EPRACTICA 3: IDENTIFICACION Y DETERMINACION DE PROPIEDADES

FISICOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

CAMACHO DAZA, Jenner Julian; GALLEGO GARCIA, Vivian Andrea.

Laboratorio de Bioquímica, Ingeniería Bioquímica, Facultad de ingeniería,
Universidad Icesi
Santiago de Cali
Febrero 16 de 2019
jenner.camacho1@correo.icesi.edu.co, vivian.gallego1@correo.icesi.edu.co

OBJETIVOS

Objetivo general
Identificar algunas de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas y su función en la
desnaturalización de estas.

Objetivos específicos
1. Conocer las condiciones bajo las cuales se puede dar la desnaturalización de las
proteínas.
2. Identificar la presencia de proteínas en ciertos alimentos comúnmente utilizados.
3. Entender la importancia y la aplicación del punto isoeléctrico de las proteínas.

RESULTADOS

1. Solubilidad
En este método se mide propiedad química que se refiere a la capacidad de una sustancia
determinada, el soluto, para disolverse en un disolvente; es decir, la solubilidad.
Imagen 1. Resultados prueba de solubilidad. De izquierda a derecha; tubo 1: solución A
con 4 mL de agua fría; Tubo 2: solución A con 4 mL de agua caliente; Tubo 3: solución A
con 4 mL de NaOH al 10%.

En el tubo uno, al mezclar la solución A con el agua fría a 4,45 ºC, observamos que el
líquido se tornó turbio y después de agitar se formó espuma.
En el tubo dos, al mezclar la solución A con el agua caliente, la solución también se tornó
menos translúcida, y al agitar se formó menos espuma que en el tubo uno.
En el tubo tres, que contenía solución a mezclada con 4ml de NaOH al 10%, el líquido
permaneció translúcido y al agitarlo se produjo bastante espuma, más que en el primer
tubo.

2. Pruebas colorimétricas

En las pruebas colorimétricas, con el reactivo de Biuret, se evalúa la presencia de proteínas

en los alimentos, ya que el cobre presente en este reacciona con las proteínas formando
un complejo de color violeta.
Imagen 2. Tubos utilizados en las pruebas colorimétricas antes de añadir el reactivo de
Biuret. De izquierda a derecha; tubo 1: solución A; tubo 2: leche en polvo; tubo 3: pescado;
tubo 4: carne molida; tubo 5: salchicha; tubo 6: jamón; tubo 7: caldo de pollo; tubo 8: jugo
de papa: tubo 9: jugo de fruta (lulo).
Imagen 3. Resultados de las pruebas colorimétricas. De izquierda a derecha; tubo 1:
solución A; tubo 2: leche en polvo; tubo 3: pescado; tubo 4: carne molida; tubo 5: salchicha;
tubo 6: jamón; tubo 7: caldo de pollo; tubo 8: jugo de papa: tubo 9: jugo de fruta (lulo).

En la siguiente tabla se registran los cambios de color observados.

Tubo Color antes de añadir Color después de añadir el reactivo de Biuret
el reactivo de Biuret

1 translúcido morado translúcido

2 blanco morado claro no translúcido

3 rosado claro morado un poco oscuro

4 rojo marrón

5 rosado morado oscuro

6 beige se observan dos fases:

 la fase que se encuentra en el fondo es de color blanca,
y la fase que permanece en la superficie es de color
morado oscuro

7 amarillo claro verde

translúcido

8 rosado (color piel) azul

9 amarillo oscuro amarillo-verde

Tabla 1. Cambios de color en los alimentos preparados al añadir el reactivo de Biuret.

3. Pruebas con sales minerales (de metales)

En esta prueba se evalúa cómo el cambio de pH de la solución A por la adición de diferentes
reactivos, y la alta concentración de sales produce la desnaturalización de la proteína
(albúmina de huevo) y por ende la formación de precipitado.

Imagen 4. Cuatro tubos utilizados para las pruebas con sales minerales, cada uno de ellos
con 2 mL de solución A.
Imagen 5. De izquierda a derecha; tubo 1: solución A con 2 gotas de ácido acético al 10%;
tubo 2: solución A; tubo 3: solución A con 2 gotas de ácido acético al 10%; tubo 4: solución
A.

A los tubos 1 y 3 se les añadió dos gotas de ácido acético provocando que se perdiera la
translucidez y se formara un poco de espuma.
Imagen 6. De izquierda a derecha; tubo 1: solución A con 2 gotas de ácido acético al 10%
y 1 mL de solución saturada de cloruro de sodio; tubo 2: solución A y 1 mL de solución
saturada de cloruro de sodio; tubo 3: solución A con 2 gotas de ácido acético al 10% y 2
gotas de solución de cloruro de calcio al 10%; tubo 4: solución A y 2 gotas de solución de
cloruro de calcio al 10%.

En los tubos 1 y 3 se observa que la solución se torna turbia y que hay presencia de espuma.
En el tubo 2 también hay presencia de espuma, pero no se observan más cambios y el tubo
4 permanece igual durante todo el procedimiento.

La siguiente tabla se presentan los cambios de pH de las soluciones presentes en los tubos
conforme se les añadían los reactivos
 4. Efecto del calor
En esta prueba se mide la temperatura a la cual se forma precipitado en una solución de
albúmina de huevo y agua destilada, en relación 1:3.

Imagen 7. Tubo con 3 mL de solución A después de ser sometido a una fuente de calor.

Al poner el tubo al baño maría se formó precipitado bastante opaco cuando el agua en el
que esté se encontraba alcanzó los 68 ºC.
 5. Efecto del alcohol etílico
En esta prueba se evidencia cómo el alcohol etílico provoca la desnaturalización de las
proteínas produciendo un precipitado.

Imagen 8. Resultado de la prueba del efecto del alcohol etílico.

Al agregar 2 mL de alcohol etílico a 1 mL de solución A se forma inmediatamente un

precipitado tal como se observa en la imagen 8.
 6. Determinación del punto isoeléctrico
En esta prueba se determina el punto isoeléctrico de la leche por medio del uso de
soluciones buffer de ácido acético 0.1M y acetato de sodio 0.1M

Imagen 9: Soluciones amortiguadoras de ácido acético 0.1M y acetato de sodio 0.1M. De

izquierda a derecha; tubo 1: 5mL de ácido acético 0.1M; tubo 2: 4mL de ácido acético 0.1M
y 1mL de acetato de sodio 0.1M; tubo 3: 3mL de ácido acético 0.1M y 2mL de acetato de
sodio 0.1M;tubo 4: 2mL de ácido acético 0.1M y 3mL de acetato de sodio 0.1M; tubo 5: 1mL
de ácido acético 0.1M y 4mL de acetato de sodio 0.1M; tubo 6: 4mL de acetato de sodio
0.1M

Se añadió 1mL a cada tubo de ensayo y se dejo reposar por 10 minutos, al finalizar el
tiempo, se observa la precipitación de las proteinas en los tubos 2, 3 y 4.
Imagen 10: Soluciones amortiguadoras con 1mL de solución de leche diluida sin agitar.
Imagen 11. Resultado de prueba de punto isoeléctrico. Soluciones amortiguadoras con
leche diluida pasado 10 minutos de ser mezclados.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

1. Solubilidad
La ovoalbúmina es una es una fosfoglicoprotein ́ a globular que consta de 385 residuos de
aminoácidos y es la proteína principal de la clara de huevo, corresponde aproximadamente
entre el 60 - 65% del peso de esta.
http://www.quimica.es/enciclopedia/Ovoalbúmina.html#_note-0/

La ovoalbúmina en solución puede desnaturalizarse y agregarse mediante el uso de

diferentes tratamientos. Su temperatura de desnaturalización es de alrededor de 84 ° C.
Por si sola, la ovoalbúmina es insoluble en agua. Es por esto por lo que cuando la solución
A es tratada con agua fría, a 4,5 ºC, se observa un líquido turbio. Igualmente, cuando se
trata con agua caliente se observa un líquido medianamente turbio, en este caso un mayor
aumento de temperatura provocaría que la proteína se desnaturalice formando un
precipitado, es por esto por lo que, aunque el agua se caliente, la proteína no aumenta su
solubilidad, sino que está más cercana su temperatura de desnaturalización.

Un factor que altera la solubilidad de la ovoalbúmina es el tratamiento con NaOH al 10%.

Esto provoca un proceso llamado Salting in el cual consiste en que, a bajas concentraciones
de sal, se aumenta la solubilidad de la proteína en agua, ya que los iones Na+ y
OH- interactúan con las cadenas laterales de la proteína, en este caso ovoalbúmina.
(Arakawa & Timasheff, 1984)Es por esto por lo que la mezcla presente en este tubo es la
única que se ve translúcida y de una sola fase, pues la proteína logra disolverse.

2. Pruebas colorimétricas.

Para realizar las pruebas colorimétricas se utilizó el reactivo de Biuret. Este contiene iones
de cobre (Cu2+) los cuales reaccionan con los grupos NH de los enlaces peptídicos, cuando
se encuentran en medio básico, formando un producto de color morado tal como se observa
en la imagen 12. La intensidad de color producido es proporcional a la concentración de
proteínas y es medida espectrofotométricamente a 550 nm, es por esto por lo que se utiliza
para la cuantificación de proteínas en diferentes alimentos. (Wharton, 1972)

Imagen 12. Reacción de una proteína con el reactivo de Biuret.

Basándonos en lo mencionado anteriormente y en lo observado en la imagen 3,

identificamos que, de los alimentos analizados, los siguientes poseían proteínas: Leche,
pescado, carne molida, salchicha y el jamón, además de la solución A.

3. Pruebas con sales minerales (de metales).

Como se mencionó anteriormente, el pH y la concentración de sal en una disolución puede

alterar la formación o no formación de precipitado de una proteína presente en esta.
La influencia del pH está ligada con el punto isoeléctrico de la proteína. Si el pH de la
disolución en la cual se encuentra la proteína es cercano o igual al punto isoeléctrico de la
proteína, los aminoácidos de esta presentarán una carga parcial neutra, lo cual provoca su
desnaturalización y la aparición de precipitado.
De igual manera, la alta concentración de sales en la mezcla provoca un proceso llamado
salting out el cual consiste en que, a altas concentraciones de sal, las moléculas de agua
dejan de reaccionar con las proteínas para reaccionar con las moléculas de sal presentes
e intentar disolverlas, impidiendo que el agua disuelva a la proteína y formando un
precipitado.

pH sin pH con reactivo

reactivo
Tubo de ensayo Ácidoacético Cloruro Cloruro de
10% de Calcio 10%
Sodio
1 9 4-5 4-5 N.A
2 9 N.A 8 N.A
3 9 4-5 N.A 4-5
4 9 N.A N.A 9
Tabla 2. pH de tubos de ensayo con solución A para la prueba de sales minerales

En el tubo 1 que contenía solución A con ácido acético y cloruro de sodio se observó la
formación de precipitado debido a que el pH de esta mezcla estaba entre 4 y 5, y el punto
isoeléctrico de la ovoalbúmina es de pH = 4,5, además de tener una alta concentración de
sal. Es decir, se presentaron los dos fenómenos que producen la presencia de precipitado,
la influencia de pH y el proceso de salting out.

En el tubo 2, el cual contenía una mezcla de solución A con 1 mL de solución saturada de

cloruro de sodio se observan dos fases, una fase líquida y una pequeña cantidad de
precipitado el cual fue obtenido por el proceso de salting out.

En el tubo 3 que contenía solución A con ácido acético y cloruro de calcio al 10%, debido
al efecto del pH, pues el pH de esta mezcla estaba también entre 4 y 5, se observó la
formación de precipitado, aunque no tan opaco como en el tubo 1.

Finalmente, en el tubo 4 no se observó formación de precipitado, por el contrario, la solución

A se disolvió completamente en agua, esto debido a que al tener un pH básico de 9 y una
pequeña cantidad de cloruro de sodio ya que se presentó el proceso de salting in explicado
anteriormente.

4. Efecto del calor

La desnaturalización de las proteínas es la pérdida de las estructuras de orden superior

(secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a su
estructura primaria. (Elmhurst College , s.f.)
 “Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente
disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la
desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas
eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitará la
agregación intermolecular y provocará la precipitación. La precipitación suele ser
consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización.” (González Mañas, s.f.)

El calor se usa para romper los enlaces de hidrógeno y deshacer las interacciones
hidrofóbicas no polar. Esto ocurre debido a que el calor aumenta la energía cinética de las
partículas y hace que las moléculas vibren tan rápida y violentamente que los enlaces se
rompen.

La temperatura óptima de la clara de huevo es de 60 ºC, es por esto por lo que, al exceder
esta temperatura, como la temperatura usada en la práctica (68 ºC), el calor comienza a
actuar sobre los enlaces presentes en las proteínas desnaturalizándolas.

La relación tiene la desnaturalización de proteínas con la práctica culinaria común de

preparar huevos cocidos es que al freír o cocer un huevo, las cadenas de las proteínas se
desnaturalizarán por acción del calor y se desenrollarán haciendo que se formen nuevos
enlaces entre las cadenas polipeptídicas. Esto hará que el huevo se solidifique parcialmente
y adquiera el color blanco comúnmente conocido.

5. Efecto del alcohol etílico

El alcohol etílico es miembro de una clase de compuestos orgánicos. Su fórmula molecular

es C2H5OH. El alcohol etílico es un importante producto químico industrial; Se usa como
solvente, en la síntesis de otros químicos orgánicos, es también el ingrediente intoxicante
de muchas bebidas alcohólicas como la cerveza y el vino.

En las proteínas, la unión de hidrógeno se produce entre los grupos amida en la estructura
de la proteína secundaria. Mientras que la unión de hidrógeno entre cadenas laterales se
produce en la estructura terciaria de la proteína en una variedad de combinaciones de
aminoácidos. Todos estos enlaces mencionados anteriormente son interrumpidos por la
adición de alcohol. El alcohol desnaturaliza las proteínas interrumpiendo los enlaces de
hidrógeno intramolecular de la cadena lateral. A su vez, se forman nuevos enlaces de
hidrógeno entre la nueva molécula de alcohol y las cadenas laterales de proteínas.
(Elmhurst College , s.f.)

En la práctica se añadieron 2 mL de alcohol etílico a 1 mL de solución A; ya conociendo el

papel que desarrolla el alcohol etílico sobre las proteínas era de esperarse que la proteína
se desnaturalice y precipite de forma veloz.
5. Determinación del punto isoeléctrico.

Para determinar el pH en la prueba del punto isoeléctrico, se empleó la ecuación de

Henderson-Hasselbach y las concentraciones de los tubos de ensayo como se muestra a
continuación, tomando como ejemplo la muestra #2:

[𝑆𝑎𝑙]
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔( )
[Á𝑐𝑖𝑑𝑜]

0.001𝐿𝑁𝑎𝐶2𝐻3𝑂2
𝑝𝐻 = 4.76 + 𝑙𝑜𝑔( )
0.004𝐿𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻

𝑝𝐻 = 4.16

Ácido acético(L) Acetato de Sodio(L) pH

0.005 0 N. A

0.004 0.001 4.16

0.003 0.002 4.58

0.002 0.003 4.94

0.001 0.004 5.36

0 0.005 N. A
Tabla 3. Determinación de pH de soluciones buffer en la prueba del punto isoeléctrico

El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH de una solución en la cual la carga neta
de la proteína se vuelve cero. A una solución de pH que está por encima del pI, la superficie
de la proteína está predominantemente cargada negativamente y, por lo tanto, las
moléculas con carga similar exhibirán fuerzas repulsivas. Del mismo modo, a una solución
de pH que está por debajo del pI, la superficie de la proteína está predominantemente
cargada positivamente, y se produce repulsión entre las proteínas. Sin embargo, en el punto
isoeléctrico, las cargas negativas y positivas están equilibradas, por lo que se reducen las
fuerzas electrostáticas repulsivas, y predominan las fuerzas de atracción, lo que causa
agregación y precipitación. El pI de la mayoría de las proteínas está en el rango de pH de
4 a 7. (P. Novák, 2016)

La proteína principal de la leche es la caseína, esta constituye alrededor del 80% de las
proteínas presentes en la leche. Para la caseína, el punto isoeléctrico es de
aproximadamente 4.6. Por lo tanto, al observar los datos de la Tabla 2 encontramos que
los tubos 3, 4 y 2 tiene un pH de 4.58, 4.94 y 4.16 respectivamente son los que se
encuentran más cercanos al pH de 4.6. Es así que concuerda que en l58a práctica estos
tubos hayan precipitado a diferencia del tubo 1 que tiene un pH muy ácido y los tubos 5 y 6
tienen un pH más básico y por ende la proteína sigue siendo soluble en la solución y no se
precipita.

Conocer el punto isoeléctrico es útil al momento de utilizar el enfoque isoeléctrico(IEF), que

es una técnica para separar moléculas cargadas , generalmente proteínas o péptidos, IEF
funciona porque en un campo eléctrico las moléculas en un gradiente de pH migrarán hacia
su pI. En la mayoría de los casos, se utiliza una tira de gradiente de pH inmovilizado (IPG)
disponible en el mercado. La tira de IPG consiste en un gel de acrilamida que contiene
poros anchos para evitar un efecto de cribado basado en la masa proteica, con un gradiente
de pH. Hay varios gradientes disponibles, con gradientes más amplios, como el pH 3-10
que se usan para el análisis del proteoma completo, y rangos más estrechos, como el pH
5-8 que se usan para aplicaciones más especializadas. (Jones)

CONCLUSIONES

1. La solubilidad, salting in/out, el enlace peptídico, el punto isoeléctrico, entre otras,

son propiedades fisicoquímicas de las proteínas que determinan si estas se
encuentran en su estado natural o desnaturalizadas.

2. La concentración de sal, el pH del medio y el calor son factores externos que

contribuyen a la desnaturalización de las proteínas.

3. Alimentos comunes como la carne, la leche y el huevo representan un alto aporte

proteico, mientras que la papa, el caldo de pollo y el jugo de fruta no están
compuestos por proteínas.

4. Conocer el punto isoeléctrico de una proteína permite determinar las condiciones a

las cuales se puede separar una proteína con ayuda de técnicas como el enfoque
isoeléctrico.

BIBLIOGRAFÍA
P. Novák, V. H. (2016). Proteomic Profiling and Analytical Chemistry .

Bank, E. (s.f.). What Does a Biuret Test Mean in Biology? Seattlepi.

Elmhurst College . (s.f.). http://chemistry.elmhurst.edu/vchembook/index.html.

Jones, P. (s.f.). Isoelectric Focusing for Separation of Proteins and Peptides. BiteSizeBio.

González Mañas, J. M. (s.f.). Curso de Biomoleculas. Obtenido de

http://www.ehu.eus/biomoleculas/index.htm
Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent
cation salts: balance between hydration and salt binding.

Wharton. (1972). Revistas La Salle. Obtenido de

https://revistas.lasalle.edu.co/index.php/sv/article/download/4076/3160/

http://www.quimica.es/enciclopedia/Ovoalbúmina.html#_note-0/