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Prueba del Flujo Bacteriano

Esta prueba es quizás la más simple para la detección de bacterias en tejidos


vegetales. Consiste en colocar cualquier tejido vegetal que se cree puede estar
infectado sobre un recipiente lleno de agua, de preferencia un vaso transparente.
Se puede realizar una incisión al tejido con un bisturí o una herramienta capaz
de cortarlo, previamente esterilizada. Al colocar el tejido sobre la superficie del
agua, se podrá observar las bacterias saliendo del tejido hacia el agua en forma
de flujo. Al realizarse.

Prueba de solubilidad en KOH


El test de solubilidad en KOH se basa en determinar la solubilidad proteínas en
una disolución de KOH, siendo el rango adecuado entre el 70 y el 85%. Esta
prueba es útil para identificar la presencia de bacterias.

Test de solubilidad en KOH (da Silvas Romeiro, 2001).

a) Depositar 1 gota de KOH 1% en un porta objeto.

b) Colocar encima de la gota, crecimiento bacteriano de un cultivo en medio


sólido.
c) Homogeneizar por 5 o 10 minutos

d) Levantar el ansa y observar presencia/ausencia de filancia.

Gram positivo: Gram negativo

Tinción de Gram

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción


diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre
todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian
Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 18841. Se utiliza tanto para poder
referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias
grampositivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias
gramnegativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

Procedimiento

1. Recoger muestras para ubicarlas en el microscopio.


2. Hacer el extendido con un palillo de madera.
3. Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
4. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces
aproximadamente).
5. Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.
6. Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra
7. Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
8. Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración del
reactivo (parte crítica de la coloración). (las gram - se decoloran, las gram + no)
9. Enjuagar con agua.
10. Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto. Este
tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.
11. Lavar levemente con agua.
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
l cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas
(tanto gram positivas como gram negativas) a través de la pared bacteriana.
El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de
potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y
actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad
a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo
insoluble en solución acuosa con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración,
ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram
positivos no se decoloran, mientras que los gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células gram negativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o
la fucsina. Después de la coloración de contraste las células gram negativas son
rojas, mientras que las gram positivas permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer
una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias gram negativas. Al
término del protocolo, las gram positivas se verán azul-violáceas y las gram
negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó,
por ejemplo, safranina).
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos
con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con
facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican
de gram positivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda,
de gram negativos. Basándonos pues, en la reacción gram, podemos clasificar
a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-
rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración gram. Los
representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal
o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al
compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos
metilo en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro
es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-
rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B,
etc., se refieren al número de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices
rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo,
y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de
Gram.
La facultad de las células para tomar la coloración gram no es propia de toda
sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así
vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera
coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios
propenden retener el colorante. La reacción de Gram no es infalible ni constante;
puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras causas.
Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva se tiñen como gram
negativas:
 Mycobacterias (están encapsuladas).
 Mycoplasmas (no tienen pared).
 Formas L (pérdida ocasional de la pared).
 Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared,
respectivamente).
Prueba Microcorrida
Se utiliza en el caso de manchas foliares. Un pequeño corte de la zona de avance
de la mancha foliar es colocado en un portaobjeto se le agrega uuna gota de
agua y es observado bajo microscopio. El flujo bacteriano se observa como una
pequeña nube descargándose desde el tejido vegetal.

Prueba o test de hipersensibilidad en NO huésped

La prueba o test de hipersensibilidad en NO huésped consiste en la inoculación


del mesófilo de una hoja de una planta con el objetivo de conocer si la bacteria
inoculada es o no una bacteria fitopatógena.
Cuando una concentración masiva de bacterias es inoculada en el mesófilo de
una hoja de una planta no huésped, esta planta tiene la capacidad de reconocer
si la bacteria inoculada es una bacteria fitopatógena o si se trata simplemente de
un contaminante de la flora saprofítica.
Cuando la planta reconoce como patógena a la bacteria inoculada en su mesófilo
se produce una reacción de hipersensibilidad y la zona inoculada se necrosa
rápidamente (en 24 a 48 horas). Esta prueba o test permite descartar a las
bacterias no patógenas que puedan haber sido aisladas durante el proceso de
diagnóstico de una enfermedad.
Se trata entonces de una prueba que permite agilitar el proceso de diagnóstico
de las enfermedades bacterianas ya que nos permite descartar en forma rápida
aquellas bacterias contaminantes o saprófitas y saber cual de los aislamientos
que hemos hecho es la bacteria fitopatógena con la cual seguiremos trabajando.

Medios de cultivo

Una placa de agar, un ejemplo de crecimiento medio bacteriano. Las líneas y los
puntos naranjas son colonias bacterianas.
Un medio de cultivo es una técnica de laboratorio (véase microbiología) que
consta de un gel o una solución que contiene los nutrientes necesarios para
permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento
de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso
pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas
u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo
fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en
estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último del cultivo es
variado: antibiograma, identificación, multiplicación.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación
de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen
los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de
cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad
y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.
Los virus, por ejemplo, son obligados parásitos intracelulares, por lo que
necesitan un medio que contenga células vivas.
Clasificación:
Según sus cualidades física
 líquidos
 semisólidos
 sólidos
 Gaseosos
Según su origen
 Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen
animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya
composición química no se conoce exactamente.
 Sintéticos: son los medios que contienen una composición química
definida cualitativamente y cuantitativamente. Se utilizan para obtener
resultados reproducibles.
 Semisintéticos: son los sintéticos a los que se les añaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por
ejemplo extracto de levadura.
Según su formulación
 Químicamente definidos: se conoce la cantidad exacta de cada uno de los
compuestos que hay en el medio.
 Complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto
de levadura, sangre, etc.); no se conoce exactamente cuál es la
composición del medio; sin embargo, presenta la ventaja de que ya están
presentes todos o casi todos los elementos que una célula puede requerir.
Según su uso
 Medio general: medio en donde crecen todo tipo de microorganismos,
excepto los que necesitan condiciones especiales (por ejemplo, agar
CLED).
 Medio selectivo: permite seleccionar el crecimiento de una especie o
grupo determinado (hongos, bacterias entéricas, protozoos...).
 Medio diferencial: permite identificar una especie con otra, ambas en el
mismo medio. Puede ser por su crecimiento, su metabolismo,su
respiración, etc. (por ejemplo, medio de McConkey).
 Medio de enriquecimiento: contiene los nutrientes necesarios para apoyar
el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos, se utiliza para
la cosecha de diferentes tipos de microorganismos en un mismo medio.
 Medio mínimo: contiene la mínima cantidad de nutrientes posible que
permite el crecimiento de una especie.
 Medio de transporte: preparado para servir como almacenamiento
temporal a especímenes transportados o en transferencia; mantienen su
viabilidad y su concentración simple.
Conteo bacteriano
Generalmente, tras analizar un cultivo, se realiza un conteo bacteriano, con el fin
de saber cuál es la densidad de población microbiana que se encuentra en el
medio.
PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que
permite amplificar pequeños fragmentos de ADN para identificar gérmenes
microscópicos que causan enfermedades.
PCR son las siglas por las que se conoce a la reacción en cadena de la
polimerasa (en inglés Polymerase Chain Reaction), una técnica científica
avanzada que fue inventada por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en
1985. Esta técnica permite amplificar pequeñas regiones específicas del ADN en
laboratorio. Es decir, consigue que un pequeño segmento de ADN que pasaría
desapercibido en un análisis cualquiera se multiplique millones de veces y así
sea fácil de detectar.
Gracias a esta técnica se han podido realizar estudios genéticos en cualquier
campo de la ciencia. Por ejemplo, se utiliza diariamente para la identificación de
cadáveres o en el estudio de escenas del crimen para buscar rastros del
culpable. También se emplea en la biología, para identificar cadenas genéticas
de plantas, animales o, sobre todo, microorganismos. En la medicina se reúne la
experiencia de todos esos campos y se usa principalmente para identificar
gérmenes agresores que se encuentran en nuestro organismo.
Cuando se desarrolló la prueba de la PCR por primera vez se trataba de una
técnica cara y algo engorrosa de realizar, pero pronto se generalizó su uso y se
empezaron a desarrollar equipos sencillos y muy baratos que se utilizan todavía
hoy en muchos centros diagnósticos.
Además, se han diseñado PCR más específicas que se pueden elegir según sea
la muestra a estudio. Los diferentes tipos de PCR, además de la básica, son:
 PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de
millones de fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos
minúsculos.
 PCR in situ: permite la detección de ADN en el mismo lugar de la muestra,
sin tener que procesarla primero con técnicas de laboratorio. Se suele
utilizar para biopsias o raspados de células.
 PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos
de ADN a la vez y con una sola muestra.
 PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN
para detectar moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa,
la misma que utiliza el VIH entre otros virus.
 PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se añade un componente
fluorescente que permite medir la luz. A más luz, más cantidad del ADN
detectado.
Prueba de tinción de yodo
Vista esquemática de una hélice de amilosa, con iones I 3− embebidos.
La prueba del yodo es una reacción química usada para determinar la presencia
o alteración de almidón u otros polisacáridos. Una solución de yodo
- diyodo disuelto en una solución acuosa de yoduro de potasio - reacciona
con almidón produciendo un color púrpuraprofundo.
Este tipo de prueba puede realizarse con cualquier producto que contenga
almidón como ser patatas, pan o determinados frutos.
Esta reacción es el resultado de la formación de cadenas de poliyoduro a partir
de la reacción del almidón con el yodo presente en la solución de
un reactivo llamado Lugol. La amilosa, el componente del almidón de cadena
lineal, forma hélices donde se juntan las moléculas de yodo, formando un color
azul oscuro a negro. La amilopectina,1 el componente del almidón de cadena
ramificada, forma hélices mucho más cortas, y las moléculas de yodo son
incapaces de juntarse, obteniéndose un color entre naranja y amarillo. Al
romperse o hidrolizarse el almidón en unidades más pequeñas de carbohidrato,
el color azul-negro desaparece. En consecuencia, esta prueba puede determinar
el final de una hidrólisis, cuando ya no hay cambio de color constituyendo una
evidencia experimental ampliamente utilizada.
La solución de yodo también reacciona con el glucógeno, aunque el color
producido es más castaño y mucho menos intenso.
Esta prueba se utiliza como indicador del grado de madurez de los frutos.
El fruto cuando está inmaduro contiene altas cantidades de almidón, que son
detectadas a través de la tinción con la prueba de almidón, apareciendo como
grandes zonas en el fruto teñidas de azul. Mientras que cuando un fruto esta
maduro, ese almidón se ha transformado en azúcares y por lo tanto no se tiñe
en la prueba.
En la industria, la hidrólisis del almidón es ampliamente utilizada para
producir glucosa a partir del almidón presente en la pulpa del fruto de banano
verde. El proceso consta de tres etapas:
1. Gelatinización:
Consiste en calentar los gránulos de almidón en agua y separar la amilosa de
la amilopectina. (Lixiviación).
2. Dextrinización:
Luego de la gelatinización del almidón, se procede a obtener polisacáridos de
bajo y alto peso molecular (maltodextrinas) aplicando una hidrolización parcial.
Las dextrinas también pueden experimentar cambio de coloración cuando
reaccionan con una solución de yoduro de potasio. La coloración obtenida va a
depender del grado de hidrólisis de la molécula, (en este caso se trata de
macromoléculas las cuales están conformadas por una cantidad importante
de átomos en su estructura).2
3. Sacarificación:
En esta etapa, se hidrolizan totalmente las maltodextrinas a glucosa,
completándose el proceso.3
En el procedimiento industrial anteriormente detallado, puede utilizase la prueba
de yodo para realizar seguimiento de las reacciones de hidrólisis. Cuando el
almidón se degrada totalmente a glucosa, ya no se obtiene la coloración azul
oscura que caracteriza a la reacción entre el almidón y la solución de yodo-
yodurada.

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