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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

GUIAS
LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA I
PRGRAMA DE BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO

INSTITUCIÓN UNIVERSITARIA
COLEGIO MAYOR DE ANTIOQUIA
MEDELLÍN (ANTIOQUIA)
2011
LABORATORIO I
NORMAS DE BIOSEGURIDAD Y CONTROL DE CALIDAD

OBJETIVO

Identificar los conceptos básicos de bioseguridad en el laboratorio y minimizar


los riesgos en el desempeño de las prácticas en el laboratorio de
Microbiología.
Conocer las diferentes formas como se realiza el control de calidad en el
laboratorio de Microbiología.

FUNDAMENTO

El personal de la salud que trabaja en el laboratorio, que manipula en su


actividad diaria, una serie de productos biológicos de origen animal o humano
(sangre, semen, heces, fluidos corporales como orina, aspirado gástrico,
esputo, saliva, secreciones, líquidos, flujo vaginal, secreción uretral) por lo
tanto si no se tienen las medidas mínimas de bioseguridad pueden provocar
un problema de salud en el personal.
Además existen otros factores de riesgo entre ellos: agentes químicos, físicos y
mecánicos, ambientales, ergonómicos, psicológicos.
Los riesgos que allí se generan pueden afectar no solo al trabajador o
empleado, sino a su familia y a la comunidad.
La bioseguridad en el laboratorio se basa esencialmente en la prevención de

accidentes, por el carácter potencialmente peligroso de la muestra, uso

inadecuado de equipos de protección, errores humanos, malos hábitos del

personal o incumplimiento de las normas, que pueden afectar a todos,

como resultado de la actividad del laboratorio.


CONTROL DE CALIDAD: consiste en una evaluación continua y sistemática
del trabajo, para asegurar que el producto final esté dentro de los límites
tolerados de precisión y exactitud previamente establecidos.
En el sentido amplio, el CONTROL DE CALIDAD en Microbiología abarca ítems
intangibles como el sentido común, el buen juicio y una constante atención por
los detalles.

El documento Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) recomienda

hacer un control de calidad interno:

 Revisar cada nuevo lote de medios y cada lote de discos

antimicrobianos antes de iniciar su uso (o en forma concurrente).

 Verificar que los tamaños de las zonas de difusión en disco o valores de

CIM (Concentración inhibitoria mínima) para las cepas de referencia

estén dentro de los rangos establecidos antes de reportar los resultados

de PSA (Pruebas de susceptibilidad antibiótica)

 Usar las cepas apropiadas de control para revisar la precisión del

procedimiento cada día que las pruebas se realicen.

 Probar las cepas de control con una periodicidad quincenal, según la

recomendación de los estándares de la CLSI para PSA diarios estén

cumplidos; o realizar el control de calidad diario según se indica en los

estándares de la CLSI

Puede consultar las CLIA en el sitio web http://www/cms.hss.gov/clia.


CEPAS DE REFERENCIA

La CLSI recomienda el uso de cepas ATCC para el CC (Control de calidad) de

pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. El CC se realiza para garantizar que

el sistema de prueba está funcionando adecuadamente tanto para el método

de difusión por disco como para las pruebas de CIM.

Las cepas utilizadas para tal fin son las de la ATCC (American Type Culture

Colleccion) tales como Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus

aureus (ATCC 25923), Streptococcus faecalis (ATCC29212) y Pseudomonas

aeruginosa (ATCC 27853).

La frecuencia con que se realizan las pruebas de control de calidad de medios


y reactivos debe ser determinada por el Microbiólogo a cargo de la sección de
Microbiología o director del laboratorio
BIBLIOGRAFÍA
 Centro de control y prevención de enfermedades CDC, Bioseguridad en
laboratorios de Microbiología y Biomedicina. 4 edicion.
Manual de bioseguridad en el laboratorio. OMS 2005
(http://www.scribd.com/doc/13062115/OMS-Manual-de-Bioseguridad-en-El-
Laboratorio).
 Organización Panamericana de la Salud. Área de tecnología y
Prestación de servicios de Salud. Unidad de medicamentos esenciales,
vacunas y Tecnologías en salud. Curso de Gestión de la calidad para
laboratorios. Washington, D.C.: OPS, 2005.
 Medicina & Laboratorio, Volumen 13, números 11-12
 CLSI Performance Standards for Antimicrobial, Susceptibility

Testing; Twentieth Informational Suplement. Januar 2010 M100-S20.

Vol. 30 No.1.
LABORATORIO II
MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO

Capacitar al estudiante en el manejo y preparación de medios de cultivos en el


laboratorio de bacteriología.
Conocer las diferentes formas de siembra.

MARCO TEORICO

En la naturaleza, los microorganismos viven casi siempre en mezclas. No


obstante antes de poder determinar la mayor parte de las características de un
microorganismo en particular, éste debe ser aislado en un cultivo puro.
El procedimiento general consiste en usar un medio de cultivo adecuado y
condiciones de incubación que estimulen el crecimiento del organismo que se
desea. Una vez que el organismo deseado ha aumentado en cantidad con
respecto a otros, se sub cultiva de modo que el nuevo repique contenga
solamente organismos del tipo deseado

FUNDAMENTO

Cuando una muestra ha sido recibida en el laboratorio si no tiene pre


tratamiento se le realiza un extendido en un portaobjetos, se fija y se colorea
por Gram.
La muestra debe ser inoculada o sembrada, sobre una serie de medios de
aislamiento llamados cultivos primarios, los cuales serán reconocidos por los
estudiantes teniendo en cuenta su consistencia (líquida o sólida) color inicial,
condiciones o requerimientos para su incubación (temperatura) con presencia o
ausencia de atmósfera de CO2, si requiere condiciones de anaerobiosis.
Los medios se clasifican en:

1- MEDIOS ENRIQUECIDOS: estos contienen factores de crecimiento que


son usualmente derivados de sangre o extractos de levaduras, el más
utilizado es la agar sangre , es un agar base adicionado con sangre de
cordero al 5%
2- MEDIO SELECTIVO: al cual se le adiciona algunos inhibidores del
crecimiento bacteriano como sales, colorantes y antibióticos, como el
agar Thayer Martín para el crecimiento de Neisserias patógenas como
N. gonorrhoeae.
3- MEDIO DIFERENCIAL: contiene varios elementos que permiten la
diferenciación de bacterias de acuerdo a su capacidad metabólica para
fermentar o no la lactosa como en el agar Mac Conkey.

Bacterias fermentadoras de la lactosa:


Bacterias no fermentadoras
(E.coli, Salmonella, Shigella y Proteus
Klebsiella, Enterobacter etc.)
MATERIALES Y METODOS

Para la siembra se utilizan patrones de estrías de la muestra, sobre placas de


cultivo, para obtener colonias bacterianas aisladas, o patrones de estría de la
muestra, para hacer un recuento semicuantitativo y técnica para inocular un
tubo de agar inclinado con asa de inoculación recta.

MÉTODO DE INOCULACIÓN

 Marcar la caja en el borde, con el # de identificación y nombre del


paciente, fecha y sitio anatómico.

 Colocar la muestra en el sitio de inoculación, (20 µl si la muestra es


líquida, si es muy purulenta tomar un poco con un aplicador estéril, o si
es a partir de una colonia) dejando una distancia del borde de la caja al
sitio de siembra, de 1 cm para evitar que la muestra se contamine.
(Tener en cuenta que la contaminación de las cajas, se inicia en el borde
de la caja.

 Extender la muestra en forma horizontal en un área de 2 cms.

 Esterilice el asa de 5 a 10” Si es un incinerador de asas. Si usa mechero


Calentar el asa hasta que se ponga roja. Enfriar antes de hacer el
extendido.
 Extender con el asa fría y estéril de un lado al otro la muestra según la
figura adjunta. (Tener en cuenta no tocar los bordes de la caja) esto
corresponde al primer cuadrante.
No esterilice el asa a menos que sea necesario. Pase el asa tocando el
primer cuadrante con estrías amplias por lo menos 4 veces quedando
listo el segundo cuadrante.
 Esterilice y enfrié el asa, gire la caja en un ángulo de 45-90º, a partir de
las 2 últimas estrías del segundo cuadrante y extienda suavemente con
estrías amplias por lo menos 4 veces quedando listo el tercer cuadrante.
 Esterilice y enfrié el asa, gire la caja en un ángulo de 45-90º, a partir de
las 2 últimas estrías del tercer cuadrante y extienda suavemente con
estrías amplias por lo menos 4 veces quedando listo el cuarto cuadrante.

MÉTODO DE INOCULACIÓN PARA SUBCULTIVO


Para sub cultivar colonias a partir de un cultivo mixto: flamear el asa
entre los cuadrantes para así obtener colonias al final puras (del tipo de
bacteria que necesito tener aislada)
MÉTODO DE INOCULACIÓN: TUBO DE AGAR INCLINADO con asa de
inoculación recta.
Esterilizar toda el asa hasta donde se inicia el mango, dejar enfriar sostenerla
con la mano derecha cerca al mechero encendido. Luego con la mano
izquierda sostener el tubo para destaparlo, con el dedo meñique de la mano
derecha girar la tapa y sostenerla ahí, colocar el tubo de ensayo en la gradilla;
luego tomar la caja de Petry donde está la colonia bacteriana, con la mano
izquierda y tomo una colonia con el asa recta estéril, fría y por picadura
introducirla en el agar hasta el fondo del tubo, irla retirando en forma recta
hasta llegar al bisel y con movimientos en zig-zag deslizarla suavemente, sobre
la superficie. Tomar el tubo de la gradilla y pasar la boca del tubo rápidamente
por el mechero, proceder a taparlo. Esterilizar el asa.

MATERIALES

Preparación de los siguientes medios de cultivo y materiales utilizados en dicho


proceso.
BHI, agar nutritivo, agar sangre, agar chocolate (suplementado), agar
MacConkey, agar SS. Agar Hektoen, citrato, Kligler o TSI, Lia, SIM, Urea,
Nitritos, RM/VP, OF, Tetrationato de sodio, Mueller Hinton, agar Dnasa, agar
Dnasa con azul de toluidina, agua destilada planchas, mecheros, bajalenguas,
tubos tapa rosca, kit de venopunción, papel de aluminio, estufa con CO2,
guantes, balones volumétricos, probetas, 1,8 gramos de bicarbonato de sodio,
cajas de petri, guantes, asas bacteriológicas.

PROCEDIMIENTO

Cada equipo y de acuerdo a la etiqueta que contenga el medio de cultivo


prepara 100 ml de medio.
Después de hervido, esterilizado y servido se seleccionará al azar del 4 al 5%
del lote para la prueba de esterilidad
Cada estudiante practicará las diferentes formas de siembra.
Después de 24 horas de incubación será evaluada la siembra por parte de los
estudiantes en compañía de los docentes.

INTERPRETACIÓN Y CORRELACION

La interpretación de los cultivos primarios luego de una incubación de 24 a 48


horas requiere de habilidad considerable. Los microbiólogos deben evaluar el
crecimiento de las colonias y decidir si son necesarios procedimientos
adicionales, de acuerdo a sus características y el número relativo de cada tipo
de colonia.

BIBLIOGRAFÍA
Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2ª edition 2004

Cultivo Medio Peso Soluciones Cant. Uso


grs adicionales

Agar sangre Agar base 20.0 Agua dest. 500 30 Cultivos de orina,
sangre ml cajas líquidos estériles F.F,
Sangre carnero cultivo de
25 ml Bacterias aerobias

Agar Agar 25.75 Agua dest. 500 30 Cultivo de orinas,


MacConkey MacConkey ml cajas bacterias aerobias,
líquidos estériles.
Infusión BHI 5.55 Agua dest 150 ml 50 cultivos de líquidos,
cerebro- tubos bacterias aerobias
corazón (BHI)
A.MuellerHinton A.Mueller 19 Agua dest 500 ml 30 Antibiogramas
Hinton cajas
Agar XLD Agar XLD 13.25 Agua dest 250 ml 10 Coprocultivos
cajas

*** leer instrucciones del fabricante antes de la preparación.

LABORATORIO III
METABOLISMO BACTERIANO
OBJETIVO

Conocer las formas de desarrollo y la interacción de las bacterias y sus


nutrientes.

MARCO TEORICO

La palabra metabolismo significa cambio. Se utiliza para designar la suma de


transformaciones químicas que tienen lugar dentro de la célula, en un proceso
continuo de reacciones independientes y coordinadas.
Los factores de crecimiento son sustancias que promueven el crecimiento de
los microorganismos y son provistas en vivo por varios líquidos corporales y
tisulares e in Vitro en la forma de extractos de levadura, sangre o productos
derivados de la sangre, vitaminas y enzimas.
Vemos que en las células se efectúan dos tipos básicos de procesos de
transformación química: los procesos de construcción llamados anabolismo y
los procesos de degradación llamados catabolismo. Así el metabolismo es el
resultado colectivo de reacciones anabólicas y catabólicas.

FUNDAMENTO DE LA PRUEBA
Conocer los procesos metabólicos de fermentación, oxidación,
descarboxilación, deaminación, hidrólisis, coagulación, desnaturalización,
hemólisis.

METABOLISMO BACTERIANO

Como microbiólogos debemos realizar pruebas bioquímicas para la


identificación de bacterias. Se debe tener un conocimiento real de los
principios, las bases bioquímicas, los métodos, interpretación, y de los
inconvenientes que pueden presentar cada una de ellas.

PRUEBA DE LA ESCULINA EN MEDIO CON BILIS

PRINCIPIO
Determinar la facultad de un organismo de hidrolizar el glucósido esculina en
esculetina y glucosa en presencia de bilis.
El medio contiene en especial, además de otros nutrientes, bilis de buey y
citrato de hierro.
La esculetina reacciona con una sal de hierro para formar un complejo castaño
oscuro o negro. El citrato de hierro se incorpora al medio como indicador de la
hidrólisis de la esculina y de la formación de esculetina resultante.
OBJETIVO
Ayuda a la diferenciación de los estreptococos del grupo D de otros
estreptococos.
Ayuda a la diferenciación de la Listeria monocytogenes +

INTERPRETACIÓN
Prueba de la BE positiva: presencia de un color negro a castaño oscuro en el
pico de flauta.
Prueba de EB negativa: no se produce ennegrecimiento del medio, o
ennegrecimiento menos de la mitad del tubo después de 72 horas de
incubación.

PRUEBA DE LA SOLUBILIDAD EN BILIS

PRINCIPIO
Para controlar la capacidad de las células bacterianas de producir lisis en
presencia de sales biliares, en un tiempo y con una temperatura específicos.
Las sales biliares utilizadas en las pruebas de solubilidad en bilis son, por lo
general, desoxicolato de sodio (es un ácido monobásico que tiene un pH
ligeramente alcalino cuando está en una solución acuosa) o taurocolato de
sodio. Estos se encuentran como aniones cuando están en un pH alcalino, por
ello se les denomina sales biliares.
Se emplea el reactivo de desoxicolato de sodio o taurocolato de sodio al 10 %
Las sales biliares hacen descender la tensión superficial en la interface medio-
membrana, provocan una descomposición de la membrana celular y aceleran
el proceso auto lítico natural del neumococo activando las enzimas por
combinación de las sales biliares con el neumococo.

OBJETIVO
Se utiliza específicamente para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae
soluble en bilis y otras especies de Streptococcus alfa-hemolíticos no solubles
en bilis.

METODO

1. Realizar una suspensión bacteriana, concentrada equivalente a la escala


de MacFarland > 1 en un tubo con 1 ml de solución salina. Este tubo se
marca como control.
2. En otro tubo marcado como problema se colocan 250 µl de la suspensión
bacteriana y 250 µl del reactivo de desoxycolato al 10%.
3. Al tubo control que tiene 250 µl de la suspensión bacteriana se le
adicionan 250 µl de solución salina
4. Incubar a 35ºC durante 4 horas.
5. Cuando es un neumococo la prueba da casi de inmediato positiva.

INTERPRETACIÓN

Soluble en bilis: solución clara o aclarándose


Insoluble en bilis: la solución se mantiene turbia (nebulosa), igual al control.

PRUEBA: PYR (L-Pyrrolidonil –β-naphthylamide)


PRINCIPIO
Sirve como un sustrato para la detección de Pyrrolidonil peptidasa
Esta técnica es mas sensible que la bacitracina para la identificación de
Streptococcus pyogenes
Después de la hidrólisis del sustrato por la peptidasa la β-naphthylamide al
adicionar el reactivo cinnamaldehyde al 0.01% produce un color rojo a los 2
minutos de adicionar el cinnamaldehyde

El PYR en polvo o líquido es un cancerígeno potencial.

PRUEBA DE LA CATALASA

PRINCIPIO
La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de
hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno.
Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno.
Comprobar la presencia de la enzima catalasa. La enzima catalasa se
encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que
contienen citocromo por lo tanto pueden descomponer el peróxido de
hidrógeno.
La mayoría de las bacterias anaerobias (Clostridium) poseen la enzima
peroxidasa en lugar de catalasa. Sin embargo se afirma que la prueba de la
catalasa no es específica y puede interferir en la acción de las enzimas
peroxidasas.
Se emplea peróxido de hidrógeno al 30 % (Superoxal) sobre el organismo del
portaobjeto.

OBJETIVO
La prueba es utilizada para diferenciar entre géneros de Streptococcus quienes
dan la prueba negativa y de Stahylococcus y Micrococcus positivos.
Género Bacillus positivo de Clostridium negativo
Listeria monocitogenes positivo.

INTERPRETACIÓN
Prueba positiva: formación inmediata de burbujas bien visibles (formación de
oxigeno).
Prueba negativa: no hay formación de burbujas.

PRUEBA DE LA COAGULASA
PRINCIPIO
Comprobar la facultad de un organismo de coagular el plasma por acción de la
enzima coagulasa. Frecuentemente esta prueba es utilizada como índice de
virulencia o patogenicidad.
La coagulasa es una enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. Los
Staphylococcus aureus patógenos dan una reacción positiva y los no
patógenos negativa

OBJETIVO
Se utiliza de manera específica en la diferenciación de especies pertenecientes
al género Staphylococcus. El S. aureus que por lo común tiene reacción
positivo, del S. epidermidis quien la da negativa.

Hay dos métodos que se utilizan de rutina para determinar la prueba de


coagulasa:
1. Método de la coagulasa en portaobjetos se determina la coagulasa libre
2. Prueba en tubo de ensayo se determina la coagulasa ligada y la coagulasa
libre.

MECANISMO DE ACCIÓN DE LA COAGULASA LIBRE:

Procoagulasa (enzima extracelular bacteriana) reacciona con un factor


activador presente en el plasma sanguíneo similar a la protrombina, dando
lugar a un complejo análogo a la trombina (coagulasa propiamente dicha) que
reacciona con fibrinógeno formando un coágulo de fibrina en ausencia de
Ca2+.
PRUEBA DE COAGULASA EN PLACA

Extender las colonias en un portaobjetos, adicionar 1-3 µl de plasma de conejo


Mezclar en una forma homogénea para que no queden grumos de la colonia.
Observe inmediatamente la aglutinación no superior a los 10”.

PRUEBA DE COAGULASA EN TUBO


1. El tubo debe estar a 25ºC
2. Se añade una colonia de un medio de cultivo que no tenga inhibidor o
dos gotas de sangre de un hemocultivo positivo, a un tubo pequeño con
0.5 ml de plasma
3. Incube a 35ºC sin CO₂ por 4 horas y observe la formación del coagulo
cada hora. No agite el tubo durante la observación. Muévalo

suavemente por inclinación.

4. Incubar por un tiempo adicional de 20 horas a 25 ºC para la formación

de un coagulo tardío

NOTA: No se debe usar plasma humano para la prueba ya que es menos


sensible y potencialmente infeccioso.
Se debe usar plasma de conejo deshidratado (Lo venden comercialmente)
INTERPRETACIÓN

1. Método del portaobjeto: prueba positiva aglutinación acentuada dentro


de los 5 a 10”; prueba positiva retardada cualquier aglutinación después
de 20 segundos a un minuto; dudosa después de un minuto, se debe
repetir y comprobar por la prueba en tubo.
2. Método en tubo de ensayo: prueba positiva se forma coágulo o filamento
de fibrina definidos y prueba negativa no hay formación de coágulo, la
suspensión se mantiene homogénea igual al tubo no inoculado.

PRUEBA DEL CITRATO (SIMMONS)

PRINCIPIO
Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente
de energía. El medio contiene citrato como única fuente de Carbono y sales
como y sales como Amonio inorgánico como única fuente de Nitrógeno.
El crecimiento es indicador de utilización de citrato un meta bolito intermedio en
el ciclo de Krebs. Cuando la bacteria metaboliza el citrato las sales de amonio
son rotas dando origen al amoniaco que incrementa la alcalinidad. El cambio
en el pH, cambia el color de verde a azul por el bromotimol presente en el
medio como indicador cuando el pH está por encima de 7.6.

OBJETIVO
Ayuda a la diferenciación entre las especies de entero bacterias. Géneros
como Salmonella, Edwarsiella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia y
Providencia son positivas.
Escherichia coli, Shigella, Morganella y Yersinia son negativas
El proteus es citrato variable
PROCEDIMIENTO
1. Siembre la colonia por picadura y en la superficie del bisel.
2. Incube aeróbicamente a 35ºC por 4 días
3. Observe el cambio de color de verde a azul a lo largo del bisel

INTERPRETACIÓN
Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el bisel o la
inclinación.
Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio de color (verde).

PRUEBA DE LAS DECARBOXILASAS


(Lisina, ornitina y arginina)

PRINCIPIO
Medir la capacidad enzimática de un organismo para decarboxilar un
aminoácido para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad.
La decarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas
decarboxilasas específicas son capaces de atacar a los aminoácidos en su
grupo carboxilo, dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico.
Cada enzima es específica para un sustrato determinado, las tres
decarboxilasas más importantes utilizadas para la identificación bacteriana son
la lisina, ornitina, arginina.
El aminoácido L-lisina sufre la decarboxilación para dar cadaverina (diamina) y
anhídrido carbónico.
El aminoácido L-ornitina sufre la decarboxilación para dar putrescina y
anhídrido carbónico.
El aminoácido L-arginina es catabolizado a través de dos sistemas el de la
arginina-dehidrolasa y el sistema de la arginina-decarboxilasa esta sufre la
decarboxilación para dar agmantina, la acción catalítica de la agmantinasa
produce la putrescina y urea, si hay presencia de ureasa se descompone esta
en amoníaco y anhídrido carbónico. Además puede producir la citrulina.

Cuando un organismo en el medio fermenta glucosa, los ácidos producidos


bajan el pH, resultando un cambio de color de purpura a amarillo.
Si hay descarboxilación o hidrólisis del amino ácido, esto ocurre como
respuesta al cambio de ph ácido, las aminas formadas producen alcalinidad
pasando nuevamente a purpura.

Cuando un organismo no fermenta la glucosa, el medio no se torna amarillo,


La prueba puede todavía estar formada, pero es importante poner un control
sin aminoácido para comparación.

Prueba positiva: Morado


Negativo: Amarillo
OBJETIVO
Las pruebas de las decarboxilasas se emplean fundamentalmente para
determinar grupos bacterianos entre las Enterobacteriaceae.

INTERPRETACIÓN
Cualquier aminoácido da los mismos resultados en color.
Prueba positiva: púrpura turbio a un púrpura amarillento apagado (producido
por la cadaverina).
Prueba negativa: color amarillo claro brillante (solamente fermentado por la
glucosa)

PRUEBA CON AGAR HIERRO DE KLIGLER Y


AGAR HIERRO TRIPLE AZUACAR (TSI)

PRINCIPIO

Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un hidrato de carbono


específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no
de gases, junto con la determinación de posible producción de ácido
sulfhídrico.
Son medios diferenciales en tubo que sirven para la determinación de las
fermentaciones de los hidratos de carbono como la glucosa y lactosa en el
caso del medio de Kligler, el TSI además de la glucosa y lactosa contiene la
sacarosa.
La fermentación se produce aeróbicamente en el pico de flauta (lactosa) y
anaeróbicamente en la capa inferior del cultivo (glucosa).
Se han observado tres formas básicas de fermentación en el medio:
1. Fermentación solamente de la glucosa.
2. Fermentación tanto de la glucosa como de la lactosa y
3. No fermentación de la glucosa ni de la lactosa
El medio contiene rojo de fenol como indicador de pH y tiosulfato de sodio;
citrato férrico de amonio o sulfato ferroso de acuerdo a la casa productora
como indicadores de ácido sulfhídrico.

OBJETIVO
La producción de ácido sulfhídrico y/o las formas de fermentación son
generalmente características de los grupos, géneros o especies bacterianos
específicos, sobre todo entre las Enterobacteriaceae.

INTERPRETACIÓN
1. Fermentación de la glucosa: K/A.
2. Fermentación tanto de la glucosa como de la lactosa: A/A
3. No fermentación de la glucosa ni de la lactosa: K/K
4. Producción de gas en un ambiente anaeróbico no se produce, se produce
gas aeróbicamente y se manifiesta por lo siguiente:
Una sola burbuja de gas, burbujas en el medio, desdoblamiento del medio,
desplazamiento completo del medio del fondo del tubo, ligera muesca del
medio en el costado del tubo.
5. Producción de ácido sulfhídrico: la presencia de un precipitado negro
distribuido por toda la capa profunda y que enmascara la acidez o un anillo
negro cerca de la parte superior de la capa profunda.
PRUEBA DE LA MOTILIDAD

PRINCIPIO
Determinar si un organismo tiene o no flagelos (es móvil o inmóvil)
El medio empleado es un medio semisólido conocido comercialmente como
SIM (movilidad, indol y ácido sulfhídrico)

OBJETIVO
Ayuda a la diferenciación entre géneros como Escherichia coli positivo, de la
variedad anaerogénica no móvil; Enterobacter por general positivo de Klebsiella
no móvil.
Ayuda a diferenciar especies como Pseudomonas mallei negativo de otras
Pseudomonas por lo general positivo.

INTERPRETACIÓN
Prueba positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se
difunden en el medio, provocando turbiedad.
Prueba negativa: crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de
siembra, el medio circundante se mantiene claro.

PRUEBA DE MOVILIDAD EN GOTA SUSPENDIDA


Tomar una pequeña gota de la bacteria, en un caldo nutritivo, se coloca en el
centro de una laminilla, a quien previamente se le han colocado en cada uno de
sus extremos un poco de vaselina, para luego colocarle encima una lámina
portaobjetos. Darle la vuelta a la preparación. La gota no debe tocar el
portaobjetos, quedando suspendida. Mirar al microscopio con objetivo de 10X
Pasar luego a 40X.
Positiva: Se ven las bacterias atravesando el campo rápidamente.
Negativa: Bacterias inmóviles.
No confundir movilidad con el movimiento browniano que tienen las partículas
El movimiento browniano es el movimiento aleatorio que se observa en
algunas partículas microscópicas que se hallan en un medio fluido (por ejemplo
polen en una gota de agua).

PRUEBA DEL INDOL

PRINCIPIO
Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar el indol de la molécula
triptófano (aminoácido) que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar
tres moléculas indólicas principales: indol, escatol e indolacético.
El indol, desdoblado de la molécula triptófano, puede ser detectado por un
reactivo que posea una combinación química que produzca un color definido, el
reactivo a utilizar es el de Ehrilch o de Kovacs (p-
dimetilaminobenzaldehído).
El medio utilizado para la prueba de movilidad y del indol es el SIM
(S = ácido sulfhídrico, I = indol y M = movilidad).

OBJETIVO
Ayuda a la diferenciación entre géneros como E. coli positiva de Klebsiella-
Enterobacter negativo
Ayuda a la diferenciación de especies como Haemophilus influenzae positivo
de otras especies de Haemophilus negativo.

INTERPRETACIÓN
Prueba positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohólica.
Prueba negativa: no se produce color en la capa alcohólica, toma el color del
reactivo.
Variable: un color anaranjado en la superficie del medio debido al desarrollo de
escatol, compuesto metilado que puede ser un precursor del la formación de
indol.
PRUEBA DEL ROJO DE METILO (RM)

PRINCIPIO
Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los
productos terminales ácidos (láctico, succínico, acético y fórmico) de la glucosa
y vencer la capacidad amortiguadora (fosfatos) del sistema.
Es una prueba cualitativa de la producción de ácido; algunos organismos
producen más ácidos que otros.
La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo
de metilo, para determinar la concentración de iones hidrógeno (pH) presente
cuando un organismo fermenta la glucosa.

OBJETIVO
Ayuda a diferenciar entre géneros: E. coli, Yersinia positivo del Enterobacter
aerogenes, Klebsiella negativo
Ayuda a la identificación de la Listeria monocytogenes: es positivo

INTERPRETACIÓN
Prueba de rojo de metilo positiva: anillo rojo en la superficie del medio.
Prueba negativa: color amarillo en la superficie del medio (pH: 6).
Reacción retardada: color anaranjado. Continuar la incubación hasta 4 días y
repetir la prueba.
REACCIÓN DE VOGES-PROSKAUER

PRINCIPIO
Determinar la capacidad de algunos organismos de producir un producto final
neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir de la fermentación de la
glucosa.
Los reactivos empleados en la reacción de VP de Barritt son:
1. Alfa naftol al 5 % en alcohol etílico, actúa como un intensificador del
color.
2. Hidróxido de potasio o de sodio al 40 %, actúa como agente oxidante.

OBJETIVO
Ayudar a diferenciar entre los géneros: Klebsiella pneumoniae y Enetrobacter
generalmente positivas de Escherichia coli negativa.
Ayudar a la diferenciación de especies: Klebsiella pneumoniae positiva de otras
especies de Klebsiella que son negativa.

INTERPRETACIÓN
Reacción VP positiva: color rojo rosado en la superficie del medio (presencia de
acetoína).
Reacción VP negativa: color amarillo en la superficie del medio (el mismo color
del reactivo).
Puede formarse un color cobrizo, pero aun así la reacción es
negativo (debido a la acción de los reactivos al mezclarse).
PRUEBA DE REDUCCIÓN DEL NITRATO

PRINCIPIO
Determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en
nitrógeno libre.
La reducción del nitrato en nitrito y en gas nitrógeno tiene lugar generalmente
en condiciones anaeróbicas, en las cuales un organismo obtiene su oxígeno
del nitrato.
La desnitrificación es la reducción del nitrato en gas nitrógeno u óxido nitroso.
Reactivos empleados: reactivo de GRIESS ILOSVAY´S (alfa-naftilamina o
dimetil-alfa-naftilamina) en la primera fase, un resultado positivo (color rojo)
dentro los 30 segundos indica una prueba completa; desechar el tubo.
Si es negativo (no aparece color) continuar con la fase 2 agregando polvo de
cinc, el color se produce en el término de 30 segundos.

OBJETIVOS
Ayudar a la diferenciación de las especies: Haemophilus ducreyi y vaginalis
negativos de otras especies de Haemophilus positivo.
Branhamella catarrhalis y Neissseria mucosa positivas de otras especies de
Neisseria negativas.
Ayuda a la identificación de enterobacterias por lo general positivas.
INTERPRETACIÓN
1. Fase uno (reactivo de Griess): prueba positiva color rosado a rojo
intenso, el nitrato fue reducido a nitrito, la prueba es completa. Si no se
produce color seguir con la fase dos.
2. Fase dos (prueba de la reducción del Zinc): prueba positiva no se
desarrolla color, ausencia de nitrito en el medio, el organismo redujo el
nitrato en nitrito y luego redujo nuevamente el nitrito. Prueba negativa:
color rosado a rojo intenso, nitrato presente, no ha sido reducido por el
organismo; el cinc redujo el nitrato en nitrito.

PRUEBA DE LA OXIDASA

PRINCIPIO
Determinar la presencia de las enzimas oxidasas.
La prueba de la oxidasa está en la producción de una enzima oxidasa. Esta
reacción se debe a la presencia de un citocromooxidasa que activa la oxidación
del citocromoreducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como
aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia de
electrones.
El sistema citocromo sólo se encuentra por lo general en los organismos
aeróbicos, lo que los hace capaces de utilizar el oxígeno como aceptor de
hidrógeno final para reducir el oxígeno molecular en peróxido de hidrógeno, el
último enlace de la cadena de la respiración aeróbica.

OBJETIVO
Diferenciar los géneros de
Pseudomonas y Neisserias positivas
Stenotrophomonas maltophilia que es
oxidasa negativa) de las
Enterobacteriaceae que son oxidasa negativa.
La mayoría de las bacterias Gram positivas son oxidasa negativas.
Muchos de los bacilos Gram negativos, aparte de las Enterobacteriaceae,
tienen una actividad de oxidasa variable.
Ayudar a la diferenciación entre los géneros Aeromonas, Moraxella y Neisseria
oxidasa positiva del Acinetobacter oxidasa negativa.
Se utiliza el reactivo de Kovacs (diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina)
para la prueba de la oxidasa. El reactivo de Nadi, son discos impregnados con
oxidasa, estos son los más utilizados.
INTERPRETACIÓN
Colonias oxidasa positiva: la colonia toma un color rosado, después marrón y
finalmente negro.
Colonias oxidasa negativa: no se produce cambio de color en las colonias, o
sólo adquieren un color rosado pálido debido al color del reactivo.

PRUEBA DE LA OXIDACCÓN-FERMENTACIÓN

PRINCIPIO

Determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono


(glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa).

Algunas bacterias son capaces de metabolizar un hidrato de carbono


(manifestada por la producción de ácido) sólo en condiciones aeróbicas,
mientras que otras producen ácido tanto aeróbica (presencia de oxígeno
atmosférico) como aneróbicamente (ausencia de oxígeno atmosférico) estas se
denominan anaerobios facultativos.
La mayoría de las bacterias que tienen importancia en clínica son anaerobios
facultativos.

El medio básico OF contiene como indicador de pH el azul de bromotimol.


Para cada hidrato de carbono que se use, inocular un par de tubos OF para
cada organismo en estudio. Rotular uno abierto y el otro sellado con 1 a 2 ml
de vaselina, aceite mineral o parafina fundida estéril, para excluir el oxígeno
atmosférico.

OBJETIVO
Fundamentalmente para diferenciar géneros intestinales no entéricos Gram
negativos de las Enterobacteriaceae.
La mayoría de las especies de Pseudomonas oxidan la glucosa y las
enterobacterias fermentan la glucosa.
Ayudar a la diferenciación entre los géneros de las Micrococcaceae: los
Micrococcus oxidan la glucosa y los Staphylococcus la fermentan.

INTERPRETACIÓN
Fermentativa: F
Oxidativa: O
Ni oxida ni fermenta: negativo

PRUEBA DE LA LICUEFACCIÓN DE LA
GELATINA

PRINCIPIO
Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo
proteolítico (gelatinasa) que licuen la gelatina.
Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grandes para
entrar a una célula bacteriana; por lo tanto, para que una célula utilice las
proteínas, primero debe ser catabolizada en componentes más pequeños. Las
enzimas de tipo proteolítico, gelatinaza, son secretadas por ciertas bacterias
para desdoblar a las proteínas, y esta
capacidad ayuda a la identificación
bacteriana.

OBJETIVO
Ayudar a la diferenciación de las especies
S. aureus gelatinasa positivo de S. epidermidis gelatinasa negativo y del
Micrococcus que puede ser variable y lenta.
INTERPRETACIÓN
Enfriar el medio si se ha incubado a 37°C antes de interpretar los resultados.
Positivo: medio líquido
Negativo: el medio se mantiene sólido.

REACCIÓN DE LA UREASA
PRINCIPIO
Determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos
moléculas de amoníaco por acción de la enzima ureasa.
El pH óptimo para la actividad de la ureasa es 7.

OBJETIVO
Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus.
Klebsiella es positivo y Escherichia es negativo.
Staphylococcus aureus es positivo.

INTERPRETACIÓN
Reacción positiva: color rojo rosado intenso.
Reacción negativa: no se produce cambio de
color.

MATERIALES Y METODOS

Método
Los estudiantes sembrarán en los diferentes medios de cultivo tanto en caja
como en tubo con colonias de microorganismos conocidos.

Materiales

Tubos preparados con las siguientes pruebas metabolicas; Urea, TSI, Lia,
Citrato, SIM, RM/VP, O.F. nitritos, mecheros, bicarbonato de sodio, citrocromo
oxidasa, reactivo de Kovac’s, KOH 40 %, alfa naftol, peroxido de hidrógeno,
Zinc en polvo, reactivo de Grees, hipoclorito de sodio, guantes, delantal,
mecheros, asas bacteriológicas.

PROCEDIMIENTO

Ya sembrados los medios de cultivo e incubados 24 horas de acuerdo a las


condiciones requeridas, se procede a la lectura de los cambios observados
macroscópicamente en los medios que contengan indicadores, los cambios de
color debidos a la utilización de los diferentes sustratos y con utilización de
reveladores para los medios que así lo exigen.

INTERPRETACIÓN Y CORRELACION
Se registraran los cambios metabólicos y se buscaran en las diferentes tablas
para diagnosticar el germen de acuerdo a su género y especie.

BIBLIOGRAFÍA
Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2ª edición 2004

Jean F. Mac Faddin, pruebas para la identificación de bacterias de importancia


clínica.
Thomas D. Brock, Microbiología, sexta edición, pág. 5, 99 – 105
LABORATORIO IV
COLORACIONES

OBJETIVO

Capacitar al estudiante en conocer la técnica de coloración de GRAM

MARCO TEORICO

El examen de una muestra clínica a través de la observación microscópica es


de vital importancia en el diagnóstico clínico.
El examen microscópico nos informa de la presencia o no de bacterias, de su
morfología, de sus características tintoriales, etc. Es el primer paso que nos
permitirá orientar el resto del examen, que se complementara con el cultivo y
aislamiento de las bacterias en los medios adecuados y las pruebas
bioquímicas para su identificación.

FUNDAMENTO DE LAS COLORACIONES

Para la realización de una buena coloración se tendrá en cuenta las siguientes


recomendaciones.

Preparación del extendido: estas se pueden realizar a partir de muestras


clínicas o de cultivos, utilizando placas nuevas y desengrasadas.

1. Elaboración del extendido: a partir de secreciones haciendo un frotis


sobre el portaobjeto, si es a partir de cultivos en medio sólido se toma
una gota pequeña de solución salina, se coloca en el portaobjeto y con
ayuda del asa de redondela se toma una porción de la colonia y se
homogeniza. Luego se deja secar a temperatura ambiente.

2. Fijación: tiene por objeto la inmovilización de las estructuras del material


a estudiar; esta se puede realizar con calor pasando la placa varias
veces por la llama, verificando que no sea muy caliente por que puede
dañar la estructura bacteriana La temperatura deseable es aquélla en el
que el portaobjetos caliente, sea tolerado al ser colocado sobre el dorso
de la mano. Otra forma de fijación es con metanol por 1’
3. Se procede a realiza la técnica de coloración elegida como Gram, Zielh
Neelsen (bacilos ácido alcohol resistente), Hansel (eosina amarillenta),
coloración de Albert (se observa bien los gránulos metacromáticos),
coloración de Scheaffer-fulton (esporas bacterianas).

MATERIALES Y METODOS

Método

Por equipo de estudiantes preparar extendidos de cepas para colorear por


Gram.
Reactivos

Cristal violeta Metanol Safranina


Oxalato de amonio yoduro de potasio acetona
Yodo metálico agua destilada eosina amarillenta
Verde de malaquita alcohol antiséptico azul de metileno

Materiales
Cepas de E. coli y S. aureus
Solución salina
Asas bacteriológicas
Guantes
Portaobjetos
Bata

PROCEDIMIENTO

Cada uno realizará montajes de extendidos con las cepas que le han sido
entregada, siguiendo los pasos anteriores de montaje, frotis, extendido,
secado, fijación y coloración.
INTERPRETACIÓN Y CORRELACIÓN

Se hará lectura de los montajes en el microscopio en 100 x


Se discutirá sobre los errores o fortalezas de las diferentes coloraciones
realizadas.

Se utilizara el protocolo de reporte de acuerdo a la técnica utilizada.


Se comparara el germen observado en 100 x y se correlacionara con la
morfología de las colonias en los diferentes medios de cultivo.

BIBLIOGRAFÍA

Koneman, Diagnóstico microbiológico. Panamericana (protocolos)


José Ángel García Rodríguez, Microbiología Médica, Mosby
Thomas D. Brock, Microbiología sexta edición.
T. Stuart Walker, Microbiología, McGraw-Hill, interame

LABORATORIO V
ESTANDARIZACION DE LA COLORACIÓN DE GRAM

OBJETIVO

Estandarizar la interpretación de los extendidos coloreados por Gram de


muestras clínicas.
Unificar los criterios en el informe de los resultados por la coloración de Gram.

MARCO TEORICO

En 1889 el médico danés Christian Gram descubre un método sencillo de


coloración que permite observar la morfología, agrupación y características
tintoriales de las bacterias, desde entonces este método se utiliza como primer
paso en su identificación.
Se ha reconocido que las bacterias pueden ser divididas en dos grupos
dependiendo de su reacción a la coloración de Gram, esta prueba refleja los
dos tipos de pared celular, la pared de Gram positivos es más gruesa que la
Gram negativa y contiene grandes cantidades de péptidoglicano, además
ácidos teicoicos y unos pocos ácidos lipotecoicos.
La pared Gram negativa es más compleja que la Gram positiva, tiene un
péptidoglicano más delgada y por fuera de ésta se encuentra una capa externa
formada por fosfolípidos, lipoproteínas, proteínas y lipopolisacáridos

FUNDAMENTO
Por contener las bacterias Gram negativas una composición elevada de lípidos,
cuando se realiza la coloración de Gram, el alcohol acetona (decolorante)
extrae la porción lipídica, lo cual permite que se disuelva el complejo violeta-
lugol, mientras que las Gram positivas con poco o nada de lípidos, el colorante
penetra poco, porque el péptidoglicano es insoluble en alcohol, por
consiguiente la disolución del complejo colorante es más lenta.

MATERIALES Y METODOS

Método
Los estudiantes realizaran extendidos a partir de muestras clínicas (abscesos,
heridas tomadas por aspiración, secreciones purulentas y a partir de colonias
de cepas conocidas de cocos Gram positivos y bacilos Gram negativos,

REACTIVOS
1. Cristal violeta (modificación de Hucker)
2. Lugol
3. Alcohol-acetona (Partes iguales 50:50 etanol al 95% y acetona)
4. Safranina
MATERIALES
Láminas portaobjetos, lápiz vidriograf, guantes, bata, placas de colección,
mecheros, asas bacteriológicas.

PROCEDIMIENTO
A. Preparación de las placas
1. Prepare un extendido de la muestra, suficientemente densa pero de
fácil visualización, teniendo como guía un periódico impreso, que
pueda ser visible a través del extendido.
Nota: siempre inocule los medios de cultivo, antes de realizar el
extendido cuando se use la misma pipeta o el mismo aplicador.
a. Muestras recibidas en aplicador
Rotar el aplicador suavemente, por impronta evitando la destrucción
de los elementos celulares
Alternativamente, si se recibe un solo aplicador colocarlo en una
pequeña cantidad de caldo o solución salina, tapar el tubo y colocarlo
en el vortex unos pocos segundos. Exprimir el aplicador, hacer el
extendido y dejar el resto de la suspensión para inocular los medios
de cultivo.

b. Muestras no recibidas en aplicador: aspirados, exudados, esputos


etc.
(1) Transfiera la muestra al portaobjetos limpio
(a) Si la muestra es recibida en una jeringa, primero inocule los
medios de cultivo y luego coloque una pequeña cantidad de la
muestra sobre el portaobjetos.
Nota: para evitar la exposición a agujas, no aceptar jeringas
con la aguja conectada. Educar al personal médico al
respecto.
(b) Seleccione una porción purulenta o teñida de sangre, de pus o
esputo, con un aplicador, un palo estéril, pipeta o un asa de
redondela.
(c) Extienda sobre un área grande del portaobjeto, para formar
una película delgada.
c. Para muestras extremadamente purulentas
(a) Colocar una gota de solución salina sobre la placa y diluya
una porción pequeña de la muestra, en una forma
homogénea.
(b) Alternativamente, coloque otra placa sobre la preparación,
Presione suavemente. Deslice una placa sobre la otra, para
obtener un extendido delgado.

Remueva el exceso de material por los lados, sobre una toalla


mojada con un desinfectante.
d. Material muy pequeño, de muestras clínicas
(1) Emulsione el material en 0.5 ml de caldo estéril. Coloque en
vortex si es necesario.
(2) Use una pipeta de Pasteur estéril o coloque una gota en la placa
(3) Use la punta para extender la muestra.
e. Muestras de biopsias y porciones de tejido
(1) Toque la preparación
a. En una caja de Petry colocar el tejido y con unas tijeras o con
una hoja de bisturí estéril, fragmentar el tejido.
b. Con unas pinzas estériles tomar varios fragmentos del tejido y
tocar en varios sitios diferentes de la placa.
2. Cultivos líquidos
a. Preparar un extendido por placa
b. Use una pipeta automática o si es un hemocultivo, con una
jeringa de 1ml, extraer 0.5 ml de la muestra, subcultivar en los
medios de cultivo aerobios y luego colocar una gota sobre una
placa y extenderla entre dos placas o como un extendido de
hematología
c. Descartar la aguja en un guardián para evitar accidentes.

3. Cultivos a partir de colonias obtenidas a partir de medios sólidos.


a. Colocar una gota pequeña de solución salina estéril y con una
asa estéril, tomar una porción pequeña de la colonia, mezclar
homogéneamente. La preparación debe quedar clara, con poco
inoculo.
b. Fijación:
Tiene por objeto la inmovilización de las estructuras del material
a estudiar; esta se puede realizar con calor pasando la placa
varias veces por la llama, verificando que no sea muy caliente por
que puede dañar la estructura bacteriana.
La temperatura deseable es aquélla en la que el portaobjetos
caliente, sea tolerado al ser colocado sobre el dorso de la mano.
Otra forma de fijación es con metanol por 1’ dejar secar y
colorear.
B. PROCEDIMIENTO DE LA COLORACION
a. Agregar 2 o 3 gotas del Cristal violeta sobre el sitio donde está la
muestra, o inundarla si el extendido es muy amplio dejar actuar por
30”.
b. Lavar con agua y decantar el exceso, sacudiendo un poco la placa
c. Agregar unas gotas de la solución de lugol, dejar actuar 30”
d. Lavar con agua
e. Agregar el alcohol-acetona y parar de agregarlo cuando la
preparación se vea blanca.
f. Lavar con agua
g. Safranina como contraste por 30”
h. Lavar con agua
i. Secar al aire o con el secador de manos automático.
j. Observar en el microscopio con objetivo de 10X inicialmente y luego
pasarlo al objetivo de 100 X y con aceite de inmersión.

CONTROL DE CALIDAD
A. Chequear la apariencia de los colorantes diariamente
1. Si el cristal violeta esta precipitado, filtrarlo.
Nota: Los colorantes se pueden contaminar. Si sospecha
contaminación cambiarlo por un nuevo lote.
B. Previo a utilizar cada lote se debe evaluar, con un control de la
coloración.
1. Elaboración de las placas de control de calidad
a. Preparar una suspensión bacteriana ligeramente turbia en un
medio de cultivo líquido con unas colonias de la cepa de la ATCC
25922 de Escherichia coli y en otro tubo una cepa de
Staphylococcus aureus ATCC 25923.

b. En una lámina portaobjetos marcarla como control de calidad


(CC). Colocar una pequeña gota de la E. coli y extenderla en un
pequeño círculo, de la mitad del portaobjetos hacia abajo, en el
centro, colocar la otra gota de el S. aureus dejar secar a tº
ambiente.
c. Fijarlas con metanol y guardarlas

d. Correr el control diariamente y anotar en el registro diario de


control de calidad interno.

e. Correr el control con cada paciente


2. Resultados esperados:
a. Gram negativos: bacilos, de color rosados
b. Gram positivos: cocos, de color morado
Para asegurar la precisión en la interpretación, se debe establecer un
control de revisión de los reportes de los Gram por el supervisor del
personal.

a. Comparar el resultado final del cultivo, con el reporte de la tinción de


Gram; si las morfologías vistas en el Gram
fueron recuperadas en el cultivo.
b. Revisar tanto el cultivo como el Gram, cuando
se recuperan abundantes ufc (unidades
formadoras de colonias) pero no fueron vistas
en el Gram.

NTERPRETACIÓN Y CORRELACION
1. La interpretación se hace de acuerdo al tipo de muestra clínica.
a. Para extendidos de muestras clínicas, revisar 10 campos para orina y
de 20-40 campos en 10X para evidenciar inflamación
(1) Observe la distribución de los organismos y de las células
(2) Determinar las áreas de inflamación o purulentas y áreas de
aparente contaminación con células epiteliales escamosas
1. 2. 3. 4.

1. PMN coloreados por Gram


2. PMN coloreados por Wright (coloración de hematología
3. PMN coloreados por Gram
4. Célula escamosa o plana

REPORTE DE RESULTADOS
A. Si no se observa bacterias ni células
REPORTE: “No se observa bacterias, No se observa células”

El recuento podría ser hecho solamente en áreas


representativas de inflamación o necrosis, si están presentes

B. Determine la
cantidad de
bacterias o de
células en 20-40
campos para

otras muestras,
sacando el
promedio de
células o bacterias por campo.

Saltar los campos donde no hay células ni bacterias.

C. Cuente las bacterias y las levaduras, vistas en 100X y reporte el número

relativo de ellas, principalmente asociadas a los PMN.

NOTA: Ignore 1-2 microorganismos vistos en toda la placa a menos que

El resultado pueda ser reproducido con un nuevo extendido y

Únicamente de muestras recolectadas de forma invasiva.


1. Raro u ocasional: Menos de 1 en 100X (por campo inmersión)

2. Pocos: de 1-5 en 100X

3. Moderado de 6-30 en 100X

4. Abundantes mayor de 30 en 100X

D. Seguir con la enumeración celular y descripción del tipo de células

PMN Polimorfo nuclear neutro filo

Mono nuclear

Células escamosas

Otras células del huésped

E. Seguir con la descripción de la morfología de las bacterias. Dando la

mayor información como sea posible.

Descripciones que pueden ser usadas:

1. Gram positivos

a. Cocos en pares (cadenas)


b. Cocos en acumuló
c. Bacilos largos
d. Bacilos cortos
e. Bacilos ramificados
f. Bacilos coryneformes

2. Gram negativos
a. Cocos
b. Bacilos
c. Bacilos, filamentosos (o pleomorficos)

3. Cocobacilos Gram variables


4. Levaduras (blastoconidias)
5. Pseudomicelios

NOTA: El microbiólogo se podría arriesgar a informar como compatibles con

cierto tipo de bacteria de acuerdo a su disposición, si ella está claramente


definida según el tipo de muestra:

“Cocos Gram positivos en pares compatibles con S. pneumoniae” si los vemos

en una muestra de esputo o en un hemocultivo cuyo paciente tiene

como antecedente, historia de una neumonía.

“Cocos Gram positivos en acumuló compatibles con un Staphylococcus si los

Vemos a partir de un hemocultivo.

“Cocos Gram positivos compatibles con estreptococo cuando los vemos en

cadenas a partir de un hemocultivo.

“Cocobacilos Gram negativos pequeños compatibles con haemophilus” si los

Observamos casi en cultivo puro en una muestra respiratoria y acompañada de

abundante reacción PMN

“Cocobacilos Gram positivos compatibles con Listeria”

“Cocos Gram negativos (diplococos ) compatibles con Neisseria”

F. Notifique al médico telefónicamente el hallazgo dependiendo de la

significancia clínica ( si es de un sitio estéril) y registre la fecha, hora y el

nombre de quien recibió el informe.

LIMITACIONES

A. Use la coloración de Gram, en asocio a otros hallazgos clínicos.

B. Use procedimientos especiales (coloraciones especiales, inclusión de

medios especiales) para confirmar los hallazgos sugeridos en el

extendido coloreado por Gram.

C. Tinciones de Gram positivas con cultivos negativos, pueden ser


resultado de contaminación, presencia de agentes antimicrobianos,

O fallas del microrganismo para crecer, bajo condiciones del cultivo

(atmosfera, medio etc.).

BIBLIOGRAFÍA

Koneman, Diagnóstico Microbiológico, Panamericana


José Ángel García Rodríguez, Microbiología Médica general, Mosby
Thomas D. Brock, Microbiología sexta edición.
T. Stuart Walker, Microbiología, McGraw-Hill, interamericana.
Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2ª edición 2004

LABORATORIO VI
ANTIBIOGRAMA

OBJETIVO

Capacitar al estudiante en el proceso e interpretación del Perfil de sensibilidad


de una bacteria a un conjunto de agentes antimicrobianos

MARCO TEORICO
Los doctores Bauer, Kirby, Sherris y Turck probaron minuciosamente todas las

variables involucradas en el proceso, tales como los medios de cultivo, la

temperatura y el espesor del agar. En 1966, ellos publicaron su estudio

describiendo la prueba que se usa en la actualidad.


El CLSI adoptó los pasos básicos del procedimiento descritos en el estudio

de Bauer como el método de referencia para difusión por disco. Estos pasos

deben seguirse en forma minuciosa para obtener resultados precisos.

Los Antibióticos se definen como cualquier agente antimicrobiano producido

por un microorganismo. Este inhibe el metabolismo y/o el crecimiento de un

microorganismo y puede matarlo. Por ejemplo la penicilina del Penicillium

notatum. En la naturaleza existe un gran número de antibióticos, pero

solamente unos pocos son seguros para uso humano.

FUNDAMENTO
Este laboratorio tiene como objeto conocer el cómo y para qué de una

Herramienta sencilla y accesible que se utiliza para determinar la sensibilidad

y resistencia de una bacteria determinada, como es el antibiograma de difusión

por disco (Kirby Bauer) conocer las variables que deben ser controladas

cuando se realiza la prueba; Identificar los problemas que podrían ocurrir si las

variables de la prueba no son controladas apropiadamente. Seguir las

recomendaciones de la CLSI en cuanto a la interpretación de los diámetros de

la zona de inhibición como sensible, intermedio o resistente para

organismo/agente antimicrobiano específico.

Lo anterior representa un importante aporte para un mejor y mayor enfoque en

el tratamiento antibiótico del paciente y a la vez, suministra un control de

calidad al informe y diagnóstico microbiológico .


MATERIALES Y MÉTODO

Método

Aplicación e interpretación de los sistemas para la sensibilidad antimicrobiana


como el sistema de Kirby Bauer, conocer la técnica de concentración inhibitoria
mínima (CIM), el patrón de Mac Farland y las pruebas de sensibilidad
especiales.

Materiales

Agar Mueller Hinton, caldo de Mueller Hinton,


diferentes sensidiscos de antibióticos, tubos
tapa rosca estériles, escobillones estériles,
cepas de colonias, preparadas con
anterioridad, tablas como guías para colocar
los sensidiscos, mecheros, bata, pinzas,
hipoclorito de sodio, solución salina.

PROCEDIMIENTO

Una vez que se han aislado colonias, de un organismo que ha sido identificado

como patógeno potencial, es necesario proceder de la siguiente manera para

realizar la prueba de susceptibilidad.

1. Seleccionar las colonias

2. Preparar estandarizar
una suspensión del inoculo

3. inocular la placa de Mueller hinton

5. Colocar discos de antimicrobiano

4. Incubar la placa

5. Medir las zonas de inhibición

6. Interpretar los resultados

1. Seleccionar la colonia
Es uno de los pasos más importantes en el proceso de la prueba, es la

preparación del inoculo.

Primero, seleccione varias colonias del organismo que esté analizando.

Seleccionar entre 3–5 colonias, de igual morfología que este en cultivo

puro en vez de solo una, sus chances de detectar resistencia son

mayores.

Nota: Utilizando un asa de inoculación (o un hisopo de algodón) recoja

de la placa sólo colonias bien aisladas para evitar pruebas de cultivo

mixto.

Si no dispone de colonias bien aisladas, haga un subcultivo de la

Bacteria en una nueva placa. Utilice las últimas colonias del cultivo, ya

que estas se encuentran más aislados.

2. Cómo Preparar y estandarizar la suspensión bacteriana o el inoculo.


Existen dos métodos para la preparación de inoculo:

Suspensión directa de colonias y fase logarítmica de crecimiento.

Sólo el método de suspensión directa de colonias proveerá resultados

precisos para ciertos organismos. En ambos métodos, la turbidez de

la suspensión debe ser estandarizada (para que sea igual) al

estándar 0,5 de McFarland (corresponde a aproximadamente 1,5 X 10

a la 8 CFU/ml).

Las suspensiones así ajustadas deben utilizarse como inoculo dentro

de los 15’ siguientes.

Nota: Los estándares de McFarland están hechos ya sea de sulfato de bario o

Partículas de látex. Si usa sulfato de bario, agite antes de usar, si usa látex,

invierta para mezclar.

a. Suspensión Directa de Colonias


Para el método de suspensión directa de colonias, las colonias no deben

Sobrepasar las 18–24 horas de aislamiento. Estandarice el inoculo al mismo

tiempo que prepara la suspensión.

Suspenda las colonias en solución salina o caldo (eje. Mueller-Hinton

o soya tríptica). Luego, ajuste el inoculo a una turbidez equivalente al estándar

0,5 de McFarland.

Puede comparar la turbidez de las suspensiones poniendo los

tubos frente a un papel blanco o una tarjeta de archivo con líneas negras.

Use suspensión directa de colonias para los siguientes organismos:

Todos los estafilococos, estreptococos, enterobacterias (consultar las guias de

La CLSI)

b. Método de Fase Logarítmica

El método de fase logarítmica se usa con la mayoría de organismos que crecen

Rápidamente excepto estafilococos. Una vez que se han inoculado las colonias

en un caldo, incube a 35 ºC para lograr un crecimiento en fase logarítmica.

El crecimiento de fase logarítmica ocurre después de 2–8 horas de incubación.

Después de la incubación, ajuste la turbidez para que sea igual al estándar 0,5

De McFarland. Asegúrese de conocer como ajustar y estandarizar el inoculo

A. ¿Qué haría si la suspensión de organismos es demasiado turbia?

B ¿Qué haría si la suspensión es demasiado clara para la suspensión

directa de colonias?

C ¿Qué haría si la suspensión es demasiado clara para el método de fase

logarítmica?
Respuestas correctas:

A. Añada más caldo o solución salina para igualar la turbidez a 0,5 del estándar

de McFarland.

B Tome más colonias y suspéndalas en el caldo. Reincube la suspensión.

Nota: No use cultivos en medio líquido de la noche anterior ni tampoco

suspensiones no estandarizadas para inocular las placas.

Cómo prepararse para la Inoculación de la Placa

Retirar del refrigerador los discos con 2 horas de anticipación hasta


que

alcancen la temperatura ambiente, igualmente el Mueller Hinton debe


estar a

Tª ambiente.

3. Inocular la placa

Depositar 100 µl de la suspensión bacteriana en cada una de las cajas

de Petry, dejando caer la suspensión en forma vertical sobre la caja de Petry.

Con un aplicador estéril, distribuir la suspensión empezando en la

parte superior de la placa MHA inocule la superficie con el hisopo.

Cubra toda la placa frotando de ida y vuelta de un borde al otro. Rote la placa

aproximadamente 60º y repita el procedimiento de frotado. Rote otra vez la

placa 60º y frote toda la placa por tercera vez. Esto garantizará que el inoculo

sea distribuido homogéneamente.

Sugerencia técnica: Incube la placa dentro de los 15 minutos siguientes


Después de haber estandarizado el inoculo.

NOTA: Después de
preparada la suspensión bacteriana, si no se tienen
pipetas

automáticas, se puede escurrir el aplicador como lo indica la figura.

La metodología de las 100µl es mucho más precisa.

Cómo Aplicar los Discos de Antimicrobianos

Coloque los discos con los agentes antimicrobianos dentro de los 15 minutos

siguientes a la inoculación de la placa MHA.

Con unas pinzas, que puede pasarlas rápidamente sobre la llama del mechero

entre disco y disco, dejándola enfriar, para evitar contaminación Se pueden


colocar 7 discos en una placa de 100 mm utilizando una guía

Presione cada disco firmemente para asegurar el contacto completo con la

superficie de agar.

No se olvide de este paso o los discos pueden terminar en la tapa de la placa

después de la incubación.

Puntos que hay que recordar sobre los discos de antimicrobianos:

No use discos después de su fecha de caducidad.

No almacene discos en un
congelador libre de
escarcha.

Use productos aprobados por la


FDA.

Use discos con el contenido


especificado en los
estándares de la CLSI

No reubique un disco una vez que éste ha tocado la superficie del agar.

Cómo Incubar la Placa


Invierta las placas e incúbelas.

Para las bacterias no fastidiosas, incube (Tª ambiente en aire) a 35°C por 16–

18 horas.

Para la prueba de difusión por disco de bacterias exigentes, use las

condiciones de incubación recomendadas por el CLSI, como se muestra en el

siguiente cuadro.

Bacteria Medio Incubación

Tiempo (h) Atmosfera

Haemophilus spp. Medio de Prueba 16–18 18 CO2 (5%)


para Haemophilus
HTM
Neisseria Agar base GC _ 1% 20–24 CO2 (5%)
gonorrhoeae suplementado
Streptococcus Solo Utilizar CIM
pneumoniae
Otros MHA-5% sangre de 20–24 CO2 (5%)
Streptococcus cordero
spp

Cómo Medir las Zonas de Inhibición – Luz Reflejada

Después de retirar la placa de la incubadora:

Examine detenidamente la placa para verificar que el crecimiento sea uniforme

Y confluente de tal modo que pueda identificar zonas sin crecimiento

bacteriano.
INTERPRETACIÓN Y CORRELACIÓN

Se hará lectura de los halos de inhibición.


Se reportará la sensibilidad como: sensible, resistente e intermedio, de acuerdo
al antibiótico y tipo de bacteria, analizado según las guías de la CLSI.

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