82 71 CT59
CT380
CT380
74
74
77
76
77
76 71
71 CT380
CT380
CT59
74
74
77
82 CT59
76
77
76
74
82
82
82 CT59
CT59
CT59
74
74
74
74 CT59
76
77
76
77
74
76
76
74
77
76
7674
77
74
77
76
76
76
77
76
76
77
77
77
77
76
7676
76
77
77
77
77
Figura 4.10. Dendrograma elaborado a partir de los perfiles electroforéticos obtenidos tras la amplificación con ERIC-
77
77
7777
77
PCR de las cepas PGPR Gram negativas aisladas de las muestras de suelo de olivar ecológico de acuerdo a la aplicación
del coeficiente de correlación de Dice, el algoritmo UPGMA y CCC.
La barra superior muestra el porcentaje de similitud entre los perfiles de bandas. Los números de los nodos de las ramas representan el CCC. El
color de la rama indica la zona de donde fue aislada: ectorizosférica (verde) o rizoplánica (rojo). El color del cuadro indica la zona de la que fue
aislada. Leyenda: SL, Fracción ectorizosférica de la parcela de laboreo; RL, fracción rizoplánica de la parcela de laboreo; SOLIVL, suelo libre de la
parcela de laboreo; SCD, Fracción ectorizosférica de la parcela con cubierta dirigida; RCD, fracción rizoplánica de la parcela con cubierta dirigida;
SOLIVD, suelo libre de la parcela con cubierta dirigida; SCE, Fracción ectorizosférica de la parcela con cubierta espontánea; RCE, fracción
rizoplánica de la parcela con cubierta espontánea; SOLIVE, suelo libre de la parcela con cubierta espontánea.
Resultados
107
Resultados
1.1.2.2. DGGE
Para determinar las diferencias poblacionales entre las parcelas de muestreo

sometidas a manejos de cubierta distintos se aplicó una técnica molecular basada en el
análisis del ADNr 16S, denominada electroforesis en gel con gradiente de
desnaturalización (DGGE).
En las bacterias, los genes que codifican los ARNr están organizados en
operones. Cada operón ribosómico incluye genes para los ARNr 23S, 16S y 5S,
regiones codificadoras muy conservadas separadas por regiones intergénicas muy
variables que pueden ser utilizadas para caracterizar grupos taxonómicos a nivel
intraespecífico (Barry et al., 1991). El gen ADNr 16S es la macromolécula más
ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas (Ahmad et al.,
2008). Este gen es un polirribonucleótido de aproximadamente 1500 pb que se
encuentra en todas las bacterias descritas hasta la fecha, altamente conservado y que
presenta regiones comunes que se emplean para el estudio de las relaciones entre
taxones distantes. Asimismo, en el gen 16S se encuentran variaciones que se concentran
en zonas específicas (Woo et al., 2008), empleadas en la diferenciación de géneros y
especies (Valverde, 2003; Rodicio y Mendoza, 2004). La estructura de este gen, por
tanto, permite el diseño de cebadores universales para la aplicación de estrategias de
PCR (Weisburg et al., 1991), posibilitando un mayor conocimiento de la diversidad de
las comunidades microbianas en los ecosistemas naturales (Muyzer y Smalla, 1998).
La DGGE es una técnica que se fundamenta en la disminución de la velocidad
electroforética que sufren las moléculas de ADN de doble cadena cuando migran en la
matriz de un gel que contiene un gradiente lineal de agentes desnaturalizantes de ADN
(Sánchez-Peinado, 2007). Este procedimiento, por tanto, permite la separación de
fragmentos de igual tamaño pero distinta secuencia, ya que estos se detienen en su
migración electroforética en distintas posiciones en el gel (Muyzer y Smalla, 1998;
Muyzer, 1999). Igualmente, posibilita la obtención de perfiles de la composición
bacteriana poblacional en la muestra de partida (biodiversidad) así como, la evaluación
de los cambios en la estructura de la comunidad microbiana a lo largo del tiempo, del
espacio o tras la introducción de un agente externo, y la identificación de los miembros
dominantes en la comunidad (Torsvik et al., 1998; Valverde, 2003; Sánchez-Peinado,
2007).

Resultados
Para ejecutar esta técnica se utilizó la biomasa bacteriana crecida en las

diluciones de los distintos manejos agrícolas. Ésta se recogió mediante asa, se
homogeneizó y se extrajo el ADN genómico que se amplificó específicamente.
Finalmente, los amplicones obtenidos de la segunda PCR se corrieron en un gel de
acrilamida con agentes desnaturalizantes.
Los perfiles resultantes (Figura 4.11.) se examinaron visualmente, apreciándose
que la composición de la comunidad procariota en las distintas muestras presentaba un
elevado número de bandas. Éstas se hallaron, principalmente, distribuidas en las zonas
media y baja del gel, revelando así una dominancia de microorganismos con un
contenido medio y alto de G+C en sus secuencias de ADNr 16S. Asimismo, la
horizontalidad de los pocillos, facultó el análisis del bandeo, encontrando un alto
número de bandas comunes entre las tres zonas muestreadas. Estas similitudes se
estrecharon entre las muestras procedentes del suelo de laboreo y las obtenidas de la
cubierta espontánea, encontrando bandas comunes adicionales entre ellas.
Figura 4.11. Análisis de la biodiversidad

microbiana presente en la colección mediante la
técnica DGGE.
Las flechas señalan las bandas comunes entre: los tres
manejos agrícolas (rojas), SL y CE (verdes), SL y CD
(azules) y CE y CD (amarillas). SL: Suelo rizosférico de la
parcela de laboreo. CE: suelo rizosférico de la parcela con
cubierta espontánea. CD: suelo rizosférico de la parcela con
cubierta dirigida.

Resultados
1.2. Aislamiento y caracterización de cepas procedentes de

agua de riego de vivero comercial de plantones de olivo
Como se expuso en el epígrafe dedicado a los objetivos, el eje central de esta

tesis fue la búsqueda de una alternativa ecológica al uso de hormonas en el estaquillado
bajo nebulización del olivo, basada en la utilización de PGPR. Para cumplir con este
propósito se desarrollaron ensayos de enraizamiento de estaquillas de olivo en viveros
comerciales, bajo las condiciones habituales del mismo. Al realizar el primer ensayo de
enraizamiento, como se comentará más adelante, se encontró que el porcentaje
enraizamiento producido en el control negativo (agua de riego) era similar al obtenido
en el positivo (hormona sintética). Esto llevó a considerar la existencia de algún
organismo en el agua de riego que produjera el enraizamiento.
El agua de riego del vivero comercial Reypra, S.L. procedía de una balsa de
recogida de aguas pluviales localizada al aire libre en los terrenos adyacentes al vivero.
Esta agua era canalizada hacia un depósito a través de filtros para partículas superiores a
0,55 mm, utilizándose, a continuación, para el riego por nebulización.
Con la intención de aprovechar este casual potencial de enraizamiento
presentado en el agua de riego, se realizó un estudio microbiológico. Para ello, se
tomaron muestras del agua filtrada procedentes del canal de salida del depósito, se
efectuaron diluciones seriadas, y tras el crecimiento en placa, se procedió a realizar un
aislamiento bacteriano. Los recuentos de viables desvelaron una población bacteriana de
102 UFC/ml de la que se aislaron 14 cepas que fueron caracterizadas tanto morfológica,
como bioquímicamente. Para eliminar las cepas redundantes, se realizó una
amplificación con ERIC-PCR de 9 aislamientos que fueron morfológicamente similares,
obteniéndose que únicamente dos de las cepas (AG10 y AG11) presentaban el mismo
bandeo (Figura 4.12.)
La evaluación de las capacidades PGP de las 13 cepas bacterianas aisladas
determinó que, dos de ellas, AG9 y AG13, poseían alguna de las habilidades estudiadas.
Las características PGP de estas cepas, se encuentran recogidas en el Apéndice I
de este trabajo y serán comentadas en el siguiente apartado. Ambas cepas se conservan
en el Departamento de Recursos Naturales y Producción Ecológica del Centro IFAPA
Las Torres-Tomejil.

Resultados
Cepa bacteriana
AG1 AG2 AG3 AG5 AG6 AG7 AG8 AG10 AG11
Figura 4.12. Gel de electroforesis de la amplificación con ERIC-PCR llevada a

cabo para diferenciar los distintos tipos bacterianos morfológicamente similares
obtenidos del agua de riego.
2. Selección e identificación de cepas PGPR

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la caracterización bioquímica
como PGPR en el aislamiento llevado cabo en las muestras de suelo de olivar ecológico
y el realizado en el agua de riego, se seleccionaron aquellas cepas que destacaban por
poseer las tres características PGP estudiadas in vitro, ya que se ha descrito
ampliamente una sinergia de estas propiedades en la promoción del crecimiento vegetal
(Gupta et al., 1998; Ahmad et al., 2008). No obstante, se ha probado que la producción
de AIA es el mecanismo más común para explicar los efectos de las PGPR sobre las
plantas, jugando de este modo el papel más importante en el desarrollo vegetal (Okon y
Vanderleyden, 1997; Khalid et al., 2004). En base a esto, se seleccionaron algunas
cepas que, sin tener todas las características, presentaron una producción de auxinas
llamativamente superior al resto.
Bajo estos criterios, se eligieron 11 estirpes de la colección procedente de la
rizosfera del olivar ecológico y las dos únicas cepas con características PGP aisladas del
agua de riego. Asimismo, se escogió la cepa M16 aislada de la micosfera de Lactarius
deliciosus en Pinus pinaster y caracterizada como PGPR por Barriuso et al. (2005).

Resultados
Además, se seleccionaron dos cepas de referencia, A. brasilense sp7 (Tarrand et

al., 1978) y A. brasilense Cd (ATCC 29729), previamente descritas como inductoras del
enraizamiento (Jain y Patriquin, 1984; Charyulu et al., 1985; Glick, 1995; Dobbelaere et
al., 2001; El Zemrany et al., 2006) debido, principalmente, a la síntesis de diversos
reguladores de crecimiento de la planta, entre ellos el AIA (Spaepen et al., 2007).
Las características más relevantes en cuanto a bioquímica y procedencia de las
bacterias seleccionadas se muestran en la tabla IV.1. En ésta se observó que las cepas
seleccionadas de la rizosfera de olivar ecológico procedían en su mayoría de las
muestras del suelo sometido a laboreo y que, casi todas, poseían una producción de AIA
superior a 50 ppm.
2.1. Actividad ACC desaminasa
Para complementar la caracterización bioquímica de las cepas PGPR elegidas se

estudió la presencia de la enzima ACC desaminasa. Esta enzima está ampliamente
distribuida en los microorganismos y juega un papel clave en la degradación del ACC,
el inmediato precursor del etileno (Li et al., 2005; Glick et al., 2007). Se ha demostrado
que a altas concentraciones de etileno el crecimiento vegetal se inhibe (Shaharoona et
al., 2008) y se producen efectos deletéreos (Cheng et al., 2007). De modo que una
disminución en los niveles de etileno de la planta, producida por la acción de esta
enzima, puede conllevar una protección frente a estreses como el encharcamiento, la
sequía o la presencia de metales pesados (Glick, 2010). Igualmente, puede producir una
elongación del sistema radical durante mayor tiempo (Ahmad et al., 2008), a través de
la actuación sinérgica de esta enzima con la síntesis de AIA (Shaharoona et al., 2008).
La expresión de esta enzima se encontró en dos de los aislados (AG9 y CT33) y
en la cepa M16, dónde ya había sido descrita (Barriuso et al., 2005).

Resultados
Tabla IV.1. Principales características PGP y procedencia de las cepas bacterianas

seleccionadas.
Acc desaminasa
Cepa Origen AIA (ppm) Fosfatos Sideróforos (nmol -cetobutirato/mg
de proteína/h)
AG9 AR 21,6 ± 15,2 No + 320,0 ± 174,4
AG13 AR 7,4 ± 2,3 No No 0,0
CT33 SL 72,8 ± 11,7 ++ ++++ 1325,2 ± 176,8
CT42 SL 55,1 ± 10,4 + + 0,0
CT194 SL 50,3 ± 5,1 ++++ + 0,0
CT276 RL 58,1 ± 8,3 No No 0,0
CT285 RL 72,6 ± 20,1 No No 0,0
CT348 SCD 13,6 ± 5,0 No ++ 0,0
CT357 RL 25,4 ± 10,8 + ++ 0,0
CT363 RL 12,1 ± 3,4 ++ +++ 0,0
CT364 RL 45,2 ± 13,1 + +++ 0,0
CT387 SL 20,5 ± 1,5 ++ +++ 0,0
CT402 SCD 83,7 ± 21,2 No No 0,0
M16 Mi 75,2 ± 14,5 + + 1270,1 ± 14,1
Cd Ref. 20,0 ± 7,6 No No 0,0
Sp7 Ref. 15,1 ± 5,2 No No 0,0
AR: agua de riego. SL: Fracción ectorizosférica de la parcela de laboreo. RL: fracción rizoplánica
de la parcela de laboreo. SCD: Fracción ectrizosférica de la parcela con cubierta dirigida. Mi:
micosfera de P. pinaster. Ref. : cepa de referencia. Los valores de AIA y ACC son media de 3
repeticiones ± la desviación típica. Diámetro del halo de hidrólisis: + (1-3cm), ++ (4-6 cm), +++
(7-9 cm), ++++ (> 9cm). No: negativo.

Resultados
2.2. Caracterización taxonómica y análisis filogenético
Para la identificación de los microorganismos seleccionados a nivel de especie

se emplearon técnicas de secuenciación del gen ADNr 16S (Rodríguez-Martínez, 2008).
Para la secuenciación del gen, el ADN genómico extraído de cada cepa, se amplificó
mediante PCR con cebadores diseñados en base a las secuencias conservadas que se
encuentran próximas a sus extremos 5ý 3´ (Rodicio y Mendoza, 2004), con el objetivo
de que dicha amplificación fuera completa.
De esta manera, se obtuvieron secuencias apropiadas (1500 pb), que fueron
alineadas con las secuencias de referencia extraídas de la base de datos de cepas tipo
EzTaxon server 2.1. (Chun et al., 2007). Posteriormente, para determinar la relación
evolutiva de las cepas comparadas, se realizó un análisis filogenético usando el
programa MEGA 5.03. (Figuras 4.13., 4.14., 4.15. y 4.16.).
Como se observa en la tabla IV.2., los aislados se encuadraron en los filos
bacterianos Proteobacteria, Bacteroidetes y Actinobacteria, aunque principalmente se
distribuyeron dentro del primero, mostrando identidades con las cepas tipo presentes en
la base de datos que oscilaron entre el 97 y el 99,9 %. Dentro de este filo abundaron las
cepas pertenecientes a clase Gammaproteobacteria, concretamente a las familias
Pseudomonadaceae y Enterobacteriaceae.
El análisis filogenético de las cepas Gram positivas (Figura 4.13.) CT285 y
CT402, desveló en ambos casos una alta homología con la especie Arthrobacter
globiformis con la que alcanzaron valores de identidad del 99,46 y 99,73 %,
respectivamente. La secuencia obtenida para la cepa CT276 se alineó con Arthrobacter
polychromogenes con una identidad del 99,74%.
Las cepas AG13 y CT348 (Figura 4.14.) se incluyeron en la familia
Flavobacteriaceae, concretamente en el género Chryseobacterium. La cepa AG13
resultó ser próxima a la especie C. defluvii, presentando una semejanza del 97,09 % con
la misma. La estirpe CT348 alcanzó la más alta homología con C. vrystaatense, aunque
igualmente exhibió una baja similitud con ella (97,80 %).
La familia de la Enterobacteriaceae agrupó 4 de las cepas secuenciadas (Figura
4.15.). Las cepas CT194 y AG9 resultaron estar íntimamente relacionadas y alcanzaron
la más alta identidad con la especie Erwinia eucrina, 99,92 y 99,85 %, respectivamente.
Por otro lado, la especie Enterobacter asburidae integró las otras dos cepas, CT33

Resultados
(98,87 %) y M16 (99,43 %), aunque los valores de similitud alcanzados no pudieron
asegurar esta identidad.
Por último, en la familia Pseudomonadaceae se localizaron 5 de las estirpes
seleccionadas (Figura 4.16.). Analizándolas filogenéticamente, se observó que las cepas
CT357 y CT364 se relacionaban estrechamente con Pseudomonas koreensis, si bien los
valores de identidad con la cepa tipo fueron del 98,41 y del 99,31 %, respectivamente.
Asimismo, la estirpe CT42 se identificó con una similitud de 99,18 % con la especie
Pseudomonas reinekei. La especie P. brassicacearum subsp. neoaurantiaca resultó ser
la más próxima a la cepa CT387, con un valor de identidad de 99,11 %. Finalmente, la
cepa CT363 encontró la mayor homología con la especie Flavimonas oryzihabitans, con
un porcentaje de similitud de 99,19 %.
Tabla IV.2. Clasificación taxonómica y número de acceso en GenBank de las

cepas secuenciadas
Cepa Número de Similitud Especie Filo

acceso
AG9 EU336938 99,85 % Pantoea eucrina Proteobacteria
AG13 EU336941 97,09 % Chryseobacterium defluvii Bacteroidetes
CT33 HQ455823 98,87 % Enterobacter asburidae Proteobacteria
CT42 GU124698 99,18 % Pseudomonas reinekei Proteobacteria
CT194 HQ455824 99,92 % Pantoea eucrina Proteobacteria
CT276 HQ455829 99,74 % Arthrobacter polychromogenes Actinobacteria
CT285 HQ455821 99,46 % Arthrobacter globiformis Actinobacteria
CT348 EU336939 97,80 % Chryseobacterium vrystaatense Bacteroidetes
CT357 HQ455825 98,41 % Pseudomonas koreensis Proteobacteria
CT363 GU124699 99,19 % Flavimonas oryzihabitans Proteobacteria
CT364 EU336940 99,31 % Pseudomonas koreensis Proteobacteria
CT387 HQ455826 99,11 % Pseudomonas brassicacearum

Proteobacteria
subsp. Neoaurantiaca
CT402 HQ455822 99,73 % Arthrobacter globiformis Actinobacteria
M16 HQ455820 99,43 % Enterobacter asburidae Proteobacteria

Resultados
Figura 4.13. Árbol filogenético construido mediante el método de ML (modelo de

Tamura-Nei, +G: 0,10; Tamura y Nei, 1993) para el análisis del ADNr 16S de los
aislados CT285 y CT402 y las especies más próximas.
La fiabilidad de las ramas se estimó utilizando un valor de Bootstraps de 1000 réplicas. Los valores
de Bootstrap ≥ 50% se muestran en los nodos. Agrococcus terreus DNG5T se empleó como
outgroup. La escala representa el número de sustituciones por sitio. El número de acceso de las cepas
tipo usadas se indica entre paréntesis. La relación filogenética de la cepa CT276 no se incluye debido
al tamaño de secuencia obtenido.

Resultados
Figura 4.14. Árbol filogenético construido mediante el método de ML (modelo

Kimura 2 parámetros, +G: 0,4493; +I: 75,3610 %; Kimura, 1980) para el análisis
del ADNr 16S de los aislados CT33, CT194, AG9 y M16 y las especies más
próximas.
de Bootstrap ≥ 50% se muestran en los nodos. Pectobacterium cacticidum LMG 17936T se empleó
como outgroup. La escala representa el número de sustituciones por sitio. El número de acceso de
las cepas tipo usadas se indica entre paréntesis.

Resultados

del ADNr 16S de los aislados CT348 y AG13 y las especies más próximas.
de Bootstrap ≥ 50% se muestran en los nodos. Epilithonimonas tenax Ep105T se empleó como
outgroup. La escala representa el número de sustituciones por sitio. El número de acceso de las cepas
tipo usadas se indica entre paréntesis.

Resultados

del ADNr 16S de los aislados CT42, CT363, CT364, CT357 y CT387 y las especies
más próximas.
de Bootstrap ≥ 50% se muestran en los nodos. Azomonas insignis NCIB 9963T se empleó como
outgroup. La escala representa el número de sustituciones por sitio. El número de acceso de las
cepas tipo usadas se indica entre paréntesis.

Resultados
3. Interacción planta-microorganismo
Una evaluación adecuada de las cepas con potencial PGP implica un estudio en
varias etapas, ya que las actividades in vitro e in vivo no siempre se relacionan (Glick,
1995; Khalid et al., 2004; Fuentes-Ramírez y Caballero-Mellado, 2005; Barriuso et al.,
2008 a). En primer lugar, se debe valorar el efecto de sus mecanismos de acción frente a
la planta en condiciones axénicas y después, las bacterias deben demostrar sus
capacidades en experiencias de campo, en competencia con otros microorganismos. En
esta última etapa, será determinante la colonización con éxito de la rizosfera y el
mantenimiento de un equilibro estable de la bacteria en la superficie radical (Lugtenber
y Dekkers, 1999), debido a que la planta ejercerá un control, a través de los exudados,
seleccionando aquellas cepas bacterianas que le proporcionen más ventajas (Barriuso et
al., 2005).
3.1. Marcaje de las cepas bacterianas con GFP
Con el propósito de realizar el seguimiento de la colonización radical de las

bacterias se llevó a cabo un marcaje con la proteína GFP a través de una conjugación
bacteriana triparental en las cepas AG9, CT42, CT363, CT364 y M16.
Las proteínas verdes de fluorescencia se han encontrado en numerosos
organismos, utilizándose en la mayoría de los estudios la GFP procedente de la medusa
Aequorea victoria (Prasher et al., 1992). La aplicación de la GFP como biomarcador se
ha empleado en multitud de organismos, tanto eucariotas como procariotas, llegando a
ser una herramienta comúnmente usada en microbiología y biología molecular
(Zimmer, 2002; Wang et al., 2007). La principal ventaja de la GFP como sistema
marcador, es que no necesita ningún cofactor o sustrato adicional, ostentando una
elevada estabilidad que permite el análisis del comportamiento de las células portadoras
del gen gfp a un nivel individual y de forma no lesiva.
La utilización de bacterias marcadas en los estudios de colonización radical hizo
necesario el empleo de técnicas de visualización adecuadas. La microscopía de
epifluorescencia se basa en la capacidad de las moléculas fluorescentes de absorber luz
a una determinada longitud de onda y de emitirla en otra más larga, permitiendo
visualizar las muestras a través de un filtro que sólo permite pasar la luz de longitud de
onda igual a la de la luz emitida por la muestra, apareciendo ésta brillando sobre un

Resultados
fondo oscuro. Esta técnica resulta muy útil en la observación de cultivos bacterianos
puros, pero plantea dificultades en los análisis tisulares. La utilización del microscopio
de escaneo láser confocal (CLSM) soluciona estos problemas empleando un juego de
diafragmas que eliminan la luz proveniente de los planos superiores e inferiores al plano
focal así como, unas fuentes de iluminación de gran intensidad y sincrónicas y un
sistema de captación de imagen electrónico. Estas características permiten la obtención
de imágenes de secciones ópticas finas con una gran resolución que, captadas a
diferentes profundidades en una misma muestra de tejido y tratadas mediante una
aplicación informática, posibilitan la reconstrucción de imágenes tridimensionales. El
uso de esta técnica implica la adición de un aditivo de montaje que evita la pérdida de
fluorescencia (fluorescence fading) que se produce cuando se irradia luz de gran
intensidad durante largos periodos de tiempo.
Antes de llevar a cabo el marcaje de las cepas, se procedió a comprobar que
éstas no presentaban autofluorescencia a la longitud de onda de excitación de la proteína
fluorescente empleada mediante microscopía de epifluorescencia.
La estabilidad e intensidad de la fluorescencia de cada conjugado se comprobó,
después de varias siembras continuas en placa sin la presión del antibiótico, mediante
microscopía de epifluorescencia. Puesto que se ha descrito que la introducción de ADN
foráneo conlleva, en muchas ocasiones, modificaciones que afectan al comportamiento
bacteriano en cuanto a patogeneidad, expresión de genes o competitividad (Glick,
1995), tras esta verificación, en cada conjugado se analizaron las capacidades PGP in
vitro por las que fueron seleccionadas sus correspondientes cepas silvestres. En ningún
caso se produjeron cambios en los niveles de actividad mostrados en las cepas marcadas
para las distintas habilidades PGP con respecto a sus homólogas silvestres.
3.2. Ensayos bajos condiciones gnotobióticas
Como se ha mencionado anteriormente, el uso a escala industrial de

rizobacterias en la promoción del crecimiento vegetal exige un profundo estudio del
comportamiento de los inóculos en condiciones controladas. Para ello, se realizaron, en
primer lugar, en condiciones axénicas, una serie de ensayos de interacción planta-
microorganismo con plantas modelo sensibles a variaciones hormonales, V. radiata, V.
unguiculata y B. napus, usando las cepas seleccionadas in vitro: AG9, AG13, CT42,
CT276, CT348, CT363, CT364 y M16.

Resultados
Paralelamente, en los ensayos con V. radiata y B. napus se llevó a cabo el

seguimiento de la colonización radical de las cepas AG9, CT42, CT363, CT364 y M16,
previamente marcadas con fluorescencia. Para verificar que el comportamiento
bacteriano de la cepa marcada con respecto de la cepa silvestre no se alteraba en cuanto
a promoción del crecimiento se refiere, en estos estudios se dispusieron conjuntamente
tratamientos bacterianos silvestres y marcados.
3.2.1. Enraizamiento y colonización bacteriana en estaquillas de V.

radiata
La capacidad de enraizamiento de las cepas PGPR se determinó, en primer

lugar, en estaquillas de V. radiata. Éstas se introdujeron en tubos de vidrio que
contenían una suspensión bacteriana y tras 10 días en cámara de crecimiento se
determinó el número de raíces adventicias emergidas y la longitud total de las mismas
en cada tratamiento bacteriano, calculando posteriormente la tasa de longitud radical
media.
Los resultados obtenidos en las cepas silvestres se compararon con los
alcanzados en sus respectivos tratamientos marcados con fluorescencia (Tabla IV.3.),
observando que ningún tratamiento marcado fue significativamente distinto con
respecto a su homólogo silvestre en los parámetros analizados.
El análisis de los tratamientos bacterianos con respecto al control negativo
(Tabla IV.4.) reveló que, en su totalidad, estimulaban significativamente tanto el
número de raíces como la longitud radical media. Las estirpes AG13 y CT363
proporcionaron buenos resultados, tanto en la variable número de raíces como en la
longitud radical total. Del mismo modo, destacaron los resultados obtenidos por los
tratamientos bacterianos AG9, CT42 y CT364 en elongación radical. Considerando
ambas variables, los valores más altos los presentó el tratamiento inoculado con la cepa
M16. No obstante, el estudio de la tasa de longitud radical media arrojó que los mejores
valores los alcanzaban las estaquillas del tratamiento inoculado con la estirpe CT42,
seguida del tratamiento AG9.

Resultados
Tabla IV.3. Efecto sobre el enraizamiento de estaquillas de V. radiata producido

entre las cepas silvestres y sus homólogas marcadas con fluorescencia para los
parámetros número y longitud total de raíces.
Tratamiento Número de raíces/Estaquilla Sig. (bilateral)
AG9 23,3 ± 2,36

0,290
AG9-gfp 28,0 ± 3,56
CT42 21,0 ± 1,46

0,069
CT42-gfp 26,0 ± 2,16
CT363 32,2 ± 2,88

0,111
CT363-gfp 38,2 ± 2,25
CT364 26,8 ± 1,88

0,074
CT364-gfp 32,9 ± 3,27
M16 39,0 ± 2,50

0,763
M16-gfp 40,2 ± 3,02
Tratamiento Longitud total de raíces (cm)/Estaquilla Sig. (bilateral)
AG9 20,6 ± 3,1

0,299
AG9-gfp 16,7 ± 2,36
CT42 17,0 ± 1,40

0,572
CT42-gfp 18,5 ± 2,26
CT363 16,9 ± 1,91

0,077
CT363-gfp 21,5 ± 1,40
CT364 16,5 ± 1,72

0,087
CT364-gfp 22,5 ± 3,42
M16 23,0 ± 1,13

0,072
M16-gfp 26,6 ± 1,70
Los datos son media de 3 ensayos independientes de 10 estaquillas cada uno ± el

error típico de la media. Los tratamientos con valores de significación (Sig.)
bilateral > 0,05 no difieren significativamente entre ellos, usando la prueba t de
Student y suponiendo varianzas iguales (test de Levene).

Resultados
Tabla IV.4. Efecto sobre el enraizamiento de estaquillas de V. radiata de las cepas

PGPR.
Longitud total de
Número de raíces/ Longitud
Tratamiento raíces(cm)/
Estaquilla radical media
Estaquilla
Negativo 6,6 f 3,3 d 0,50 bc
AG9 26,5 cd 18,5 b 0,69 ab
AG13 33,9 b 14,2 bc 0,41 c
CT42 22,4 de 17,4 b 0,77 a
CT276 26,8 cd 12,9 c 0,48 bc
CT348 19,6 e 9,9 c 0,50 bc
CT363 34,9 ab 18,9 b 0,54 bc
CT364 28,4 c 18,4 b 0, 64 abc
M16 39,6 a 24,6 a 0,62 abc
Los datos son media de 3 ensayos independientes de 10 estaquillas cada uno. Los tratamientos
que poseen un homólogo marcado incluyen los datos obtenidos con ambas cepas. Las cifras
seguidas por la misma letra, no difieren significativamente al nivel del 5%, usando el test de
rango múltiple de Duncan. Longitud radical media = longitud total de raíces/ número de raíces.
La colonización radical de las cepas inoculadas se determinó al finalizar los

ensayos, mediante recuento de bacterias fluorescentes viables y confirmación bajo
microscopía de epifluorescencia (Tabla IV.5.). En todos los tratamientos bacterianos se
detectó una colonización radical cercana a la población inoculada, mostrando la cepa
AG9 valores ligeramente superiores al resto.

Resultados
Tabla IV.5. Cuantificación de las bacterias adheridas a las raíces adventicias

emergidas en las estaquillas de V. radiata a la finalización del ensayo.
Recuento de bacterias viables (UFC/g de raíz)
AG9 3,08 ± 2,42 x 108
CT42 3,53 ± 7,07 x 107
CT363 1,73 ± 1,93 x 108
CT364 1,21 ± 1,39 x 108
M16 1,37 ± 1,23 x 108
Los datos son media de 2 repeticiones en 3 ensayos

independientes ± la desviación típica. UFC: Unidades
Formadoras de Colonias.
Para el análisis in situ de la colonización radical de las cepas marcadas, se

prepararon muestras radicales de, aproximadamente, 1 cm de longitud y 20 µm de
grosor tomadas a lo largo de la raíz. Asimismo, se realizaron cortes radicales
longitudinales para comprobar la existencia de una colonización endófita.
En general, tal y como se muestra en las figuras 4.17. y 4.18., se encontró una
buena colonización de la superficie radical en todas las cepas marcadas, en
concordancia con los resultados obtenidos en los recuentos de viables. Sin embargo, la
cepa que presentó visualmente la mejor colonización fue CT42.
Esta colonización se produjo preferentemente en las depresiones de la superficie
radical, donde se formaron microcolonias en disposición de cordón (Figura 4.17.).
Asimismo, en algunas muestras se encontraron numerosas células bacterianas
individuales colonizando la superficie radical (Figura 4.18.a).
En todos los tratamientos se observó el mismo patrón de colonización a lo largo
de la raíz. En las zonas del meristemo apical la colonización fue escasa (Figura 4.18.b),
incrementándose en las zonas de diferenciación hasta llegar a su máximo en los puntos
de unión con el tallo. Cabe resaltar que, comparando la colonización de diversas raíces
de un mismo tratamiento y planta, se encontraron importantes desigualdades, ya que
algunas de las raíces permanecieron sin colonizar mientras que otras estaban
completamente cubiertas por células bacterianas.

Resultados
Mediante la observación de los cortes radicales longitudinales se detectaron

indicios de colonización endófita en los espacios intercelulares del córtex radical en los
tratamientos inoculados con las cepas M16 y CT364 (Figura 4.18. c). Asimismo, tal y
como muestra la figura 4.18.d., la cepa M16 penetró en algún caso en el interior celular
del parénquima cortical.
Figura 4.17. Observación in situ de la colonización radical en Vigna radiata de la

cepa CT42 mediante CLSM a distintas profundidades ópticas.
Las imágenes se crearon en modo de escaneo XYZ y superposición de canales.

Resultados
Figura 4.18. Observación in situ de la colonización de las cepas marcadas con

fluorescencia en soja verde mediante CLSM.
a. Bacterias individuales de la cepa AG9 colonizando la superficie radical.
b. Colonización de la cepa CT363 en las zonas de división de la raíz.
c. Colonización de los espacios intercelulares por la cepa CT364 (corte
longitudinal).
d. Colonización bacteriana de M16 en el interior celular.
Las flechas indican la localización de las bacterias. Las imágenes ortogonales (b,c y d) se crearon en
modo de escaneo XYZ y superposición de canales, haciendo cortes ópticos de 1 µm de grosor.

Resultados
3.2.2. Enraizamiento de estaquillas de V. unguiculata
Para comprobar si existían diferencias entre la rizogénesis producida por la

inoculación mediante suspensiones bacterianas y la llevada a cabo por la introducción
de las estaquillas en las auxinas generadas por las bacterias durante el crecimiento se
realizaron ensayos de enraizamiento en la especie V. unguiculata. Esta especie se
diferencia de la empleada anteriormente en su menor sensibilidad a los cambios
hormonales y en su resistencia a altas concentraciones de AIA.
En estos ensayos, las estaquillas recién cortadas se manipularon de dos formas:
unas se introdujeron en una suspensión bacteriana (109 UFC/ml), tal y como se indicó
para V. radiata, y otras en el sobrenadante obtenido del primer lavado del cultivo
bacteriano, donde se encuentran las auxinas. Las estaquillas se mantuvieron en el
sobrenadante una hora, pasándolas, a continuación, a tubos que contenían agua destilada
estéril, dónde permanecieron hasta la finalización del ensayo. En estos últimos ensayos,
además de un control negativo, se dispuso un control positivo de estaquillas sumergidas
durante una hora en una solución de AIA (50 ppm).
El análisis del número y de la longitud total de raíces por estaquilla, así como la
tasa de longitud radical media calculada en ambos métodos de aplicación, se presentan
en la tabla IV.6.
La aplicación del sobrenadante para inducir el enraizamiento produjo diferencias
significativas entre la mayoría de los tratamientos bacterianos y el control negativo,
mostrando varios de ellos valores significativamente superiores al control positivo, para
las dos variables estudiadas. A nivel individual, sin valorar la tasa de longitud radical
media, el tratamiento CT276 fue el que alcanzó los mejores resultados, tanto en número
como en longitud total de raíces por estaquillas. Sin embargo, teniendo en cuenta esta
tasa, los mejores resultados los obtuvo la cepa CT364.
La mayor parte de los tratamientos inoculados mediante suspensión bacteriana
difirieron significativamente del control negativo en ambos parámetros (Figura 4.19.),
hallándose los mejores valores en los tratamientos de las cepas CT276 y M16.
Considerando la tasa de longitud radical media, los mejores resultados los lograron las
cepas CT364 y M16.

Resultados
Control negativo
CT348 sobrenadante CT348 suspensión celular
Figura 4.19. Efecto sobre el enraizamiento de estaquillas de V. unguiculata de la

cepa CT348 con respecto al control negativo.
Para evaluar e interpretar correctamente el efecto producido por la forma de

aplicación de los distintos tratamientos bacterianos sobre el número y la longitud total
de raíces por estaquilla, se aplicó un modelo factorial de análisis de la varianza (Tabla
IV.6.) y se representaron los gráficos de perfil (Figuras 4.20, 4.21 y 4.22.)
correspondientes al efecto de la interacción entre ambas variables, para los tres
parámetros analizados.

Tabla IV.6. Efecto sobre el enraizamiento de estaquillas de V. unguiculata de las cepas PGPR seleccionadas usando dos métodos de
aplicación (sobrenadante y suspensión celular) y comparación de los efectos forma de aplicación y tratamiento bacteriano sobre las
variables número y longitud total de raíces y tasa de longitud radical media.
Métodos de aplicación
Sobrenadante Suspensión celular

Tratamientos
Nº de raíces/ Longitud total de raíces Longitud radical Nº de raíces/ Longitud total de raíces Longitud radical
Estaquilla (cm)/Estaquilla media Estaquilla (cm)/Estaquilla media
Negativo 7,62 e A 7,86 f A 1,03 bc A 7,62 d A 7,86 f A 1,03 e A
Positivo (IBA) 11,40 cd 12,74 cd 1,11 ab
AG9 9,90 de A 10,37 def A 1,04 bc B 9,83 bc A 12,70 de A 1,29 de A
AG13 8,16 e A 9,16 ef A 1,12 ab A 10,43 bc A 12,30 e A 1,17 e A
CT42 13,84 bc A 10,12 def B 0,73 bc B 9,11 cd B 16,03 cd A 1,75 bcd A
CT276 53,90 a A 29,87 a A 0,55 c A 29,27 a B 21,74 ab B 0,74 e A
CT348 13,46 bc A 14,21 c A 1,05 b B 10,50 bc B 15,85 cd A 1,50 cd A
CT363 13,00 bcd A 12,38 cde B 0,95 bc B 10,89 bc A 19,02 bc A 1,74 abc A
Resultados
CT364 12,67 bcd A 20,55 b A 1,62 a B 9,67 bcd B 21,18 ab A 2,19 a A
M16 15,60 b A 12,77 cd B 0,82 bc B 11,56 b B 24,77 a A 2,14 ab A

131131
Los datos son media de 3 ensayos independientes de 10 estaquillas. Las cifras seguidas por la misma letra en minúscula y dentro de cada columna, no difieren
significativamente al nivel del 5%, usando el test de rango múltiple de Duncan. Las cifras seguidas por la misma letra en mayúscula dentro de cada fila y comparando
las columnas del mismo parámetro indican que la diferencia de las medias es no significativa (Sig.) al nivel del 5 %, usando un modelo factorial de análisis de la
varianza y el ajuste para comparaciones múltiples de Bonferroni. Longitud radical = longitud total de raíces/ número de raíces. Nº: número.
Resultados
El análisis de los gráficos de perfil, junto con los resultados obtenidos en la

comparación de los efectos de las variables forma de aplicación y tratamiento
bacteriano, puso de manifiesto que el empleo del sobrenadante superaba, en casi todos
los tratamientos, al de la suspensión celular en número de raíces emergidas, siendo
diferencialmente significativo para las cepas CT42, CT276, CT348, CT364 y M16. En
cambio, en los resultados obtenidos en elongación radical ocurrió generalmente lo
contrario, hallándose una mayor elongación en los tratamientos de suspensión
bacteriana. Esta tendencia generalizada llegó a ser significativa en los tratamientos
inoculados con las estirpes CT42, CT363 y M16. Los valores mostrados por la cepa
CT276 fueron también significativamente distintos pero opuestos al resto. El estudio de
la tasa de longitud radical media confirmó que, efectivamente, la inoculación mediante
suspensión bacteriana producía un menor número de raíces pero ésta eran más largas,
difiriendo significativamente la aplicación de ambos métodos en todos los tratamientos,
salvo en los inoculados con las cepas AG13 y CT276 (Tabla IV.6).
Medias marginales estimadas del número
60
50
de raíces por estaquilla
40
Suspensión
bacteriana
30
Sobrenadante
20
10
0
AG9 AG13 CT42 CT276 CT348 CT363 CT364 M16
Tratamientos
Figura 4.20. Forma de aplicación frente a tratamiento bacteriano para el número de

raíces por estaquilla de V. unguiculata.
Los valores representan las medias marginales estimadas de la variable número de raíces por
estaquilla.

Resultados
Medias marginales estimadas de la 35

longitud total de raíces (cm)
30
25
Suspensión
20 bacteriana
15
Sobrenadante
10
0
Tratamientos
Figura 4.21. Forma de aplicación frente a tratamiento bacteriano para la longitud

total de raíces por estaquilla de V. unguiculata.
Los valores representan las medias marginales estimadas de la variable longitud total de raíces.
Medias marginales estimadas de la
2,5
longitud radical media
2
Suspensión
1,5 bacteriana
1 Sobrenadante
0,5
0
Tratamientos
Figura 4.22. Forma de aplicación frente a tratamiento bacteriano para la tasa de

longitud radical media por estaquilla de V. unguiculata.
Los valores representan las medias marginales estimadas de la variable longitud radical media.

Resultados
3.2.3. Elongación radical y colonización bacteriana en B. napus
Para estudiar la capacidad que las cepas seleccionadas tienen de promover la

elongación radical, se realizaron ensayos utilizando plantas de colza. En ellos, las
semillas se mantuvieron durante una hora embebidas en las suspensiones celulares
correspondientes a los distintos tratamientos bacterianos, se dejaron secar, se colocaron
en bolsas de crecimiento y se mantuvieron durante 1 semana en cámara de cultivo.
La comparación de los resultados obtenidos entre las cepas silvestres y sus
homólogas marcadas con fluorescencia (Tabla IV.7.) corroboraron la inexistencia de
cambios de comportamiento, en cuanto a promoción de la elongación radical en colza,
tras la introducción del plásmido.
Tabla IV.7. Comparación del efecto producido sobre la elongación radical en B.

napus entre las cepas silvestres y sus homólogas marcadas con fluorescencia.
Tratamiento Longitud de raíz (mm) Sig. (bilateral)
AG9 79,5 ± 1,30

0,260
AG9-gfp 81,5 ± 1,22
CT42 63,6 ± 0,90

0,905
CT42-gfp 63,8 ± 1,36
CT363 65,5 ± 1,62

0,196
CT363-gfp 63,0 ± 0,96
CT364 77,9 ± 1,44

0,108
CT364-gfp 81,6 ± 1,81
M16 67,2 ± 1,12

0,333
M16-gfp 68,7 ± 1,09
Los datos son media de 3 ensayos independientes de 72 semillas cada uno ± el

error típico de la media. Los valores de significación (Sig.) bilateral > 0,05 no
difieren significativamente, usando la prueba t de Student para dos muestras
independientes y suponiendo varianzas iguales (test de Levene).

Resultados
El análisis de los resultados de elongación radical alcanzados al comparar cada

tratamiento bacteriano con su respectivo control negativo (Tabla IV.8.), reveló un
incremento significativo en este parámetro en todos los tratamientos inoculados.
Tabla IV.8. Evaluación de la capacidad de elongación radical en B. napus de las

cepas PGPR seleccionadas.
Longitud de raíces (mm)/

Tratamiento Sig. (bilateral)
Estaquilla
AG9 80,7 ± 0,90

0,000
Negativo 66,8 ± 1,15
AG13 62,4 ± 1,08

0,000
CT42 63,7 ± 0,76

0,015
CT276 57,4 ± 0,71

0,001
CT348 60,3 ± 0,77

0,000
CT363 65,4 ± 1,62

0,006
CT364 79,6 ± 1,16

0,000
M16 67,8 ± 0,79

0,000
Los datos son media de 3 ensayos independientes de 72 semillas cada uno ± el

error típico de la media. Los tratamientos que poseen un homólogo marcado
incluyen los datos obtenidos en ambos tratamientos. Los valores de significación
(Sig.) bilateral > 0,05 no difieren significativamente, usando la prueba t de
Student para dos muestras independientes y suponiendo varianzas iguales (test de
Levene). Para cada tratamiento bacteriano se dispuso un control negativo
diferente debido a las dimensiones de la cámara de crecimiento.

Resultados
Las poblaciones bacterianas adheridas a las semillas al inicio del ensayo, así
como las que permanecieron adheridas a la raíz al final del mismo, se determinaron
mediante recuento de bacterias fluorescentes viables, confirmando éstas bajo
microscopía de epifluorescencia. Los resultados obtenidos (Tabla IV.9.) mostraron una
población bacteriana adherida a la raíz superior a la encontrada en las semillas, en los
tratamientos inoculados con las estirpes M16 y, fundamentalmente, AG9, donde se
incrementó en casi 4 órdenes. En el resto de los tratamientos, la colonización radical
determinada fue igual (cepa CT363) o inferior (cepas CT42 y CT364) a la encontrada
inicialmente en las semillas.
Tabla IV.9. Cuantificación de las bacterias adheridas a las semillas y a las raíces en
los ensayos de elongación radical en B. napus.
Recuento de bacterias viables adheridas

Cepa
Semillas (UFC/semilla) Raíz (UFC/ g de raíz)
AG9 6,78 ± 3,30 x 104 1,16 ± 0,54 x 108
CT42 1,65 ± 0,87 x 106 2,50 ± 0,50 x 104
CT363 3,03 ± 3,14 x 106 5,85 ± 0,21 x 106
CT364 1,23 ± 0,06 x 106 9,60 ± 2,69 x 104
M16 2,65 ± 1,05 x 105 6,26 ± 0,90 x 106
Los datos son media de 2 repeticiones formadas por 10 semillas o 100 mg de raíz en 3 ensayos
independientes ± la desviación típica. UFC: Unidades Formadoras de Colonias.
El estudio in situ de la colonización bacteriana mediante CLSM se efectuó en

muestras radicales de aproximadamente 1 cm de longitud, tomadas a lo largo de la raíz.
De forma adicional, algunas de estas muestras se seccionaron longitudinalmente para el
estudio de una posible colonización endófita.
Todos los tratamientos bacterianos mostraron un incremento de la colonización
desde las zonas de división, donde era escasa, a las áreas de diferenciación celular. En
estas últimas, la colonización quedó principalmente restringida a los puntos de unión de
los pelos radicales con la raíz primaria (Figura 4.23.a. y 4.23.b.) y a las escasas
depresiones que la epidermis radical de la colza posee en esta zona (Figura 4.24.). En
estos lugares se constituyeron fundamentalmente microcolonias (Figura 4.23.c. y

Resultados
4.23.d.), aunque se observó una alta población bacteriana debido a una colonización por
células individuales de las zonas cercanas a los pelos radicales (Figura 4.23.a.). En
ningún caso se encontraron indicios de colonización endófita.

fluorescencia en colza mediante CLSM.
a y b. Formación de microcolonias en los puntos de unión de los pelos
radicales con la raíz primaria llevada a cabo por la cepa M16, así como
abundante colonización de bacterias individuales (Imagen a) de la cepa
AG9.
c (6,24X) y d (2,75X). Microcolonias formadas por las cepas CT42 y CT364,
respectivamente, en las depresiones de la superficie radical.
Las flechas indican la localización de las bacterias. Las imágenes ortogonales (a, b y d) se crearon en
modo de escaneo XYZ y superposición de canales, haciendo cortes ópticos de 1 µm de grosor.

Resultados
Figura 4.24. Observación in situ de la colonización radical en colza de la cepa AG9

mediante CLSM a distintas profundidades ópticas.
Las imágenes se crearon en modo de escaneo XYZ y superposición de canales. Las flechas indican
la localización de las bacterias.

Resultados
3.3. Ensayos en condiciones no axénicas
Tras comprobar la efectividad de las PGPR seleccionadas en las plantas modelo

en condiciones axénicas, se procedió a la realización de ensayos de enraizamiento en
viveros comerciales, empleando la planta objeto de esta tesis, el olivo. Asimismo, estos
ensayos se complementaron con estudios en invernadero y vivero que evaluaron el
comportamiento e impacto del inóculo, así como su posterior evolución en el tiempo.
En estos ensayos se emplearon aquellos cultivares más demandados en la
actualidad en la industria viverística, ya sea por su aptitud al enraizamiento, por su
precoz entrada en producción o por permitir la plantación en seto (Àrbequina´, `Picual´,
`Hojiblanca´ y `Koroneiki´).
3.3.1. Antibiograma
Para optimizar el estudio de las cepas bacterianas en este tipo de ensayos no

axénicos, además del marcaje logrado con fluorescencia, fue necesario conocer aquellos
antibióticos más comunes a los que dichas cepas presentaban una resistencia natural.
Con este objetivo, se realizó un antibiograma con los antibióticos: Ap, Gm, Cm, Rif y
Tc. Para ello, se depositaron gotas procedentes de cultivos bacterianos frescos sobre 3
placas de medio TSA, estando dos de ellas suplementadas con el antibiótico
correspondiente. Tras 48 h de incubación, se llevó a cabo la evaluación del crecimiento
en presencia del antibiótico (Tabla IV.10.).
El análisis del antibiograma desveló que todas las cepas marcadas con
fluorescencia presentaban una resistencia natural a la Ap. Además, 4 de ellas (CT42,
CT364, AG9 y M16) exhibieron un crecimiento adecuado en las placas
complementadas con Tc, mostrando las cepas CT42 y CT364, además, resistencia al
Cm. Los antibióticos Gm y Rif inhibieron el crecimiento de la totalidad de las cepas
estudiadas.
De este modo, en los sucesivos ensayos de interacción planta-microorganismo,
los recuentos de viables se realizaron, en todos los casos, complementando las placas
con Ap.

Resultados
Tabla IV.10. Antibiograma de las cepas marcadas con el gen de fluorescencia.
Cepa bacteriana
Antibiótico
CT42 CT363 CT364 AG9 M16
Ap (50 µg/ml) R R R R R
Gm (25 µg/ml) - - - - -
Cm (30 µg/ml) R - R - -
Rif (50 µg/ml) - - - - -
Tc (12,5 µg/ml) R - R R R
Los signos indican resistencia (R) o sensibilidad (-) al antibiótico.
3.3.2. Enraizamiento de estaquillas de olivo
Para determinar las cepas bacterianas más aptas en el enraizamiento del olivo y
la forma de inoculación más adecuada, se realizaron 11 ensayos de enraizamiento de
estaquillas de olivo en viveros comerciales entre noviembre de 2005 y septiembre de
2009.
En estos estudios se utilizaron estaquillas comerciales provenientes de 4
variedades de olivo (Àrbequina´, `Hojiblanca´, `Picual ý `Koroneiki´) y se probaron
tres métodos de inoculación:
Método 1: mezcla del sustrato con el caldo de cultivo de la bacteria 24 h
antes del estaquillado.
Método 2: inmersión del extremo de la estaquilla en un cultivo
bacteriano durante 24 h, 2 h o 1 h.
Método 3: introducción del extremo de la estaquilla en una mezcla de
inoculante sólido (turba) y agua destilada estéril durante unos segundos.
Todas las cepas bacterianas testadas se multiplicaron en el medio apropiado en
presencia de Try hasta alcanzar concentraciones de 109 UFC/ml y fueron utilizadas, si
las concentraciones de auxinas producidas eran óptimas.
En todos los ensayos se dispuso un control positivo formado por estaquillas que
previamente se sumergieron en una solución de AIB. Asimismo, se usaron controles

Resultados
negativos donde las estaquillas fueron clavadas en sustratos humedecidos con agua de
riego y en su caso, con medio de cultivo (Ensayos 1 a 3).
Las estaquillas se mantuvieron durante un periodo de dos meses en el túnel de
nebulización, a excepción de los ensayos realizados en los meses de verano, en los que
el enraizamiento se produjo en seis semanas.
3.3.2.1. Ensayo 1
En noviembre de 2005 se realizó un ensayo preliminar, utilizando las cepas

bacterianas de referencia M16 y A. brasilense Cd y Sp7, descritas en la bibliografía
como productoras de auxinas. Para la inoculación se mezcló el sustrato con el caldo de
cultivo de la bacteria 24 h antes del estaquillado (Método 1), efectuando a continuación
el mismo en las variedades arbequina y picual.
Como controles negativos se estaquillaron bandejas con sustratos previamente
humedecidos con agua de riego y con los medios de cultivo NFb y CN.
Transcurridos dos meses, se observó que la variedad arbequina enraizó, mejor
que la variedad picual (Tabla IV.11.), alcanzando los mayores porcentajes en las
bandejas humedecidas con el medio de cultivo CN (72,4 %), con el agua de riego (77,2
%) y en la inoculada con la bacteria Cd (78,1 %) (Figuras 4.25. y 4.26.). La variedad
Picual mostró, en todos los tratamientos porcentajes de enraizamiento inferiores al 21,1
%, a excepción del agua de riego (42,5 %).
Tabla IV.11. Efecto de los tratamientos aplicados sobre el porcentaje de estaquillas

enraizadas de las variedades arbequina y picual en el Ensayo 1.
Tratamiento
Variedad de olivo
AR NFb CN Cd Sp7 M16
Arbequina (%) 77,2 45,1 72,4 78,1 41,2 19,1
Picual (%) 42,5 6,3 12,6 13,6 21,1 1,3
Datos correspondientes a una repetición de 273 estaquillas. AR: Agua de riego.

Resultados
Figura 4.25. Enraizamiento Figura 4.26. Enraizamiento obtenido

producido en el control negativo en la bandeja inoculada con la cepa
(agua de riego) en la variedad A. brasilense Cd en la variedad
arbequina. arbequina.
3.3.2.2. Ensayo 2
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el control negativo de agua de

riego en el Ensayo 1, se procedió al análisis microbiológico de dicha agua. Como se
mencionó anteriormente, este estudio dio lugar al aislamiento de 13 cepas bacterianas
mostrando dos de ellas, AG9 y AG13, alguna de las características PGP estudiadas. Se
realizó un segundo ensayo de vivero con las 13 estirpes aisladas y las cepas Cd, Sp7 y
M16 en marzo de 2006.
En base a los resultados mostrados por la variedad picual en el anterior ensayo,
en éste se optó por la utilización de las variedades arbequina y hojiblanca, que fueron
inoculadas a través del Método 1.
Los resultados (Tabla IV.12.) revelaron que, en la variedad arbequina, los
tratamientos inoculados con las cepas AG9 y AG13 alcanzaron unos porcentajes de
enraizamiento de 81,3 y 70,1 %, respectivamente, ambos valores por encima de los
encontrados en los controles negativos de los medios de cultivo y próximos al control
positivo. En la variedad Hojiblanca, el tratamiento bacteriano con el que se obtuvieron
los mejores resultados fue el que empleó la cepa M16, con un 24,1 % de enraizamiento.
Sin embargo, en esta variedad de olivo se observó que, en algunos tratamientos, los
porcentajes de callos fueron muy altos (Sp7, agua de riego y el medio de cultivo NFb)
(Figura 4.27.).

Resultados
Figura 4.27. Callo producido

en las estaquillas de la
variedad hojiblanca en
algunos de los tratamientos.

enraizadas de las variedades arbequina y hojiblanca en el Ensayo 2.
Variedad Tratamiento
de olivo
AG1 AG2 AG3 AG4 AG5 AG6 AG7 AG8 AG9 AG10
Arbequina 14,1 6,0 57,6 54,3 18,1 16,8 39,1 35,0 81,3 41,2
(%) (10,1) (1,1) (14,4) (14,7) (7,3) (15,8) (4,3) (45,2) (6,5) (1,1)
Hojiblanca 1,5 2,3 1,5 3,0 2,2 3,6 1,7 1,3 5,5 6,1
(%) (6,1) (19,6) (22,2) (26,4) (21,0) (20,7) (10,4) (18,1) (21,3) (25,6)
Variedad Tratamiento
de olivo
AG11 AG12 AG13 Cd Sp7 M16 CN NFb AR AIB
Arbequina 22,3 62,0 70,1 21,5 20,0,0 43,3 62,1,0 54,4 29,7 90,2
(%) (24,1) (10,4) (15,1) (30,4) (25,4) (21,3) (13) (29,3) (61,1)
Hojiblanca 1,4 2,7 2,4 5,2 0,0 24,1 3,9 11,5 11,7 80,0
(%) (15,5) (1,1) (24,3) (38,6) (54,4) (23,1) (9,5) (57,4) (57,3)
Datos correspondientes a una repetición de 273 estaquillas. Entre paréntesis se muestra el

porcentaje de estaquillas que, aunque no enraizaron, formaron callo. AR: Agua de riego.

Resultados
3.3.2.3. Ensayo 3
A finales de junio de 2006, se dispuso un ensayo con las variedades arbequina y

hojiblanca en el que se inocularon las cepas Cd, Sp7, M16 y AG9, por ser éstas las que
produjeron los mayores porcentajes de enraizamiento en los dos ensayos anteriores.
Con el propósito de encontrar un método de inoculación más eficiente y eficaz,
se ensayó, junto con la forma de inoculación ya utilizada, el Método 2, consistente en
sumergir el extremo de las estaquillas en el caldo de cultivo durante 24 horas.
El análisis de los resultados (Tabla IV.13.) mostró que la inoculación a través del
nuevo método de aplicación era más efectiva, proporcionando valores de enraizamiento
similares o superiores al control con AIB en los 4 tratamientos bacterianos inoculados
(Figura 4.28.) y raíces visualmente más largas en los tratamientos de las bacterias M16
y Sp7 (Figura 4.29.) con la variedad arbequina. No obstante, a través del Método 1 las
cepas M16 y AG9 obtuvieron rendimientos del 87,7 y del 66,5 %, respectivamente. En
la variedad hojiblanca, los tratamientos bacterianos no lograron altos porcentajes de
enraizamiento, salvo en el inoculado con la cepa AG9 (50,3 %) a través del Método 2.
Sin embargo, la cepa M16 produjo nuevamente un alto porcentaje de callos (datos no
mostrados).
Figura 4.28. Enraizamiento producido en la bandeja inoculada con la cepa Cd en la

variedad arbequina.

Resultados
Método 1 Método2 Método 2 Método1
Figura 4.29. Enraizamiento de las bandejas inoculadas con las cepas M16 y Sp7 en
la variedad arbequina.

enraizadas de las variedades arbequina y hojiblanca en el Ensayo 3.
Variedad de olivo
Arbequina (%) Hojiblanca (%)

Tratamiento
Método 1 Método 2 Método 1 Método 2
Cd 12,3 80,6 36,1 n.e.
Sp7 61,1 91,3 1,9 21,2
M16 87,7 92,4 29,7 24,4
AG9 66,5 60,3 35,2 50,3
NFb 55,4 5,5
CN 82,1 26,1
AR 44,0 5,5
AIB 60,0 70,5
Datos correspondientes a una repetición de 126 estaquillas. Método 1: mezcla del sustrato con el
caldo de cultivo de la bacteria 24 h antes del estaquillado. Método 2: inmersión del extremo de la
estaquilla en un cultivo bacteriano durante 24 h. La inoculación de la cepa Cd mediante el Método 2
en la variedad hojiblanca no pudo evaluarse por causas ajenas al ensayo. AR: Agua de riego. n.e.: no
evaluado.

Resultados
3.3.2.4. Ensayo 4
De acuerdo a los resultados obtenidos hasta el momento, en el ensayo realizado

en septiembre de 2006 se inocularon las cepas Cd, AG9, Sp7, M16 y AG13, en las
variedades arbequina, hojiblanca y picual. Asimismo, dada la formación de callos
producidos en las estaquillas de la variedad hojiblanca en los ensayos precedentes, en
éste y en los posteriores, esta variedad se mantuvo en el interior del túnel de
nebulización 2 semanas más con respecto al resto de variedades.
La inoculación se llevó a cabo aplicando el citado Método 2 y un tercero basado
en la introducción de las estaquillas en una mezcla de inoculante en polvo y agua. La
aplicación de estos métodos eliminó la necesidad de disponer de controles con los
medios de cultivo.
Para la inoculación a través del Método 3 se utilizaron, inoculantes sólidos de
cada bacteria elaborados con turba como soporte.
El análisis de los resultados reveló que la mayoría de los tratamientos
bacterianos produjeron porcentajes de enraizamiento significativamente superiores al
control con AIB, en las tres variedades estudiadas (Tabla IV.14.).
En Àrbequina´ los mejores resultados se alcanzaron con los tratamientos Cd,
AG9 y M16 (~70 %) aplicados mediante inmersión de las estaquillas en los
correspondientes cultivos bacterianos. Además, las cepas Sp7 y AG9 proporcionaron
resultados similares al AIB cuando fueron aplicadas mediante el Método 3. Los valores
encontrados en la variedad picual corroboraron la eficacia de la estirpe AG9, que logró
valores superiores al 85 % mediante la aplicación de ambos métodos. Asimismo, se
hallaron valores del 80,1 % en las bandejas inoculadas con la cepa AG13 mediante el
Método 3 y porcentajes cercanos a éste en los tratamientos inoculados por inmersión
con la bacteria M16. La inoculación de las cepas Cd y M16 a través de ambos métodos
obtuvo más de un 82 % de enraizamiento en `Hojiblanca´, encontrándose valores
comparables al obtenido en el control positivo en la mayor parte de los tratamientos
bacterianos.

Resultados
Tabla IV.14. Efecto de los tratamientos bacterianos sobre el porcentaje de estaquillas

enraizadas de las variedades arbequina, picual y hojiblanca en el Ensayo 4.
Variedad de olivo
Tratamiento Arbequina (%) Picual (%) Hojiblanca (%)
Método 2 Método 3 Método 2 Método 3 Método 2 Método 3
Cd 70,1 ab 49,4 d 35,0 f 22,1 g 88,5 a 83,3 a
Sp7 61,1 c 64,1 bc 3,5 h 8,6 h 62,1 c 64,5 bc
AG9 70,4 ab 60,4 c 87,0 a 85,5 ab 68,4 bc 70,8 b
AG13 58,0 c 45,7 de 54,3 ed 80,1 bc 70,1 b 64,5 bc
M16 71,3 a 39,4 e 76,0 c 48,3 e 84,6 a 82,4 a
AR 17,1 f 50,1 e 37,5 d
AIB 60,2 c 60,5 d 70,1 b
Los datos son media de 2 repeticiones de 126 estaquillas. Las cifras seguidas por la misma letra, no
difieren significativamente al nivel del 5%, usando el test de rango múltiple de Duncan. AR: Agua
de riego.
3.3.2.5. Ensayo 5
Durante los meses de enero a marzo del 2007 se efectuó un ensayo en el que se
testaron además de las cepas inoculadas en el ensayo anterior, las bacterias CT348,
CT363, CT364 y CT387, seleccionadas por sus características PGP de la rizosfera de un
olivar ecológico.
Con la idea de obtener, tras el enraizamiento de las estaquillas, cepellones más
compactos que facilitaran el trasplante y mejoraran la supervivencia de la planta, las
estaquillas de olivo de las variedades arbequina, picual y hojiblanca se introdujeron en
un sustrato formado únicamente por fibra de coco.
El estudio de los porcentajes de enraizamiento (Tabla IV.15.) alcanzados en la
variedad arbequina reveló unos valores similares o superiores a los encontrados en el
control con AIB en la mayoría de los tratamientos bacterianos inoculados por inmersión
y en algunos de los llevados a cabo mediante introducción de la estaquilla en el
inoculante sólido. Los mejores resultados los obtuvieron las bacterias CT348 (en ambos

Resultados
métodos) y CT363 y M16 con la aplicación del Método 2, que lograron un 70 % de

enraizamiento. Asimismo, las estirpes AG9, en ambos métodos, y las cepas Cd, AG13 y
CT364, mediante el Método 2, mostraron valores del ~60 % de enraizamiento.
En la variedad picual, las estirpes AG9 (Método 2 y 3), CT348 (Método 2) y
CT363 (Método 2) lograron una promoción del enraizamiento similar al producido en el
control positivo.
El análisis de los porcentajes de enraizamiento en `Hojiblanca´ mostró unos
valores significativamente superiores al control con AIB en los tratamientos inoculados
con las estirpes Cd y CT364, en ambos métodos. Del mismo modo, se encontraron
valores similares a los alcanzados en el tratamiento AIB en las cepas AG9, para ambos
métodos, y CT348, para el método de inoculación con turba.
El cambio en la composición del sustrato, a pesar de formar efectivamente
cepellones más compactos, produjo el encharcamiento de los alveolos, conllevando un
efecto negativo en cuanto al enraizamiento de las estaquillas (Figura 4.30.),
especialmente visible en los tratamientos inoculados con las cepas Cd, AG13 y CT364,
en la variedad picual, y M16, en las variedades picual y hojiblanca.
Figura 4.30. Efectos negativos producidos en el Ensayo 5 por el cambio de sustrato

en las bandejas inoculadas.

Resultados

Variedad de olivo
Tratamiento Arbequina (%) Picual (%) Hojiblanca (%)
Método 2 Método 3 Método 2 Método 3 Método 2 Método 3
Cd 63,1 bc 42,2 ef 20,2 e 10,5 ghi 70,5 a 73,3 a
AG9 63,0 bc 60,1 cd 35,0 bc 38,0 ab 61,2 bc 58,6 cd
AG13 60,0 cd 44,7 ef 6,4 hi 7,2 hi 40,3 g 41,6 fg
CT348 71,3 a 70,5 a 42,9 a 30,0 cd 52,5 de 61,2 bc
CT363 68,4 ab 41,5 efg 34,4 bc 12,0 fgh 33,5 h 31,1 h
CT364 56,1 d 39,0 fg 17,5 ef 16,7 efg 70,0 a 67,0 ab
CT387 38,7 fg 35,5 g 21,1 e 12,3 fgh 47,4 ef 43,0 fg
M16 68,9 ab 47,7 e 27,6 d 20,0 e 27,3 h 28,5 h
AR 28,4 h 4,3 hi 19,1 i
AIB 60,3 cd 40,5 ab 57,6 cd
difieren significativamente al nivel del 5%, usando el test de rango múltiple de Duncan. AR: Agua
de riego.
3.3.2.6. Ensayo 6
En el ensayo de julio de 2007 se inocularon las cepas anteriormente testadas

(M16, Cd, AG13, AG9, CT348, CT364 y CT363) salvo CT387, así como otras tres
seleccionadas por sus habilidades PGP (CT42, CT194 y CT276), en la variedad
arbequina. La climatología presentada ese verano imposibilitó la obtención de material
vegetal de las variedades picual y hojiblanca en condiciones óptimas.
Las estaquillas de la variedad arbequina se inocularon mediante la aplicación de
los Métodos 2 y 3.
Tras corroborar en el ensayo anterior la importancia de un sustrato bien aireado
que impidiera el encharcamiento, en éste y en los sucesivos ensayos, se utilizó un
sustrato formado por fibra de coco y perlita.

Resultados
Como se observa en la tabla IV.16., las cepas CT364, AG9, CT276, CT42 y
CT363 mostraron valores de enraizamiento significativamente superiores o iguales al
control con IBA mediante ambas formas de inoculación mientras que, las cepas CT348
y Cd, sólo alcanzaron estos valores al ser inoculadas con el Método 2.
Tabla IV.16. Efecto de los tratamientos bacterianos sobre el porcentaje de

estaquillas enraizadas de la variedad arbequina en el Ensayo 6.
Variedad de olivo
Tratamiento Arbequina (%)
Método 2 Método 3
Cd 58,5 cdef 39,5 ghi
AG9 63,0 bcde 77,5 ab
AG13 42,0 fghi 28,4 ij
CT42 53,5 defg 61,4 bcde
CT194 42,4 fghi 18,6 j
CT276 69,3 abcd 59,0 cdef
CT348 75,1 abc 40,6 ghi
CT363 60,5 bcde 47,5 efgh
CT364 85,7 a 62,8 bcde
M16 42,0 fghi 30,7 hij
AR 31,1 hij
AIB 64,6 bcde
Los datos son media de 4 repeticiones para el Método

2 y de 2 repeticiones para el Método 3. Cada
repetición consta de 273 estaquillas. Las cifras
seguidas por la misma letra, no difieren
significativamente al nivel del 5%, usando el test de
rango múltiple de Duncan. AR: Agua de riego

Resultados
3.3.2.7. Ensayo 7
Este ensayo tuvo lugar durante los meses de septiembre a noviembre de 2007.
En él, la inoculación de las cepas AG9, M16, CT42, CT276, CT348, CT363, CT364 y
Cd en las estaquillas de Àrbequina´, `Picual´ y `Hojiblanca´, se realizó aplicando el
Método 2.
El análisis de los resultados (Tabla IV.17.) mostró a las cepas AG9, CT363 y
M16, como unas bacterias versátiles capaces de producir un enraizamiento similar o
significativamente superior al tratamiento con AIB en las tres variedades de olivo
inoculadas. Asimismo, cabe resaltar los porcentajes logrados con las bacterias CT364
(38,0 %) y CT276 (26,5 %) en Àrbequina´, CT42 (51,8 %), CT348 (48,3 %), M16 (40
%) y CT364 (39 %) en `Picual´ y Cd (40 %) y M16 (40,5 %) en `Hojiblanca.

Tratamiento Variedad de olivo
Arbequina (%) Picual (%) Hojiblanca (%)
Cd 16,7 de 31,3 de 40,0 bcd
AG9 60,5 a 61,5 a 48,5 ab
CT42 22,3 cde 51,8 abc 16,0 ef
CT276 26,5 cd 22,0 e 23,0 def
CT348 19,5 de 48,3 abc 16,5 def
CT363 46,5 ab 54,5 ab 70,5 a
CT364 38,0 bc 39,0 cd 19,5 def
M16 51,7 ab 40,0 bcd 40,5 bcd
AR 6,7 e 7,7 f 10,0 f
AIB 35,7 bc 48,0 abc 42,7 bc
Los datos son media de 3 repeticiones de 78 estaquillas. Las cifras seguidas por la
misma letra, no difieren significativamente al nivel del 5%, usando el test de rango
múltiple de Duncan. AR: Agua de riego.

Resultados
3.3.2.8. Ensayo 8
En el estudio realizado en abril de 2008, se ensayaron los tratamientos

bacterianos previamente testados (AG9, M16, CT42, CT276, CT348, CT363, CT364,
Cd y AG13) y dos nuevos seleccionados por sus características PGP (CT33 y CT285),
en la variedad arbequina.
La inoculación se llevó a cabo mediante inmersión de la estaquilla en caldo de
cultivo (Método 2), reduciendo el periodo de inmersión de 24 a 2 h.
Los porcentajes de estaquillas enraizadas, cuyos valores se muestran en la tabla
IV.18., revelaron que la reducción del tiempo de imbibición no afectó a su
enraizamiento, ya que 10 tratamientos (Cd, AG9, CT33, CT42, CT276, CT285, CT348,
CT363, CT364 y M16), lograron porcentajes superiores o comparables al control con
AIB, algo similar a lo obtenido con un mayor tiempo de imbibición.

Variedad de olivo Variedad de olivo

Tratamiento Tratamiento
Arbequina (%) Arbequina (%)
Cd 34,5 abcd CT285 51,0 a
AG9 48,3 ab CT348 46,5 ab
AG13 27,3 cd CT363 33,5 bcd
CT33 42,5 abc CT364 45,5 ab
CT42 43,5 abc M16 47,0 ab
CT276 45,7 ab
AR 20,5 d AIB 46,0 ab
Los datos son media de 3 repeticiones de 78 estaquillas. Las cifras seguidas por la misma
letra, no difieren significativamente al nivel del 5%, usando el test de rango múltiple de
Duncan. AR: Agua de riego.

Resultados
3.3.2.9. Ensayos 9 y 10
En mayo y septiembre de 2009 se realizaron dos ensayos en el vivero comercial

Plantas Continental, S.L. localizado en Posadas (Córdoba). Para éstos, se eligieron las
cepas bacterianas AG9, CT276, CT348, CT363 y CT364. La inoculación se llevó a cabo
a través del Método 2 con un periodo de inmersión de 2 h y se utilizaron dos variedades
de olivo: arbequina y koroneiki, variedad en la que este vivero muestra un gran interés.
En ambos ensayos y en las dos variedades se observó (Tabla IV.19.) que los
mayores porcentajes de enraizamiento los originó la cepa CT348 con valores superiores
al 70 % y, en algún caso, cercanos al 90 %. Asimismo, se encontró en la variedad
arbequina que todos los tratamientos inoculados mostraron valores comparables al
tratamiento con AIB, a excepción del tratamiento CT363 en el Ensayo 10. En la
variedad koroneiki, todas las cepas, menos la CT276 y CT363 en el Ensayo 9, lograron
porcentajes de enraizamiento similares al control positivo.

enraizadas de las variedades arbequina y koroneiki en los Ensayos 9 y 10.
Variedad de olivo
Tratamiento Arbequina (%) Koroneiki (%)
Ensayo 9 Ensayo 10 Ensayo 9 Ensayo 10
AG9 36,0 b 55,4 bc 38,0 b 56,7 bc
CT276 45,6 b 63,9 ab 9,0 de 42,4 c
CT348 70,7 a 77,7 a 73,5 a 89,1 a
CT363 38,4 b 42,5 d 16,1 d 52,4 bc
CT364 69,0 a 56,3 abc 54,3 ab 70,6 ab
AIB 49,0 ab 72,4 ab 33,0 bc 74,8 ab
difieren significativamente al nivel del 5%, usando el test de rango múltiple de Duncan.

Resultados
3.3.2.10. Ensayo 11
Para analizar la supervivencia de las cepas inoculadas en los ensayos de

enraizamiento de estaquillas de olivo, se dispuso en septiembre de 2009 un ensayo en el
que se inocularon tratamientos bacterianos tanto silvestres como marcados con
fluorescencia de las cepas AG9, CT42, CT363, CT364 y M16. En este ensayo la
inoculación de las estaquillas de la variedad arbequina se realizó a través del Método 2,
disminuyendo el tiempo de imbibición a 1 h.
Los resultados obtenidos en las cepas silvestres se compararon con los de sus
homólogas marcadas (Tabla IV.20.) encontrando que en ningún caso el enraizamiento
inducido por ambas bacterias difería significativamente.
Tabla IV.20. Comparación del efecto producido por los tratamientos bacterianos
silvestres y sus homólogos marcados con fluorescencia sobre el enraizamiento de
estaquillas de olivo de la variedad arbequina en el Ensayo 11.
Porcentaje de
Sig.
Tratamiento enraizamiento
(bilateral)
(%)
AG9 65,4 ± 8,65

0,442
AG9-gfp 74,0 ± 5,90
CT42 55,1 ± 1,67

0,297
CT42-gfp 52,6 ± 1,30
CT363 37,0 ± 6,70

0,387
CT363-gfp 45,2 ± 5,69
CT364 43,8 ± 5,68

0,827
CT364-gfp 41,9 ± 6,07
M16 82,3 ± 4,25

0,287
M16-gfp 75,1 ± 3,96
Los datos son media de 4 repeticiones de 52 estaquillas ± el

error típico de la media. Los valores de significación (Sig.)
bilateral > 0,05 no difieren significativamente, usando la
prueba t de Student para dos muestras independientes y
suponiendo varianzas iguales (test de Levene).

Resultados
El análisis de los porcentajes de enraizamiento, reflejados en la tabla IV.21.,

mostró que la reducción del periodo de imbibición a 1 h no afectó al enraizamiento de
las estaquillas, puesto que los resultados obtenidos fueron similares a los obtenidos en
los ensayos anteriores.

Variedad de olivo
Tratamiento
Arbequina (%)
AG9 69,7 a
CT42 53,8 bc
CT363 41,1 c
CT364 42,8 c
M16 79,2 a
AR 47,1 c
AIB 67,8 ab
Los datos son media de 8 repeticiones (cepa silvestre y

marcada) de 52 estaquilla. Las cifras seguidas por la misma
letra, no difieren significativamente al nivel del 5 %, usando
el test de rango múltiple de Duncan. AR: Agua de riego
Estos porcentajes validaron el ensayo para hacer el seguimiento de la

supervivencia de las bacterias al finalizar el mismo (Tabla IV.22.). Este seguimiento se
realizó mediante recuento de bacterias fluorescentes viables contenidas en el sustrato y
adheridas a las raíces adventicias emergidas, confirmando bajo microscopía de
epifluorescencia. Se encontró que todos los tratamientos bacterianos fueron capaces de
sobrevivir hasta finalizar el ensayo, determinándose las poblaciones más altas en las
raíces de las plantas inoculadas con las cepas CT364, AG9 y M16, dónde se alcanzaron
valores muy próximos o superiores a 104 UFC/g de raíz. Los recuentos realizados sobre
el sustrato adherido mostraron en la mayoría de los casos valores iguales o cercanos a
102 UFC/ g de sustrato.

Resultados
Tabla IV.22. Cuantificación de las bacterias adheridas a las raíces adventicias

emergidas en las estaquillas de olivo de la variedad arbequina.
Recuento de bacterias viables (UFC/g)

Cepa
Raíz Sustrato
AG9 9,30 ± 6,91 x 103 1,30 ± 0,14 x 102
CT42 2,40 ± 0,1 x 102 1,12 ± 1,15 x 101
CT363 8,23 ± 1,2 x 102 8,27 ± 9,09 x 101
CT364 6,33 ± 0,1 x 104 3,82 ± 6,20 x 102
M16 8,80 ± 10,2 x 103 n.d.

Los datos son media de 4 repeticiones ± la desviación típica.
n.d.: no detectable. UFC: Unidades Formadoras de Colonias.
3.3.3. Persistencia y colonización bacteriana en plantas de olivo
Se ha descrito que la persistencia y establecimiento de una bacteria en la raíz o en

la rizosfera de una planta depende de un complejo, continuo y delicado balance entre un
amplio número de variables bióticas (planta, estirpe inoculada, competencia con otros
microorganismos rizosféricos establecidos, etc.) y abióticas (tipo de sustrato, contenido
de agua y minerales, pH, temperatura, composición de los exudados radicales,
nutrientes disponibles, etc.). Así, por lo general, al introducir un microorganismo en la
rizosfera de una planta, la población inoculada tiende a disminuir en mayor o menor
medida a lo largo del tiempo, dependiendo principalmente de lo influenciada que se
encuentre la cepa inoculada con respecto a un determinado factor biótico o abiótico
(Thomashow, 1996; Mercado-Blanco y Bakker, 2007) y de las características de la
misma.
Para establecer la persistencia de las estirpes así como, los procesos de
colonización de las bacterias en las raíces de plantas de olivo, se realizó un estudio,
tanto en condiciones ambientales controladas y sustrato estéril (invernadero), como en
condiciones de campo y suelo (vivero). En estos ensayos se inocularon suspensiones
celulares, a una concentración de 109 UFC/ml, de las 5 cepas marcadas con
fluorescencia, AG9, CT42, CT363, CT364 y M16, en plantas de 1 año de la variedad
hojiblanca. La monitorización se efectuó mediante recuentos sucesivos de las bacterias

Resultados
viables presentes en las raíces del olivo y en la ectorizosfera, verificando estos datos
mediante microscopía de epifluorescencia. Asimismo, la identificación bacteriana se
confirmó a través del análisis de los perfiles electroforéticos obtenidos de la
amplificación con ERIC-PCR. El seguimiento de la colonización bacteriana in situ
mediante microscopía confocal se realizó durante la primera quincena del ensayo de
invernadero.
3.3.3.1. En invernadero
Los datos obtenidos de los recuentos de bacterias adheridas a la raíz o presentes

en el sustrato asociado, se representaron en una gráfica a lo largo del tiempo, obteniendo
así sus curvas de persistencia (Figura 4.31.). Éstas mostraron que todas las cepas
inoculadas fueron capaces de persistir adheridas a las raíces del olivo durante, al menos,
3 meses, observándose, en la mayoría de los tratamientos, que estas poblaciones
bacterianas adheridas eran superiores a las encontradas en el sustrato adyacente
(ectorizosfera).
Analizando los datos de forma individual, se encontró que la cepa CT42 fue
capaz de persistir 5 meses. Durante los 15 primeros días, se observó un descenso brusco
de las concentraciones iniciales hasta valores de 104 y 103 UFC/g, en raíz y
ectorizosfera, respectivamente, donde se mantuvieron hasta el final del ensayo con
ligeras oscilaciones.
Las raíces de las plantas inoculadas con la cepa CT363 mostraron un número de
bacterias adheridas superior a 106 UFC/g durante los primeros 15 días. Posteriormente,
la población disminuyó bruscamente hasta alcanzar en tres meses valores inferiores a
102 UFC/g de raíz. A continuación, las poblaciones siguieron una tendencia negativa
hasta su desaparición. En la ectorizosfera, la población inicial sobrepasó a la obtenida
en las raíces en un orden de magnitud, descendiendo de forma brusca en los siguientes 4
días hasta valores próximos a 104 UFC/g. Esta colonización se mantuvo durante dos
meses, a partir de los cuales las poblaciones se redujeron, situándose en valores
inferiores a 102 UFC/g hasta finalizar el ensayo a los 5 meses.
El tratamiento inoculado con la cepa CT364 manifestó una disminución lineal a
lo largo del ensayo en ambas zonas, pasando de 107 UFC/g en raíces y 106 UFC/g en
ectorizosfera a 104 UFC/g y 103 UFC/g, respectivamente, en tres meses. Posteriormente,

Resultados
se observaron descensos (dos órdenes de magnitud) e incluso la no detección de la cepa

inoculada en la zona de la ectorizosfera al finalizar el ensayo.
La cepa M16 presentó una población, en el primer tiempo de muestreo, próxima
a 108 UFC/g en las raíces y superior a ésta en la ectorizosfera. Las bacterias adheridas a
las raíces se mantuvieron en valores superiores a 106 UFC/g durante el primer mes, tras
el cual se produjo una fuerte caída hasta una concentración de 10 4 UFC/g, que
permaneció hasta finalizar el ensayo. Las densidades bacterianas ectorizosféricas
disminuyeron de forma lineal a lo largo del tiempo de muestreo, hasta el tercer mes
donde fueron indetectables. Al quinto mes se estimó una población microbiana de 104
UFC/g en el sustrato.
En el primer punto de muestreo la población de la cepa AG9 alcanzó niveles
próximos a 109 UFC/g en la ectorizosfera y de 107 UFC/g en la raíz. En los 4 días
posteriores, ambas zonas protagonizaron una brusca caída poblacional hasta alcanzar
valores inferiores de 105 y de 103 UFC/g en ectorizosfera y en raíz, respectivamente. A
mediados del primer mes, se observó una recuperación en la colonización radical de dos
órdenes que se sostuvo brevemente, para caer de forma lineal hasta su indeterminación a
los 4 meses. La población de la ectorizosfera mostró un descenso gradual, con ligeras
oscilaciones, desde la primera semana hasta su desaparición, en el cuarto mes.

Resultados
8 9
7 8
6 7
Log nº bacterias/g
Log nº bacterias/g
5 6
4 5
3 4
2 3
1 2
0 1
0
3 7 15 30 60 90 120 150
3 7 15 30 60 90 120 150
Días Días
CT42r CT42s CT363r CT363s
8 9
7 8
Log nº bacterias/g
6 7
Log nº bacterias/g
5 6
4 5
3 4
2 3
1 2
0 1
0
3 7 15 30 60 90 120 150
Días 3 7 15 30 60 90 120 150
Días
CT364r CT364s
M16r M16s
10
9
8
Log nº bacterias/g
7
6
5
4
3
2
1
0
3 7 15 30 60 90 120 150
Días
AG9r AG9s
Figura 4.31. Permanencia de las cepas CT42, CT363, CT364, M16 y AG9
inoculadas en olivos de la variedad hojiblanca en condiciones de invernadero en
ectorizosfera y raíz.
Los valores son media de dos repeticiones independientes. Las letras r (raíz) y s (ectorizosfera)
indican la procedencia de las muestras en los recuentos de viables.

Resultados
Tras la finalización del ensayo, las plantas restantes se mantuvieron en las

mismas condiciones durante 3 meses más. El recuento de viables a los 8 meses mostró
que las cepas CT42 y CT363, aún persistían en la ectorizosfera con unos valores de 1,6
± 1 x 101 UFC/g y 7,1 ± 0,8 x 101 UFC/g, respectivamente. Aunque, el caso más
llamativo fue el observado en la bacteria M16 que tras 8 meses, aún permanecía, tanto
en la raíz como en la ectorizosfera con poblaciones relativamente altas (1,1 ± 2,2 x 104
UFC/g y de 4,6 ± 3,1 x 102 UFC/g, respectivamente). No se encontraron indicios de la
cepa CT364.
El seguimiento in situ de la colonización radical mediante CLSM se realizó a los
3, 7 y 15 días tras la inoculación (Figuras 4.32. y 4.33.).
En general, las cepas estudiadas mostraron una buena colonización de la
superficie radical que fue decreciendo en el tiempo, en concordancia con los resultados
obtenidos en los recuentos de viables. En todos los tratamientos se observó un mismo
patrón de colonización: un asentamiento escaso en las zonas de división celular y uno
masivo en las zonas de diferenciación. Igualmente, se encontraron importantes
desigualdades poblacionales al comparar diferentes raíces de una misma planta.
De forma particular, el estudio de las raíces inoculadas a los 3 días mostró una
colonización superficial formada básicamente por células bacterianas individuales y
algunas microcolonias localizadas en las depresiones radicales (Figura 4.32.a).
Asimismo, en todos los casos se encontró un alto número de bacterias en el interior de
los numerosos pelos radicales que aparecen en las raíces del olivo. Esto fue
especialmente frecuente en las raíces ocupadas por la cepa AG9 (Figura 4.33.) y de
forma muy escasa en las colonizadas por la bacteria M16. Igualmente, se observaron
indicios de una colonización endófita en los espacios intercelulares de las células del
córtex radical en las raíces colonizadas por las cepas AG9, CT364 y M16 (Figura
4.32.b. y 4.32.c.).
Tras una semana, las raíces inoculadas con la estirpe M16 mostraron numerosas
microcolonias en forma de cordón localizadas en las depresiones de la superficie
radical. Asimismo, se volvió a encontrar una colonización endófita de los pelos
radicales y numerosos indicios de ocupación de los espacios intercelulares del córtex
radical. Por otro lado, la cepa AG9 continuó con una colonización de la superficie de la
raíz generalmente dispersa formada por células bacterianas individuales. No obstante, se
advirtieron, en menor medida, microcolonias dispuestas en forma de cordón a lo largo
de las depresiones de la superficie radical y al abrigo de los puntos de unión de los pelos

Resultados
radicales con las raíces. La invasión de los pelos radicales no pareció variar con
respecto al punto de análisis anterior, pero no se observaron indicios de colonización en
los espacios intercelulares de las células del córtex. Los tratamientos inoculados con las
bacterias CT42, CT363 y CT364 mostraron en general una colonización dispersa y
escasa de la superficie radical, localizándose ésta principalmente en depresiones (Figura
4.32.d) e invadiendo numerosos pelos radicales, especialmente la cepa CT364.
En las muestras analizadas 15 días después de la inoculación no se detectó un
descenso visual de la colonización ni cambios en los patrones de comportamiento, con
respecto al anterior punto de muestreo en las cepas AG9, CT42 CT363 y CT364. Sin
embargo, las plantas inoculadas con la bacteria M16 mostraron una escasa colonización
de la superficie radical, aunque se mantuvo visualmente el mismo número de pelos
radicales infectados observados previamente. En ningún caso se encontraron indicios de
colonización bacteriana en los espacios intercelulares del córtex radical.

Resultados

fluorescencia en olivo mediante CLSM.
a. Colonización abundante de la superficie radical llevada a cabo por la cepa
CT364, tres días tras la inoculación.
b y c. Colonización intercelular manifestada por las cepas AG9 y M16,
respectivamente, en el córtex de la raíz.
d. Formación de microcolonias dispuestas en cordón en las depresiones de la
raíz a los 7 días de la inoculación en la cepa CT42 (1,62X).
Las imágenes ortogonales se crearon en modo de escaneo XYZ y superposición de canales, haciendo
cortes ópticos de 1 µm de grosor.

Resultados
Figura 4.33. Observación in situ de la cepa AG9 infectando un pelo radical de olivo
mediante CLSM a distintas profundidades ópticas.
Las imágenes (2,07X) se crearon en modo de escaneo XYZ y superposición de canales.

Resultados
3.3.3.2. En vivero
De forma general, en el ensayo en vivero, los perfiles de supervivencia

determinados a partir de los resultados obtenidos de los recuentos de bacterias viables a
lo largo del ensayo (Figura 4.34.), mostraron una colonización bacteriana en las raíces
superior a la observada en la ectorizosfera, logrando mantener esta adhesión a la raíz, en
la mayor parte de los casos, durante todo el tiempo que duró el ensayo.
Específicamente, las raíces inoculadas con la cepa CT42 mostraron una
colonización inicial que se aproximó a 106 UFC/g, produciéndose a continuación, un
descenso lineal hasta alcanzar, valores cercanos a 103 UFC/g, al finalizar el ensayo. En
la ectorizosfera, las densidades bacterianas fluctuaron entre 10 5 y 104 UFC/g durante los
dos primeros meses para posteriormente, caer abruptamente hasta la no detección al
final del ensayo.
En la primera semana, las poblaciones microbianas de la cepa CT363 rondaron
los valores de 105 y 103 UFC/g, en raíces y ectorizosfera, respectivamente.
Inmediatamente, la colonización radical se elevó en dos órdenes (15 días), descendiendo
de forma lineal hasta alcanzar valores de 101 UFC/g a los tres meses. Durante el
siguiente mes, se observó un incremento lineal que culminó en una población de 10 2
UFC/g en el último punto de muestreo. La ectorizosfera presentó una colonización más
o menos constante a lo largo de los tres primeros meses, precipitándose hasta cero en el
último mes de estudio.
Las plantas colonizadas con la bacteria CT364 obtuvieron valores iniciales de
105 UFC/g en raíz. A partir de ahí, las poblaciones sufrieron una caída lineal hasta
alcanzar 102 UFC/g a los tres meses, recuperando casi dos órdenes de magnitud en los
siguientes 30 días. Las poblaciones ectorizosféricas iniciales disminuyeron bruscamente
de 104 a 102 UFC/g al principio del ensayo para mantenerse constantes hasta el término
del mismo.
La estirpe M16 alcanzó niveles iniciales de 106 UFC/g tanto en las muestras
ectorizosféricas como en las radicales. En ambos casos, se produjo un descenso lineal a
partir de la primera semana, alcanzando a los dos meses poblaciones de 103 y 101
UFC/g en raíz y ectorizosfera, respectivamente. Del segundo al cuarto mes de ensayo,
ambas zonas destacaron por la recuperación de las poblaciones bacterianas en un orden
de magnitud.

Resultados
9
7
Log nº bacterias/g . 8
6
Log nº bacterias/g
7
5 6
4 5
3 4
2 3
2
1
1
0 0
7 15 30 60 90 120 7 15 30 60 90 120
Días Días
CT42r CT42s CT363r CT363s
8
6
Log nº bacterias/g 7
5
Log nº bacterias/g
6
4 5
4
3
3
2 2
1 1
0
0
7 15 30 60 90 120
7 15 30 60 90 120
Días
Días
CT364r CT364s M16r M16s
7
6
Log nº bacterias/g
5
4
3
2
1
0
7 15 30 60 90 120
Días
AG9r AG9s
Figura 4.34. Permanencia de las cepas marcadas con fluorescencia inoculadas en

olivos de la variedad hojiblanca en condiciones de vivero en ectorizosfera y raíz.
Los valores son media de dos repeticiones independientes. Las letras r (raíz) y s (ectorizosfera)
indican la procedencia de las muestras en los recuentos de viables.

Resultados
Por último, la cepa AG9 mostró, tanto en raíz como en ectorizosfera

concentraciones de 105 UFC/g que descendieron bruscamente, haciendo imposible
identificar la cepa bacteriana en el sustrato 15 días después de su inoculación.
Asimismo, los recuentos realizados en las muestras radicales en este tiempo mostraron
concentraciones de 103 UFC/g que se mantuvieron durante el primer mes, para caer
hasta su indeterminación en el segundo.
3.3.4. Efecto de la inoculación bacteriana sobre plantas de olivo a lo

largo del tiempo
La forma habitual de enraizar las estaquillas de olivo es mediante la aplicación

de hormona sintética. Esta hormona es muy lábil, y su método está bien establecido. Sin
embargo, la aplicación de microorganismos, en este caso, PGPR para alcanzar este fin,
no ha sido estudiada hasta el momento, así pues, se desconocen los efectos (positivos o
negativos) que la bacteria puede, a lo largo del tiempo, ejercer sobre la planta.
Para evaluar la evolución de las estaquillas enraizadas mediante PGPR a lo largo
del tiempo, algunas de las plántulas obtenidas de cada tratamiento bacteriano marcado
con fluorescencia del Ensayo 11 (AG9, CT42, CT363, CT364 y M16), junto con sus
respectivos controles positivo y negativo, se trasplantaron a maceta y se mantuvieron
bajo umbráculo durante un año, bajo el manejo del viverista.
La determinación de los parámetros biométricos de las plantas, transcurrido este
tiempo, (Tabla IV.23.) mostró que ningún tratamiento bacteriano utilizado para el
enraizamiento de las estaquillas de olivo ejercía un efecto negativo sobre la planta,
encontrando, en la mayor parte de los casos, resultados similares a los alcanzados por el
control positivo en el mismo periodo de tiempo. Asimismo, no se observaron bacterias
fluorescentes viables ni en el sustrato ni en las raíces de las plantas después de un año.

Resultados
Tabla IV.23. Parámetros biométricos de las estaquillas de olivo de la variedad

arbequina enraizadas en el Ensayo 11 tras un año bajo umbráculo.
Parámetros biométricos
Tratamiento DCuello PSPA (g) LongPA PSR (g) LongR (cm)

(cm) (cm)
AG9 3,7 a 1,6 ab 17,5 ab 0,7 a 28,3 a
CT42 3,3 bc 1,2 bc 13,8 bc 0,6 ab 24,5 a
CT363 3,6 ab 1,5 ab 17,0 ab 0,7 a 24,3 a
CT364 3,5 abc 1,7 a 20,2 a 0,7 a 24,2 a
M16 3,3 abc 1,4 ab 16,6 ab 0,6 ab 27,3 a
AR 3,2 c 0,9 c 12,4 c 0,5 b 22,7 a
AIB 3,6 ab 1,4 ab 16,6 ab 0,7 a 25,4 a
Los datos son media de 25 plantas. Las cifras seguidas por la misma letra, no difieren significativamente
al nivel del 5%, usando el test de rango múltiple de Duncan. Dcuello: Diámetro de cuello. PSPA: peso
seco de la parte aérea. LongPA: longitud de la parte aérea. PSR: peso seco del sistema radical. LongR:
longitud del sistema radical.
Para complementar los resultados obtenidos, se realizaron dos ensayos con

plantas de olivo de un año de las variedades hojiblanca y arbequina enraizadas mediante
el método convencional. Éstas se inocularon con las cepas bacterianas marcadas con
fluorescencia (AG9, CT42, CT363, CT364 y M16) y se mantuvieron durante un año al
aire libre, bajo el manejo habitual del vivero.
El análisis de los datos obtenidos sobre la longitud aérea de las plantas (Tabla
IV. 24.) reveló que ninguna de las cepas inoculadas producía un efecto negativo sobre la
planta, llegándose a encontrar un efecto significativamente positivo sobre la promoción
del crecimiento, inducido por la cepa AG9 en la variedad arbequina. Los recuentos de
viables fluorescentes realizados al finalizar el ensayo mostraron ausencia de las
poblaciones inoculadas tanto en sustrato como en raíces.

Resultados
Tabla IV.24. Crecimiento de las plantas de olivo de las variedades hojiblanca y

arbequina tras un año en vivero.
Longitud aérea (cm)
Tratamiento Variedad
Hojiblanca Arbequina
Negativo 81,3 a 78,1 b
AG9 81,5 a 88,4 a
CT42 82,3 a 86,6 ab
CT363 79,4 a 84,0 ab
CT364 84,3 a 81,9 ab
M16 80,8 a 82,2 ab

Los datos son media de 15 plantas. Las cifras
seguidas por la misma letra, no difieren rango
múltiple de Duncan.

Discusión
Discusión
El olivo es una planta con gran potencial para multiplicarse vegetativamente, de

este modo pueden utilizarse diferentes sistemas de propagación, siendo el más usado de
forma comercial, hoy día, el estaquillado semileñoso bajo nebulización. Esta técnica
aplica sobre estaquillas semileñosas una hormona sintética, AIB, con el objetivo de
favorecer el enraizamiento de éstas, ya que sin esta estimulación, el porcentaje de
estaquillas enraizadas sería mínimo en muchas variedades y no se obtendría material
vegetal de la calidad suficiente para cubrir la demanda del mercado. No obstante, aún
hoy el sector viverista encuentra dificultades para lograr con éxito el enraizamiento de
ciertas variedades de olivar de importancia comercial de una forma eficiente, eficaz y
desde una perspectiva sostenible (Fabbri et al., 2004; İsfendiyaroğlu et al., 2009).
Con el objetivo de solventar los inconvenientes económicos que generan en el
sector viverista las variedades de difícil enraizamiento, autores como García-Férriz et
al. (2003) o Fernández-Aparicio et al. (2001) describieron técnicas alternativas
fuertemente prometedoras basadas en la micropropagación. Sin embargo, éstas
presentan el problema de requerir unas instalaciones específicas y una manipulación
compleja, así como una mayor inversión económica (Fontanazza y Cipriani, 2001), sin
contar que para el cultivo del olivo, aún no se han puesto totalmente a punto desde el
punto de vista comercial.
En la bibliografía se han encontrado numerosos estudios que intentan hallar una
alternativa ecológica al enraizamiento del olivo, basándose en la utilización de
diferentes productos auxínicos comerciales autorizados. Entre ellos, cabe destacar el
trabajo desarrollado por Suárez et al. (2002) que testó, en tres variedades de olivo
(picual, manzanilla y picuda) y en tres ensayos independientes, varios productos
comerciales (compuestos formados por extractos húmicos de turba, extractos de algas,
vitaminas y mio-inositol y formulados sobre la base de polisacáridos y alcoholes
naturales enriquecidos con microelementos). La aplicación de éstos no produjo
incremento significativo alguno sobre el porcentaje de enraizamiento de las estaquillas
con respecto al control negativo. Asimismo, Centeno et al. en el año 2008 utilizaron la
variedad cornicabra para evaluar el enraizamiento llevado a cabo por un extracto de
algas Fucus, la levadura de cerveza, las semillas de girasol y unos productos
comerciales compuestos de hormonas de crecimiento y nutrientes esenciales. Este

Discusión
estudio únicamente demostró, en un primer ensayo, tasas de enraizamiento similares al

control positivo (AIB) en los tratamientos dónde se aplicaron los productos comerciales.
Observándose además, problemas de fitotoxicidad tras un aumento de los periodos de
inmersión en los productos con el objetivo de mejorar los porcentajes de enraizamiento.
Esta Tesis plantea una nueva alternativa al uso de hormonas sintéticas en el
enraizamiento del olivo mediante la utilización de bacterias promotoras del crecimiento
vegetal (PGPR) (Kloepper y Schroth, 1978; Fisher et al., 2007), en base a sus
capacidades para alterar el balance hormonal de la planta y mejorar su nutrición
(Gutiérrez-Mañero et al., 2001).
Planteado el objetivo principal de este trabajo se realizó el aislamiento de cepas
bacterianas procedentes de la rizosfera de un olivar ecológico, sitio adecuado para aislar
este tipo de microorganismos debido a la riqueza de nutrientes (Ahmad et al., 2006), así
como del agua de riego de un vivero comercial. Como criterios determinantes para la
elección del lugar se consideraron la alta presión selectiva que produce en la rizosfera la
planta de estudio a través de sus exudados (Botelho y Mendoça-Hagler, 2006; Príncipe
et al., 2007), cuya composición y cantidad varían dependiendo de la especie y las
condiciones ambientales (Kumar et al., 2007) y el aislamiento de bacterias nativas,
según sus características PGP en el rango de ambientes donde iban a ser usadas (Ross et
al., 2000; Fisher et al., 2007). Sobre la base de estos hechos, se llevó a cabo el
aislamiento de dichas cepas y se plantearon una serie de experimentos orientados a
conocer los mecanismos mediante los cuales, las bacterias interaccionan con las plantas
alterando su fisiología.
El muestreo realizado en un olivar en producción ecológica, que presentaba tres
parcelas diferenciadas por su manejo de cubiertas, mostró que independientemente del
manejo de éstas, las muestras rizosféricas revelaban una diferencia de un orden de
magnitud entre la población bacteriana ectorizosférica (10 6 UFC/ g de suelo) y la
rizoplánica (107 UFC/ g de raíces), reflejando la existencia de un gradiente creciente de
microorganismos desde el suelo no rizosférico hacia la raíz, también observado por
autores como Yeates y Darrah (1991) y García-Galavís (2007). La ausencia de
diferencias significativas entre las poblaciones bacterianas viables encontrada en las
172 Montero-Calasanz, M.C

Discusión
muestras de las parcelas con distintos manejos agrícolas, se ha observado en otros

estudios (Grayston et al., 1998), atribuyendo este fenómeno a la capacidad de
amortiguación que existe en la rizosfera y que es llevada a cabo de forma determinante
por la planta (Barea et al., 1998; García-Galavís, 2007).
En la rizosfera se encontró una mayoría de bacterias Gram negativas. Resultados
similares han sido descritos por diversos autores (Kloepper, 1993; Cattelan et al., 1999;
Donate-Correa et al., 2004; Sanguin et al., 2006) para el aislamiento de proteobacterias,
mientras que otros describen como grupo predominante las bacterias Gram positivas
(Lucas García et al., 2001; Barriuso et al., 2005; García-Galavís, 2007). La aparición de
ambos resultados en la bibliografía plantea que el método empleado para el aislamiento
bacteriano, así como la especie vegetal, el manejo del cultivo (Marschner et al., 2003) o
la época de muestreo, pueden ser críticos, dando lugar a la predominancia de un grupo u
otro (Acero et al., 1994).
La caracterización bioquímica in vitro de las cepas aisladas se centró sobre las

actividades que potencialmente pueden determinar que una cepa se encuadre dentro del
grupo de las PGPR (Cattelan et al., 1999), principalmente las relacionadas con la
fitoestimulación (producción de AIA), y el ciclo de los nutrientes (solubilización de
fosfatos y producción de sideróforos) (Barea et al., 2005; Rodríguez Romero et al.,
2008). Así, se determinó que la mitad de las cepas aisladas eran poseedoras de alguna
característica PGP, observándose fundamentalmente en éstas, habilidades relacionadas
con la nutrición vegetal. Kochian (2000) sugirió que la densidad de bacterias
rizosféricas productoras de sideróforos podría utilizarse como un indicador indirecto de
la eficacia con la que la planta es por sí misma capaz de extraer hierro del sustrato. De
este modo, los resultados obtenidos hacen pensar en un muestreo realizado en un
ambiente limitante de hierro y fósforo que ha promovido a la planta a seleccionar, a
través de sus exudados, a este tipo de microorganismos. El cotejo con los resultados
obtenidos en el análisis de suelo de las tres parcelas, donde se encontraron
concentraciones medias de 4,31 ppm de P y 5,5 ppm de Fe3+ (datos proporcionados por
la Red Andaluza de Experimentación Agraria, RAEA), apoyó esta hipótesis.
La producción de AIA es una característica muy extendida en los
microorganismos rizosféricos (Baca y Elmerich, 2007; Ali, 2009), encontrando estudios
sobre la rizosfera de distintas plantas donde el 80% de los aislados presentaban esta
capacidad (Costacurta y Vanderleyden, 1995). En la colección PGPR aislada del olivo

Discusión
esta característica se observó en los mismos porcentajes descritos anteriormente en los

aislados Gram positivos sin embargo, en el grupo de las bacterias Gram negativas la
manifestación de esta habilidad, se encontró en un porcentaje menor, destacando en este
grupo aquellas que presentaban actividades relacionadas con la nutrición.
Salvaguardando la afirmación expuesta anteriormente sobre la carencia de P y Fe
disponible en el suelo muestreado, cabría lanzar nuevas hipótesis basadas en la aserción
de otros autores. Así, Richardson (2001) propone una promoción del crecimiento
vegetal en dos fases: una primera en la que para la planta joven tiene mayor relevancia
la producción de hormonas (Khalid et al., 2004) y otra en su madurez, en la que
adquiere superior importancia la movilización de fósforo y la producción de sideróforos
por parte de los microorganismos rizosféricos. Asimismo, Woodward y Bartel (2005)
señalan la época primaveral (previa a la floración o durante la misma) como un periodo
en el que la concentración de Try exudado a través de las raíces disminuye,
justificándose así, en este trabajo, la menor proporción de microorganismos productores
de AIA de los que cabría esperar en la rizosfera. Por otro lado, también se ha
demostrado que la inducción in vitro para la producción de AIA en determinadas cepas
no es eficiente, siendo necesario en estos casos estímulos provenientes de la rizosfera
(Donate-Correa et al., 2004). Resultados similares referentes a la variabilidad en la
cantidad de AIA producida, entre cepas de una misma especie o entre cultivos distintos
de una misma cepa, también han sido descritos (Patten y Glick, 1996), atribuyendo esta
heterogeneidad a las condiciones del cultivo, el estadío de crecimiento o la
disponibilidad de sustratos (Tsavkelova et al., 2005).
El porcentaje obtenido de cepas Gram negativas que muestran in vitro tres de las
características estudiadas relacionadas con la promoción del crecimiento vegetal,
postulan la actuación directa, indirecta o sinérgica de estas habilidades (Gupta et al.,
1998; Donate-Correa et al., 2004; Ahmad et al., 2008), siendo probable un incremento
real del porcentaje de éstas in vivo que demostraría lo señalado anteriormente, que las
condiciones naturales de la rizosfera o el estado fenológico de la planta propician la
inducción de genes implicados en la promoción vegetal (Rainey, 1999). Además, esta
afirmación involucraría que, independientemente de las actividades PGP potencialmente
demostradas in vitro, el genoma de cada cepa podría encerrar la información necesaria
para realizar otras actividades. Sin embargo, también se ha descrito que cepas que
muestran in vitro una habilidad, es decir, tienen la información necesaria en su genoma,
puede que en la rizosfera ésta no se muestre de forma constitutiva como aparecía in

Discusión
vitro. En resumen, puede ocurrir que cepas bacterianas que inicialmente no se

caracterizan como buenas PGPR, induzcan una promoción del crecimiento vegetal
superior al que cabría esperar de estirpes seleccionadas por sus características in vitro. A
pesar de esto, la selección in vitro de cepas con características PGP con una aplicación
potencial tanto en condiciones de vivero como de campo, es útil y proporciona, en
general, una buena herramienta que ahorra tiempo y dinero al investigador (Khalid et
al., 2004; Barriuso et al., 2005; Fuentes-Ramírez y Caballero Mellado, 2005).
En cuanto a la distribución de las cepas PGPR, la mayoría fue aislada de las

fracciones rizoplánicas y ectorizosféricas, independientemente del manejo agrícola
aplicado, concordando estos resultados con los obtenidos por otros autores en muestreos
realizados en distintos cultivares (Khalid et al., 2004; Donate-Correa et al., 2004; Ali,
2009).
El análisis de parcelas con diferente manejo de cubiertas reveló una mayor
concentración de estirpes con habilidades PGP in vitro en la parcela sometida a laboreo,
presentando un número superior de cepas con características relacionadas con la
nutrición vegetal, seguidas muy de cerca por las cepas productoras de auxinas, que
pueden justificarse con las hipótesis propuestas previamente por Woodward y Bartel
(2005), Kochian (2000) y Richarson (2001). Esta coincidencia en la localización hace
pensar en el papel de las plantas en la selección de aquellos organismos que le son más
beneficiosos a través de sus exudados radicales (Del Castillo, 2010). El laboreo de la
tierra implica una situación de estrés para la planta, el suelo queda desnudo a expensas
de las condiciones ambientales, sin el aporte de N que propician las leguminosas
crecidas en la cubierta espontánea o dirigida. De este modo, la sequía hace mella en las
capas superficiales del suelo, estimulando una exudación radical (Lynch, 1990) dirigida
a la modificación de las comunidades microbianas del suelo hacia estirpes con mayor
capacidad para aprovechar los nutrientes existentes.
Como se comentó al inicio de este epígrafe, uno de los factores determinantes en

la selección de cepas PGPR aptas para su utilización en el enraizamiento del olivo, fue
el aislamiento de bacterias nativas adaptadas al ambiente donde iban a ser empleadas
(Ross et al., 2000; Fisher et al., 2007). Para ello, se consideró la realización de un
análisis microbiológico del agua de riego en uno de los viveros comerciales usados,
dados los resultados de enraizamiento obtenidos en el control negativo de uno de los
ensayos. Del total de las cepas aisladas, dos mostraron habilidades PGP aún sin estar

Discusión
aisladas de la rizosfera de ninguna planta, verificando la existencia de otros nichos

ecológicos donde encontrar bacterias beneficiosas (Bashan y Holguin, 1998).
1.1. Biodiversidad microbiana
La rizosfera es un medio complejo y dinámico, que varía temporal y

espacialmente, y que resulta influenciada por el tipo de suelo, las especies de plantas
existentes, las distintas estaciones climáticas y por las diferentes prácticas agrícolas
(Asuming-Bramong et al., 2008). De esta manera, cambios en la microbiota rizosférica
son capaces de poner de manifiesto alteraciones en el sustrato agrícola, debidos al
manejo del cultivo, con mayor antelación que a través de las características
fisicoquímicas del suelo (Alves Pereira et al., 2007; Del Castillo, 2010). La técnica
DGGE proporciona información muy precisa sobre los cambios producidos en la
estructura de la comunidad microbiana del suelo (Trevors et al., 2008; Ahn et al., 2009)
cuando se somete a distintos manejos agrícolas (Li et al., 2005).
El estudio de los perfiles de la fracción cultivable mostró una alta diversidad en
los tres manejos de cubierta estudiados, posiblemente debida al periodo estacional en el
que las muestras fueron recogidas. Bacilio-Jiménez et al. (2003) y Kamilova et al.
(2006) pusieron de manifiesto que en el tiempo de formación y maduración de las
flores, el sistema radical secreta menor material orgánico, es decir, las raíces se
encuentran menos activas y los sustratos liberados al medio prácticamente se reducen a
restos orgánicos de las células de la raíz. Estos escasos exudados son menos selectivos y
por tanto, una población más amplia de microorganismos es capaz de utilizarlos, por lo
que la diversidad de la población se incrementa, de ahí la mayor actividad
microbiológica del suelo en la época primaveral que los resultados de esta tesis
corroboran. Diversos estudios en distintas especies vegetales han confirmado esta
tendencia hacia el enriquecimiento de las poblaciones bacterianas en la rizosfera en el
periodo de floración (Smalla et al., 2001). Otros autores (Hungría et al., 2001; Ruíz
Palomino et al., 2005) afirman que, en presencia de mayor cantidad de fuentes de
carbono, de asimilación más fácil, en el suelo deja de existir la presión selectiva
impuesta por la planta respecto a la utilización de las fuentes de nutrientes mientras que,
con una mayor demanda de nutrientes por las plantas (Hungría et al., 2006), habría
mayor selección positiva de aquellos organismos más eficientes en la captación del
elemento limitante. Consecuentemente, esta mayor diversidad fisiológica o genética

Discusión
encontrada durante el periodo primaveral puede no estar asociada con una mejor
funcionalidad en términos de necesidades del cultivo. La diversidad por tanto, puede ser
opuesta a la funcionalidad.
La gran cantidad de bandas coincidentes entre los tres manejos agrícolas, y más
especialmente entre la zona de laboreo y la cubierta espontánea, pone de manifiesto lo
anteriormente descrito en cuanto a la naturaleza de los exudados durante la época del
año en la que se realizó el muestreo. Asimismo, revela que el manejo de cubiertas en el
cultivo no es determinante desde el punto de vista de diversidad microbiológica en este
periodo estacional, encontrando imposible asegurar qué manejo del cultivo es más
sostenible. Resultados similares fueron encontrados por Kaschuk et al. (2006) en otra
especie vegetal para el mismo periodo estacional.
Expuesta la alta diversidad encontrada en los patrones de DGGE, puede
precisarse que estas bandas representan solamente las especies cultivables
numéricamente dominantes (Muyzer y de Waal, 1994) aisladas de la rizosfera del olivo,
por lo que cabría esperar una mayor biodiversidad de la colección que la observada en
estos geles. Diversos estudios han constatado que a través de esta metodología, sólo se
es capaz de detectar poblaciones que constituyan, como mínimo un 1 % de la
comunidad total (Muyzer y Smalla, 1998; Asakawa y Kimura, 2007; Zhang et al.,
2007). Este umbral limita la detección de ADN amplificado a partir de poblaciones poco
numerosas, por lo que se ha de considerar que las bandas presentes en los perfiles de
DGGE obtenidos son representantes de las poblaciones mayoritarias crecidas en las
placas, cuyos genes ARNr 16S se encuentran en las concentraciones más altas. Por
tanto, hay que admitir que esta técnica tiene limitaciones que impiden el conocimiento
de la diversidad completa de la colección PGPR aislada, como también comentó
Sánchez Peinado (2007). Además, la DGGE es una técnica que está influenciada por la
reacción de PCR. De este modo, las variaciones en intensidad que se encuentran de una
misma banda en las tres zonas de muestreo, podrían estar directamente relacionadas con
cambios de abundancia relativa en la composición de la comunidad bacteriana
(Brüggemann et al., 2000; Stamper et al., 2003; Lin et al., 2005). Asimismo, dado que
estos perfiles moleculares se generaron mediante la amplificación con cebadores
universales, se puede afirmar que las bandas sencillas pueden estar compuestas a su vez
por varias secuencias diferentes solapadas entre sí con la misma concentración de G+C.
De esta manera, las bandas de gran intensidad pueden no estar causadas por
concentraciones elevadas de un solo gen en el ADN molde, sino por contribuciones de

Discusión
más de una población, dando también una idea sobre la biodiversidad que podría
encerrar en realidad la colección, tal y como expusieron otros investigadores
previamente (Schmalenberger y Tebbe, 2003; Sánchez Peinado, 2007).
El método molecular ERIC-PCR es la técnica que se usó para caracterizar los

aislados a nivel de cepa, eliminar las cepas redundantes y conocer la biodiversidad
presente en la colección aislada del olivo. Las matrices de similaridad de los patrones de
bandeo generados entre cada par de cepas pueden calcularse a través de dos modelos:
uno basado en bandas y otro en curvas. Los coeficientes fundamentados en el análisis de
las curvas densitométricas, como el coeficiente de correlación de Pearson, son métodos
más robustos y objetivos (Rademaker y Bruijn, 1997), ya que se comparan curvas
enteras y se omite la posible subjetividad ocasionada en el marcaje del bandeo de forma
automática o manual. Sin embargo, exige que la intensidad de las bandas sea
reproducible en los diferentes geles, un hecho que no fue posible obtener, ya que se
consideró que una divergencia entre los marcadores moleculares de los distintos geles
cercana al 10 % era excesiva con respecto a lo aceptado por los distintos autores
(valores cercanos al 5%) (Rodelas, Comunicación personal). El tratamiento de las
imágenes obtenidas mediante aplicaciones informáticas como GelCompar II®, tienen la
gran ventaja de aportar análisis objetivos de los perfiles, aunque pueden dar lugar a este
tipo de problemas al trabajar con patrones provenientes de varios geles, incluso a pesar
de disponer de herramientas para mitigar estas diferencias. Estos problemas en cuanto a
reproducibilidad de la intensidad de los geles y su normalización han sido encontrados
por otros autores (Alonso de la Vega, 2010). Por este motivo, se optó por un modelo
basado en bandeo que apoya la presencia o ausencia de bandas entre dos cepas,
determinando de esta manera las matrices de similitud de variables binarias (Coll,
2004).
El coeficiente de Dice (Dice, 1945) es uno de los algoritmos basados en bandas
más usados para caracterizar perfiles electroforéticos bien definidos como son los
determinados por rep-PCR (Fernández-Cuenca, 2004). Los dendrogramas construidos
mediante este algoritmo, revelaron una alta biodiversidad, tanto de cepas Gram
positivas como de Gram negativas, dentro de la colección bacteriana aislada del suelo
rizosférico. La separación de ambos grupos por encima del 50% de similitud permitió
realizar una estimación de la diversidad bacteriana existente (Alonso de la Vega, 2010),
encontrando una mayor dispersión entre las bacterias Gram positivas que entre las Gram

Discusión
negativas. La alta biodiversidad encontrada en ambos grupos corrobora la hipótesis

anteriormente expuesta sobre la naturaleza de los exudados vegetales en la época del
año en la que se realizó el muestreo, donde la presión selectiva realizada por la planta es
menor que en otras épocas del año. Igualmente, la biodiversidad se encontró poco
influenciada por el manejo agrícola realizado, ya que se localizaron algunas cepas
bacterianas redundantes en la rizosfera de las distintas parcelas, aunque mostrando
habilidades PGP distintas. Esto último permite asegurar la existencia de una
direccionalidad por parte de la planta a través de sus exudados, que da lugar a que
bacterias genéticamente iguales presenten actividades bioquímicas distintas, lo que
corrobora que estas habilidades son inducibles y no constitutivas (Rainey, 1999;
Barriuso, 2006).
La utilización de esta técnica no permite obtener información de las relaciones
filogenéticas entre cepas o establecer un porcentaje a partir del cual sería posible
determinar una especie o un género, pero es una excelente herramienta para conocer la
diversidad de una colección bacteriana (Lecadet et al., 1999; Lima et al., 2002; Reyes-
Ramírez e Ibarra, 2005). Ahora bien, los resultados de agrupamiento que se han
obtenido a través del algoritmo de Dice pueden presentar cierta subjetividad, de modo
que deben de tomarse con cautela y ser considerados como estimaciones iniciales de la
biodiversidad que deben ser confirmadas mediante otro tipo de marcadores (Alonso de
la Vega, 2010).
2. Selección e identificación de cepas PGPR

Para los ensayos de interacción planta-microorganismo se seleccionaron cepas
que a priori ostentaban las tres capacidades PGP estudiadas (síntesis de auxinas,
producción de sideróforos y solubilización de fosfatos), ya que así éstas podrían
promover el crecimiento de la plata de forma directa, indirecta o bien sinérgicamente
(Gupta et al., 1998; Ahmad et al., 2008). La producción de sideróforos llevada a cabo
por las cepas PGPR disminuye la concentración de Fe del medio, haciéndolo limitante
para otros microorganismos (Ahmad et al., 2006; Príncipe et al., 2007). Este mecanismo
directo actúa indirectamente, protegiendo frente a patógenos al competir con éstos por
un nutriente esencial, y sinérgicamente, provocando la activación de los mecanismos de
ISR, promoviendo una respuesta defensiva frente a patógenos del suelo y foliares (van

Discusión
Loon et al., 2008; del Castillo, 2010). Asimismo, la capacidad de solubilizar fosfatos
que poseen los aislados seleccionados apoya un incremento del crecimiento vegetal,
actuando estas bacterias como biofertilizantes (Rogríguez y Fraga, 1999). No obstante,
es de resaltar el papel crítico que tiene en la promoción del crecimiento vegetal y en este
trabajo la producción microbiana de fitohormonas como el AIA, no sólo en un papel
sinérgico junto a las habilidades ya mencionadas, sino también desde el punto de vista
individual. De hecho, se seleccionaron cepas que poseían únicamente esta actividad o
principalmente destacaban por ella. Además, también se escogieron las bacterias
adaptadas a las condiciones de vivero con alguna característica PGP aisladas del agua
de riego (AG9 y AG13) y otras previamente descritas como PGPR (cepa M16) o
utilizadas por otros autores como inductoras de enraizamiento (cepas Sp7 y Cd).
La fitoestimulacion a través de ciertas hormonas como el AIA ha sido
demostrada en numerosas ocasiones (Dobbelaere et al., 1999; Rodríguez-Romero et al.,
2008). De este modo, la síntesis de AIA es una de las características más importante que
una bacteria PGP puede poseer (Okon y Vanderleyden, 1997; Mehnaz y Lazarovits,
2006; Matsukawa et al., 2007). Aunque las actividades in vitro e in vivo no siempre se
relacionan, se ha comprobado que cepas con una alta producción in vitro de auxinas
también producen una alta promoción del crecimiento in vivo (Fuentes-Ramírez y
Caballero Mellado, 2005; Aslantas et al., 2007). No obstante, esto no siempre es cierto,
ya que en estudios realizados con mutantes sobreproductores de AIA se demostró que si
los niveles de AIA sintetizados eran demasiado altos, el crecimiento de la raíz se inhibía
y no existía esta relación directa (Spaepen et al., 2007).
El etileno es otra hormona producida endógenamente por la mayoría de las
plantas, que regula el crecimiento vegetal a través de múltiples mecanismos y participa
en una gran cantidad de actividades fisiológicas, como la formación de raíces
adventicias, la diferenciación de raíces y tallos, la floración o la maduración de los
frutos, pero también actúa como hormona del estrés. A altas concentraciones, el etileno
tiene efecto inhibidor del crecimiento de las raíces y puede conducir a un desarrollo
anormal de las plantas (Saleem et al., 2007). En los microorganismos de suelo se
encuentra muy extendida la presencia de la enzima ACC desaminasa (Glick et al.,
2007), implicada en la degradación de la molécula ACC, inmediato precursor del etileno
y por tanto, en el crecimiento de las raíces (Penrose y Glick, 2001; Sergeeva et al.,
2006). Dada la importancia de esta otra hormona, se decidió comprobar la presencia de

Discusión
la enzima ACC desaminasa en las cepas seleccionadas. La actividad de esta enzima se

detectó en distintos grados en tres de las cepas seleccionadas (CT33, AG9 y M16).
Las bacterias son los organismos que mayor biodiversidad presentan en el

ecosistema edáfico (Barea et al., 2005; Sánchez-Peinado, 2007). Sin embargo, se ha
descrito que la comunidad microbiana que habita en la proximidad de las raíces presenta
una menor diversidad que las muestras de suelo alejadas de las mismas (Ramos-Solano
et al., 2003; Barriuso et al., 2005), estando esta comunidad enriquecida en bacterias
Gram negativas de la clase Proteobacteria (Marilley y Aragno, 1999; Sun et al., 2004;
Zhou et al., 2007). No obstante, el grupo de bacterias que constituyen las PGPR
incluyen representantes de muy diversos taxones (Vessey, 2003; Lucy et al., 2004;
Antoun y Prévost, 2005). De acuerdo a sus posiciones taxonómicas dentro del dominio
Bacteria, actualmente, se pueden encontrar especies que actúan como PGPR
principalmente en los filos Proteobacteria, incluyendo las clases Alfaproteobacteria,
Betaproteobacteria y Gammaproteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria (Rodríguez-
Díaz et al., 2008) y Bacteroidetes (Franco, 2008).
La asignación de nuevas cepas a una especie bacteriana o la propia aparición de
nuevas especies dentro de un género siempre ha suscitado fuertes debates (Rosello-
Mora y Amann, 2001; Carro, 2009) acerca de la propia definición de especie. La
introducción en la sistemática microbiana de la comparación de las secuencias del gen
ribosómico 16S como una herramienta de clasificación basada en la filogenia molecular
revolucionó la taxonomía. Así, en base a la secuenciación de este gen, se admite que si
dos organismos presentan una similitud inferior al 97 % posiblemente se trate de dos
especies diferentes, mientras que si presentan una similitud entre 97 % y 99 % se
necesita además, una confirmación mediante otra serie de métodos (Rodríguez-
Martínez, 2008). Por otro lado, el ARNr 16S al evolucionar de una forma tan lenta,
existen ocasiones en las que los valores de similitud superiores al 99 % pueden
corresponder igualmente a cepas que pertenecen a diferentes especies (Yamamoto y
Harayana, 1995; Richert et al., 2007).
Las cepas identificadas en este estudio se engloban dentro de los filos
Proteobacteria, principalmente dentro de la clase Grammaproteobacteria, y en menor
grado en los filos Actinobacteria y Bacteroidetes.
La clase Gammaproteobacteria encuadra las familias Enterobacteriaceae y
Pseudomonadacea que incluyen un amplio rango de microorganismos íntimamente

Discusión
relacionados con las plantas (Park et al., 2005; Tsavkelova et al., 2007). Entre ellos se
localizan miembros descritos como PGPR en los géneros Citrobacter (Nguyen et al.,
2003), Enterobacter (Shoebitz et al., 2009), Erwinia (Reiter et al., 2002), Klebsiella
(Chelius y Triplet, 2000), Kluyvera (Ma et al., 2001), Pantoea (Verma et al., 2004),
Serratia (Franco, 2008), Pseudomonas (Cheng et al., 2007), Flavimonas (Gutiérrez
Bustos et al., 2009) o Azotobacter (Rodelas et al., 1999). Dentro de esta clase se
incluyeron la mayoría de las cepas seleccionadas, ratificando el papel fundamental que
la planta realiza a través de sus exudados en la determinación de la composición de la
comunidad rizosférica. De modo particular, a pesar de haberse encontrado algunas
especies patógenas (Gray y Smith, 2005), el género Pseudomonas es uno de los más
importantes como PGPR y en él se han descrito cepas solubilizadoras de fosfatos muy
eficientes, grandes promotoras del crecimiento, eficaces colonizadoras rizosféricas
(Patten y Glick, 2002; Donate-Correa et al., 2004) y efectivas controladoras de
fitopatógenos (Prieto y Mercado-Blanco, 2008). En este género se englobaron cuatro de
las cepas que se identificaron como P. koreensis (cepas CT357 y CT364), P. reinekei
(Cepa CT42) y P. brassicacearum subsp. neoaurantiaca (CT387). Sin embargo, al
analizar los porcentajes de similitud obtenidos por comparación de las cepas tipo
descritas, se encontró que estos valores variaban entre 98,41 % para la cepa CT357 y
entre 99,11 % y 99,31 % para las restantes. En las cuatro secuencias analizadas se
obtuvieron valores de similaridad menores a los observados entre las especies P.
koreensis y P. reinekei (99,6 %) que a priori, según la bibliografía, deberían
corresponder a la misma especie, demostrándose que las cuatro cepas aisladas y en
especial la estirpe CT357 podrían ser propuestas como nuevas especies. La cepa CT363
presentó una similitud de 99,11 % con Flavimonas oryzihabitans, encontrando una
diferencia de 12 nucleótidos entre ellas. El alineamiento de las secuencias de las
especies F. oryzihabitans y su inmediatamente cercana, P. putida, encontró entre ellas
un porcentaje de similitud equivalente al encontrado entre la estirpe CT363 y su más
próxima, siendo la diferencia entre ambas secuencias de 14 nucleótidos. De esta
manera, la cepa CT363 podría ser sugerida para constituir también una nueva especie.
Asimismo, el género Enterobacter englobó a dos de las estirpes seleccionadas, CT33 y
M16, identificándolas como E. asburidae cuya similitud con las especies descritas fue
de un 98,87 % y 99,43 %, respectivamente. Realizando el mismo razonamiento anterior,
se encontró que el alineamiento de secuencias de las especies descritas más cercanas, E.
asburidae y E. cancerogenus mostraban una semejanza entre ellas de 99,6 %, arrojando

Discusión
indicios de otras dos posibles nuevas especies. Finalmente, el género Erwinia englobó
dos cepas, CT194 (99,92 %) y AG9 (99,85 %), que se identificaron sin lugar a dudas
como E. eucrina.
En el filo Actinobacteria aparecen géneros de PGPR tan comunes como
Frankia, una pionera en la colonización de suelos pobres o contaminados, capaz de
establecer simbiosis con plantas no leguminosas (Venssey et al., 2005), Streptomyces
(Siddiqui y Mahmood, 1999) o Arthrobacter (Gray y Smith, 2005). Las cepas CT285 y
CT402 se identificaron como A. globiformis, mostrando ambas porcentajes superiores al
99 % que verificaron la identidad de las cepas. No obstante, para este género autores
como Stackebrandt y Ebers (2006) han descrito la necesidad de confirmar la identidad
de las cepas mediante otros métodos.
Por último, dentro del filo Bacteroidetes se localiza la familia Flavobacteriaceae
que incluye los géneros Flavobacterium, donde casi todas sus especies de comportan
como PGPR (Soltani, 2010), y Chryseobacterium (Dardanelli et al., 2010) en el que se
agruparon con C. defluvii, la cepa AG13 con una identidad del 97,09 %, y con C.
vrystaatense, la estirpe CT348 con un 97,80 %, presentándose ambos casos como
propuestas para nuevas especies, a expensas de confirmación a través de otras técnicas.
Como se ha discutido el método de identificación basado en la secuenciación del
ARNr 16S sólo sirve como una aproximación en la asignación taxonómica de un
microorganismo que es útil y muchas veces aceptable según los estudios que se estén
llevando a cabo. No obstante, cuando este método revela indicios que indican la
aparición de nuevas especies, se hace necesario la utilización de otro tipo de estudios
complementarios. Actualmente, los métodos para distinguir entre géneros y para definir
nuevas especies se basan en la taxonomía polifásica, en la cual se incluyen todos los
datos genotípicos, fenotípicos, bioquímicos y quimiotaxonómicos disponibles en una
clasificación conjunta que las diferencien de las ya descritas (Alonso de la Vega, 2010).
3. Interacción planta-microorganismo
Las cepas seleccionadas por sus características PGP in vitro se testaron, en
primer lugar, en ensayos de interacción planta-microorganismo en condiciones
axénicas, usando plantas modelo. El planteamiento y la ejecución de experimentos con
plantas modelo proporciona una serie herramientas metodológicas que permiten

Discusión
comprender los mecanismos de acción de las bacterias inoculadas y establecer las

estrategias biotecnológicas de manipulación más adecuadas (Barriuso, 2006). De este
modo, se mejora la interacción del microorganismo con la planta diana y se obtienen los
máximos beneficios que de otra manera serían imposibles de alcanzar, dado el método
de propagación del olivo.
En este trabajo se usaron tres plantas modelo, dos especies de soja verde (V.
radiata y V. unguiculata) y una de colza (B. napus), descritas como de rápido
crecimiento, fácil cultivo y que constan de una amplia caracterización genética (Franco,
2008; Ali, 2009). Además, han sido extensamente empleadas en ensayos de interacción
planta-microorganismo debido a su alta sensibilidad a cambios hormonales (Mayak et
al., 1999; Penrose y Glick, 2003; Shaharoona et al., 2006; Contesto et al., 2008).
La promoción radical producida por la aplicación de bacterias productoras de
AIA es uno de los efectos beneficiosos más medidos y buscados, ya que un rápido
establecimiento radical proporciona a las plántulas una mayor supervivencia. Se ha
debatido mucho qué concentración de auxinas puede determinar la aparición de un tipo
de raíces u otras en las plantas. Khalid et al. (2004) observaron, tras la inoculación de
diferentes PGPR que producían una alta concentración de AIA, que podía establecerse
una correlación positiva entre la producción de AIA in vitro y el incremento del peso
radical y aéreo de las plántulas de trigo. Arkhipova et al. (2005) sugirieron que esta
relación era debida a un incremento en la concentración endógena de AIA in planta
provocada por la producción de las auxinas bacterianas. Así, se ha descrito que los
niveles bajos de AIA estimulan la elongación radical y que los niveles altos, dentro de
un rango que depende de la especie vegetal, inducen la aparición de raíces adventicias,
ocasionándose por encima de estas concentraciones malformaciones o la inhibición del
enraizamiento (Patten y Glick, 2002; Ali et al., 2009 b).
El efecto de la inoculación de las distintas cepas bacterianas sobre las semillas

de colza produjo un incremento en la elongación de la raíz primaria significativamente
superior a sus respectivos controles negativos en todos los tratamientos, verificando lo
descrito anteriormente en numerosos trabajos (Lifshitz et al., 1987; Mayak et al., 1999).
Los mejores resultados se obtuvieron con la cepa AG9. Esta supremacía con respecto a
los otros tratamientos, en principio, como sostiene Franco (2008), puede proponerse
como un efecto sinérgico de diferentes propiedades que promueven el desarrollo radical
y la diferencian del resto de las cepas inoculadas, la síntesis de auxinas sumada a la

Discusión
actividad ACC desaminasa. Sin embargo, la presencia in vitro de estas características en

la estirpe M16 en mayor magnitud sugiere que la eficacia de la cepa AG9 no sólo se
deba a la sinergia de actividades, sino también a una expresión de las mismas en la justa
medida, que puede estar relacionada con la presencia en esta cepa de cierta
especificidad a los exudados radicales de esta planta. Estos datos corroboran los
descritos por Penrose y Glick en 2003, quienes encontraron que no siempre los
organismos con mayores niveles de ACC desaminasa promovían una mayor elongación
radical. De modo que, una bacteria productora de altas concentraciones de AIA, como la
estirpe M16, puede activar la ACC sintetasa en la planta y elevar los niveles de etileno.
Dado que esta cepa presenta actividad ACC desaminasa, las concentraciones de etileno
a priori podrían equilibrarse, al menos parcialmente, no produciendo una inhibición
total de la elongación radical, pero sí raíces de menor longitud. No obstante, los
resultados encontrados en la cepa AG9 también podrían deberse a su mayor adaptación
a las condiciones en las que se realizó el ensayo, dada su procedencia. Esta ductilidad o
versatilidad de la estirpe AG9 quedó avalada por las poblaciones radicales bacterianas
encontradas al final del ensayo realizado en colza, donde se observó una multiplicación
bacteriana de casi 4 órdenes de magnitud, seguida por la experimentada en la cepa M16,
quedando patente la adherencia de las cepas a las raíces de la planta inoculada.
Como se ha dicho, la propagación viverística del olivo se realiza comercialmente

a través de esquejes. De este modo, la realización de estudios en condiciones axénicas
que ayuden a entender como las PGPR podrían ser usadas en la industria viverista como
promotoras de la formación de raíces adventicias resultan de vital importancia, ya que
se ha descrito que las raíces según su origen y características anatómicas y fisiológicas
responden de forma distinta a las variaciones hormonales de la planta (Mayak et al.,
1999). La utilización de la soja verde para observar el efecto de las PGPR sobre la
iniciación y desarrollo de las raíces adventicias se ha descrito ampliamente (Tsavkelova
et al., 2007). En este trabajo se utilizaron dos especies de soja verde para distintos fines
dadas sus diferencias fisiológicas en cuanto a niveles tóxicos de AIA y medio de
cultivo.
La aplicación de las distintas suspensiones bacterianas sobre la base de las
estaquillas de V. radiata reveló una estimulación significativamente superior del
enraizamiento de las mismas en los dos parámetros estudiados, verificando los
resultados ya descritos por otros autores para otras PGPR (Li et al., 2005). Los mejores

Discusión
resultados se encontraron en el tratamiento inoculado con la estirpe M16, observándose

la formación de un alto número de raíces adventicias y por tanto, un valor alto de
longitud radical total. Resultados similares, los observaron otros autores en esta planta
al inocular con suspensiones de bacterias altamente productoras de AIA (Patten y Glick,
2002). No obstante, el cálculo de la tasa de longitud radical media mostró que otras
cepas como CT42 y, nuevamente, AG9 lograban los mejores resultados. Mayak et al.
(1999) obtuvieron resultados similares mediante la utilización de bacterias con niveles
de AIA y ACC desaminasa no excesivamente altos, que producían un número moderado
de raíces de mayor longitud. Estos resultados sugieren nuevamente, las hipótesis
lanzadas sobre la aplicación de las PGPR sobre la colza en cuanto a sinergia de
actividades PGP, expresión de los niveles adecuados, especificidad de la cepa a los
exudados radicales y mejor adaptación a las condiciones de ensayo. La colonización
radical fue óptima en todas las cepas, alcanzando unos niveles poblacionales cercanos al
inóculo y asegurando nuevamente la adherencia de las cepas a las raíces.
Con el objetivo de simular bajo condiciones axénicas la extendida práctica
viverista de usar grandes concentraciones de auxinas sintéticas para estimular el
enraizamiento de los esquejes de las distintas plantas, se planteó la verificación de la
existencia de diferencias en la formación de las raíces adventicias tras la imbibición de
las estaquillas durante una hora en el sobrenadante bacteriano y en la suspensión
bacteriana durante todo el ensayo. Para ello, se utilizó otra especie de soja verde, V.
unguiculata, una planta quizás con una menor sensibilidad a cambios hormonales, pero
capaz de soportar niveles de auxinas superiores que V. radiata, así como restos de
medio de cultivo. En estos ensayos, se observó una estimulación del enraizamiento
significativamente superior entre la aplicación de la mayoría de los sobrenadantes
bacterianos y el control negativo, por encima en algunos casos del control positivo de
AIA, hallando su mejor exponente en el sobrenadante de la cepa CT276, tanto en
número como en longitud total de raíces. Sin embargo, al aplicar el cociente de longitud
radical media se observó que la que alcanzaba un mayor equilibrio entre el número de
raíces y la longitud de éstas era la cepa CT364. La aplicación del sobrenadante de la
estirpe CT276 obtiene un alto número de raíces, pero muy pequeñas lo cual sugiere que
pueda deberse a una sobreexposición de AIA, que eleva los niveles de etileno,
provocando la inhibición de la elongación radical. Esto confirma, lo ya observado por
otros autores, que diferentes concentraciones de AIA dan lugar a diferentes respuestas
en la planta (Li et al., 2005). De esta manera, la aplicación de una concentración de

Discusión
auxina sintética equivocada en el vivero puede dar lugar, y como de hecho a veces
ocurre, a la pérdida de toda una producción de olivos, tanto por exceso como por
defecto. De forma independiente, en estos ensayos se corroboraron los resultados
mostrados anteriormente en la otra especie de Vigna al inocular mediante la suspensión
de bacterias. En este caso, los mejores resultados se observaron en las cepas CT276 y
M16 para ambos parámetros, aunque, nuevamente, la cepa CT364 alcanzó en esta
especie, junto con la estirpe M16, los valores más equilibrados en cuanto al número de
raíces y longitud de las mismas. La comparación entre ambas formas de inoculación
reveló diferencias significativas, encontrándose que casi todas las cepas promovían un
mayor número de raíces tras la aplicación de los sobrenadantes, y una mayor elongación
radical al emplear la suspensión bacteriana. El análisis de la tasa de elongación radical
media confirmó que la aplicación de una suspensión bacteriana produce, en general,
unas raíces más largas pero menor número, proponiendo que esto puede ser debido a
que a priori están sometidas a una menor concentración de auxinas o a que éstas son
constantes durante todo el ensayo, ocurriendo justamente lo contrario en los
tratamientos con sobrenadante.
Las diferencias en comportamiento observadas entre las dos especies de Vigna
tras la aplicación de la suspensión bacteriana, subraya la variabilidad existente entre las
dos especies y la estrecha relación que se produce entre la cepa bacteriana aplicada y la
planta diana, que puede dar lugar a que ciertas bacterias, como la cepa AG9, alcancen
mejores resultados con una planta que con otra. Esto ha sido ampliamente descrito por
otros autores, afirmando que diferentes factores como la especificidad del huésped, la
distribución geográfica, la edad de la planta o la variedad pueden dar lugar a variaciones
significativas en las actividades de las bacterias inoculadas (Aslantas et al., 2007; Ali,
2009). Estos factores promoverían diferencias en la composición de los exudados
radicales (Mehnaz y Lazarovits, 2006), pero también en la estructura y capacidad de
absorción del sistema radical (Lucas-García et al., 2003).
Tras efectuar los ensayos de interacción planta-microorganismo en condiciones

controladas, se procedió a la realización de ensayos de enraizamiento en la planta diana,
el olivo, en condiciones de vivero. A lo largo de 11 ensayos de enraizamiento de
estaquillas semileñosas bajo nebulización se encontró que, en las cuatro variedades
empleadas (arbequina, hojiblanca, picual y koroneiki), siempre hubo una respuesta
positiva a los tratamientos bacterianos inoculados, independientemente del método de

Discusión
inoculación, produciendo un enraizamiento igual o superior al observado en el

tratamiento control positivo con AIB. Si bien es cierto, estos resultados no fueron en
todos los casos homogéneos debido a los diversos factores que intervienen en los
ensayos llevados a cabo en condiciones no estériles, algo ya verificado por otros autores
(Cattelan et al., 1999; Ahmad et al., 2006; Centeno et al., 2008).
Antes de comenzar a analizar detalladamente los potenciales enraizadores de
cada cepa seleccionada, conviene enfatizar sobre los factores que intervienen en el
enraizamiento a través del estaquillado semileñoso bajo nebulización.
En primer lugar, es de resaltar la importancia de la forma de aplicación de los
tratamientos bacterianos. En este trabajo se han probado tres formas de inoculación
distintas. En los primeros ensayos las bandejas se llenaron con sustrato previamente
inoculado con el cultivo bacteriano (10 9 UFC/g), proporcionando un buen
enraizamiento. Sin embargo, este método no es viable a escala comercial, ya que
necesita de grandes cantidades de cultivo bacteriano (500 l para producir 270.000
plantones de olivo). A partir de ésto y con los precedentes de que A. brasilense puede
también unirse de forma efectiva a una amplia variedad de superficies, incluyendo tallos
vegetales o estaquillas de clavel (Li et al., 2005), surgió la idea de sumergir las
estaquillas en el cultivo bacteriano líquido a distintos tiempos de imbibición (24 h, 2 h y
1 h), permitiendo a la bacteria su adhesión a la estaquilla de forma previa al
estaquillado. Esta segunda técnica reveló resultados tan buenos como con el anterior
método y además, confirmó la persistencia del inóculo al final del ensayo, mostrando
una colonización radical que rondó entre 102 y 104 UFC/g en raíz. Sin embargo,
teniendo en cuenta la pérdida de viabilidad de los inoculantes líquidos en un corto
periodo de tiempo descrita por otros autores (Date, 2000), que dificultaría el almacenaje
y comercialización del inóculo, se optó por la experimentación de una tercera forma de
inoculación. En este tercer método, las estaquillas se sumergieron en una pasta
elaborada por un inoculante sólido (turba) mezclado con agua, durante unos segundos,
no obteniendo diferencias significativas en algunas cepas y algunas variedades, con
respecto a los anteriores métodos empleados. Esto confirmó la idoneidad de esta forma
de inoculación, que es relativamente fácil de comercializar y de aplicar bajo condiciones
de vivero, debido a su semejanza con los inoculantes basados en turba empleadas desde
finales del siglo XIX para Rhizobium (Daza et al., 2000; Temprano et al., 2002). Sin
embargo, habrá que realizar más estudios, quizás con periodos de imbibición en pasta
más prolongados o mediante la utilización de otros tipos de soportes más ecológicos

Discusión
como el corcho (Albareda, 2007) hasta lograr poner a punto este método con las cepas
seleccionadas y para las diferentes variedades de olivo.
Otro factor importante es el sustrato usado en las bandejas donde se realiza el
estaquillado, considerándose a éste como una parte integral del sistema de propagación
(Loach, 1988). En este trabajo se optó por la utilización de una mezcla de fibra de coco
y perlita (Fabbri et al., 2004) en todos los ensayos, salvo en el Ensayo 5 donde se
empleó únicamente fibra de coco. La eliminación en el sustrato de la perlita y la
realización del ensayo en época invernal, trajo consigo un aumento de la humedad en el
sustrato que afectó negativamente al enraizamiento de las estaquillas, siendo la variedad
picual la más perjudicada. Estos datos concuerdan con İsfendiyaroğlu et al. (2009) que
tras la utilización de un total de 25 sustratos de enraizamiento en la variedad de olivo
ayvalik, describieron que, los mejores resultados se lograban cuando el sustrato poseía
una buena aireación y una reducida capacidad de retención de agua. Sin embargo, la
idoneidad del sustrato depende de otros factores como la variedad de olivo, el tipo de
estaquilla, la estación del año, el sistema de propagación usado, el coste y la
disponibilidad de los componentes del sustrato (Hartmann et al., 2002), así como de la
calidad del agua de riego. De este modo, una forma de incrementar el éxito en la
propagación viverística del olivo sería, adecuando el medio de propagación a cada
variedad (İsfendiyaroğlu et al., 2009).
Se ha descrito que la variedad juega un papel determinante en el enraizamiento
de las estaquillas de olivo (Cimato y Fiorino, 1980; Rallo, 2005), debido al particular
equilibrio endógeno que cada variedad tiene entre auxinas y cofactores de
enraizamiento, tanto promotores como inhibidores del proceso (del Río et al., 1988;
Rallo, 2005). De este modo, del Río y Caballero (2005) clasificaron las variedades,
según su potencial enraizador a través del método de estaquillado semileñoso bajo
nebulización y estimulación con AIB en: altas enraizantes (> 60 % de estaquillas
enraizadas) como las variedades arbequina y picual, medias (60-40 % de estaquillas
enraizadas) como `Hojiblanca´ o bajas (< 40 % de estaquillas enraizadas). La variedad
koroneiki no se encuentra recogida en este estudio pero se considera de enraizamiento
bajo, según la percepción personal del viverista. En un trabajo realizado por Guzmán
Álvarez (2005) se determinó que hasta un 60 % de la variación que se obtiene en el
enraizamiento se debe a la variedad de olivo utilizada. En los ensayos realizados en este
trabajo se encontraron diferencias que avalan esta hipótesis, aunque en estos casos las
variaciones nunca llegaron a alcanzar un valor superior al 20 por ciento. Asimismo, la

Discusión
inclusión de la variedad hojiblanca como “enraizante media” puede discutirse por los
datos obtenidos en los ensayos antes mencionados, ya que en ellos siempre se observó
que las estaquillas de esta variedad enraizaban de forma más lenta que el resto de
variedades, pero no de una forma menos eficaz. Sin embargo, tanto en ésta como en la
variedad koroneiki se observó una relación directa entre la aparición de callo en la base
de la estaquilla y su enraizamiento posterior, algo solamente descrito por Hartmann et
al. (2002) en las variedades difíciles de enraizar.
Igualmente, se ha expuesto que la propagación vegetativa del olivo puede estar
fuertemente influenciada por la estación del año (Hartmann y Loreti, 1965). Los
estudios de Guzmán Álvarez (2005) pusieron de manifiesto que la mejor época para el
estaquillado es primavera-verano ya que, desde el comienzo de la brotación, el
porcentaje de enraizamiento se incrementa progresivamente hasta alcanzar el máximo a
final del verano, en el momento de la recolección para verdeo (septiembre). Por otro
lado, Rallo (2005) señaló que los mejores niveles de enraizamiento se presentaban en
verano y los peores en invierno, alcanzando valores intermedios en primavera y en
otoño, pero que este comportamiento no era la pauta seguida en todas las variedades
ensayadas. En los ensayos se observó que `Picual´ y Àrbequina´ siempre alcanzaban
valores aceptables en cualquier época del año y que otras como `Hojiblanca´ enraizaban
mejor en primavera que en verano. Asimismo, la experiencia del viverista indicó que los
mejores resultados de enraizamiento se obtenían con estaquilla recogidas tras el reposo
invernal, antes de la floración o después de la misma, y tras la descarga del fruto
(septiembre-octubre). Dadas estas discrepancias, se dispusieron ensayos a lo largo de
todo el ciclo vegetativo del árbol, centrando su establecimiento en septiembre (4
ensayos) y primavera, antes de la floración, (3 ensayos), pero también en verano (2
ensayos) y en invierno (2 ensayos). Los resultados demostraron que, efectivamente, en
las variedades picual y koroneiki, se obtenían mejores porcentajes de enraizamiento si
las estaquillas eran recogidas en la época del verdeo, mientras que `Hojiblanca´ también
podría preferir una época primaveral anterior a la floración y el verano, aunque sin lugar
a dudas Àrbequina´, presente en todos los ensayos realizados, mostró unos porcentajes
de enraizamiento aceptables en cualquier época del año, corroborando lo descrito por
del Río et al.,1991 y Guzmán Álvarez, 2005. Estas diferencias de enraizamiento,
debidas a la estación en la que se realizó la recogida del material vegetal, dentro de una
misma variedad y un mismo tratamiento y entre años, se ha visto que pueden deberse a
diferentes estatus de los carbohidratos endógenos (Özkaya y Çelik, 1999; İsfendiyaroğlu

Discusión
et al., 2009). De esta manera, Guzmán Álvarez (2005) observó que el 17 % de la

variación en el enraizamiento, podía atribuirse a la época en la que se realizó la
propagación y el 22 % al diferente comportamiento de las variedades en las distintas
épocas de recolección del material vegetal. No obstante, algunos autores señalan que las
variaciones dependientes de la variedad y de la época del año en la que se recoge el
material vegetal pueden reducirse mediante la utilización de plantas madre cultivadas
con el fin de servir como reproductoras, proporcionando elevados porcentajes de
estaquillas enraizadas, prácticamente durante todo el año (del Río et al., 1991) o
mediante el mantenimiento de las plantas madre en ambientes controlados que permitan
un crecimiento continuo y por tanto, un constante potencial de enraizamiento
(Fontanazza y Cipriani, 2001). Asimismo, otros autores (del Río et al., 1991; Rallo,
2005) determinaron que el enraizado además, podía ser influido por la edad y el estado
vegetativo o reproductor de la planta madre suministradora de las estaquillas, y en
relación con la posición que la estaquilla ocupe en el ramo, así como de las oscilaciones
ambientales donde se realiza la multiplicación, fundamentalmente luz, humedad y
temperatura.
Las oscilaciones ambientales asociadas a la multiplicación vegetativa del olivo
suelen estar referidas a la localización de las distintas repeticiones en el interior del
túnel de nebulización e intentaron minimizarse en cada ensayo, aunque se han descrito
como inherentes en este tipo de estudios (Porras Piedra et al., 1998; Centeno et al.,
2008). Estas fluctuaciones se relacionan con los distintos factores que determinan el
enraizamiento, como la característica de la madera, y a las propias debidas a las
instalaciones de multiplicación, principalmente a las referentes a la temperatura y
humedad (Hartmann et al., 2002). Así, para asegurar un enraizamiento homogéneo a
través de este método, se hace indispensable la automatización y normalización de las
infraestructuras de multiplicación. Sin embargo, esto puede implicar un coste
demasiado excesivo para el viverista. No obstante, algunos autores como Porras et al.,
1992, sugieren que estas variaciones más que, a carencias tecnológicas en los viveros,
podrían estar ligadas a la variación del fotoperiodo en el interior del túnel, ya que se ha
demostrado que en las zonas del vivero donde las estaquillas reciben más radiación,
ofrecen un mayor porcentaje de enraizamiento.
Como se ha comentado, el éxito del enraizamiento en el sistema de reproducción
vegetativa a través de este método, requiere de un sistema de automatización que
asegure principalmente un control de la nebulización, así como un sistema de

Discusión
refrigeración y una óptima calefacción del sustrato (Porras-Piedra et al., 1997). Cuando
se emplea hormona sintética, la temperatura sólo influye en la fisiología de la planta,
mientras que en la aplicación de cultivos bacterianos, éste sería otro factor
determinantes a tener en cuenta, ya que un descenso en la temperatura de la mesa puede
suponer una ralentización en el crecimiento y en la colonización bacteriana y por tanto,
en la producción hormonal. Así, en los ensayos realizados en verano (Ensayo 3 y 6),
donde la temperatura no descendió de 25 ºC, los porcentajes de enraizamiento fueron
altos y se obtuvieron raíces en un periodo inferior (sólo seis semanas) al requerido en
otra época del año (8 semanas). Cuando la temperatura no es la óptima, los tratamientos
bacterianos necesitan más tiempo para inducir el enraizamiento que los tratados con
hormona sintética (en general, 1-2 semanas más). Resultados similares han sido
descritos por Porras-Piedra et al. (2005) en la inoculación de plantones de olivo con otro
tipo de microorganismo (micorrizas) donde, en periodos invernales no se muestran
diferencias significativas entre los tratamientos control y los inoculados.
Definidos todos los parámetros a tener en cuenta cuando se realiza el
estaquillado semileñoso bajo nebulización, es el momento de especificar detalladamente
la acción llevada a cabo por cada tratamiento bacteriano en los ensayos. En primera
instancia, cabe resaltar el papel protagonizado por la cepa bacteriana AG9, identificada
provisionalmente como Pantoea eucrina, y aislada del agua de riego del propio vivero
comercial. El aval de esta cepa no es sólo su potencial enraizador, sino también su
versatilidad, alcanzando en los todos los ensayos realizados un porcentaje igual, y en
muchos casos superior, al control con AIB, en cualquier época del año,
independientemente de la forma de inoculación (inmersión de estaquillas en caldo de
cultivo o en inoculante sólido), en los dos viveros comerciales utilizados y en distintas
variedades de olivo, incluso en `Koroneiki´. Bien es cierto que esta bacteria no presenta
in vitro una de las mayores producciones de AIA, ni de sideróforos, ni posee un valor
alto de actividad ACC desaminasa, sin embargo, este conjunto de actividades ensayadas
añadidas a la adaptabilidad al medio que esta bacteria puede poseer frente al resto de
seleccionadas, la convierten en la más efectiva de este trabajo.
Ya se ha descrito que la actividad ACC desaminasa por parte de las bacterias las
hace altamente efectivas como PGPR, debido al hecho de que pueden reducir la
cantidad de etileno producido por la planta y por tanto, promover la elongación radical
(Penrose y Glick, 2001; Glick et al., 2007). Sin embargo, otra de las cepas
seleccionadas, M16, a pesar de poseer, a priori, incluso mejores características que la

Discusión
estirpe AG9 (Tabla IV.1.) y de alcanzar en la mayoría de los ensayos valores de

enraizamiento iguales o superiores al control con AIB, no mostró la versatilidad ni la
eficacia de la cepa AG9. Esto se postula que sea debido, como se ha comentado, a la
adaptabilidad que la cepa AG9 presenta a las condiciones ambientales que se dan los
ensayos y también, a la especificidad de los exudados radicales que las distintas
variedades de olivar pueden exhibir, ya que la estirpe M16 no procedió ni de la rizosfera
del olivo ni del agua de riego del vivero. Esto último se comentará más adelante.
Diversos autores han expuesto que la inoculación con Azospirillum brasilense
induce la proliferación de raíces laterales y pelos radicales (Glick, 1995; El-Khawas y
Adachi, 1999). La inoculación aplicada por inmersión en un cultivo líquido arrojó
buenos resultados sobre el enraizamiento con la cepa Cd, no así tras la aplicación del
inoculante sólido, donde se observó una reducción significativa del enraizamiento en las
variedades arbequina y picual.
Las cepas CT364 y CT363 desempeñaron un buen papel en los ensayos de
enraizamiento. En concreto la primera alcanzó valores iguales o superiores al control
positivo en cinco de los ensayos realizados en la variedad arbequina,
independientemente de la época del año y un notable incremento en `Hojiblanca´ en el
ensayo desarrollado en enero de 2007, donde las condiciones de humedad debidas al
sustrato no fueron las adecuadas. Estos resultados sugieren que esta cepa podría poseer
algún mecanismo de amortiguación de los estreses ambientales que no ha podido
descubrirse in vitro. Igualmente, la estirpe CT363 demostró en la variedad arbequina
una gran homogeneidad en sus resultados, con independencia de la época de
estaquillado, aunque no hay que olvidar los resultados hallados para `Picual´ y
`Hojiblanca´ del ensayo realizado en septiembre de 2007, donde se alcanzaron
porcentajes de enraizamiento iguales (54,5 %) e incluso superiores el control con AIB
(70,5 %), respectivamente.
La estirpe CT348 resultó ser una bacteria capaz de enraizar con bastante éxito la
variedad koroneiki. Sin embargo, se hace necesaria la realización de otros ensayos en
diferentes épocas del año para confirmar su eficacia. Asimismo, se alcanzaron buenos
resultados en Àrbequina´ (en tres ocasiones) y `Picual´ (en dos ocasiones), siendo
también afortunada en el enraizamiento de la variedad hojiblanca a través del Método 3
en el Ensayo 5. Esto plantea de nuevo la existencia en esta cepa de algún mecanismo
que amortigüe las situaciones de estrés que no se ha inducido mediante las pruebas in
vitro.

Discusión
El comportamiento bacteriano demostrado en los distintos ensayos revela una

clara interacción entre la cepa bacteriana y la variedad de olivo en la mayor parte de los
casos. Así, cepas altamente enraizantes con determinadas variedades son inefectivas con
otras (ej. A.brasilense Cd obtiene porcentajes muy altos con Àrbequina´ y `Hojiblanca´
y es inefectiva frente a `Picual´). La alta especificidad de algunas PGPR para ciertas
especies vegetales, variedades y genotipos ha sido ya descrita por otros autores (Nowak,
1998; Khalid et al., 2004) y en otro tipo de relaciones. Citenersi et al. (1998)
describieron una respuesta distinta de varios cultivares de olivo a la inoculación con el
hongo micorrícico Glomus mosseae. Igualmente, se han encontrado diferencias entre la
respuesta de un mismo cultivar a la inoculación con distintas especies de hongos
micorrícicos (Porras-Piedra et al., 2005; Soriano-Martín et al., 2006). Esta variación en
la respuesta a la inoculación podría deberse a diferencias genotípicas que darían lugar a
diferencias entre los exudados radicales de las distintas variedades vegetales (Dazzo et
al., 2000; Khalid et al., 2004). No obstante, la versatilidad demostrada por la cepa AG9
y en menor medida, por las estirpes M16 y CT348 presenta nuevas oportunidades en el
desarrollo de productos comerciales.
A pesar de las variaciones discutidas, el método de enraizamiento propuesto
presenta una serie de ventajas que lo hacen ecológico, eficiente y eficaz frente a otras
formas de propagación del olivo. En el método de estaquillado de olivo bajo
nebulización convencional, tanto la concentración óptima de AIB (2000-4000 ppm)
como el tiempo que la estaquilla está introducida en la solución (2-5 s), en el caso de
inmersión de una solución líquida de AIB, depende del estado fisiológico de la planta
madre, y es la experiencia del viverista la que determina ambos parámetros. Esto da
lugar a que, en ocasiones, se pierdan producciones enteras al “quemarse” la base de la
estaquilla por un exceso de AIB. Cuando la estaquilla se trata con bacterias productoras
de auxinas no está sometida a este “shock momentáneo”, sino a concentraciones de
hormona muy inferiores (entre 10-100 ppm) durante todo el periodo que dura la
nebulización de forma que, las pérdidas por “quemado” de estaquillas son nulas. De
aquí la importancia que este tipo de tratamiento puede tener, no sólo en el estaquillado
ecológico del olivo, donde el uso de hormonas sintéticas está prohibido, si no en la
producción viverística convencional (Camacho et al., 2007). Aunque son necesarios
estudios adicionales, los resultados presentados en condiciones reales, sugieren
firmemente que es posible obtener de forma efectiva el enraizamiento de estaquillas
semileñosas mediante tratamientos con bacterias que promueven el crecimiento vegetal.

Discusión
3.1. Monitorización de la colonización bacteriana in planta
El uso del gen de fluorescencia gfp como marcador microbiano se ha empleado

exitosamente en estudios de interacción planta-microorganismo (Lu et al., 2004; Kutter
et al., 2006; Germaine et al., 2006; Prieto y Mercado-Blanco, 2008), proporcionando
una mejor comprensión del proceso de colonización bacteriana en los tejidos vegetales
in situ (Larrainzar et al., 2005). Sin embargo, en este tipo de ensayos el marcaje
bacteriano con la proteína GFP puede plantear problemas asociados, ya que para
permitir el seguimiento de las actividades bacterianas in planta, este gen debe ser
estable en las células durante todo el proceso de infección, así como mantener unos
niveles altos de expresión para su detección. En este trabajo, la introducción del gen gfp
a través de un vector plasmídico proporcionó un alto número de copias de éste en la
célula, suministrando la intensidad suficiente de fluorescencia para ser visualizada
mediante microscopía de epifluorescencia. No obstante, para impedir la pérdida de este
plásmido durante la multiplicación celular (Wang et al., 2007), se usó un método de
transferencia o movilización de ADN plasmídico basado en una conjugación bacteriana
triparental de la que se obtuvieron cepas transconjugantes incapaces de perder el
plásmido transferido (Ma et al., 2001; Collados-Clares, 2006), como posteriormente se
comprobó. Sin embargo, es sabido que la introducción de ADN foráneo en una célula
huésped produce en la misma una serie de modificaciones fisiológicas y funcionales,
tales como cambios en la patogeneidad, expresión de genes o competitividad (Glick,
1995). Principalmente, se han descrito alteraciones en el funcionamiento de su
metabolismo que imponen una mayor demanda energética, como requerimiento para
mantener la presencia del nuevo ADN que se traduce a ARN y proteína en la célula
(Roesti, 2005). Algunos autores han observado este incremento metabólico tras la
introducción de plásmidos de gran tamaño en E. coli o con alto número de copias,
produciéndose una tasa de crecimiento menor, así como una fase estacionaria más corta,
es decir, las células huésped crecen más lentamente y mueren antes (Cheah et al., 1987).
La declinación en la fase de crecimiento puede resolverse incrementando el oxígeno
disuelto en el medio (Seo y Bailey, 1985). Aún así, la sobreproducción de una proteína
puede debilitar a la propia célula, aunque esto va a depender de las características de esa
proteína, la tasa de crecimiento celular, la composición del medio o la cantidad de
oxígeno disuelto en el mismo (Glick, 1995). Asimismo, la expresión de la proteína
foránea puede interferir en el funcionamiento propio de la célula, convirtiendo un

Discusión
importante y necesario metabolito intermedio hacia un componente irrelevante o incluso

tóxico para la célula (Sano y Cantor, 1990). Esta última circunstancia, se ha observado
frecuentemente en la introducción de genes que confieren resistencia a antibióticos,
aunque fenómenos similares ocurren en células que poseen una alta tasa de respiración
que requieren grandes cantidades de energía (Share et al., 1989). También, una
sobreproducción proteica puede conllevar a alteraciones en el tamaño y la forma de la
célula bacteriana por la formación de proteínas de alto peso molecular, los llamados
cuerpos de inclusión, o incluso pueden tender a establecer cadenas celulares constituidas
por tres o cuatro células unidas, no encontrando células individuales en el cultivo.
Asimismo, puede ocasionar una aumento en la síntesis y secreción de polisacáridos
extracelulares o la activación de ciertos mecanismos bioquímicos reservados para una
situación de estrés ambiental (Glick, 1995). En cuanto al efecto sobre la interacción
planta-microorganismo, Glick et al. en un estudio realizado en el año 1994 usando la
cepa P. putida GR12-2 transformada con los plásmidos de resistencia a la Ap y Tc,
encontraron que esta modificación disminuía la capacidad para sintetizar sideróforos,
producía una inferior tasa de crecimiento bacteriano y una menor habilidad para elongar
las raíces de colza bajo condiciones gnotobióticas. Estos cambios de comportamiento
los achacaron a un aumento en el metabolismo celular producido por la inclusión en el
vector plasmídico del gen resistencia al antibiótico, demostrando estos resultados que
los genes que codifican para la Km, Cm o Ap originan un gasto energético mayor que el
gen de resistencia a la Tc, en base a que los primeros suelen expresarse en niveles
superiores. Por otro lado, Glick y Pasternak (2003) resaltaron que, además, una
expresión génica a través de un promotor transcripcional constitutivo fuerte casi
siempre debilitaba al organismo. A pesar de lo expuesto, todos los transconjugantes de
este trabajo presentaron características morfológicas inalterables, análogas tasas de
crecimiento en fase estacionaria (datos no mostrados) y las mismas capacidades PGP
por las que fueron seleccionados, corroborando así lo observado por otros autores
previamente (Ma et al., 2001; Rothballer et al., 2003). Asimismo, en este trabajo, en
cada tipo de ensayo de interacción planta-microorganismo se aplicaron tratamientos
paralelos de cepas marcadas con fluorescencia y silvestres, asegurando en todos los
casos, la ausencia de diferencias significativas en cuanto a promoción del crecimiento
vegetal, tras la introducción del vector plasmídico que incluía el gen de fluorescencia y
el de resistencia a Km. Estos resultados concuerdan con los hallados por otros autores

Discusión
usando plásmidos similares (Wang et al., 2007) y en estudios análogos (Bacilio et al.,
2004; Roesti, 2005).
La monitorización in situ de la colonización radical de las cepas bacterianas

marcadas con fluorescencia a través de microcopía laser confocal, ayudó a entender el
comportamiento in planta de cada bacteria PGP marcada (Ma et al., 2001). La utilidad
de CLSM ha sido constatada por diversos autores en distintas plantas en ensayos
similares de interacción planta-microorganismo (Chelius y Triplett, 2000; Elbeltagy et
al., 2001; Verma et al., 2004; Liu et al., 2006). En los ensayos realizados, se observaron
patrones de colonización superficial muy parecidos entre cepas y semejantes en las tres
especies vegetales ensayadas, incluso a pesar de las diferencias existentes entre los
métodos de inoculación llevados a cabo o las características anatómicas y fisiológicas
de las raíces formadas en los distintos ensayos.
En líneas generales, la colonización bacteriana en la raíz se incrementó desde las
zonas de división celular, donde fue escasa, hasta las de diferenciación, donde se
alcanzaron los valores más altos, resultados que concuerdan con los encontrados por
otros autores en ensayos similares (Unge y Jansson, 2001; Roesti, 2005). En las tres
especies vegetales ensayadas, se halló una importante colonización de la superficie
radical formando biofilms, un comportamiento previamente descrito en otros estudios
(Sutherland, 2001; Nancharaiah et al., 2003). Esta colonización principalmente se
distribuyó por las depresiones que forman las células epiteliales en la superficie radical,
donde se visualizaron microcolonias o agregados dispuestos en forma de cordón.
Asimismo, se encontraron numerosos agregados en los puntos de unión de los pelos
radicales y la raíz, y la raíces adventicias y el tallo. Ambas formas de colonización
corroboran lo observado en otras cepas bacterianas por distintos autores (Naureen et al.,
2005; McGrath y Andrews, 2007). Igualmente, se encontraron multitud de células
individuales por la superficie radical, especialmente en los ensayos de colza y con la
cepa AG9 en olivo. Un modelo de colonización espacial similar al comentado fue
encontrado por Ma et al. (2001) para la cepa PGPR Kluyvera ascorbata SUD165/26 en
colza, sugiriendo que las bacterias tienden a colonizar las zonas con más nutrientes de la
raíz, en concordancia con lo propuesto por Sorensen y Nybroe (2001) y Roesti (2005).
La capacidad de adhesión a la superficie radical de las cepas bacterianas puede deberse
así, a la capa de mucílago radical que es rica en polisacáridos y por tanto, una buena
fuente de carbono (Naureen et al., 2005). Sin embargo, su agregación y la emergencia

Discusión
de dicho patrón de colonización aún no están claros, pero se propone que podría ser
debido a variaciones en los nutrientes, la disponibilidad de agua, la prevención o
tolerancia a estreses ambientales y a la presencia de otros microorganismos (McGrath et
al., 2007). La habilidad de las cepas para colonizar a lo largo de las distintas regiones
radicales muestra así, la capacidad para moverse a través de los gradientes de nutrientes
y oxígeno, un factor de vital importancia para asegurar el éxito de una colonización
rizosférica a largo plazo (Naureen et al., 2005).
Las diferencias de colonización superficial encontradas entre raíces dentro de
una misma planta y tratamiento bacteriano fueron observadas frecuentemente en los
ensayos de V. radiata y olivo, encontrando resultados similares en los estudios llevados
a cabo por Unge y Jansson (2001) y McGrath et al. (2007). Prieto y Mercado-Blanco
(2008) sugirieren que la colonización en ciertas raíces, podría deberse, bien a que las
bacterias una vez que se adhieren a la raíz en una zona definida, éstas se multiplican y
aparentemente no se trasladan o bien a que la presencia de competidores nativos en las
raíces no permitan la colonización del inoculante, pudiendo entonces únicamente
colonizar raíces de nueva formación. Estas hipótesis podrían explicar los resultados
obtenidos en los ensayos realizados con plantones enraizados, pero no los obtenidos en
los ensayos en condiciones gnotobióticas, donde inicialmente se partió de estaquillas de
soja verde sin enraizar. Esto hace pensar en la posible existencia de un mecanismo de
regulación en la planta para limitar el número de colonizadores en su sistema radical, de
la misma manera que las leguminosas limitan el número de nódulos formados por las
cepas fijadoras de nitrógeno (Perigio y Akao, 1993).
Algunos estudios han demostrado que hay bacterias beneficiosas que no sólo
colonizan la superficie radical, sino que penetran en el interior de la raíz e incluso son
capaces de colonizar la planta de forma sistémica (Kutter et al., 2006) sin causar
enfermedades (Germaine et al., 2006), llegándose a establecer como bacterias
beneficiosas endófitas (Prieto y Mercado-Blanco, 2008). Entre ellas podemos
mencionar Azoarcus sp. BH72 (Reinhold-Hurek y Hurek, 1998), Herbaspirillum spp.
(James y Olivares, 1998) o Gluconacetobacter spp. (Sevilla et al., 2001). Ahora bien,
no hay que confundir una colonización endófita con una colonización llevada a cabo por
bacterias que quedan resguardadas en grietas o embebidas en la capa de mucílago
radical y que pueden sobrevivir tras una esterilización superficial de la raíz e imitar una
verdadera colonización endófita (Kutter et al., 2006). En este trabajo se han llevado a
cabo estudios, en condiciones axénicas y no axénicas, que demuestran que algunas

Discusión
cepas pueden colonizar de forma endófita las raíces de las plantas utilizadas, sin
producir ningún efecto patógeno a lo largo del tiempo. La verificación de esta
colonización endófita se realizó mediante el análisis de las imágenes en tres
dimensiones producidas por el CLSM en cortes radicales longitudinales de un grosor
inferior a 20 µm que permitieron la acceso a las capas internas de las células del córtex
radical, preservando la estructura en 3D de la raíz (Prieto y Mercado-Blanco, 2008). Las
cepas, M16 y CT364 en soja verde y AG9, M16 y CT364 en olivo, colonizaron
endófitamente los espacios intercelulares, formando microcolonias en disposición de
cordón, en las zonas de elongación y diferenciación celular, pero nunca en el área de
división. Una pauta similar a ésta fue encontrada para otras cepas en distintos estudios
(Lucas-García et al., 2003; Albareda et al., 2006). Diversos autores creen que la
colonización interna tiene lugar donde se produjo la colonización superficial (Reinhold-
Hurek y Hurek, 1998; Prieto y Mercado-Blanco, 2008). No obstante, la entrada masiva
de las bacterias marcadas a través de los pelos radicales de las plantas de olivo,
observada en este trabajo, ha sido corroborada por autores como Mattos et al. (2008).
Asimismo, también se ha descrito que la colonización interna puede producirse a través
de heridas o, como en algunas bacterias patógenas del género Salmonella, directamente
entre los puntos de unión del tallo con las raíces adventicias (Kutter et al., 2006). Sin
embargo, este afluencia de microorganismos puede verse regulada dependiendo de las
variables ambientales, de la edad del cultivo y del propio cultivar que dará lugar a
estructuras radicales diferentes (Kutter et al., 2006). De esta manera, la colonización
llevada a cabo por cepas endófitas nativas puede inducir unos efectos positivos mayores
en ambos organismos que los obtenidos por estirpes que únicamente colonicen de forma
superficial. La bacteria se encontraría dentro de la planta, protegida frente a los estreses
bióticos y abióticos (Roesti, 2005), compitiendo en menor medida por los nutrientes
(Reiter et al., 2002), e inducirían una mayor promoción del crecimiento (Govindarajan
et al., 2008; Khan y Doty, 2009) y/o, en su caso, protección frente a fitopatógenos y
plagas (Ji et al., 2008), ofreciendo así, un gran potencial de explotación en agricultura
(Prieto y Mercado-Blanco, 2008). Estos beneficios ya se han observado en distintas
especies de bacterianas (Mercado-Blanco y Bakker, 2007; Ali, 2009), que se han aislado
de diferentes plantas como la colza, el tomate (Nejad y Johnson 2000), el arroz
(Adhikari et al., 2001) o la soja (Kuklinsky-Sobral et al., 2004) y recientemente en el
olivo, detectando Pseudomonas endófitas en diversos tejidos vegetales y su efecto
contra el hongo Verticillium (Prieto y Mercado-Blanco, 2008). En este sentido y con la

Discusión
finalidad de aprovechar los beneficios que podrían proporcionar el uso de las bacterias
endófitas descritas en este trabajo, se deberían realizar estudios posteriores que
cuantificasen su promoción vegetal y su permanencia endófita a lo largo de periodos de
tiempo mayores.
Analizando detalladamente el proceso de colonización radical y la persistencia
en el tiempo del inóculo en los plantones de olivo, en condiciones de invernadero y de
vivero, se observó la semejanza ya comentada en los modelos de colonización, donde el
incremento del número de bacterias colonizadoras se efectúa desde la zona de división
radical hacia la de diferenciación, tres días después de la inoculación. Ahora bien, en
estos tres primeros días la colonización es principalmente dispersa, aunque ya se
encuentran numerosos pelos infectados por la cepa AG9 y, en menor medida, por la
estirpe M16 y una colonización de los espacios intercelulares de las dos anteriores y de
la cepa CT364. Esto puede sugerir que los mecanismos bacterianos que inducen la
colonización endófita, actúan de una forma más rápida y eficaz que los encargados en
organizar la colonización superficial formando microcolonias. En este corto espacio de
tiempo las microcolonias son escasas, pareciendo en un principio más importante la
infección radical interna de forma masiva que la propia colonización externa de la raíz.
Sin embargo, tras una semana, se observó una colonización superficial, localizada
principalmente en los puntos de unión de los pelos radicales con las raíces adventicias y
en las depresiones originadas por las células epiteliales de la raíz, donde forman
microcolonias en disposición de cordón. No obstante, en este punto, cabe resaltar el alto
número de pelos infectados que también presentan las cepas CT42 y CT363 que no se
habían mostrado como endófitas en las otras especies vegetales. Esto sugiere
reiteradamente que ésta zona es un sitio preferente para la entrada de microorganismos
endófitos. En cuando a la colonización superficial llevada a cabo por la cepa AG9, ésta
aún se muestra dispersa sin la formación de agrupamientos, a pesar del alto número de
pelos radicales infectados, no observándose colonización en los espacios intercelulares.
Estas circunstancias proponen que las bacterias que antes invadían esos espacios, hayan
podido emigrar hacia otras partes de la planta (Kutter et al., 2006; del Castillo, 2009),
aunque no de una forma masiva, dada la alta localización y distribución de las bacterias
en las raíces muestreadas. Finalmente, tras 15 días, visualmente no se observó descenso
en la colonización, aunque en la cepa M16 las bacterias se agruparon en mayor medida
junto o en el interior de los pelos radicales.

Discusión
La habilidad de las cepas seleccionadas para colonizar y sobrevivir en el sistema

donde son inoculadas (Naureen et al., 2005; Rodríguez-Romero et al., 2008; Ali, 2009)
así como, el efecto perjudicial o beneficioso que pueden ejercer sobre la planta a lo
largo del tiempo son de suma importancia a la hora de desarrollar comercialmente un
buen inoculante microbiano que promueva el enraizamiento de las estaquillas de olivo.
Así, desde el punto de vista cuantitativo, en los dos ensayos de permanencia realizados,
se vio una disminución en la concentración microbiana de la ectorizosfera y la rizoplana
desde el mismo momento en el que se inocularon, confirmando las experiencias
previamente descritas (Unge y Jansson, 2001; Prieto y Mercado-Blanco, 2008).
Asimismo, siempre se observaron poblaciones menores en el suelo ectorizosférico que
adheridas a la raíz, corroborando lo encontrado anteriormente en los recuentos
realizados en la rizosfera del olivar ecológico donde se llevó a cabo el aislamiento
bacteriano. Ahora bien, todas las cepas, salvo el caso de la estirpe AG9 en el vivero,
fueron capaces de persistir al menos tres meses, tanto en rizoplana como en
ectorizosfera, e incluso cepas como CT42, CT363 y M16 perduraron durante 8 meses en
el ensayo de invernadero. Esto reveló la buena persistencia rizosférica que la mayoría de
estas cepas presentan, mostrando valores comparables a los niveles publicados en otros
sistemas vegetales (Bonaterra et al., 2003; Rodríguez-Romero et al., 2008). No
obstante, las concentraciones bacterianas encontradas en condiciones de vivero fueron
inferiores a las halladas en invernadero. Esto puede deberse a que en vivero las cepas se
encuentran sujetas a las diversas condiciones climáticas que durante el ensayo tuvieron
lugar, sometidas al manejo del viverista, es decir, a la aplicación de plaguicidas,
fungicidas y fertilizantes, y además deben de competir por los sitios de unión, no sólo
con los microorganismos adheridos a la superficie de las raíces de los plantones, sino
también con los existentes en el suelo de trasplante. Todos estos inconvenientes pueden
dar lugar a una bajada en la colonización radical del inoculante (Dobbelaere et al., 2001;
Lucy et al., 2004). No obstante, para algunos autores la escasa persistencia de algunas
de las cepas nativas les hace pensar de nuevo, en la presencia en éstas de plásmidos que
provocan una elevación de la tasa energética, haciéndolas por tanto menos capaces de
persistir en la planta y de promover el crecimiento vegetal, aunque como se ha
comprobado en los diversos ensayos de interacción planta-microorganismo no siempre
existe esta correlación. De hecho, el gran descenso poblacional producido en el
tratamiento de la cepa AG9 en el ensayo de vivero, se sugiere que pudo deberse a
diversos motivos: una no aclimatación al nicho ecológico donde se inoculó, una mayor

Discusión
susceptibilidad al manejo del cultivo por el viverista (plaguicidas, fertilizantes,…) o

simplemente ser poco competitiva con respecto al resto de los microorganismos
rizosféricos, ya que hay que recordar que esta cepa no fue aislada de un ambiente
rizosférico. Además, en el ensayo de invernadero se observó una caída menos
pronunciada de esta cepa, quizás por ser éste un nicho al que pudo adaptarse mejor,
dadas las condiciones climáticas más constantes y la menor existencia de competidores
radicales.
En cuanto al seguimiento llevado a cabo para evaluar el efecto de la inoculación
de las bacterias seleccionadas sobre las plantas de olivo a lo largo del tiempo, hay que
resaltar la ausencia de efectos perjudiciales en todos los casos, destacando la promoción
del crecimiento vegetal significativamente superior al resto de tratamientos llevada a
cabo por la cepa AG9 en la variedad arbequina. Este resultado confirma, a pesar de lo
comentado en cuanto a persistencia de la cepa AG9, su gran valía como bacteria
promotora del crecimiento vegetal. Este efecto promotor del inóculo a bajas
concentraciones ha sido descrito previamente por otros autores (Bonaterra et al., 2003;
Rodríguez-Romero et al., 2008), afirmando que en promoción de crecimiento posee
mayor importancia el establecimiento bacteriano inicial por adhesión que la persistencia
a lo largo del tiempo (Jacoud et al., 1998). Asimismo, no hay que olvidar el efecto
beneficioso que, como se comentó, puede proporcionar una colonización bacteriana
endófita. Ahora bien, con el objetivo de valorar los efectos sobre la promoción vegetal a
lo largo del tiempo podría proponerse como medida para aumentar la adhesión y
persistencia de estas cepas en condiciones de vivero, la aplicación de las mismas a
través de una formulación adecuada (Chebotar y Kang, 2003) que les proporcione un
microambiente que asegure sus supervivencias en el sustrato/suelo (Bashan et al.,
2008), aunque tanto sus persistencias como sus establecimientos radicales siempre serán
dependientes de las condiciones bióticas y abióticas del sustrato/suelo donde se inoculen
(Costa et al., 2006). Por ello, también resultaría interesante la inoculación de consorcios
que contengan microorganismos con diferentes propiedades funcionales o ecológicas, o
bien actividades complementarias, que se adapten no sólo a un único hospedador o a
unas ideales condiciones agroclimáticas (Roesti, 2005).

Conclusiones
Conclusiones
1. El laboreo, como manejo agrícola, proporciona una mayor diversidad de

bacterias con capacidades promotoras de crecimiento, que la cubierta dirigida o
espontánea.
2. Las cepas CT33, CT42, CT348, CT357, CT363, CT364, CT387, AG13, M16 y,
en menor grado, CT285 y CT402, identificadas mediante el análisis del ARNr
16S pueden constituir nuevas especies bacterianas.
3. La utilización de las plantas modelo Vigna sp. y Brassica napus permite

establecer una correlación directa entre los resultados obtenidos en condiciones
axénicas y de vivero.
4. Las cuatro variedades de olivo empleadas (arbequina, hojiblanca, picual y

koroneiki) enraízan de manera eficaz y eficiente tras la aplicación de bacterias
promotoras del crecimiento vegetal, pudiendo constituir este procedimiento una
alternativa al uso de hormonas sintéticas en el método de producción ecológica y
una solución a la propagación de variedades difíciles de enraizar.
5. Las tres formas de inoculación empleadas en los ensayos de enraizamiento de

estaquillas semileñosas de olivo proporcionan buenos resultados, constituyendo,
actualmente, el inoculante sólido la forma más viable desde el punto de vista
comercial.
6. La capacidad de producir auxinas junto a la actividad de la enzima ACC

desaminasa, ambas en proporciones adecuadas, sitúan a la cepa AG9 como la
más versátil y eficaz tanto en las plantas modelo como en todas las variedades de
olivo estudiadas.
7. Las cepas bacterianas CT42, CT363, CT364, AG9 y M16 colonizan de forma
endófita y no patógena las raíces del olivo.

Bibliografía
Bibliografía
Abbas-Zadeh, P., Saleh-Rastin, N., Asadi-Rahmani, H., Khavazi, K., Soltani, A.,
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Apéndice
Apéndice I. Características de la colección PGPR aislada de la rizosfera del olivo y del agua de riego.
AIA
Cepa Origen Crecimiento Gram Morfología Esporas Color Colonia Fósforo Sideróforos ACC*
(ppm)
CT1 RCD Rápido - Bacilo largo No Rosa 0,0 + + n.e.
CT2 SCD Rápido - Bacilo No Amarilla clara 1,4 ± 0,4 + + n.e.
CT6 RCD Rápido + Bacilo Sí Blanca 0,0 + No n.e.
CT7 SCD Rápido + Bacilo Sí Blanca 0,0 + No n.e.
CT9 RL Rápido + Bacilo No Blanca 1,0 ± 0,9 + No n.e.
CT12 SOLIVE Lento + Bacilo grande Sí Blanca 0,0 + No n.e.
CT15 SOLIVD Rápido + Bacilo Sí Blanca 6,7 ± 2,3 No No n.e.
CT18 SOLIVD Rápido + Coco pequeño No Blanca 8,2 ± 5,7 No No n.e.
CT20 SOLIVL Rápido + Bacilo grande Sí Blanca 1,2 ± 0,7 + No n.e.
CT22 RL Rápido - Coco No Blanca 2,2 ± 1,4 + + n.e.
CT25 SOLIVL Rápido - Bacilo No Blanca Transl. 5,3 ± 2,1 No No n.e.
CT30 RL Rápido - Cocobacilo No Blanca 2,0 ± 0,9 + +++ n.e.
Apéndice
CT31 SL Rápido + Bacilo Sí Blanca 4,2 ± 3,4 + No n.e.
CT32 SL Rápido - Bacilo No Amarilla clara 0,0 No ++ n.e.

251
252
Crecimiento Gram AIA ACC*

Cepa Origen Morfología Esporas Color Colonia Fósforo Sideróforos
(ppm)
Apéndice
CT33 SL Rápido - Bacilo largo No Blanca 72,8 + 11,7 ++ ++++ 1325 ± 176,8
CT34 SCD Rápido + Bacilo No Blanca 0,0 No + n.e.
CT36 SL Rápido - Bacilo No Naranja 5,0 ± 4,5 No + n.e.
CT37 SL Rápido - Bacilo No Naranja 0,0 No + n.e.
CT38 SL Rápido - Bacilo No Blanca 0,0 ++ + n.e.
CT40 SL Rápido - Bacilo No Blanca 58,3± 0,1 + + n.e.
CT41 SL Rápido - Bacilo No Amarilla 2,0 ± 1,4 + + n.e.
CT42 SL Rápido - Bacilo No Blanca 55,1 + 10,4 + + 0,0
CT45 SL Rápido + Bacilo No Blanca 7,8 ± 6,1 + + n.e.
CT47 SL Rápido - Bacilo No Blanca 0,0 + +++ n.e.
CT48 SCE Rápido - Bacilo No Blanca 8,9 ± 5,3 + No n.e.
CT51 SCD Rápido - Bacilo No Blanca 0,0 No + n.e.

CT53 SCD Rápido - Bacilo No Amarilla 0,0 + + n.e.
CT58 SCD Rápido - Bacilo No Amarilla 0,0 + No n.e.

Crecimiento Gram AIA ACC*

Cepa Origen Morfología Esporas Color Colonia Fósforo Sideróforos
(ppm)
CT60 SCD Rápido - Bacilo pequeño No Blanca 0,0 ++ + n.e.
CT64 SCE Rápido - Bacilo No Amarilla clara 5,8 ± 2,7 + ++ n.e.
CT68 SL Rápido - Bacilo No Blanca 1,9 ± 1,2 + ++ n.e.
CT69 SL Rápido - Bacilo No Blanca 2,6 ± 2,1 + +++ n.e.
CT71 SOLIVL Rápido - Bacilo No Blanca 8,8 ± 8,1 No No n.e.
CT72 SCE Rápido - Cocobacilo No Blanca 3,5 ± 2,1 No No n.e.
CT73 SL Rápido + Coco No Blanca 27,4 ± 0,1 No No n.e.
CT79 SOLIVL Rápido - Bacilo No Beige 5,2 ± 1,3 No No n.e.
CT80 RCE Rápido - Bacilo No Amarilla 3,5 ± 1,7 No No n.e.
CT81 SL Rápido - Bacilo No Blanca 3,7 ± 1,7 + No n.e.
CT82 SL Rápido - Bacilo No Blanca 2,5 ± 2,0 + ++ n.e.
CT83 RL Lento - Bacilo No Blanca 0,0 No + n.e.
Apéndice
CT84 RL Rápido - Bacilo No Blanca 2,2 ± 1,8 + + n.e.
CT87 SOLIVL Lento + Coco No Blanca 6,5 ± 2,3 No No n.e.

253
254
Crecimiento Gram Morfología AIA ACC*

Cepa Origen Esporas Color Colonia Fósforo Sideróforos
(ppm)
Apéndice
CT90 RCE Rápido + Bacilo grande Sí Blanca 3,5 ± 1,2 No No n.e.
CT99 RL Rápido + Bacilo No Blanca 5,3 ± 0,9 No No n.e.
CT115 SL Rápido - Bacilo No Blanca 0,0 + No n.e.
CT117 SL Rápido + Bacilo No Blanca 0,0 + No n.e.
CT118 SL Rápido - Bacilo No Amarilla 0,0 + ++ n.e.
CT133 RCD Lento + Bacilo No Amarilla 4,1 ± 2,0 + + n.e.
CT137 RCE Rápido + Bacilo No Beige 5,2 ± 1,3 No No n.e.
CT148 SL Rápido - Bacilo No Amarilla 0,0 + ++ n.e.
CT154 RCE Lento - Bacilo No Blanca 0,0 + No n.e.
CT155 RL Rápido - Bacilo No Blanca 3,0 ± 1,4 + + n.e.
CT156 RCD Lento - Bacilo No Blanca 0,0 + + n.e.
RCD Rápido + Bacilo No Blanca 0,0 No + n.e.

CT157
CT160 RCE Lento - Bacilo No Blanca 0,0 + No n.e.
CT164 RCE Rápido - Bacilo No Blanca 4,3 ± 1,5 No + n.e.

AIA
(ppm)
CT166 RL Rápido + Bacilo No Beige 1,3 ± 0,3 No + n.e.
CT167 RCE rápido - Bacilo No Blanca Transl. 3,0 ± 1,2 + + n.e.
CT168 RL Rápido - Cocobacilo No Amarilla 0,0 No + n.e.
CT169 RL Rápido - Bacilo No Blanca 4,3 ± 1,8 + No n.e.
CT174 RL Rápido + Bacilo Sí Blanca 8,5 ± 3,2 No No n.e.
CT177 RL Rápido - Bacilo No Blanca 0,0 ++ No n.e.
CT182 RCE Rápido + Bacilo No Blanca 7,8 ± 2,5 No + n.e.
CT184 SL Rápido + Bacilo Sí Blanca 4,0 ± 2,2 No ++ n.e.
CT186 RL Rápido - Bacilo No Blanca 2,4 ± 0,6 No No n.e.
CT188 SCD Rápido + Bacilo No Amarilla 1,9 ± 0,2 No No n.e.
CT192 SL Rápido - Bacilo No Beige transl. 0,0 + + n.e.
Apéndice
CT193 SOLIVD Rápido + Bacilo pequeño No Amarilla 3,0 ± 2,1 No No n.e.
CT194 SL Rápido - Cocobacilo No Amarilla 50,3 + 5,1 ++++ + 0,0
CT195 RCE Rápido - Bacilo pequeño No Beige 1,0 ± 0,3 No + n.e.

255
256
AIA
(ppm)
Apéndice
CT198 SOLIVD Rápido + Bacilo Sí Blanca 0,0 + No n.e.
CT202 RL Rápido - Bacilo pequeño No Blanca 4,2 ± 0,7 + ++++ n.e.
CT203 RL Rápido + Bacilo No Blanca 1,0 ± 0,2 No No n.e.
CT204 RL Rápido - Cocobacilo No Beige 1,9 ± 0,3 No ++++ n.e.
CT205 RL Rápido + Bacilo No Beige 3,8 ± 3,1 No ++++ n.e.
CT208 RCD Rápido - Coco No Blanca 1,47 ± 0,8 No + n.e.
CT209 RCE Rápido - Bacilo No Blanca 8,6 ± 7,1 No No n.e.
CT210 RCE Lento - Bacilo pequeño No Beige 2,0 ± 0,3 No No n.e.
CT211 RCD Rápido - Bacilo No Amarilla 1,82 ± 0,1 No No n.e.
CT214 RCD Rápido - Bacilo pequeño No Blanca 1,9 ± 0,3 + ++++ n.e.
CT223 SCD Rápido - Bacilo No Blanca 7,0 ± 1,8 No No n.e.

CT234 SCD Rápido - Bacilo pequeño No Beige 3,1 ± 1,2 + + n.e.
CT237 SL Rápido - Bacilo No Blanca 4,0 ± 2,2 + + n.e.
CT241 SL Rápido + Bacilo No Blanca 5,2 ± 2,3 No + n.e.

AIA
(ppm)
CT242 SCD Rápido - Bacilo No Beige 14,4 ± 3,7 ++ ++++ n.e.
Bacilo n.e.
CT246 SL Rápido - No Blanca 3,3 ± 1,7 + ++
Bacilo n.e.
CT247 SL Rápido + Sí Beige 2,0 ± 1,1 No No
CT248 SCE Rápido - Bacilo largo No Naranja 0,0 No + n.e.
CT250 SL Rápido + Bacilo pequeño No Blanca 15,5 ± 7,1 No ++ n.e.
CT266 RCE Rápido - Bacilo pequeño No Blanca 1,3 ±0,3 No No n.e.
CT271 RCE Rápido - Bacilo No Beige 0,0 + + n.e.
CT274 RL Rápido + Bacilo No Blanca 10,0 ± 5,8 + + n.e.
CT275 RL Rápido - Bacilo pequeño No Beige 4,1 ± 2,3 + +++ n.e.
CT276 RL Rápido + Cocobacilo pequeño No Blanca 58,1 ± 8,3 No No 0,0
0,0 n.e.
CT277 RL Rápido - Bacilo No Beige + +
0,0 n.e.
CT278 RCE Rápido - Bacilo No Blanca No +
Apéndice
0,0 n.e.
CT280 RL Rápido - Bacilo No Blanca + +
Bacilo 0,0 n.e.
CT283 RL Rápido - No Blanca + No
257
258
AIA
(ppm)
Apéndice
Bacilo n.e.
CT284 RL Rápido - No Blanca 3,4 ± 1,7 No ++
CT285 RL Rápido + Cocobacilo grande No Blanca 72,6 ± 20,1 No No 0,0
CT293 RL Rápido - Bacilo No Beige 2,3 ± 2,0 + No n.e.
0,0 n.e.
CT304 SOLIVD Rápido + Coco No Rosa + No
CT306 RL Rápido - Cocobacilo No Beige 0,0 ++ No n.e.
CT309 SOLIVL Rápido - Bacilo No Blanca 37,5±10,2 No No n.e.
CT314 SCD Rápido - Cocobacilo No Amarilla 0,0 + ++++ n.e.
CT315 SCE Rápido - Bacilo No Beige 7,1 ± 3,4 + +++ n.e.
CT317 RCE Rápido - Bacilo pequeño No Beige 20,1±10,4 No No n.e.
CT319 SL Rápido - Coco No Blanca 22,3 ± 4,8 No No n.e.
CT320 SCE Rápido - Coco No Blanca 30,4 ± 8,9 + No n.e.
0,0
CT321 SCE Rápido - Coco No Amarilla + ++ n.e.
0,0 n.e.
CT323 SCD Rápido - Bacilo No Amarilla + ++++
CT324 SCD Rápido - Coco No Blanca 32,3±12,1 No No n.e.

AIA
(ppm)
CT328 SCE Rápido - Cocobacilo No Amarilla 0,0 + ++ n.e.
CT329 SCD Rápido - Bacilo No Amarilla 3,1 ± 1,5 + ++++ n.e.
CT331 SCD Rápido + Bacilo No Amarilla 6,3 ± 2,1 No No n.e.
CT332 SCE Rápido - Bacilo pequeño No Blanca 10,0 ± 4,5 No No n.e.
CT333 SCD Rápido - Bacilo pequeño No Amarilla 7,4 ± 3,4 + ++++ n.e.
CT334 SCD Rápido - Bacilo No Amarilla 0,0 + + n.e.
Amarilla 0,0 n.e.

CT335 SCD Rápido - Cocobacilo No + +
CT340 SL Rápido + Bacilo Sí Blanca 0,0 + ++++ n.e.
CT341 SCE Rápido - Bacilo No Amarilla clara 16,0 ± 10,6 No + n.e.
CT344 SCE Rápido + Bacilo Sí Blanca 3,4 ± 1,8 + No n.e.
CT345 SCE Rápido + Bacilo No Beige 6,3 ± 1,5 No No n.e.
CT348 SCD Rápido - Bacilo No Naranja 13,6 ± 5,0 No ++ 0,0
Apéndice
Bacilo 0,0 n.e.
CT350 SCE Rápido - No Blanca transl. ++ +
Bacilo 0,0 n.e.

CT351 SCD Rápido - No Blanca transl. + +
259
260
AIA
Apéndice
(ppm)
CT353 RCE Rápido + Bacilo No Beige 5,2 ± 4,1 + ++ n.e.
CT355 SCE Rápido - Bacilo No Amarilla 2,0 ± 1,1 No No n.e.
Bacilo 0,0
CT357 RL Rápido - No Beige 25,4 ± 10,8 + ++
Bacilo + n.e.
CT358 RL Rápido - No Beige 4,0 ± 1,3 +
Bacilo n.e.
CT359 RL Rápido - No Amarilla 3,8 ± 1,9 No No
CT362 RL Rápido - Bacilo pequeño No Amarilla 10,3 ± 9,1 No ++++ n.e.
CT363 RL Rápido - Bacilo No Amarilla clara 12,1 ± 3,4 ++ +++ 0,0
CT364 RL Rápido - Bacilo largo No Blanca transl. 45,2 ± 13,1 + +++ 0,0
CT365 RL Rápido - Bacilo No Beige 10,0 ± 4,7 ++ ++ n.e.
CT367 RL Rápido - Coco No Amarilla clara 0,0 + ++ n.e.
CT368 RL Rápido - Cocobacilo No Amarilla 0,0 No ++++ n.e.

CT372 RL Rápido - Bacilo No Beige 0,0 + No n.e.
CT375 SCE Rápido - Bacilo No Blanca transl. 0,0 ++ ++ n.e.
CT379 RL Rápido + Coco grande No Beige 0,0 + No n.e.

AIA
(ppm)
Bacilo 0,0
CT387 SL Rápido - No Blanca 20,5 ± 1,5 ++ +++
CT388 SL Rápido - Bacilo No Blanca 1,1± 0,8 + ++ n.e.
Bacilo 0,0 n.e.

CT389 SL Rápido - No Amarilla + No
Bacilo 0,0 n.e.

CT393 RCE Rápido - No Amarilla + ++
Bacilo 0,0 n.e.

CT399 SL Rápido - No Blanca ++ +
CT402 SCD Rápido + Coco No Blanca 83,7 ± 21,2 No No 0,0
CT403 SCD Rápido - Bacilo No Amarilla clara 0,0 No + n.e.
CT405 RL Rápido - Bacilo No Beige 4,7 ± 3,1 ++ ++++ n.e.
Bacilo 0,0 n.e.

CT407 RL Rápido - No Naranja + No
Bacilo 0,0 n.e.

CT409 RL Rápido - No Amarilla No +
CT410 RL Rápido + Coco No Blanca 21,9 ± 7,8 + No n.e.
CT411 RCD Rápido - Cocobacilo No Beige 4,1 ± 1,8 + ++++ n.e.
Apéndice
CT414 RCD Rápido - Bacilo No Amarilla 0,0 + ++++ n.e.
CT415 RL Lento - Coco No Amarilla 13,2 ± 0,8 No No n.e.

261
262
AIA
Apéndice
(ppm)
CT416 RCE Lento - Coco No Blanca 20,0 ± 8,3 + No n.e.
CT424 RCD Lento - Bacilo pequeño No Blanca 13,2 ± 0,8 + No n.e.
CT428 SCD Rápido - Bacilo grande No Blanca 0,0 No + n.e.
CT430 RL Rápido - Bacilo No Beige 2,0 ± 1,2 + ++++ n.e.
CT431 RL Rápido - Bacilo No Blanca 4,7 ± 2,3 ++ ++++ n.e.
CT432 RL Rápido - Bacilo No Blanca 1,0 ± 0,4 + ++++ n.e.
CT442 RL Rápido - Bacilo pequeño No Beige 1,2 ± 0,3 No No n.e.
CT446 SL Rápido - Coco No Blanca 0,0 + No n.e.
CT457 SCD Lento - Bacilo No Beige 17,0 ± 3,8 + + n.e.
CT459 RL Rápido - Bacilo No Blanca 0,0 + + n.e.
CT462 RCE Rápido + Bacilo No Blanca 0,0 + + n.e.
CT465 SL Rápido - Cocobacilo No Beige 31,6 ± 1,8 No No n.e.

Montero-Calasanz, M.C
CT466 SL Rápido - Bacilo No Beige 2,8 ± 1,2 + + n.e.
CT470 SL Rápido - Bacilo No Blanca 0,0 + + n.e.

261
Montero-Calasanz M.C
AIA
(ppm)
CT483 RCD Rápido - Bacilo No Beige 0,0 + + n.e.
Bacilo n.e.
CT484 SL Rápido + No Blanca 11,5 ± 6,1 No +
CT491 RCE Rápido + Bacilo No Amarilla 7,2 ± 3,3 No No n.e.
CT496 SCD Rápido - Cocobacilo No Amarilla 0,0 No +++ n.e.
CT500 SCE Lento - Bacilo No Amarilla 0,0 No ++++ n.e.
CT506 SL Lento - Bacilo No Amarilla 0,0 No + n.e.
AG9 AR Rápido - Bacilo No Amarilla 21,6 ± 15,2 No + 320,0 ± 174,4
AG13 AR Rápido - Bacilo No Naranja 7,4 ± 2,3 No No 0,0
AR: agua de riego. SL: suelo rizosférico de la parcela de laboreo. RL: fracción rizoplánica de la parcela de laboreo. SOLIVL: suelo libre de la parcela de laboreo.
SCD: suelo rizosférico de la parcela con cubierta dirigida. RCD: fracción rizoplánica de la pacerla con cubierta dirigida. SOLIVD: suelo libre de la parcela con
cubierta dirigida SCE: suelo rizosférico de la parcela con cubierta espontánea. RCE: fracción rizoplánica de la parcela con cubierta espontánea. SOLIVE: suelo libre
de la parcela con cubierta espontánea. Los valores son media de 3 repeticiones ± la desviación típica. Diámetro del halo de hidrólisis: + (1-3cm), ++ (4-6 cm), +++
(7-9 cm), ++++ (> 9 cm). No: negativo. Sí: positivo. n.e.: no evaluado. Transl.: Transl. * nmol α-cetobutirato/mg de proteína/h.
Apéndice
263

Tesis Propagacion de Estacas PDF

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Inducción del enraizamiento en estaquillas de olivo mediante el empleo de

bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR)

Inducción del enraizamiento en

Inducción del enraizamiento en

Mª del Carmen Montero Calasanz

Inducción del enraizamiento en estaquillas de

Memoria presentada por la Licenciada en Biología Mª del Carmen Montero Calasanz

Inducción del enraizamiento en estaquillas de

Memoria realizada en el Área de Producción Ecológica y Recursos Naturales del

Fdo.: María Camacho Martínez-Vara de Rey Fdo.: Manuel Megías Guijo

Fdo.: Mª del Carmen Montero Calasanz

Fernando Romero Muñoz, Director del Centro IFAPA Las Torres-Tomejil,

CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral titulada “Inducción del enraizamiento en

Alcalá del Río, 9 de mayo de 2011

Tenemos el placer de informarle de que

Harry Potter y la Piedra Filosofal. Capitulo 4.

… y por fin terminé la Tesis!!

1. El cultivo del olivo ................................................................................... 3

4.3.2. Selección de cepas ...................................................................... 38

II. Objetivos ...................................................................... 43

III. Materiales y métodos ................................................ 47

1. Material biológico .................................................................................... 49

4.3.2. Tampón de carga ........................................................................ 63

7.3.2. Determinación de la concentración y la calidad de ADN .......... 71

IV. Resultados .................................................................. 93

1. Colección bacteriana ............................................................................... 95

1.1.2. Caracterización basada en técnicas moleculares ........................ 101

3.3.4. Efecto de la inoculación bacteriana sobre plantas de olivo a lo

V. Discusión ...................................................................... 169

1. Colección bacteriana ................................................................................ 172

VI. Conclusiones .............................................................. 203

VII. Bibliografía ............................................................... 207

VIII. Apéndice .................................................................. 249

1.1. Visión global del cultivo del olivo ............................................................ 3

3.2. Parcela con cubierta dirigida ..................................................................... 65

4.6. Distribución de los aislamientos según zona de muestreo y manejo de

4.15. Árbol filogenético construido mediante el método de ML (modelo

4.28. Enraizamiento producido en la bandeja inoculada con la cepa Cd en la

I.1. Superficie ocupada por las principales variedades de olivo cultivadas en

V.9. Cuantificación de las bacterias adheridas a las semillas y a las raíces en

IV.20. Comparación del efecto producido por los tratamientos bacterianos

A Cepas productoras de AIA

a.C. Antes de Cristo

AC Usada para obtención de aceite

ADN Ácido desoxirribonucleico

ADNr Ácido desoxirribonucleico ribosomal

AIA Ácido indolil-3-acético, ácido indolacético

AIB Ácido indol butírico

AM Fungi Hongo micorrícico arbuscular

ANOVA Análisis de la varianza

APS Solución de Persulfato de Amonio

BNI Fijación Biológica de Nitrógeno

C. Comunidad, cubierta (Figura 4.6. y 4.7.)

CCC Coeficiente de Correlación Cofenética

CE Suelo rizosférico de la parcela con cubierta espontánea

CD Suelo rizosférico de la parcela con cubierta dirigida

CLSM Microscopio Confocal de Escaneo Láser

COI Comité Oleícola Internacional

CRAE Consejo Regulador de la Agricultura Ecológica

Dcuello Diámetro de cuello

DGGE Electroforesis en Gel con Gradiente de Agentes

DNTPs Desoxirribonucleótidos Trifosfatos

DOCE Diario Oficial de la Unión Europea