Virología 332 (2005) 8-15

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Comunicación rápida

La inhibición de la hepatitis nativo replicasa virus C por

inhibidores de nucleótidos y no análogos de nucleósidos

Han Ma *, Vicente Leveque, Anniek De Witte, Weixing Li, Que Hendricks,

Saundra M. Clausen, Nick Cammack, Klaus Klumpp *

Roche Palo Alto LLC, 3431 Hillview Avenue, Palo Alto, CA 94304, EE.UU.

Recibido el 29 de septiembre de 2004; devuelto al autor de la revisión 7 noviembre de 2004; aceptado 18 de de noviembre de de 2004

Disponible en Internet el 15 de diciembre de de 2004

Resumen

Un número de inhibidores de nucleótidos y no nucleósidos de la polimerasa del VHC están actualmente bajo investigación como agentes antivirales potenciales para el tratamiento de
pacientes infectados por el VHC. La polimerasa del VHC es parte de un complejo de replicasa incluyendo la subunidad NS5B polimerasa junto con otras proteínas virales y del huésped y ARN viral.
La actividad de síntesis de ARN del complejo de replicasa nativa fue inhibida por 3 V- desoxi-CTP, un análogo de nucleótido chainterminating, pero no inhibida por los inhibidores de la polimerasa
NS5B no nucleósidos de tres clases estructurales diferentes. La replicasa del VHC también era resistente a la heparina, un amplio espectro, inhibidor de la polimerasa de ARN a la competencia.
Prebinding de la proteína NS5B recombinante con una plantilla de ARN hecho que la polimerasa en gran parte resistente a la inhibición por la heparina y los inhibidores no nucleósidos, pero no
afectó a la potencia inhibidora de 3 V- desoxi-CTP. Por lo tanto, la replicasa del VHC mostró un patrón similar de sensibilidad inhibidor en comparación con NS5B RNA de ruedas. Estos resultados
sugieren que el complejo de replicasa de HCV nativo representa un complejo de la polimerasa de ARN-estable y productiva. Los inhibidores de la polimerasa NS5B no nucleósidos alostéricos son
inactivos contra replicasa del VHC establecido, pero pueden funcionar antagónicamente con la formación de un complejo enzima-plantilla productiva.

re 2004 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

palabras clave: Hepatitis; Replicación; RNA polimerasa; nucleósido; inhibidor no nucleósido; complejo de proteína de membrana; inhibidor alostérico; El fraccionamiento celular;
NS5B; replicasa

Introducción Se ha identificado la actividad de la polimerasa del VHC. análogos de

RNA de replicación del virus de la hepatitis C (HCV) se produce en el
citoplasma y está mediada por un complejo de replicasa asociada a la membrana
que consiste en muchas, si no todas las proteínas NS y, posiblemente, el anfitrión
de los factores (s) ( Moradpour et al., 2003 ). NS5B, la ARN polimerasa
dependiente de ARN (RdRp), es la subunidad catalítica del complejo de replicasa
y por lo tanto constituye un objetivo primordial para la intervención anti-viral. Uso
de proteína NS5B recombinante para la detección, ambos inhibidores de
nucleótidos y no análogos de nucleósidos de
* los autores correspondientes. Fax: +1 650 3547554.
Correos electrónicos: han.ma@roche.com (H. Ma) 8
klaus.klumpp@roche.com (K. Klumpp).
nucleótidos diana el sitio activo de la polimerasa, son inhibidores
principalmente competitivos con respecto a los sustratos de nucleótidos
naturales, y pueden causar la terminación de cadena sobre la incorporación
en las moléculas de ARN ( Carroll et al., 2003; Migliaccio et al., 2003; Calce
et al., 2003 ). inhibidores no nucleósidos de la actividad de la síntesis de
ARN NS5B se han identificado independientemente por varios laboratorios y
pertenecen a un número de diferentes clases estructurales ( Beaulieu et al.,
2004; Chan et al, 2004a, 2004b.; Dhanak et al., 2002; McKercher et al.,
2004 ). Sobre la base de la ubicación de la resistencia que confiere
aminoácidos en NS5B, estudios de resistencia cruzada y información de la
estructura co-cristal, bencimidazol, benzotiadiazina, y compuestos
carboxílicos de ácido-base de tiofeno unirse a tres sitios no solapantes de
unión sobre NS5B ( Amor et al., 2003; Nguyen et al., 2003; Tomei y otros,
2003., 2004; Wang et

0042-6822 / $ - see front matter re 2004 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados. doi: 10.1016 /
j.virol.2004.11.024
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al., 2003 ). Benzotiadiazina y los inhibidores de bencimidazol no inhiben la resultados

actividad de NS5B bajo de un solo ciclo condiciones de síntesis de ARN ( Gu et

al., 2003; McKercher et al., 2004 ). Por lo tanto, la potencia de estos inhibidores
no nucleósidos puede ser dependiente sobre el estado de la interacción
plantilla de enzima, y ​la inhibición de la polimerasa del VHC solamente puede
estar ocurriendo durante la fase de iniciación de la síntesis de ARN. A pesar
del uso generalizado de la NS5B recombinante como un modelo in vitro de la
síntesis de ARN-VHC específica, el impacto de la interacción NS5B con otras
subunidades HCV replicasa sobre la potencia inhibidora de inhibidores de la
polimerasa permanece poco clara. El sistema de replicón de VHC en células
de hepatoma proporciona una fuente de complejo de replicasa nativa, que
podría ser utilizado para abordar esta cuestión, independientemente de las
posibles diferencias en la penetración celular o la toxicidad celular entre
compuestos en investigación. Aquí, se determinó la inhibición de la actividad
de HCV replicasa usando ejemplos representativos de inhibidores no
nucleósidos de tres clases estructurales diferentes y un análogo de nucleótido.
Caracterización biológica del complejo de replicasa asociada a la
membrana
NS5B polimerasa del VHC es una proteína asociada a la membrana y parte
de un complejo de replicasa multiproteicos ( Moradpour et al., 2003 ). Una
preparación libre de células de complejo HCV replicasa enzimáticamente activa
se aisló como una fracción de membrana citoplasmática de las células Huh-7
que alberga un replicón subgenómico NS3-5B ( Krieger et al., 2001 ) Por Dounce
de homogeneización y centrifugación diferencial ( Takeda et al., 1986 ). La
composición de proteína de VHC del complejo de replicasa citoplásmica (CRC)
obtenido por este método se determinó por análisis de transferencia de Western.
NS3, NS4B, NS5A y NS5B estaban presentes en la fracción de CRC a partir de
células de replicón, pero no en la fracción de membrana correspondiente a partir
de los padres, Huh-7 células libre de replicón ( Figura 1 UNA). Como control,
GRP78, una proteína chaperona que reside en el retículo endoplasmático (ER),
se confirmó que era

Fig. 1. Aislado CRC contiene múltiples proteínas NS de VHC y es enzimáticamente activa. (A) Detección de HCV proteínas no estructurales y endoplásmico GRP78 proteína reticulumresiding en la fracción de membrana
de Huh7 (H) o células de replicón (R). Los pesos moleculares de las proteínas se indican a la izquierda. Policlonal de conejo antisueros contra NS5B, NS5A, y NS3 se desarrollaron utilizando NS5B recombinante, dominio
de proteasa NS5A, o NS3 como inmunógenos. anticuerpo monoclonal contra NS4B (4B52) fue proporcionado amablemente por el Dr. Kohara ( Tsukiyama-KOHARA et al., 2004 ). (B) NTP-dependiente de la actividad de la
síntesis de ARN in vitro de las fracciones de membrana citoplasmática. fracción de membrana de Huh7 (H) o células de replicón (R) se incubó con [ una- 33 P] -CTP en presencia o ausencia de 1 mM de cada uno de ATP,
UTP, y GTP (AUG). M, radiomarcado replicón de ARN de cadena sencilla. (C) actividad de síntesis de ARN dependiente de enzima de replicasa. (D) Evolución temporal de ensayo de replicasa en el que 10 UNA l de CRC
se incluyó en las reacciones para los puntos de tiempo indicados. bandas de ARN se cuantificaron y se representaron como se muestra en el panel inferior. R 2 valores representan la bondad de la regresión lineal de los
datos.
10 Comunicación rápida

estar presente tanto en las fracciones de membrana a partir de células padre Huh7,
así como células derivadas de Huh7 que contienen replicón de HCV ( Figura 1 UNA).
En presencia de trifosfatos de nucleótidos exógenos (PNT), el complejo de
replicasa fue capaz de sintetizar copias de longitud completa de la plantilla
endógeno replicón de ARN ( Figura 1 SEGUNDO). El producto principal de la
síntesis de RNA por CRC era de longitud completa de ARN replicón. El producto
de ARN no se observó con la fracción correspondiente membrana de Huh-7 células
parentales o cuando sólo se proporcionó una única NTP ( Figura 1 SEGUNDO). Por
lo tanto, la síntesis de ARN de replicón de VHC in vitro era-HCV-replicasa
específica y dependiente de NTP. La actividad de síntesis de ARN replicasa
asociado era dependiente de la cantidad de complejo de proteínas en la reacción.
Se observó un aumento lineal de formación de producto de hasta 12,5 UNA l CRC,
donde 1 UNA l de CRC representado fracción de membrana de 5

10 5 Células ( Figura 1 DO). En el

presencia de 10 UNA l CRC, la síntesis de ARN de longitud completa también se
incrementó linealmente con el tiempo hasta 180 min ( Figura 1 RE). Se obtuvieron
resultados similares con múltiples preparaciones de CRC que sugieren la actividad de
HCV replicasa altamente robusto y reproducible obtenida usando el protocolo de
fraccionamiento celular actual. Diez microlitros CRC y un tiempo de incubación de
120 min se establecieron como condiciones de ensayo replicasa estándar para la
caracterización de inhibidor. De acuerdo con el análisis de transferencia Western
comparativo utilizando NS5B recombinante como una referencia, la concentración de
Fig. 2. Efecto de los inhibidores de nucleótidos y no nucleósidos sobre la actividad de replicasa. (A)
NS5B en el ensayo de replicasa estándar fue similar dentro de 2 veces a la utilizada Estructuras de compuestos inhibidores. (B) Inhibición de la actividad replicasa por el nucleótido y los
en el ensayo de la polimerasa NS5B recombinante estándar (datos no mostrados). inhibidores no nucleósidos. Se determinó la actividad replicasa en presencia de análogo de
nucleótido 3 V- dCTP a concentraciones de 0,01, 0,03, 0,09, 0,28, 0,83, 2,5, y 7,5 UNA M, o cada uno
de los inhibidores no nucleósidos en concentraciones de 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20, y 100

UNA M. C, la actividad de replicasa en ausencia de inhibidor; 3Dc, la actividad replicasa en presencia de

7,5 UNA M 3 V- dCTP.

La inhibición de la actividad de replicasa por inhibidores análogos de nucleótidos y no análogos

de nucleósidos

actividad de NS5B recombinante y el complejo de replicasa con potencia

Un número de inhibidores de la polimerasa del VHC se han identificado
utilizando proteínas NS5B recombinante aislada de otras subunidades de
replicasa in vitro. Se seleccionaron diferentes compuestos para comparar
potencias inhibidoras utilizando en ensayos de síntesis de ARN in vitro con
replicasa del VHC (CRC) o polimerasa del VHC recombinante (NS5B570-BK).
Los inhibidores ensayados incluyen un análogo de nucleótido de terminación de
cadena, 3 V- desoxicitidina trifosfato (3 V- dCTP), y una molécula representante de
cada uno de tres clases diferentes de inhibidores no nucleósidos: El compuesto 1
sobre la base de un andamio bencimidazol ( Beaulieu et al., 2004; Dhanak et al.,
2002 ), El compuesto 2 sobre la base de una estructura de benzotiadiazina ( Dhanak
et al., 2002 ), Y el compuesto 3 en base a una estructura de ácido carboxílico
tiofeno ( Chan et al., 2004a, 2004b ) ( Figura 2 UNA). Basado en el análisis
estructural y mutacional, estos cuatro compuestos se unen a sitios de unión
distintos sobre NS5B. 3 V-
dCTP inhibió significativamente la actividad de síntesis de ARN de la replicasa
del VHC, con una inhibición completa logra a 7,5
UNA M ( Figura 2 SEGUNDO). Sorprendentemente, ninguno de los inhibidores no
nucleósidos mostró un efecto inhibidor sobre la actividad replicasa del VHC a
concentraciones de hasta 100 UNA M, a pesar completa inhibición de la replicasa por 7,5
UNA M 3 V- dCTP en reacciones de control ( Figura 2 SEGUNDO). 3 V- la síntesis de ARN
inhibe dCTP
similar ( tabla 1 ). Todos los tres inhibidores no nucleósidos probados
inhibieron la actividad de síntesis de ARN de NS5B570-BK en un molde de
ARN heteropolimérica derivado de la 3 V- extremo del genoma del VHC de
cadena negativa (Cires) con IC submicromolar 50 valores, similares a los
valores publicados previamente ( tabla 1 ). La actividad de síntesis de ARN
de NS5B se inhibió a más de 90% de finalización por cada uno de los tres
inhibidores no nucleósidos en 100 UNA M (datos no mostrados), una
concentración a la que no se inhibió la actividad de replicasa.
actividad replicasa es resistente a la inhibición heparina
La diferente sensibilidad de la RdRp recombinante y la replicasa a la inhibición
de los inhibidores no nucleósidos de la alostéricos sugirió que la RdRp en el
complejo de replicasa puede asumir una conformación diferente debido a su
interacción con la plantilla de ARN del VHC endógeno, otras proteínas virales, o
cofactores anfitrionas . Sensibilidad de la actividad RdRp a la heparina se utilizó
para probar las diferencias en el volumen de negocios RNA entre NS5B
recombinante y replicasa del VHC nativo. La heparina es un inhibidor competitivo
de la unión del ácido nucleico y puede funcionar como un agente de la polimerasa
que atrapan la unión a
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tabla 1 complejos de replicasa asociadas a la membrana entre los virus de la Flaviviridae familia.
La inhibición de la replicasa del VHC y la actividad de síntesis de ARN NS5B recombinante por inhibidores de
Estos resultados son diferentes de los descritos por Hardy et al. (2003) , Que mostró una
nucleótidos y no análogos de nucleósidos
alta sensibilidad de la heparina de la replicasa del VHC purificada a partir de células de
ARN IC 50 [ UNA METRO] una
replicón. La razón de la pérdida de resistencia a la heparina en que la preparación de
ensayo de
3 V- dCTP Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 membrana está clara, pero puede estar relacionado con ligeramente diferentes
síntesis de

protocolos de fraccionamiento celular que conduce a la pérdida de un cofactor de

0,31 replicasa F 0.18 norte 100 norte 100 norte 100

NS5b570 0,33 0.05 F 0.01 0.1 F 0.04 0.29 F 0.04

estabilización.

una Los valores representan medias y desviaciones estándar de IC 50 los valores determinados a partir de al

menos tres experimentos independientes.

y la inhibición de moléculas de polimerasa libres, mientras que los complejos de

polimerasa-plantilla productivas son resistentes a la inhibición por heparina ( Bambara
et al., 1995; Tomei et al., 2000 ). El complejo de replicasa se preincubó con heparina
durante 10 min antes de la adición de tampón de ensayo y mezcla de NTP para
permitir el equilibrio replicasa heparina antes de la iniciación de la síntesis de ARN. Fig.
3 Una muestra de longitud completa la síntesis de ARN de replicón de VHC por
CRC en presencia de heparina de hasta 1 mg / ml. La actividad RdRp de la
replicasa del VHC era completamente resistente a la inhibición por la heparina en
estas condiciones, de acuerdo con una interacción ARN molde polimerasa-
altamente estable en el CRC. En contraste, la actividad de síntesis de ARN de la
proteína NS5B recombinante era sensible a la inhibición por heparina y
completamente inhibida a concentraciones de heparina por encima de 100 UNA g /
ml ( Fig. 3 SEGUNDO). Estos resultados sugieren que la replicasa de HCV nativa
existe como un complejo de la polimerasa de ARN-estable y productiva. resistencia
a la heparina de la replicasa también indica que la replicasa se somete a rotación
ARN molde limitada bajo las condiciones de ensayo, la generación de múltiples
copias de producto de cada plantilla. Alternativamente, el producto de ARN
generado por la replicasa puede representar una sola ronda de replicación del ARN
a partir de la elongación de intermediarios de replicación presentes en el momento
de la preparación de CRC. Varias líneas de evidencia apoyan la primera hipótesis.
Etiquetada producto de ARN generada por CRC aumentó linealmente con el tiempo
hasta 180 min, que es mucho más largo que el requisito de tiempo estimada para
una sola ronda de la síntesis de ARN del replicón de longitud completa en base a la
velocidad de alargamiento se informó anteriormente de 700 nucleótidos por minuto
del HCV polimerasa in vitro ( Tomei et al., 2000 ). producto de ARN de longitud
completa se detectable muy temprano en la reacción de la replicasa y aumentó en
intensidad linealmente con el tiempo, de acuerdo con la síntesis continua de nuevas
copias de longitud completa ( Figura 1 RE). Los estudios sobre las tasas de
replicación de otros virus de la Flaviviridae familia, Kunjin y el virus de Dengue,
mostraron que el ciclo de la síntesis de ARN viral para completar una cadena de
longitud completa fue de aproximadamente 15 min ( Chu y Westaway, 1985 ),
Consistente con la detección de transcritos de longitud completa generados por
replicasa del VHC en tiempos de reacción temprana. Un estudio reciente sobre el
complejo de replicasa del virus de la diarrea viral bovina mostró que la replicasa
BVDV retiene una gran proporción de la actividad de la síntesis de ARN incluso en
presencia de 2 mg / ml de heparina ( Tomassini et al., 2003 ). Por lo tanto, estable
proteína-plantilla interacción ARN puede ser una característica conservada de
nativo,

Fig. 3. sensibilidad diferencial de la replicasa del VHC y NS5B a la inhibición por heparina. (A) la
replicasa es resistente a la inhibición de heparina. Se determinó la actividad replicasa en ausencia ( )
O presencia de heparina a las concentraciones indicadas. producto de ARN en presencia de la
heparina se expresó como un porcentaje del producto de ARN sintetizado en ausencia de heparina y
se representó gráficamente. (B) Inhibición de la NS5B recombinante por la heparina.
12
Efecto de la formación de complejos de ARN-NS5B en las propiedades de
inhibición de tres clases de compuestos no nucleósidos
La interacción más estable de la polimerasa con la plantilla de ARN en el
complejo de replicasa en comparación con NS5B recombinante puede estar
relacionada con la resistencia de la replicasa a la inhibición por los compuestos
no nucleósidos. Con el fin de determinar si la interacción estable con plantilla de
ARN fue suficiente para generar resistencia a la inhibición por los inhibidores no
nucleósidos y heparina, NS5B recombinante se preincubó con moldes de ARN
antes de la evaluación de inhibidores de potencias. NS5B se preincubó con el
molde de ARN heteropolimérica por un período de hasta 4 h antes de la adición
de heparina o de cada uno de los tres compuestos no nucleósidos ( Fig. 4 ).
NS5B se inhibió a más de 90% de finalización en estas condiciones, cuando la
heparina o inhibidores no nucleósidos se añadieron junto con ARN molde ( Fig. 4 ,
Tiempo 0). En comparación con la actividad en ausencia de inhibidores, la
actividad RdRp de NS5B se hizo cada vez más resistentes a la inhibición por
heparina, cuando NS5B fue ya enlazado a la plantilla de ARN antes de la
adición de la heparina y la iniciación de la síntesis de ARN ( Fig. 4 , panel
izquierdo). La adquisición de resistencia a la heparina por la unión de ARN era
un proceso lento, alcanzando un efecto máximo a alrededor de 2 h de
preincubación de NS5B con HCV RNA Cires, lo que sugiere un lento proceso de
la formación de complejos de ARN estable, posiblemente relacionada con una
proteína de cambio conformacional inducido por ARN. Similar a los resultados
obtenidos con heparina, la actividad de la síntesis de ARN de NS5B se convirtió
en gran medida resistente a la inhibición por diferentes clases estructurales de
compuestos no nucleósidos después de la preincubación con NS5B ARN del
VHC Cires ( Fig. 4 , Medio y paneles de la derecha). Según se observó con la
heparina, la adquisición de resistencia no nucleósido por la ARN unión fue un
proceso lento, alcanzando niveles meseta después de 2 h de preincubación de
enzima-plantilla. Se obtuvieron resultados similares en experimentos llevados a
cabo con un máximo de concentración de compuesto 1 mM (datos no
mostrados). En contraste, la sensibilidad de NS5B a la inhibición por
Fig. 4. Efecto de la preincubación plantilla de ARN de la extensión de la inhibición de la actividad de la polimerasa NS5B. NS5B recombinante y molde de ARN Cires se preincubaron durante los períodos de tiempo indicados
antes de la adición de 1 mg / ml de heparina ( 5), 10 UNA M 3 V- dCTP ( X), 10 UNA compuesto M 1 ( norte), 10 UNA compuesto M 2 ( MI),
y 10 UNA compuesto M 3 ( z). La actividad residual en presencia de inhibidor se expresó como un porcentaje de la actividad de síntesis de ARN en ausencia de inhibidor a cada punto de tiempo de
preincubación.
Comunicación rápida
3 V- desoxi-CTP no se vio afectada por la formación de complejos NS5B-ARN ( Fig. 4 ,
panel izquierdo).
Discusión
Las potencias relativas de los inhibidores de nucleótidos y no análogos de
nucleósidos de VHC RdRp se compararon mediante la replicasa de HCV nativa y
la polimerasa del VHC recombinante, NS5B. Como se describe aquí, la replicasa
del VHC nativo mostró una sensibilidad similar a la inhibición por 3 V- desoxi-CTP
en comparación con NS5B bajo condiciones de tampón y de incubación de
sustrato similares. Estos resultados sugieren que la interacción de NS5B con
sustratos de NTP y análogos de NTP es similar en la proteína NS5B aislado y el
complejo de replicasa asociada a la membrana. Consistentes con nuestra
conclusión, trifosfatos de 2 V- análogos de nucleósidos modificados también
inhibieron la replicasa del VHC y la NS5B recombinante con una potencia
comparable ( Migliaccio et al., 2003 ). Muchos inhibidores no nucleósidos son
inhibidores alostéricos con sitios distantes del sitio activo de la RdRp de unión.
La potencia de esta clase de inhibidores puede depender de la accesibilidad del
sitio y la conformación de la polimerasa de unión. Aquí, ninguno de los
compuestos representativos ensayados a partir de tres clases estructurales
diferentes de síntesis de ARN mensurable inhibida por replicasa del VHC incluso
a concentraciones de más de 1000 veces mayor que las concentraciones
necesarias para la inhibición mitad de la máxima de NS5B recombinante ( tabla 1 ),
Aunque los análisis estructurales y bioquímicos sugieren que estos compuestos
se unen a diferentes sitios, que no se solapan de unión en la proteína NS5B. Las
posibles explicaciones para la resistencia de la actividad replicasa a estos
inhibidores no nucleósidos incluyen (1) conformación diferente proteína NS5B
relacionadas con la interacción productiva de NS5B con ARN molde, (2) la
interacción proteína-proteína entre NS5B y otra VHC proteínas no estructurales o
proteínas del huésped sitios en NS5B de unión compuesto de oclusión, (3) la
oligomerización de NS5B durante la formación del complejo de replicasa tal
como se sugiere por los estudios in vitro con
 Comunicación rápida
NS5B del VHC o virus de la polio de la polimerasa ( Lyle et al., 2002; Wang et al.,
2002 ). Los resultados obtenidos en los estudios de preincubación NS5B ARN
apoyan la primera hipótesis. proteína NS5B recombinante fue protegida de la
inhibición por no nucleósido, así como la heparina después de la preincubación
con ARN plantilla, lo que sugiere que una proteína de plantilla complejo RNA
estable formado durante el periodo de preincubación es suficiente para conferir
la resistencia. Resultados similares fueron reportados recientemente con
compuestos relacionados a partir de dos clases diferentes de los inhibidores no
nucleósidos, benzimidazoles y benzothiadiazines ( Tomei et al., 2003, 2004 ).
Curiosamente, la inhibición de la polimerasa VHC por el compuesto 3 de la
nueva clase de ácidos tiofeno-carboxílico, que se unen a una región pulgar
separado de los sitios de unión de compuestos de bencimidazol y de
benzotiadiazina también siguió un patrón similar de inhibición en comparación
con benzimidazoles y benzothiadiazines. Por lo tanto, inesperadamente, los
compuestos que se unen a tres sitios de unión distintos sobre NS5B parecen
requerir la oportunidad de unirse a NS5B antes de la formación de un complejo
de ARN proteína-plantilla estable para lograr la inhibición de la polimerasa. Los
factores adicionales pueden contribuir al alto nivel de resistencia replicasa a los
inhibidores no nucleósidos. La proteína NS5B aislado no logró una protección
completa de la inhibición, incluso después de la preincubación prolongado con
ARN. La actividad residual meseta alcanzó niveles máximos de 50-75%
después de 2-4 h para los tres no nucleósidos y heparina, mientras que una
fracción residual de 25-50% de la proteína se mantuvo aparentemente sensibles
a la inhibición. La resistencia completa del complejo replicasa nativa en
comparación con la resistencia parcial del complejo proteína-ARN formado in
vitro podría estar relacionado con un aumento de la estabilidad del complejo de
la polimerasa en la plantilla en la replicasa o al hecho de que la reiniciación de la
próxima ronda de la síntesis de ARN es más eficiente en el complejo de
replicasa. Si el aumento de estabilidad del complejo proteína-ARN en la
replicasa puede ser conferida por la presencia de interacciones adicionales
proteína-proteína o proteína-ARN en el complejo multiproteico o por la
oligomerización funcional de NS5B en el complejo de replicasa espera más
estudios sobre la replicasa del VHC proceso de ensamblaje.
El estudio descrito aquí establecido que el complejo de replicasa de HCV
nativo representa un complejo proteína-ARN estable y productiva con actividad
de síntesis de ARN replicativo. inhibidores alostéricos de NS5B puede, por
tanto, funcionan a través de un mecanismo común antagónicamente con la
formación de un complejo de ARN proteína-plantilla productiva, a pesar de la
unión a distinta, que no se solapan sitios de unión en NS5B. El efecto
observado anteriormente inhibidora de estos compuestos alostéricos en cultivo
de células de replicación del VHC, por tanto, más probablemente el resultado
de la inhibición de la formación de nuevos complejos de replicasa.
Descubrimiento de compuestos, que también podrían interferir con la etapa
química de NMP incorporación o con sustrato NTP unión a NS5B por lo tanto
puede aumentar aún más su impacto global en la replicación del VHC y de la
potencia inhibidora de los inhibidores no nucleósidos futuras.
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materiales y métodos
Compuestos
Los inhibidores no nucleósidos se sintetizaron en Roche Palo Alto
acuerdo con procedimientos publicados. 3 V- desoxi-CTP fue adquirido de
TriLink Biotecnologías (# N-3003).
Preparación de fracción de membrana citoplasmática
fracciones membrana citoplasmática se prepararon a partir de células
Huh7 o una línea celular derivada Huh7 que contiene un replicón de VHC
subgenómico de replicación autónoma. ruptura celular y citoplásmica
aislamiento fracción de membrana se realizaron como se ha descrito
previamente ( Takeda et al., 1986 ). La fracción de membrana aislada se
almacenó en un tampón que contenía HEPES 10 mM, pH 7,5, NaCl 10 mM,
DTT 1 mM, y 15% de glicerol a 5
10 5 equivalente celular / UNA l en
80 8 C hasta el ensayo.
expresión y purificación de proteínas
E. coli cepa M15 se utilizó para la expresión de HCV NS5B570-BK, que
contenía una etiqueta de histidina N-terminal y una deleción de 21 aminoácidos en
el extremo C-terminal. La construcción que contiene la secuencia codificante de
HCV BK residuos de ácido cepa aminoácidos 2421-2999 (número de acceso
GenBank M58335) aguas abajo de un cassette de expresión promotor Taq fue
proporcionado amablemente por Hilary Overton, Roche Descubrimiento Welwyn.
NS5B570-BK se purificó secuencialmente a través de Ni-NTA SuperFlow,
SP-Sepharose, y Superdex 75 columnas. Las fracciones eluidas se comprueban
mediante SDS-PAGE y las fracciones homogéneas que contiene NS5B570-BK se
agruparon. La concentración de proteína se determinó utilizando el reactivo de
proteínas Pierce Coomassie.
En ensayo de replicasa vitro
Las reacciones de ensayo replicasa estándar contenían 10 UNA l fracción
citoplásmica de la membrana, HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 10 mM, DTT 10
mM, MgCl 5 mM 2, 20 UNA g / ml de actinomicina D, ATP 1 mM, GTP y UTP, 30
UNA ci [ una- 33 P] -CTP (3000 Ci / mmol, 10 mCi / ml), 1 U / UNA l SUPERase.In
(Ambion), 10 mM fosfato de creatina, y 200 UNA g / ml fosfoquinasa de
creatina en un volumen final de 25 UNA l. Las mezclas de reacción se
incubaron a 30 8 C durante 120 minutos y se detuvo mediante la adición de
EDTA 50 mM y 0,5% de SDS. Los productos de ARN se recuperaron
mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol después
de la extracción de proteínas por digestión con proteinasa K. Los productos de
ARN se desnaturalizaron en tampón de carga de muestra glioxal y se
resolvieron en gel de fosfato de agarosa-sodio al 1%. análisis
autorradiográfica de los productos de ARN se realizó con phosphoimager y
software ImageQuant (Amersham Biosciences). actividad de síntesis de ARN
en presencia de inhibidores de los compuestos se expresó como un
porcentaje
14
de la actividad de la síntesis de ARN en ausencia de compuestos inhibidores.
ensayo de la polimerasa del VHC
El molde de ARN Cires 377 nucleótidos de largo, que se derivó de la
cadena complementaria de la región IRES del genoma de HCV se generó
por la ARN polimerasa de T7 mediada por la transcripción usando el kit
MEGAscript T7 (Ambion). mezclas de reacción enzimática que contienen 10 UNA
g / ml plantilla de ARN Cires, enzima 200 nM NS5B570-BK, 2,1 UNA Ci de
UTP tritiada (42 Ci / mmol), 1 UNA M ATP, CTP, y GTP, 1 tampón TMD (40
mM Tris-HCl pH 8,0, DTT 4 mM, y MgCl 4 mM 2), NaCl 2,5 mM, con o sin
inhibidores en un volumen total de 50 UNA l se incubaron durante 2 horas a
30 8 C. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10% (v / v) de
ácido tricloroacético. La actividad enzimática de NS5B570 BK se midió
como la incorporación de monofosfatos de nucleótidos radiomarcados en
productos de ARN insolubles ácidos. ensayo de preincubación NS5B-ARN
se basó en el ensayo de la polimerasa del VHC descrito anteriormente con
las siguientes modificaciones. Mezcla A (25 UNA l por reacción) contenía 20 UNA
g / ml plantilla de ARN Cires, enzima 400 nM NS5B570-BK, y 1 búfer TMD.
Mezcla B (25 UNA l por reacción) contenía 4,2 UNA Ci de UTP tritiada (42 Ci /
mmol), 2 UNA M ATP, CTP, y GTP, 20 UNA compuesto M o 2
UNA sol/ UNA l heparina, y 1 búfer TMD. Mezclas A se incubaron a temperatura
ambiente durante hasta 4 h antes de la adición de la mezcla B para comenzar la
reacción. La actividad relativa por ciento se representó como una función del
tiempo de preincubación.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a Peter Bloomgren, Lina Setti, Mateo Muñoz, Jason
Harris para la síntesis de los inhibidores no nucleósidos, y Joan Chow y
Jim Barnett para proporcionar proteínas del VHC-BK NS5B570.
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