FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
PROF. MARTHA GILES GÓMEZ
PRÁCTICA 4. Tinciones diferenciales: Gram y
Ziehl-Neelsen. Tinciones selectivas (Espora y
Cápsula)
OBJETIVO

El alumno distinguirá las diferencias entre las preparaciones en fresco, simples, diferenciales y
selectivas más utilizadas para el estudio microscópico de las bacterias.

INTRODUCCIÓN

En el ejercicio experimental anterior se explicaron las tinciones mas sencillas utilizadas para el
estudio microscópico de los procariotes, a saber, preparaciones en fresco, preparaciones fijas y
tinción simple. Sin embargo, existen otra serie de preparaciones fijas teñidas que permiten
profundizar sobre la morfología y composición microscópica de estos organismos.

La aplicación de diferentes colorantes según sus propiedades y las combinaciones de éstos, con
agentes mordentes y decolorantes, han permitido desarrollar tinciones que pueden agruparse en:

1. Tinciones simples.
2. Tinciones diferenciales.
3. Tinciones selectivas.

1. Tinciones simples. Consisten en aplicar un solo colorante para observar la morfología de los
microorganismos. Se usan principalmente colorantes básicos como el azul de metileno, el cristal
violeta o safranina.
2. Tinciones diferenciales. Consisten en aplicar una combinación de colorantes, mordentes y
decolorantes que permiten poner de manifiesto alguna diferencia importante en la composición de
los microorganismos. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que áun cuando
tengan igual morfología, presenten diferencias en su composición química. Las dos tinciones
diferenciales mas importantes que se aplican en bacteriología son la de Gram y la de Ziehl –
Neelsen. Usando cualquiera de éstas es posible clasificar a las bacterias por lo menos en dos
categorías ya que las células resultarían positivas o negativas con respecto a la tinción empleada.
3. Tinciones selectivas. Son aquéllas que permiten observar un organelo celular determinado,
porque el colorante se combina selectivamente con él; en algunos casos, se requieren mordentes,
agentes acidificantes o precipitantes para lograr la combinación específica colorante-organelo;
también suelen usarse colorantes de contraste para distinguir el resto de la célula. Las tinciones
selectivas más importantes son:
a. Tinción de endosporas
b. Tinción de flagelos
c. Tinción de núcleo
d. Tinción de cápsula

TINCIONES DIFERENCIALES

Tinción de Gram. Fue desarrollada hacia 1884 por el danés Christian Gram, posteriormente se
determinó que se basa en la composición de la pared celular y la presencia en uno de los grupos de
bacterias de una membrana externa (adicional a la membrana citoplásmica). Consiste en aplicar 4
reactivos, el cristal violeta o colorante primario, es el primer reactivo de la serie de Gram; éste imparte
color a todos los microorganismos del frotis; el segundo reactivo es una solución de yodo denominada
yodo de Gram o lugol, ésta actúa como mordente (aumenta o refuerza la unión entre el colorante

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primario y el sustrato), formando un complejo cristal violeta-yodo-ribonucleato de magnesio); el tercer
reactivo es el alcohol-acetona, actúa como decolorante disolviendo y arrastrando fuera de las células
el colorante primario. Sin embargo las bacterias Gram-positivas cuya pared es relativamente gruesa
(25 a 30 nm), con un mayor contenido de peptidoglicano (20 a 80%) y con numerosos enlaces
transversales peptídicos entre las cadenas del polisacárido formado por N-acetilmurámico y N-
acetilglucosamina, no pierden el complejo cristal violeta-yodo, pues la pared al deshidratarse reduce
únicamente su permeabilidad con el decolorante y aún queda con un grosor suficiente para evitar la
difusión o salida del complejo. En cambio, las bacterias Gram-negativas cuya pared es mas delgada
(10 a 15 nm) y contienen poco peptidoglicano (5 a 10%) con pocos enlaces transversales, se
deshidrata adelgazando aún mas la pared. Además de la deshidratación que sufre la pared celular,
en las bacterias Gram-negativas, el alcohol-acetona disuelve los abundantes lípidos (20 a 35%) que
conforman la bicapa lipídica de la membrana externa. Con ambos efectos los poros se abren y se
facilita la salida del complejo cristal-violeta yodo y la decoloración de este tipo de bacterias, por lo que
se tornan translúcidas y reaccionan con el último colorante de la tinción de Gram, la safranina siendo
el curanto reactivo también conocido como colorante de contraste. Las bacterias que retienen el
colorante primario a lo largo de todo el proceso son llamadas Gram-positivas, éstas se ven teñidas de
morado, el segundo grupo de bacterias pierden el colorante primario después de la decoloración y se
tiñen con el colorante de contraste y se denominan Gram-negativas, éstas se tiñen de rojo.

Esta sencilla técnica que se realiza en unos cuantos minutos proporciona amplia información sobre la
bacteria con respecto a su composición, requerimientos nutricionales y sensibilidad a agentes
químicos. Hay bacterias cuya composición los sitúa en el límite entre bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas y por lo tanto reaccionan de maneras diferentes, por ello, se denominan Gram-
variables, pero su verdadero carácter de Gram puede establecerse en cultivos muy jóvenes obtenidos
en medios específicos, como agar sangre y controlando cuidadosamente todas las condiciones
incluyendo, desde luego, los detalles de la manipulación. Finalmente, los factores que afecten a la
pared celular como el envejecimiento o el daño físico, alteran el Gram de las bacterias positivas lo
mismo que el medio ácido.

Tinción de Ziehl-Neelsen o Bacilo Ácido Alcohol Resistente (BAAR). Esta tinción se aplica
especialmente para la diferenciación de Mycobacterium sp. y Nocardia sp. que son resistentes al
alcohol-ácido, de otras bacterias que no lo son. Esta característica se debe a que su pared celular
tiene un alto contenido de lípidos (arriba del 60%) sobre todo del tipo de las ceras A, B, C y D, unidos
a los polisacáridos tales como mananas,, glucanas, arabinogalactanas y arabinomananas, además de
glicolípidos, ácidos micólicos, micósidos-C y ceras-D, lo que hace que tenga propiedad hidrofóbica; la
capa intermedia es una cápsula fibrosa compuesta principalmente de ácidos micólicos y
arabinogalactana, la capa interna pertenece propiamente a la pared celular bacteriana que se
encuentra dividida en dos capas compuestas por lipopolisacáridos y complejo mucopéptido-
arabinogalactana. Esto que la pared se comporte de manera hidrofóbica y por tanto impermeable, por
lo que para teñir a estos microorganismos, es necesario emplear agentes que intensifiquen y faciliten
la penetración del colorante primario. Los colorantes mas apropiados para estas tinciones son los
colorantes básicos como la fucsina, rosanilina y pararosanilina, La fucsina básica se une a los ácidos
micólicos de la pared celular. Con el fin de intensificar la unión del colorante a la pared celular, se
incorpora al colorante una solución de sustancias polares y no polares, tales como la anilina y el
fenol, y para facilitar la penetración del mismo se introdujo el calentamiento.

La técnica consiste en aplicar fucsina fenicada calentando la preparación por cierto tiempo. Cuando
se desea evitar el calentamiento se aumenta la concentración del colorante primario fenolizado y éste
se mezcla con un detergente fuerte antes de aplicarlo al frotis. Los detergentes frecuentemente
empleados son: el tween 80, tween 20, Anatorox A-400, tetradecilsulfonato de sodio y Tergitol-7.

La tinción en caliente suaviza las ceras y facilita la solubilización y penetración del colorante entre
ellas, pero la decoloración se hace en frío. La tinción es también conocida como ácido-resistente,

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debido a la naturaleza ácida del agente decolorante empleado. En los microorganismos ácido-
resistentes, una vez que el colorante se ha combinado con las sustancias céreas, éstos resisten la
decoloración con alcohol-ácido, pues ni el fenol ni las ceras son soluble en éste, los demás
microorganismos si se decoloran y para observarlos se aplica como colorante de contraste azul de
metileno de Loeffler.

TINCIONES SELECTIVAS

Tinción de endosporas. Las endosporas son organelos de resistencia de algunas bacterias, se

producen en el interior de la célula y se caracteriza por la resistencia de las capas externas que la
conforman con diferentes tipos de peptidoglicano y proteínas, además de que la parte interna de la
espora denominada núcleo o protoplasto de la espora contiene un compuesto muy característico
denominado dipicolinato de calcio. Esto aunado al estado de latencia, las hace muy resistentes a los
efectos adversos de agentes físicos y químicos.

Por la composición de la cubierta externa, es muy difícil penetren para teñir la espora, por eso en las
tinciones simples suelen verse como cuerpos incoloros o refráctiles dentro de las bacterias. Para
teñirlas es necesario emplear métodos muy drásticos y similares a los empleados en la tinción de
ácido-resistentes. En la tinción de endospora se tiñe en caliente con verde de malaquita, una vez que
la espora ha tomado este colorante no se puede decolorar ni siquiera con un colorante de contraste
que permite distinguir a la espora de la célula vegetativa.

Tinción de cápsula. Este organelo es una cubierta extracelular constituída por polisacáridos,
generalmente dextranas, alginatos o glicopéptidos que se acumulan alrededor de la célula; su
composición depende de la especie y de la composición del medio de cultivo. La cápsula puede llegar
a medir varias veces el diámetro del microorganismo; el desarrollo de microorganismos capsulados
en medios líquidos produce viscosidad como sucede en el pulque y alimentos deteriorados por
microorganismos capsulados.

Como la cápsula no se combina fácilmente con colorantes y dado que el calentamiento origina su
disolución y pérdida, se observa casi siempre con una tinción negativa, usando la tinta china o
nigrosina para oscurecer el fondo y en ocasiones un colorante de contraste para teñir las células.

METODOLOGÍA

MATERIAL

Microscopio
Aceite de inmersión
Portaobjetos
Mechero
Asa bateriológica
Mechero
Gradilla
Reactivos para tinción de Gram: Cristal-violeta, lugol, alcohol-acetona y safranina
Cultivos de 24 h de Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus, Streptococcus oralis, Mycobacterium sp., Pulque,
Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc citreum.
Tripié con tela de alambre y placa de asbesto
Vaso de pp de 250 ml con agua hirviendo (para un baño maría)
Pinzas de disección
Papel filtro
Pizeta

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Tinta china o nigrosina
Safranina 0.5%
Verde de malaquita

Tinción de Gram

METODO

 Hacer una preparación fija (frotis) de cada uno de los microorganismos en estudio indicados por el
profesor, marcando cada portaobjetos con su nombre
 Cubrir la preparación con Cristal-violeta de Gram, dejar actuar por un minuto. Al cabo de un
minuto escurrir el exceso de colorante y lavar con agua contenida en pizeta.
 Cubrir la preparación con lugol de Gram, dejar actuar por un minuto. Escurrir el exceso de lugol
 Decolorar agregando mezcla de alcohol-acetona a la preparación, mientras se sostiene
ligeramente inclinada para que el decolorante resbale lentamente por ella.
 Cubrir la preparación con safranina y dejar actuar por 1 minuto. Escurrir el exceso y dar un
enjuague final con agua ayudándose de una pizeta.
 Dejar secar al aire.
 Observar al microscopio con 1,000X y registrar resultados.

Tinción de ácido-resistencia

METODO

 Hacer una preparación fija (frotis) de cada uno de los microorganismos en estudio indicados por el
profesor, marcando cada portaobjetos con su nombre
 Colocar sobre la preparación un pedazo de papel filtro
 Agregar sobre el papel filtro una gota de fucsina fenicada
 Colocar el portaobjetos sobre un vaso de pp. de 250 ml que contendrá baño maría en ebullición.
Verificar que el portaobjetos reciba una cantidad adecuada de vapor de agua.
 Calentar por 10 min tener cuidado de evitar que la fucsina se seque por efecto del calentamiento.
Para evitarlo continuar agregando colorante para mantener húmeda y saturada la preparación con
la fucsina. Evite en todo momento que el baño maría se pigmente por un exceso de colorante.
 Retire la preparación del baño , retire el papel filtro con unas pinzas y elimínelo en una bolsa.
 Enjuague el exceso de fucsina fenicada enjuagando con agua contenida en pizeta.
 Decolore con alcohol-ácido mientras se sostiene ligeramente inclinada para que el decolorante
resbale lentamente por ella.
 Cubrir la preparación con azul de metileno de Loeffler y dejar actuar por 1 minuto. Escurrir el
exceso y dar un enjuague final con agua ayudándose de una pizeta.
 Dejar secar al aire.
 Observar al microscopio con 1,000X y registrar resultados.

TINCIÓN DE ENDOSPORAS

METODO

 Hacer una preparación fija (frotis) de cada uno de los microorganismos en estudio indicados por el
profesor, marcando cada portaobjetos con su nombre
 Colocar sobre la preparación un pedazo de papel filtro
 Agregar sobre el papel filtro una gota de verde de malaquita
 Colocar el portaobjetos sobre un vaso de pp. de 250 ml que contendrá baño maría en ebullición.
Verificar que el portaobjetos reciba una cantidad adecuada de vapor de agua.

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 Calentar por 10 min tener cuidado de evitar que el verde de malaquita se seque por efecto del
calentamiento. Para evitarlo continuar agregando colorante para mantener húmeda y saturada la
preparación con el verde de malaquita. Evite en todo momento que el agua del baño maría se
pigmente por un exceso de colorante.
 Retire la preparación del baño, retire el papel filtro con unas pinzas y elimínelo en una bolsa.
 Enjuague el exceso de verde de malaquita enjuagando con agua contenida en pizeta.
 Cubrir la preparación con safranina al 0.5% y dejar actuar por 1 minuto. Escurrir el exceso y dar
un enjuague final con agua ayudándose de una pizeta.
 Dejar secar al aire.
 Observar al microscopio con 1,000X y registrar resultados.

TINCIÓN DE CÁPSULA

METODO

 En el extremo de un portaobjetos colocar 1 gota de tinta china o nigrosina.

 Tomar con pipeta Pasteur 1 gota del cultivo indicado por el profesor y colocarla encima de la gota
de tinta china previamente colocada.
 Mezclar suavemente.
 Colocar el borde de otro portaobjetos sobre la gota y delizar éste sobre el portaobjetos que
contiene la muestra formando una película delgada de color negro-grisáceo.
 Dejar secar al aire
 Cubrir el frotis con safranina al 0.5% durante 1 min.
 LAVAR CUIDADOSAMENTE CON AGUA CONTENIDA EN PIZETA (tener especial cuidado en
este paso para evitar romper la película oscura).
 Dejar secar al aire.
 Observar al microscopio con 1,000X y registrar resultados.

NOTA IMPORTANTE

Para lavar los portaobjetos con frotis ya usados, sumergir en un frasco con desinfectante (hipoclorito
de sodio) al menos por 15 minutos, lavar con agua y jabón y una esponja. Lavar nuevamente con
agua y jabón y enjuagar con alcohol al 95%, escurrir el exceso de alcohol, flamear en mechero sus
portaobjetos y guardarlos para otros ejercicios.

BIBLIOGRAFÍA

Capuchino & Sherman (1998) Microbiology, a laboratory manual. 5ª. ed. Cummings Publishings. USA

Ramírez Gama R. et al (1998) Manual de Prácticas de Microbiología General. Facultad de Química,

UNAM

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las ventajas de una tinción diferencial sobre una tinción simple?
2. Explica el propósito de los siguientes reactivos en un procedimiento de tinción diferencial
a. Colorante primario
b. Agente mordente

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 c. Agente decolorante
d. Colorante de contraste
3. ¿Cuáles son las ventajas prácticas de una tinción negativa?
4. ¿Porqué las bacterias permanecen sin teñir durante un procedimiento de tinción negativa?
5. ¿Porqué es necesario el calentamiento durante la tinción de esporas?
6. ¿ Porqué es necesario el calentamiento durante la tinción de ácido resistencia?
7. Realiza una comparación en la apariencia de una endospora al realizar una tinción simple en
comparación con una tinción de esporas.