V Congreso Peruano de Reproducción Animal.

12-14 de Agosto de 2015, Lima, Perú.

TRATAMIENTO DE ACTIVACIÓN DE OVOCITOS EN EL
DESARROLLO PREIMPLANTACIONAL, CALIDAD Y PLOIDÍA
DE EMBRIONES BOVINOS CLONADOS

Dr. Ricardo Felmer D.

Director Laboratorio de Reproducción, Centro de Biotecnología de la Reproducción (CEBIOR-
BIOREN), Universidad de La Frontera. Casilla 54-D, Temuco, Chile.
ricardo.felmer@ufrontera.cl
INTRODUCCION

Dolly
 INTRODUCCION
Aplicaciones de la clonación:

Kubota et al., 2000

El bucardo (Capra pyrenaica pyrenaica)

 INTRODUCCION
Aplicaciones de la clonación:
Xenotrasplantes Resistencia a enfermedades

Cerdos K.O.
α 1,3 transferasa (-/-) Corderos K.O.
(PPL-Roslin Institute, Scotland 2001) Proteína Priónica (-/-)
(PPL-Roslin Institute, Scotland 2000)

Envejecimiento celular.

Tumor
INTRODUCCION
 INTRODUCCION
Factores que afectan la eficiencia de la clonación:
El tipo celular.
•Células del cumulus
•Células de la granulosa
•Fibroblastos fetales
•Fibroblastos adultos
In vitro In vivo
(Lagutina et al., 2005, Miyoshi et al. 2003; Poehland et al. 2007)

Felmer and Arias 2011

 INTRODUCCION
Factores que afectan la eficiencia de la clonación:
El grado de diferenciación celular.

Heyman Y 2005
 INTRODUCCION
Factores que afectan la eficiencia de la clonación:
El estado del ciclo celular de la célula donante
y receptora.
Fertilización

Dr. Keith Campbell

M II G1 S G2 Mitosis (1954-2012)
MPF

Transferencia nuclear
2n
G1 Replicación del DNA
2n

Campbell et al., 1993, Campbell et al., 1994, Cambpbell et al., 1996

 INTRODUCCION
Factores que afectan la eficiencia de la clonación:
El método de clonación.

Hand Made Cloning Clonación Tradicional

(Tecirgioglu et al., 2005)

El medio de cultivo

Arias et al., 2013

 INTRODUCCION
Factores que afectan la eficiencia de la clonación:

La activación del ovocito.

Oscilaciones de [Ca2+]i

[Ca2+]i
Serie de eventos que ocurren como resultado
del incremento de Ca2+i en el ovocito.
Tiempo

Es una de etapas más variables dentro del protocolo de clonación

Activación del
Ovocito

El tiempo entre la La edad del ovocito al

El método La duración del activación y la fusión momento de la
utilizado tratamiento con la célula donante activación
 ACTIVACIÓN DEL OVOCITO
Eventos asociados a la activación (Fecundación Normal)
o Los óvulos mamíferos al ser ovulados
están bloqueados en Metafase II.

o El espermatozoide induce la activación del óvulo.

Desbloqueo de la mitosis

Formación de pronúcleos

Exocitosis de gránulos corticales

Reclutamiento de RNAs maternos

 ACTIVACIÓN DEL OVOCITO
Activación del ovocito en embriones clonados.
Protocolos de Activación:
-Ionomicina 5 µM 4 min Susko-Parrish et -Ionomicina 5 µM 4 min Presicce and Yang,
-DMAP 2mM 4 h al., 1994 -CHX 10 µM 5 h 1994

• Ionóforo + DMAP • Etanol + CHX Ionomicina +

• Ionóforo + CHX • Etanol + DMAP…..etc CHX + DMAP

La tasa de desarrollo
embrionario
Perfiles de
Número total de
expresión
células en blastocistos
génica
Activación
Cariotipo
del ovocito Índice de células
apoptóticas

La combinación de estos tratamientos es

dependiente de la especie
Bavister et al., 1992; Abe et al., 1999; Byrne et al., 1999; Krisher et al., 1999; Kuran et al., 2001; Farin et al., 2001; Lazzari et al 2002; Hoshi H 2004; Escriba & Garcia-Ximenez, 2000; Liu
et al., 2005; Garcia-Mengual et al., 2008; Alexopoulos & French, 2009; Whitworth et al., 2009, Gupta et al., 2009; Wrenzycki et al., 2001; Cervera et al., 2009.
 ACTIVACIÓN DEL OVOCITO
Activación del ovocito en embriones clonados.
Problema con DMAP:
Poca selectividad y/o amplio espectro de acción, por lo que puede interferir en otras kinasas
involucradas en procesos celulares, con efectos adversos para el desarrollo embrionario.

Alta incidencia de Avery et al., 1998; Rho et al., 1998; De

anormalidades cromosómicas la Fuente and King 1998.

Dificultades en establecer
preñeces Cibelli et al., 1998; Hill et al., 2000

DMAP Alta mortalidad embrionaria Slimane-Bureau and King 2002

Malformaciones congénitas Yoo et al., 2003

Mutaciones en S.thiphimurium
Katoh et al., 2004
en el test de Ames
 ACTIVACIÓN DEL OVOCITO
Activación del ovocito en embriones clonados.

Anisomicina (ANY)

Antibiótico producido por

Streptomyces griseolus.

Anisomicina Inhibe síntesis de proteínas. Barbacid and Vazquez 1975;

Zinck et al., 1995.

Puede activar proteínas

quinasas y otras señales de
transducción.

Como activador de ovocitos de ratón (Clayton et al., 1995; Liu et al., 2000).
Se ha utilizado como droga inductora de estrés (Margalit et al., 2005).
 OBJETIVO

1.-Establecer el efecto de Anisomicina en la activación

partenogenética de ovocitos bovinos, evaluando diferentes
concentraciones y tiempos de exposición.

2.-Comparar este tratamiento de activación con los clásicos

compuestos DMAP y CHX en el desarrollo preimplantacional,
ploidía y calidad de embriones bovinos generados por SCNT.
 METODOLOGÍA
Equipos para micromanipulación:
micromanipulación:
Capilares de vidrio
 METODOLOGÍA

Obtención de la célula donante:

donante:

Biopsia de piel

Vaca Overo Negro 7 días 10 días 15-18 días

 METODOLOGÍA
Obtención ovocito receptor
receptor::
Aspiración de ovocitos Selección de ovocitos

Maduración in vitro (18 horas)

38,5°C, 5% CO2
Antes de la maduración Después de la maduración
 METODOLOGÍA
Procedimiento de TNCS
TNCS..

Metafase II

Enucleación

Transferencia
nuclear

Fusión y
desarrollo
embrionario
 METODOLOGÍA
Cultivo de embriones
embriones::
Día 3 Día 7
KSOM/BSA (Felmer et al., 2011)

38,5°C, 5% (CO2) 5% (O2), 90%

(N2) y humedad a saturación.
•Registro desarrollo. •Registro tasa Bl
• +5% SFB.

•Evaluación Calidad
embrionaria

•Análisis cromosómico
(96 hpa)
 RESULTADOS
Optimización condiciones para Anisomicina.
Anisomicina.
Efecto de la Concentración de Efecto del Tiempo de Incubación
Anisomicina en el Des. Emb. de Anisomicina en el Des. Emb.

ANY: 1 µg/ml, 5 h
 RESULTADOS

Efecto del Agente de Activación

en el Desarrollo de Partenotes

DMAP > CHX

•Bovino (Holm et al., 2003, Lagutina et al.,
2004, Bhak et al., 2006, Wang 2008).
•Cerdos (Grupen et al., 2002).
•Ovejas (Alexander et al., 2006).
 RESULTADOS

Desarrollo Preimplantacional
Embriones Clonados

DMAP = CHX

•Bovino 16 y 13% (Bhak et al., 2006).

•Bovino 23 y 26% (Ross et al., 2009)
•Ovejas 19 y 14% (Alexander et al., 2006).

DMAP > CHX (Partenotes)

DMAP = CHX (Clonados)
RESULTADOS

Evaluación de la Calidad
Embrionaria
 RESULTADOS

x
Evaluación Cromosómica de
Embriones Clonados

DMAP = CHX
•Ovejas (Alexander et al., 2006)
Anormalidades (60% = 56%)

DMAP > CHX -Avery et al., 1998

(55% > 31%) •Bovino (Bhak et al., 2006) -Rho et al., 1998
 CONCLUSIONES
1. La activación de ovocitos bovinos con ANY mejora las tasas
de desarrollo in vitro en partenotes y embriones clonados en
comparación con los clásicos protocolos de activación química
DMAP y CHX.

2. ANY generó una mayor tasa de blastocistos en embriones

clonados, mejor calidad embrionaria y un menor porcentaje de
anormalidad des cromosómicas.

3. Los resultados sugieren que ANY podría ser una mejor

alternativa para la activación de ovocitos no sólo bovinos sino de
otras especies y podría tener aplicaciones en otras biotecnologías
reproductivas como en ICSI.
 AGRADECIMIENTOS

Dra. María Elena Arias.

Horacio Floody.

Grant: 1080216
Muchas gracias