INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO DE GENÉTICA MICROBIANA

PRÁCTICA:
CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y FÍSICA DE DNA RECOMBINANTE

ALUMNOS:
VALDES ORTIZ ALVARO A.
RUIZ RAMIREZ BRIAN GIOVANNI
GRUPO:
5QV2

EQUIPO:
12

SECCIÓN:
2

FECHA DE ENTREGA:
08/06/2018
 OBJETIVOS
 Obtener DNA de doble cadena de los plásmidos recombinante y no recombinante derivados del
pCR2.1-TOPO.
 Obtener células competentes de E. coli y transformarlas.
 Diferenciar un vector recombinante de uno no recombinante por pruebas fenotípicas y de
restricción.

RESULTADOS

Tabla1. Caracterización fenotípica del DNA recombinante y no recombinante.

Equipo T1 T1 T2 T3 T4 T5
(L) (L+Amp) Azules Blancas Azules Blancas Azules Blancas Azules Blancas
7 Césped SC 4+ 1+ 3+ 1+ 3+ 1+ 3+ 1+
8 Césped SC 3+ 1+ 3+ 1+ 2+ 3+ - 4+
9 Césped SC - 1+ 3+ 4+ 1+ 4+ - 4+
10 Césped SC 3+ 1+ 4+ - 1+ 3+ - 4+
11 Césped SC 4+ - 4+ - - 4+ - 4+
12 Césped SC 3+ 1+ 3+ 2+ - 4+ - 4+
SC= sin crecimiento (-)= ausentes
El número de cruces (+) representa la cantidad de crecimiento presente en la placa para cada tubo.

Figura 2. Placa del tubo 1 Figura 3. Placa del tubo 2

Figura 1. Placa del
(L+Amp). (L+Amp+Xgal).
tubo 1 (L).
 Figura 4. Placa del tubo 3 Figura 5. Placa del tubo 4 Figura 6. Placa del tubo 5
(L+Amp+Xgal). (L+Amp+Xgal). (L+Amp+Xgal).

7 7 8 9 9 10 11 12

ʎ T TE TB Ta TaE TaB TE TB

8 10 7 8 9 10 11 12

λ T Ta TaE TaB TE TB TaE TaB

Figura 7. Caracterización física del DNA recombinante y no recombinante. Se utilizó como

marcador de peso molecular al DNA del Fago λ digerido con la enzima de restricción Hind III.
Se utilizaron los vectores digeridos y no digeridos con enzima de restricción de los diferentes
equipos de la sección. T (pCR2.1-TOPO), TE (pCR2.1-TOPO+Eco RI), TB (pCR2.1-TOPO+Bam
HI), Ta (pCR2.1-TOPO-ape), TaE (pCR2.1-TOPO-ape+Eco RI), TaB (pCR2.1-TOPO-ape+Bam HI).
Figura 8. Caracterización teórica física del DNA recombinante (TOPO-pep) y no recombinante
(TOPO), usando enzimas de restricción Eco RI y Bam HI.

Tabla 2.-Tamaños moleculares del perfil de restricción teórica del DNA recombinante y no
recombinante, usando las enzimas de restricción EcoRI y BamHI
 2.8
2.6
2.4
DISTANCIA RECORRIDA (cm)
2.2
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5
LOG TAMAÑO MOLECULAR

Figura 9. Gráfica de migración de los fragmentos del DNA del Fago λ digeridos con la enzima
de restricción Hind III (Marcador de Tamaño Molecular).

Tabla 3. Tamaños moleculares de los fragmentos resultantes de la digestión con las enzimas
de restricción Eco RI y Bam HI obtenidos por interpolación en la gráfica del marcador molecular.
Distancia de
VECTOR migración Tamaño (pb)
(cm)
2 4361
T
2.4 2630
2 4361
TE
2.4 2630
TB 2.1 4226
2.2 3388
Ta
1.7 7413
TaE 1.8 6557
TaB 2 4361
T= pCR2.1-TOPO TE= pCR2.1-TOPO + Eco RI TB= pCR2.1-TOPO + BamHI
Ta= pCR2.1-TOPO-ape TaE= pCR2.1-TOPO-ape + Eco RI TaB= pCR2.1-TOPO-ape + BamHI
Figura 10. Sitios de corte para las enzimas de restricción EcoRI y BamHI, el vector superior
corresponde al DNA no recombinante y el inferior a al DNA recombinante.

DISCUSIÓN
En la transformación de las células competentes con los plásmidos pCR2.1-TOPO y pCR2.1-TOPO-
ape se esperaba que el tubo 1 en todos los equipos hubiera crecimiento ya que esta placa contenía
medio L sin ampicilina, lo cual resulto como se esperaba de acuerdo a nuestros resultados.
Al cultivar las células competentes del tubo 1 en medio L + Amp, no crecieron colonias debido a que
E. coli DH10B es sensible a la ampicilina (Amp), por lo tanto, se inhibe su crecimiento en el medio.
En el Tubo 2 el cual contenía células competentes y el vector pCR2.1-TOPO (3µL) al sembrar en un
medio con ampicilina y X-gal se esperaba que todas las colonias fuesen de color azul, el vector TOPO
contiene un caset de resistencia a la ampicilina, lo cual permitiría a las células transformadas con el
plásmido poder crecer en este medio. La bacteria al tener en el cromosoma a lac ZΩ que codifica para
el extremo carboxilo terminal de la β-galactosidasa y el vector TOPO a lac Zα que codifica para el
extremo amino terminal de la β-galactosidasa se llevará a cabo la α-complementación haciendo
funcional a la β-galactosidasa que será capaz de utilizar al X-gal como sustrato separándolo en
galactosa y 5-bromo-4Cloro-3-hidroxindol el cual posteriormente se oxida generando un compuesto
insoluble de color azul que es característico de las colonias que realizaron esta alfa complementación,
en algunos equipos se obtuvieron colonias de color blanco lo cual no significa que no se sintetice la β-
galactosidasa, esto puede deberse a que en el momento de agregar el X-gal, si este no se dispersó
de manera adecuada en el medio, se generarían algunas zonas donde su concentración sería mayor
que en otras, lo cual esto pudo producir colonias de color blanco por falta de este, ya que pudieron
utilizar a la glucosa como sustrato en lugar del X-gal. En el equipo 9 se observa que no hubo
crecimiento de ningún tipo de colonia (azul ni blanca), lo cual podría deberse a un error aleatorio, que
sería por falta de inoculo en el medio.
En el Tubo 3 que contenía células competentes y el vector pCR2.1-TOPO (5 µL) en mayor proporción
al tubo anterior se esperaba una mayor proporción en las colonias de color azul, ya que como el vector
estaba en mayor cantidad con respecto al tubo 2 las células competentes podrían incorporarlo con
mayor probabilidad que en el tubo 2.
En el tubo 4 y 5 contenía células competentes y el vector pCR2.1-TOPO-ape (3 y 5µL
respectivamente), que a diferencia de los tubos 2 y 3 se esperaba que las colonias fuesen de color
blanco, debido a que el vector TOPO-ape contiene dentro del gen lac Zα una secuencia polylinker en
la cual se le incorporo un inserto de 1.2kb (gen estructural que codifica para la aminopeptidasa del
Hongo Ustilago maydis), cuando se introduce un inserto en este sitio el gen (lac Zα) que codifica para
el extremo amino terminal de la - galactosidasa es interrumpido, y por lo tanto, no hay alfa
complementación lo cual evita la hidrolisis del X-gal teniendo así colonias blancas, de acuerdo a
nuestros resultados se obtuvieron en mayor proporción colonias blancas que azules, donde no se
evidencia esta proporción es en el equipo 7, aquí tienen mayor proporción de colonias azules en las
cajas sembradas del tubo 4 y 5, lo cual pudo deberse a una contaminación con el vector no
recombinante con el recombinante o incluso que al momento de la transformación se usara únicamente
al vector TOPO, o que en algunos casos puede haber pérdida del inserto y en vez de tener un vector
TOPO-ape tener un TOPO dentro de las células.
Para estos experimentos no se utilizó un inductor como el IPTG ya que la cepa que se utilizó (E. coli
DH10B) presenta una deleción en el del lac I (ΔlacX74) que codifica para el represor del operón Lac
por lo tanto la transcripción de los genes estructurales de este operón sería constitutiva. Para que
pudiera existir la α-complementación era necesario que el gen lacZα no estuviera presente en el
cromosoma de la bacteria o bien que se encontrara noqueado como es el caso de la cepa utilizada
(φ80lacZΔM15).
En la electroforesis se esperaba que en los carriles donde se agregó a Topo y Topo-ape se mostrara
solo una banda ya que no fue tratado con ninguna enzima de restricción, sin embargo para Topo se
obtuvieron 2 bandas de 4631 y 2630 (pb) y para Topo-ape 3388 y 7413 (pb).
En el caso de Topo podría deberse a una contaminación generando una banda de 2630 y la banda
que correspondería a nuestro vector sería la de 4631. Para Topo-ape la banda de 3388 correspondería
a nuestro vector y la otra podría indicar que hubo una contaminación con alguna enzima de restricción,
ocasionando que 2 vectores se unieran dando una banda de casi del doble de tamaño.
En el carril de Topo + Eco RI se esperaba 2 fragmentos de tamaño 17 y 3891 (pb) ya que el vector
Topo contiene 2 sitios de corte para Eco RI, el fragmento de 17 pb no se espera visualizar en la
electroforesis pues es muy pequeño y migraría muy rápido en el gel, sin embargo obtuvimos 2
fragmentos de 4361 y 2630 similares al del Topo sin digerir esto puede deberse a que el equipo 7
coloco la misma muestra para ambos carriles por lo cual las bandas son muy similares.
En el carril Topo-ape + Eco RI se esperaban fragmentos de 1,200 y 3,908 (pb), donde el de 1200
correspondería al gen que codifica para aminopeptidasa (peso de 1.2 kb) el cual se visualizarían en la
electroforesis, en la práctica obtuvimos una banda de 6557 que podría representar una posiblemente
unión de 2 vectores formando un dímero de este tamaño.
En el carril Topo + Bam HI se espera solo 1 banda pues este vector solo tiene un sitio de corte para
Bam HI a diferencia de Eco RI que tiene 2 sitios de corte por lo cual genera 2 bandas, nosotros
obtuvimos un fragmento de 4226(pb) por lo que podemos inferir que corresponde a nuestro vector.
En el carril con Topo-ape + Bam HI se esperan 2 bandas pues el vector tiene 1 sitio de corte sin
embargo el gen para la aminopeptidasa contiene otro sitio Bam HI por lo cual se generarían 2 bandas
una de 4528 y otra de 580 (pb), sin embargo obtuvimos una de 4361, lo cual podría indicar solo la
presencia de nuestro vector.
CONCLUSIONES
 Se consiguió aislar DNA de doble cadena de los plásmidos recombinantes y no recombinantes
derivados del pCR2.1-TOPO por el método de lisis alcalina, lo cual se evidencio con la
restricción de los plásmidos y la transformación en E. coli DH10B.
 Se obtuvieron células competentes de E. coli usando CaCl2 y aplicando un choque térmico para
su transformación empleando el plásmido recombinante y no recombinante.
 Se puso en evidencia a los vectores recombinantes y no recombinantes por pruebas fenotípicas
usando la alfa complementación.
REFERENCIAS

1. Casdaban, M. and Cohen, S. (1980) J Mol Biol 138:179 PMID 6997493.

2. Grant, S.G.N. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4645-4649 PMID 2162051.
3. E. coli Genetic Stock Center, MC1061 Record.
4. DH10B Genome Sequencing Project, Baylor College of Medicine.
5. file:///C:/Users/braya_000/Downloads/Restricciones_2018.pdf
6. https://www.addgene.org/vector-database/2285/
7. http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/pacopp/3-VECTORES_DE_CLONACION.pdf