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Para tener un mejor conocimiento de los procesos llevados a cabo en estapráctica de

laboratorio, se hace necesario el empezar explicando detalladamente que es una
levadura.

Se denomina así a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son
importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediante fermentación de
diversos cuerpos orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo
distintas sustancias.

Producen enzimas capaces de descomponer diversos sustratos, principalmente los azúcares. A

estas se les ha dado diferentes usos, en gastronomía se utiliza desde la antigüedad en la
elaboración de distintos alimentos, como el pan, el vino o la cerveza.

En cada una de las pruebas realizadas se emplearon los siguientes carbohidratos:

2    
  
Glucosa Monosacárido , aldosa , hexosa
Fructosa Monosacárido, cetohexosa
Sacarosa Disacárido , (alfa-glucopiranosa y beta-fructofuranosa )
Almidón Polisacárido, (amilosa y amilopectina)

En la Tabla 1 se describe la conformación de varios de los carbohidratos, además de algunos

aspectos generales referentes a su estructura.

3  4 4 ?
:

Las condiciones necesarias para llevar a cabo el procedimiento, fueron ausencia de oxígeno y
un medio acuoso, debido a que el proceso de fermentación alcohólica desarrollado en varios de
los carbohidratos, se genera en condiciones anaeróbicas que contribuyen a la producción de
dióxido de carbono y etanol.
Los resultados obtenidos en muchos de los casos no fueron lo esperado, esto se explicara
másadelante, aun así se ha hecho una estimación de lo que deberíaobtenerseen condiciones
favorables.

2
 


 (orden de mayor a menor )
V Fructosa
V Glucosa
rV Sacarosa
V Almidón (No hay desplazamiento)

En la Tabla 2 se describe el desplazamiento del embolo de mayor a menor,la estimación de

estos resultados se explicara más detalladamente a continuación.

°V ¢4
4


El desplazamiento generado para esta prueba es bastante significativo , aunque menor al

generado por la fructosa , esto se debe a que se parte inicialmente del sustrato principal del
proceso de glucolisis , en donde la levadura actúa enzimáticamente segregando las enzimas
principales conocidas como zimasas , encargadas de convertir la glucosa en etanol y dióxido
de carbono ,esta actividad de estos microorganismos permite procesar muchos de los
carbohidratos , formandoasí energía suficiente para la supervivencia de estos .

Una vez la levadura inicia el proceso enzimático sobre el sustrato se genera la glicolisis, en
donde el objetivo principal es la formación de un compuesto que pueda escindirse fácilmente en
derivados fosforilados de tres carbonos. la energía requerida se obtendrá de estos compuestos.

La glucosa entra en la mayoría de las células por medio de un transportador específico o sistema
activo, dentro de la célula solo tiene un único destino: ser fosforilada por el ATP para formar
glucosa ± 6 ± fosfato. la transferencia del grupo fosforilo del ATP al grupo hidroxilo del C-6 de
la glucosa se halla catalizado por la hexoquinasa, como se muestra en la Figura 1.

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. Conversion de la Glucosa a Glucosa-6-fosfato

La hexoquinasa,entonces, es una enzima que transfiere un grupo fosforilo desde el ATP a un

grupo de azucares de seis carbonos (hexosas). La hexoquinasa al igual que otras quinasas
requiere para su actividad Mg +2..

La etapa siguiente en la glicolisis es la isomerización de la glucosa -6-fosfato a fructosa-6-

fosfato. el anillo piranosico de seis miembros de la glucosa -6-fosfato se convierte en el anillo
furanosico de cinco miembros de la fructosa-6-fosfato, esto seconoce comolaconversion de una
aldosa a una cetosa(Fig 2).
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Conversión de la Glucosa-6-fosfato a frutosa-6-fosfato

A la etapa de isomerización le sigue una segunda reacción de fosforilacion. la fructosa-6-fosfato

es fosforilada porel ATP hasta fructosa-1,6-difosfato (Fig3).

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r Conversión de la Fructosa-6-fosfato a Fructosa-1,6-difosfato

Esta reacción es catalizada por la fosfofructoquinasa, una enzima alosterica. La marcha de la

glicolisis depende críticamente del nivel de actividad de esta enzima. la actividad catalítica de
la fosfofructoquinasa es controlada alostericamente por el ATP y otros metabolitos.

La segunda etapa de la glicolisis consta de cuatro pasos, comenzando por la división de la

fructosa-1,6-difosfato en gliceraldehido-3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato. En los siguientes
pasos de la glicolisis reaccionan compuestos de tres carbonos en vez de compuestos de seis
carbonos (Fig 4).

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Esta reacción esta catalizada por la aldolasa, el gliceraldehido-3-fosfato se encuentra en la vía

directa de la glicolisis, pero no la dihidroxiacetona fosfato. Sin embargo, esta última puede
convertirse fácilmente en gliceraldehido-3-fosfato. Estos compuestos son isómeros: la
dihidroxiacetona fosfato es una cetosa mientras que el gliceraldehido-3-fosfato es una aldosa.
La isomerización de los azucares fosforilados de tres carbonos va catalizada por la triosa fosfato
isomerasa (Fig 5).
 ï


Así pues se forman dos moléculas de gliceraldehido-3-fosfato a partir de una molécula de

fructosa-1,6-difosfato por la acción secuencial de la aldolasa y la triosa fosfato isomerasa(Fig
6).

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De esta forma hasta ahora se ha transformado una molécula de glucosa en dos moléculas de
gliceraldehido-3-fosfato. Todavía no se ha extraídoenergía. ahora llegamos a la reacción de
conversión del gliceraldehido-3-fosfato hasta 1,3-difosfoglicerato (1,3-DPG), reacción
catalizada por la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa.

Gliceraldehido-3-fosfato + NAD+ + Pi 1,3-DPG + NADH + H +

En seguida se utilizara el alto potencial de transferencia de fosfato del 1,3-DPG para generar
ATP, esta es la primera reacción de generación de ATP en la glicolisis .la fosfogliceratoquinasa
cataliza la transferencia del grupo fosfórico del 1,3-DPG al ADP.

Una vez se obtiene el 3-fosfoglicerato, este es convertido a 2-fosfoglicerato por medio de la

acción catalítica del fosfogliceratomutasa, que se encarga de generar un cambio intramolecular
de un grupo químico como el fosfórico (Fig 7).

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 Cambio Intramolecular

En la siguiente reacción se forma un enol por la deshidratación del 2- fosfoglicerato. La enolasa

cataliza la formación del fosfoenolpiruvato . esta reacción de deshidratación eleva
marcadamente el potencial de transferencia del grupo fosforilo. (Fig 8).
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Reacción de Deshidratación

La ultima reacción para la formación del piruvato , es la transferencia de un grupo fosforilo

desde el fosfoenolpiruvato hasta el ADP que se encuentra catalizada por lapiruvatoquinasa,
(Fig 9).

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Obtención del Piruvato

Para la producción de etanol , se lleva a cabo una descarboxilacion del piruvato.

Piruvato + H+ acetaldehído + CO2

Esta reacción se encuentra catalizada por la piruvato descarboxilasa , que contiene tiamina
pirofosfato como coenzima . La tiamina pirofosfato actua como coenzima de una serie de
descarboxilasas.

En seguida se produce la reducción de acetaldehído a etanol por el NADH. El alcohol

deshidrogenasa cataliza esta reacción de óxido-reducción

Acetaldehído + NADH + H+ etanol + NAD +

La reacción neta de este proceso anaeróbico es:

Glucosa + 2 Pi + 2ADP + 2H+ 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O

De esta forma se obtiene el CO2 que desplaza el embolo , debido a que este es más denso que el
oxígeno, por lo que la presión generada dentro de la jeringa será mayor , contribuyendo a su
desplazamiento.

°V ï4
4

La fructosa es un monosacárido por lo que la obtención de CO2 y etanol , en este caso se

generaran de la misma forma que para glucosa, la cantidad de gas producido para este caso debe
ser mayor, puesto que separte de un sustrato intermediario y no de la glucosa ,esto contribuye a
que se lleve a cabo la fosforilacion de inmediato , generando que la célula se ahorre un paso en
el proceso de glicolisis, su desplazamiento se ve incrementado debidoa que se genera más
desprendimiento de gas , pues la duración del proceso es mucho más corta en relación a el de la
glucosa , la cual debe primero fosforilarse y convertirse a fructosa , la obtención de etanol y
di
ido de carbono se lleva a cabo de la misma forma que para la glucosa , pues las dos sufren
un proceso de glicolisis que es llevado a fermentaci n una vez se obtiene etanol a partir del
acetaldehído generado por la descarboxilacion del piruvato.

El que el proceso de glicolisis se lleve a cabo en menos pasos implica que la cantidad de gas
generado en una misma cantidad de tiempo debe ser mayor que el generado por la glucosa.

°V   + 5/0#


La obtenci n de gas en este caso es menor debido a que la sacarosa es un disacárido , por lo que
primero debe generarse un proceso de hidrolisis que permita que los carbohidratos por los que
esta se encuentra compuesta queden dispuestos en monosacáridos como glucosa y fructosa , las
enzimas encargadas de este proceso de hidrolisis son secretadas por la levadura y se denominan
invertasas , se caracterizan porque su hidrolisis puede hacerse al nivel del puente de oxigeno por

una glucosidasa o del lado de la fructosa con la inversi n de una b-fructosidasa , generando

siempre los mismos productos y dando paso a la iniciaci n de la glicolisis hasta generar C y
etanol , el desprendimiento de gas en este caso es menor debido a que inicialmente el
carbohidrato debe sufrir un proceso de ruptura, por lo que comparando el tiempo que emplea la
glucosa para empezar este proceso , podría decirse que esta inicia más rápidamente, por lo tanto
 
la obtenci n de di xido de carbono y etanol será mucho más eficaz en este caso que en el de la
sacarosa , la cual debe sufrir primeramente una hidrolisis para iniciar así la glicolisis en la
célula.

°V (' + 5/0#

Este polisacárido no obtuvo desprendimiento de gas y por consecuencia tampoco se generó

movilidad del embolo , este resultado se debe a que el proceso de hidrolisis al que debe ser
sometido lleva tiempo y quizás necesite de la acción de un ácido que acelere este proceso , el
almidón puede ser fermentado y por lo tanto producir dióxido de carbono y etanol , pero las
condiciones expuestas del laboratorio no fueron lo suficientemente fuertes como para
hidrolizarlo completamente, por esta razón el proceso de glicolisis no se llevó a cabo.

Muy posiblemente la completa hidrolisis del almidón pueda llevarse más efectivamente en
presencia de otras levaduras.

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 $  + '$ 6# 

'$ # NaOH

En este caso ninguno de los carbohidratos empleados genero desplazamiento del embolo , lo
cual indica que el proceso de fermentación alcohólica no se llevó a cabo , esto se debe a que la
adición de una base dismuye el pH de la solución por lo que el crecimiento y desarrollo de las

levaduras se verá afectado , pues su rango de actividad se sit a entre pH 3.5 y 5.5 por lo que la
disminución del mismo contribuye a que su acción sobre el sustrato se vea seriamente afectada ,
evitando así que la glicolisis se lleve cabo y por consiguiente también el proceso de
fermentación .

"- )  %  6#

Para este caso la presencia de levadura se reemplaza por una cepa de microorganismos llamados
lactobacillus , los cuales contribuirán a llevar a cabo la fermentación láctica esperada, la cual es
una ruta metabólicaanaeróbica que ocurre en el citosol de la célula, en la que se oxida
parcialmente la glucosa para obtener energía y donde el producto de desecho es el ácido láctico.

Esta reacción también se genera en las células de los organismos superiores cuando la cantidad
de oxigeno disponible es limitada, como ocurre en el musculo durante la actividad intensa. La
reducción del piruvato por el NADH para formar lactato esta catalizada por la lacto
deshidrogenasa :

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C
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Lactato
rogenasa
C
 + +
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+




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la reacción global de la glucosa en lactato es :

Glucosa + 2 Pi + 2 ADP 2 Lactato + 2 ATP + 2 H 2O

Al igual que en la fermentación alcohólica , no existe oxido-reducción neta . el NADH formado

en la oxidación del gliceraldehido -3-fosfato se consume en la reacción del piruvato. La
regeneración del NAD+ en la reducción del piruvato hasta lactato impiden que la glicolisis cese
en condiciones anaeróbicas. Solamente una pequeña fracción de la energía de la glucosa se
libera en la conversión anaeróbica hasta lactato ,para este caso no se espera desplazamiento del
embolo debido a que no se genera fermentación alcohólica que produzca dióxido de carbono ,
pues lo que se lleva a cabo es una fermentación láctica en donde se ocasiona nuevamente el
proceso de glicolisis ya descrito anteriormente para la glucosa hasta piruvato en donde gracias a
las enzimas especializadas , el piruvato pasa a ácido láctico .

La adición del medio acuoso facilita la actuación de los microorganismos sobre el sustrato.

El fracaso en muchos de las pruebas realizadas se debió a que la solución tampón no se

encontraba bien preparada ocasionando que el amortiguamiento del pH no se llevara a cabo de
forma eficaz,lo cual es necesario ya que el efecto de la levadura sobre el sustrato se ve
claramente afectado si no se tiene un pH comprendido entre 3.5 y 5.5 ,pues la modificación de
este se genera a medida que se lleva a cabo la glicolisis con mucho de los sustratos
intermediarios.

De esta forma se puede concluir que como la solución amortiguadora no fue lo suficientemente
fuerte como para regular el pH , en muchos de los casos no se pudo llevar a cabo el proceso de
glicolisis pues el efecto de la levadura se vio alterado.

'('*'' #

Para este proceso se empleó carbonato de sodio para eliminar el agua presente en el medio ,
enseguida se añadió una solución de yodo/yoduro en condiciones de temperatura de 70°C a
través de un baño de agua , la adición de la solución de yodo se hace en exceso para asegurar
que todas las moléculas de etanol reaccionen y den paso a la formación del precipitado de
yodoformo, la formación de este se genera por el desprendimiento del carbono 2 de la
moléculade etanol, al encontrarse ligado a tres átomos de yodo ; por medio de este precipitado
puede determinarse la presencia de etanol efectivamente.

Esta prueba para nuestro caso fue negativa puesto que en ninguno de los casos se obtuvo una
fermentación alcohólica.

'('*'7   #

Para esta prueba se empleó éter etílico , en el cual se disolvió el ácido láctico generado por la
fermentación láctica , esta disolución permite un aislamiento de este producto, facilitando así la
determinación del mismo por la formación de un complejo de hierro +3 , la obtención de este
compuestogenera en la solución una coloración verde-amarillenta .

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 V

*8 ,  

Para nuestro caso esta prueba dio negativa debido a que no se obtuvo ácido láctico , por lo tanto
la determinación del mismo no fue posible.

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°V la determinación de la fermentaciónalcohólica puede hacerse visualmente con el

desplazamiento del embolo , debido al desprendimiento de gas obtenido por la generación
de dióxido de carbono ; mientras que la fermentación láctica se determina solo por el
aumento del volumen del líquido contenido en la jeringa , proveniente del ácido láctico
producido.

°V La utilización de una solución tampón , permite el favorecer las condiciones óptimas de pH

para que la levadura pueda actuar de forma satisfactoria sobre cada uno de los sustratos.

°V El empleo de una solución tampón se hace necesaria debido a que a medida que se lleva a
cabo el proceso de glucolisis , la generación de cada uno de los sustratos intermediarios
modifica el pH de la solución , lo cual puede afectar la acción de la levadura.

°V El desprendimiento de gas estimado para la fructosa debe ser mayor , puesto que esta es un
sustrato intermediario , en donde la fosforilacion por parte de la enzima da paso al
desarrollo de glucolisis , esto quiere decir que el proceso no tarda tanto pues se parte de un
producto intermediario.
°V En el caso de sacarosa el desprendimiento de gas fue menor , pues antes de iniciar el
proceso de glucolisis y fermentación , la céluladebió segregar enzimas que dieran paso su
hidrolisis.
°V El almidón no genero un desprendimiento de gas , debido a que este es un polisacárido, por
lo que las condiciones para que se llevara a cabo su fermentación debieron ser más fuertes,
generando así los monosacáridos que serán empleados en el proceso de glucolisis.




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ermented Beverage Production", Andrew Geoffrey Howard Lea, John Raymond Piggott; 2003;
Ed. Springer Verlag, ISBN 0-306-47706-8

ermentación alcohólica: Una opción para la producción de energía renovable a partir de
desechos agrícolas", H.J. Vázquez, INGENIERÍA Investigación y Tecnología VIII. 4. 249-259,
2007.

ermentation Process Development of Industrial Organisms", Justin O. Neway, 1989; Marcel
Dekker; ISBN 0-8247-7917-7.