AOAC Método Oficial 996.

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Etoxiquina en alimentos
Método de cromatografía líquida.

(Aplicable para la determinación de 0,5-300 µg/g de etoxiquina extraída en Comida seca para
mascotas o comida de Carne.)

Ver Tabla 996.13 para los resultados del estudio interlaboratorios apoyando la aceptación del
método.

A. Principio.

La etoxiquina se extrae con acetonitrilo. El extracto es analizado por cromatografía liquida

Isocratica con detector de fluorescencia.

B. Aparatos.

(a) Cromatógrafo Líquido. – Generador de 1500 ± 200 psi; con integrador para pico de área,
bomba isocrática LC, y calentador de columna. Condiciones de operación: volumen de
inyección, 20 µL; taza del flujo, 1.3mL/min; temperatura, 35°C; detector de fluorescencia
con salida, para conversión de análogo a digital; configuración del detector; excitación, 360
nm; emisión, 432 nm, Tiempo de retención de retención de la etoxiquina, 6 min. La
Bombeo de la fase móvil del LC a través de la columna 30-60 min del LC por una taza de
flujo de 1.3 mL/min hasta que el sistema se equilibre.
(b) Columna LC. – 250 x 4,6 mm id, C 18, 5 mm octadecilsilano, 5 µm esférica, tamaño de
poro de 100 Å.
(c) Automuestreador. – Opcional; envió de 20 µL.
(d) Viales ámbar para el automuestreador.
(e) Centrifuga o micro centrífuga. – Mantenga 300 x g.,
(f) Tubos de moicrocentrifuga. – 2mL.
(g) Fiolas volumétricas ámbar. – 50, 100 y 250 ml.
(h) Balanza analítica. – División mínima 1 mg.
(i) Dispensador. – De entrega de 1.0 -5.0 mL ± 1%.
(j) Vortex mixer.
(k) Pipetas volumétricas. – 5, 6, 10 y 25 mL.
(l) Estándar de alimento molida.
(m) Filtro de membrana. – 0.4 µm de porosidad.
C. Reactivos
(a) Agua. – Grado LC
(b) Acetonitrilo. – Grado LC
(c) Acetato de Amonio. – 0.01 M: Disolver 0.231g de acetato de amonio (grado ACS) en 300ml
de agua. Preparar una solución nueva diariamente.
(d) Fase móvil LC. – Acetonitrilo y acetato de amonio 0.01M (70+30, v/v). Preparar una fase
nueva diariamente. Antes de usarla filtrarla y desgasificarla por 30 minutos.
(e) Etoxiquina. –: Liquida; aproximadamente 93.5 % de pureza.

D. Preparación de soluciones estándares

(a) Solución stock del estándar de etoxiquina.- 400ug/mL. Pesar el equivalente de 0.1000g de
etoxiquina liquida dentro de una fiola ámbar volumétrica de 250 mL y llevarlo a volumen
con acetonitrilo ( La cantidad de etoxiquina necesitada para la preparación de la solución
estándar está basada en la pureza del líquido , ejemplo ; para la pureza de 93.5% la
cantidad de etoxiquina líquido es 0.100/0.935 = 0.1070g )
 (b) Soluciones estándar de etoxiquina.-
(1) 4.0 µg/mL.- Transferir 5.0 mL de la solución estándar de etoxiquina de reserva
dentro de una fiola ámbar volumétrica de 50 mL, diluir a volumen con acetonitrilo, y
mezclar bien. Transferir 5.0 mL a una fiola de ámbar volumétrica de 50 mL y diluir
a volumen con acetonitrilo. 4.0 µg/mL.,
(2) 1.0 µg/mL.- Transferir 25 mL de 4.0 µg/mL de la solución estándar de etoxiquina
dentro de una fiola ámbar volumétrica de 100 mL, diluir a volumen con acetonitrilo,
y mezclar bien. Transferir 5.0mL a una fiola de ámbar volumétrica de 50 mL y diluir
a volumen con acetonitrilo.
(3) 0.4 µg/mL.- Transferir 10 mL de 4.0 µg/mL de solución estándar de etoxiquina a
una fiola volumétrica ámbar de 100 mL y diluir con acetonitrilo.
(4) 0.10 µg/mL.- Transferir 5.0 mL 1 µg/mL de solución estándar de etoxiquina a una
fiola volumétrica ámbar de 50 mL y diluir a volumen con acetonitrilo.
(5) 0.06 µg/mL.- Transferir 6.0 mL de 1 µg/mL de solución estándar de etoxiquina a
una fiola volumétrica ámbar de 100 mL y diluir con acetonitrilo.
(6) 0.04 µg/mL.- Transferir 10.0 mL de 0.4 µg/mL de solución estándar de etoxiquina a
una fiola volumétrica ámbar de 100 mL y diluir a volumen con acetonitrilo.
(7) 0.02 µg/mL.- Transferir 2.0 mL de 1.0 µg/mL de solución estándar de etoxiquina a
una fiola volumétrica ámbar de 100 mL y diluir a volumen con acetonitrilo.
(8) 0.01 µg/mL.- Transferir 25 mL 0.04 µg/mL de solución estándar de etoxiquina a
una fiola volumétrica ámbar de 100 mL y diluir a volumen con acetonitrilo.

Las soluciones estándares de etoxiquina son estables por 1 día. Es crítico que la exposición de la
luz sea mínima.
Dependiendo de las concentraciones del analito, ciertas concentraciones de las soluciones patrón
de calibración de etoxiquina pueden ser eliminadas.
Utilizar curvas de calibración separadas para matrices con concentraciones por encima y debajo
0.1 µg etoxiquina/mL.

E. Extracción

Moler la muestra de laboratorio a un tamaño de partícula 0.85 mm o menor.

Almacenar las muestras de prueba selladas con exposición mínima a la luz y calor.
Analizar muestras de prueba en un plazo de 30 días a partir de la recepción

Pesar (en duplicado) 0.06-0.1 g de la porción de prueba en un tubo de microcentrífuga de 2 mL.

Usando el dispensador calibrado o la pipeta volumétrica, adicionar 1.5 mL de acetonitrilo a cada
tubo y taparlo con seguridad.

Si se analiza una porción de ensayo más grande, incrementar proporcionalmente el volumen de

acetonitrilo para mantener la relación de 0.5g de porción de prueba en 7.5 mL de solvente.

Mezclar completamente por 1 minuto en un mezclador Vortex y dejar reposar por 20 minutos.
Remezclar por 1 min en el mezclador Vortex y luego centrifugar por 1 min a 3000 rpm por g .
Transferir la capa sobrenadante de acetonitrilo al frasco de inyector automático ámbar y proceder
con el análisis de LC.
 F. Idoneidad del sistema

Calibrar el sistema LC con soluciones estándares de calibración de etoxiquina.

Para el sistema de LC se debe cumplir los siguientes criterios: La etoxiquina debe eluir al minuto 6.
El tiempo de corrida total no debe exceder de 8-9 minutos. Leves ajustes cromatográficos pueden
ser necesarios para asegurar el tiempo de retención apropiado.

La relación señal/ruido de la solución estándar de etoxiquina de 0,01 µg/mL debería ser ≥3.
Repitiendo exactamente cinco inyecciones de solución estándar de etoxiquina de 0,1 µg/mL
debería dar la desviación estándar relativa (RSD) ≤ 2,0%, por otra parte, repita los pasos de
calibración y compruebe la precisión con 0,1 µg/mL de la solución estándar de etoxiquina. Si el
RSD es aun > 2.0%, verificar el equipo por potenciales problemas.

Calcule la concentración de etoxiquina manualmente o usando la integración de la computadora.

G. Determinación de LC

Antes de analizar soluciones de prueba, correr soluciones de estándares de etoxiquina para

establecer la linealidad. Usar el autosampler o la inyección manual. Correr solución estándar por
cada 10 pruebas y al final de la corrida para asegurar la mínima deriva de la calibración.

Usar curvas separadas de calibración para matrices con concentraciones por encima y por debajo
de 0.1µg etoxiquina /mL.

Diluir soluciones que contienen 4,0 ug/mL con acetonitrilo (por ejemplo, adicionar 200uL del
sobrenadante para 1.8mL y usar 10 como factor de dilución F, en los cálculos).

H. Cálculos

Calcular la concentración de etoxiquina, µg/g o ppm, en la muestra de prueba de la curva de

calibración (usar la regresión lineal con la línea forzada a atravesar el intersecto del punto) como
sigue:

Etoxiquina, µg/g or ppm = C x 1.5 x F

W

Dónde:

C = Concentración de la etoxiquina del LC por la curva de calibración, µg/mL;

1.5 = Volumen de acetonitrilo adicionado a la solución de prueba, mL ;
F = Factor de dilución.
W= Peso de la solución de prueba, g.

Promedio de los valores duplicados e informar el resultados.