UN GEN ES UNA SECUENCIA DISCRETA DE

NUCLEÓTIDOS DE ADN.

Concepto

Mendel describió un gen como una unidad discreta de

herencia que influye en un rasgo visible. Beadle y Tatum
definieron un gen como las direcciones discretas para
elaborar una proteína única, que influye en un rasgo
metabólico. Los primeros esfuerzos de secuenciación
mostraron que las proteínas son, a su vez, largas cadenas
de aminoácidos dispuestas en un orden específico. El
código genético del triplete refinó aún más la definición de
un gen como una secuencia discreta de ADN que codifica
una proteína, comenzando con un codón de "inicio" y
terminando con un codón de "parada".
El análisis genético dio un gran paso adelante con el
descubrimiento de métodos para determinar la secuencia
exacta de nucleótidos que componen un gen específico. La
secuenciación del ADN se construyó sobre el conocimiento
anterior de las ADN polimerasas y los sistemas libres de
células para replicar el ADN. El método de terminación de
cadena, que hace un uso inteligente de un nucleótido de
ADN "defectuoso", ahora domina la tecnología de
secuenciación de ADN.

soy Fred Sanger. en los años 50. Fui el primero en determinar la

secuencia de amino en una proteína. Mostré que los 51
aminoácidos de la proteína insulina están ordenados en un orden
específico
ya que el código genético determina el orden de los aminoácidos,
el ADN es colineal con la secuencia de aminoácidos
sin embargo, conocer la secuencia de aminoácidos de la proteína
no nos dice la secuencia exacta de nucleótidos de su gen. recuerde
que el código genético es redundante: más de un codón puede
codificar un aminoácido

Por ejemplo, aquí están los codones redundantes para estos

aminoácidos.

a principios de los 70, desarrollé un método para determinar la

secuencia exacta de nucleótidos en un gen. casi al mismo tiempo.,
alan maxxam y walter gilbert desarrollaron un método de
secuenciación diferente, ya que resulta que mi método de
"terminación de cadena" se usa más comúnmente en los
laboratorios de hoy.

Mi método se basó en el trabajo anterior de Arthur

Kombergs en la replicación del ADN. recuerde que una
nueva hebra de ADN se sintetiza utilizando una hebra
existente como modelo. Aquí estoy usando ADN de poli-
timina como ejemplo
el carbono 5 de un desoxinucleótido "entrante" (dNTP) se
une al carbono 3 en el extremo de la cadena. Los grupos
hidroxilo en cada posición forman enlaces éster con un
fosfato central. De esta forma, la cadena de nucleótidos
elongales.
la clave de mis métodos de secuenciación es la peculiar
química de los didecxinucleótidos (didNTP), como un
desoxinucleótido, un didNTP está incorporado en la cadena
de información al formar un enlace fosfodiéster en su
extremo 5
sin embargo, el didNTP carece de un grupo 3 hidroxilo (oh),
necesario para formar el enlace con un nucleótido entrante.
Por lo tanto, la adición de un didNTP salas de alargamiento
Configuré cuatro reacciones separadas, una para proporcionar
información de secuencia sobre cada uno de los nucleótidos.
cada reacción contenía: plantilla de ADN, y los cuatro dNTP (uno
etiquetado radioactivamente)

one type of didNTP -. A,T,C or G - was added to each

Luego realicé una secuencia de pasos. vamos a enfocarnos en la
reacción del terminador de adenina (A)
En primer lugar, el ADN se desnaturaliza en cadenas simples a
una temperatura cercana a la de la inflexión. a altas
temperaturas, el movimiento cinético de la molécula de ADN
interrumpe los débiles enlaces de hidrógeno que unen las
cadenas de ADN complementarias
cuando la temperatura es más baja, el cebador se une a su
secuencia complementaria en el ADN plantilla. El trabajo anterior
de Kombergs mostró que se necesita un cebador para que la
ADN polimerasa comience la replicación

La ADN polimerasa no hace distinción entre dNTPs o didNTPs.

Cada vez que se incorpora un didNTP, en este caso la síntesis se
finaliza y se genera una cadena de ADN de un tamaño discreto.
En este ejemplo de secuenciación, el didATP (púrpura) ha
terminado la reacción. El dATP es el trazador radioactivo, pero
esto no tiene efecto en el alargamiento.
Debido a que hay miles de millones de moléculas de ADN
presentes, la reacción de elongación se puede terminar en
cualquier posición de adenina. Esto da como resultado
colecciones de cadenas de ADN de diferentes longitudes
Lo mismo es cierto para las otras tres reacciones de terminación.
Cada reacción se carga luego en una línea separada de un gel de
poliacrilamida que contiene urea, lo que evita que las cadenas de
ADN se desnaturalicen durante la electroforesis.
Los fosfatos aislados le dan a la molécula de ADN una carga
negativa, el ADN migra hacia el polo positivo de un campo
eléctrico. El movimiento de las moléculas de ADN a través de la
matriz de poliacrilamida depende del tamaño
Se agrega un tinte azul que también migra al polo + a las muestras
para rastrear el progreso del ADN en el gel de secuenciación. El
tinte corre un poco más rápido que los fragmentos más pequeños
de ADN.
En el transcurso de la electroforesis, las moléculas de ADN más
cortas se moverán más hacia abajo en el gel que las más grandes.
Millones de moléculas terminadas del mismo tamaño migrarán al
mismo lugar y "banda" en el gel
Después de la electroforesis, el gel se intercala en una película de
rayos X. La adenina radioactiva en el ADN sintetizado emite
partículas beta que exponen la película, haciendo un registro de
las posiciones de las bandas de ADN en el gel.
El gel de secuenciación se "lee" de abajo hacia arriba. La secuencia
de bandas en los distintos carriles de terminación da la secuencia
de nucleótidos en la plantilla de ADN.
Una reacción de secuenciación típica producirá 200-500 pares de
bases de secuencia legible.
Biografia
Frederick Sanger recibió dos premios Nobel (en la misma
categoría), por su trabajo sobre la secuenciación de proteínas y la
secuencia de ADN Frederick Sanger (1918-2013) Frederick Sanger
nació en Rendcombe, Inglaterra. Su padre era médico y se
esperaba que Fred también ingresara en el campo médico.
Cuando Sanger creció, se interesó mucho por la naturaleza y la
ciencia y cuando fue a la Universidad de Cambridge, tomó la
decisión de no estudiar medicina. Sentía que una carrera en la
ciencia le daría una mejor oportunidad de convertirse en un
solucionador de problemas. Sanger era un objetor de la educación
de los cuáqueros. Después de su B.A. en 1939, se quedó en
Cambridge hasta el doctorado. Con Albert Neuberger, sobre el
metabolismo de los aminoácidos. Después de su doctorado. en
1943, Sanger comenzó a trabajar para A. C. Chibnall, en la
identificación de los grupos amino libres en la insulina. En el curso
de la identificación de los grupos amino, Sanger descubrió formas
de ordenar los aminoácidos. Fue la primera persona en obtener
una secuencia de proteínas. Al hacerlo, Sanger demostró que las
proteínas eran moléculas ordenadas y, por analogía, los genes y el
ADN que hacen que estas proteínas también deban tener un
orden o secuencia. Sanger ganó su primer Premio Nobel de
Química en 1958 por su trabajo sobre la estructura de la proteína.
durante la guerra a causa de su En 1951, Sanger formó parte del
personal del Consejo de Investigación Médica de la Universidad de
Cambridge, en 1962,
Para 1951, Sanger formaba parte del personal del Consejo de
Investigación Médica de la Universidad de Cambridge. En 1962, se
trasladó con el Consejo de Investigación Médica al Laboratorio de
Biología Molecular en Cambridge, donde Francis Crick, John
Kendrew, Aaron Klug y otros trabajaban en un Problema
relacionado con el ADN. Resolver el problema de la secuenciación
del ADN se convirtió en una extensión natural de su trabajo en la
secuenciación de proteínas. Sanger investigó inicialmente formas
de secuenciar el ARN porque era más pequeño. Eventualmente,
esto llevó a técnicas que aplican el ADN y, finalmente, al método
dideoxi más comúnmente usado en las reacciones de
secuenciación en la actualidad. Sanger ganó un segundo Premio
Nobel de Química en 1080 compartiéndolo con Walter Gilbert,
por sus contribuciones relacionadas con la determinación de
secuencias de bases en ácidos nucleicos, y Paul Berg por su trabajo
sobre ADN recombinante. Sanger se retiró en 1983 y pasó la
mayor parte de su tiempo trabajando en su gaitden Le dio a su
amigo, Margaret Joan, mucho crédito por ser una compañera de
apoyo en la parte no científica de su vida. En 1992, el Wellcome
Trust y el Consejo de Investigación Médica establecieron el Centro
Sanger, un centro de investigación para profundizar en el
conocimiento de los genomas. El Centro Sanger fue uno de los
principales centros de secuenciación del Proyecto de
Secuenciación del Genoma Humano y también se encuentran
proyectos de secuenciación de otros organismos. En marcha en el
centro de Sanger. Por todas las cuentas, Sanger era un verdadero
"hombre amable, extremadamente cortés y encantador
Problema
Tu hermana es una estudiante graduada de biología molecular.
Ella te invitó a visitar su laboratorio.
Antes de que ella pudiera ofrecerle un recorrido, su supervisor
convocó una reunión de laboratorio. Ahora estás sentada en su
escritorio esperando que regrese.
Su hermana ha estado tratando de secuenciar un gen y el
autoradlograma del gel de secuenciación está en su escritorio. Vas
a leer la secuencia
De abajo hacia arriba, comenzando en la A, ¿cuál es la secuencia
de los primeros 20 nucleótidos? CTGCTGATGTTGAATTAGAG O
ACTGCTGATGTTGAATTAGA ACGTACGTACGTACGTACGT
GACTAGTGCTCCTGGCCGTG
2 actgct
Usted lee la mayor parte de la secuencia que puede y la escribe en
el cuaderno de su hermana O Eso es correcto
Suponiendo que la cadena de ADN que acaba de leer es la cadena
5 'a 3', ¿cuál es la secuencia de ADN complementaria? Comience
con el extremo 3 'del complemento de ADN.
3'ACTGCTGATGTTGAATTAGA 5 O 3
'ACUGCUGAUGUUUGAGAAUUAGA 5 3
UGACGACUACAACUUAAUCU 5' 3 TGACGACTACAACTTAATCTAT 5
Los enlaces de adenina con timina; Los enlaces de guanina con la
citosina. Esta es la secuencia de ADN del complemento. O eso es
correcto
La ARN polimerasa lee la secuencia de ADN de 3 'a 5' para crear
ARNm. ¿Cuál es la secuencia de mRNA hecha en este ejemplo? 5
'ACTGCTGATGTTGAATTAGA 3 "O 5'
ACUGCUGAUGUUGUGAAUUAGA 3 'O5'
UGACGACUACAACUUAAUCU 3 5 'TGACGACTACAACTTAATCTATCT
3
El ARNm tiene uracilos en lugar de timina. Observe que el ARNm
es el mismo que la secuencia de 5 a 3 ADN con uracilos que
reemplazan a las tinas O Eso es correcto.
Su hermana probablemente usa un programa de computadora
para decodificar el ARNm, pero una secuencia corta, así que usa
una tabla de codones. ¿Para qué se codificarán los primeros 20
nucleótidos de esta secuencia de ARNm? Utilizar como el codón
de parada OTADVEL OLLMLN * C% O Todo lo anterior. O Ninguno
de los anteriores.
Como no sabes dónde comienza el gen, debes considerar tres
marcos de la secuencia que es correcta.
Te das cuenta de que no sabes cómo obtuvo tu secuencia esta
hermana, por lo que realmente debes considerar los seis marcos.
Después de todo, la ARN polimerasa puede estar leyendo la otra
cadena para el "gen". ¿Cuál es el otro ARNm que podría hacerse?
La "otra" secuencia de ARNm se lee como el ADN complementario
con uracilos que reemplazan a las tesinas. Eso es correcto.
Se deducen los codones para la otra secuencia de ARNm. 5
'UUAACGCGUGCCUCUGGUCUAGCAGCCGC MARCO 4 R V P L V N
A Frame 1: TADVEL Frame 2: LLMLN Frame 3: C C IR Frame 4
LTRASGL Frame 5: RVPLV Frame 6: N A CLWSI