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Química Farmacéutica Castillo Moreno Adolfo & Sanchez Murcia Angie

CROMATOGRAFIA DE COLUMNA, CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA Y CROMATOGRAFIA


DE PLACA PREPARATIVA
Castillo Moreno Adolfo & Sanchez Murcia Angie1

domingo, 14 de octubre de 2018

1
Estudiantes curso Química Farmacéutica
RESUMEN

En esta práctica se empleó el uso de tres técnicas cromatográficas, en columna, capa fina y placa
preparativa, con el fin de determinar: su aplicabilidad en la determinación de las propiedades
fisicoquímicas tanto de los reactivos utilizados en la fase móvil como la estacionaria así como de
las muestras analizadas, aplicar los conceptos básicos de polaridad de las sustancias la capacidad
de elución identificar el principio de capilaridad, reconocer los métodos de análisis de las muestras
como reconocimiento por luz uv, vapores de yodo, Rf en las placas, y determinar así cual es la
mejor técnica para cada muestra analizada. En la cromatografía de columna se obtuvieron 9 tubos
de ensayo los cuales contenían cada fracción extraída por efecto de la elución en la columna
obteniendo diferentes alcaloides, en la cromatografía de capa fina que se realizo con los alcaloides
de la ruda se obtuvo como resultado la minuciosa separación de los alcaloides según su polaridad
visualizándolo con luz ultravioleta y por último en la cromatografía de placa preparativa se
obtuvieron de una mezcla homogénea dos moléculas de diferentes polaridades con diferentes
tonalidades para mayor visualización. Con ello se pudo determinar que a partir de la ruda se logró
la extracción de 5 alcaloides y con la placa preparativa se pudieron separar las moléculas 3-Amino-
4-anilino-1H-isocromen-1-ona y 3-Amino-4- [metil (fenil) amino] -1H-isocromen-1-ona siendo así la
3-Amino-4-anilino-1H-isocromen-1-ona la molécula mas polar.

Palabras Clave: Cromatografía, Placa fina, columna, placa preparativa.

ABSTRACT

In this practice the use of the chromatographic techniques was used, in the column, the thin layer
and the preparative plate, in order to determine: its applicability in the determination of the
physicochemical properties of both the reagents and in the mobile phase as the stationary as well
as the samples analyzed, apply the basic concepts of polarity of the substances the elution
capacity to identify the principle of capillarity, recognize the methods of analysis of the samples as
the recognition of ultraviolet light, the iodine vapors, Rf in the plates, and determine which is the
best technique for each sample analyzed. In the chromatography of the column, 9 test tubes were
obtained which were counted more and more were extracted by the effect of the elution in the
column different alkaloids were obtained, in the chromatography of the layer that was made with
the alkaloids of the rue the meticulous separation of the alkaloids was obtained as a result of their
polarity visualizing it with ultraviolet light and finally in the preparative plaque chromatography we
would obtain a homogeneous mixture of the different polarities with different tonalities for a larger
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audience. With this, it was determined that the extraction of alkaloids and the preparative plate
can separate the molecules 3-Amino-4-anilino-1H-isocromen-1-one and 3-Amino-4- [ methyl
(phenyl) amino] -1H-isocromen-1-one being 3-Amino-4-anilino-1H-isocromen-1-one the most polar
molecule.

Key Words: Chromatography, thin plate, column, preparative plate.

1. INTRODUCCIÓN Los componentes individuales interactúan con la fase


estacionaria con diversas intensidades.
Las técnicas cromatográficas se han utilizado desde Como lo menciona Gary Christian “El equilibrio de
1906 cuando el científico ruso y botánico Mijaíl Tsvet distribución se define con la constante de distribución
inicio con la separación de colores provenientes de
hojas utilizando una columna de carbonato de calcio Kc= [X]s
y alúmina, la técnica se fue perfeccionando y se [X]m
aplicó el mismo principio en otras técnicas cómo se
conoce hoy en día. Este principio parte
fundamentalmente de la separación de dos donde [X]s es la concentración del componente X
componentes de una muestra en una dirección sobre o en la fase estacionaria, y [X]m es su
definida al ser distribuida en dos fases, una fase concentración en la fase móvil. Esta constante de
estacionaria y una móvil. Aunque existen dos tipos equilibrio está gobernada por la temperatura, la clase
principales de cromatografía, en esta práctica nos de compuesto y las fases estacionaria y móvil.
centramos en la cromatografía de líquidos, donde la También se llama coeficiente de distribución o
separación se da por diferentes técnicas en las que coeficiente de partición en la cromatografía de
se tiene en cuenta las propiedades fisicoquímicas de partición. Los solutos con un valor grande de Kc serán
las sustancias analizadas. retenidos con mayor fuerza por la fase estacionaria
que los que tienen un valor pequeño. Como
resultado, estos últimos avanzaran por la columna
PRINCIPIO DE LA SEPARACIÓN (serán eluidos) con mayor rapidez. Debido a que no
CROMATOGRÁFICA EN COLUMNA se alcanza un equilibrio verdadero entre las dos
fases, habrá algo de retraso de las moléculas de
analito entre ellas, lo cual dependerá de la rapidez de
flujo de la fase móvil y del grado de interacción con
la fase estacionaria; el resultado será el
ensanchamiento de la banda”

CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

Para esta técnica se utiliza una placa de vidrio o


aluminio recubierta con una suspensión delgada de
un adsobrente aplicada en una capa de gel de sílice,
Imagen 1 (tomada del libro Química Analitica de Gary
alúmina o celulosa pulverizada con un espesor entre
Christian)
0.1 y 0.3 mm ya que estás al ser, la más común y la
que se utilizó fue el gel de sílice cómo fase
Se agrega la fase móvil de disolvente a la columna y
estacionaria, esta contiene grupos hidroxilo en la
se deja que salga lentamente por su parte inferior.
superficie que permiten la formación de puentes de

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hidrogeno con moléculas polares. Se deposita la
muestra en una cubeta con el disolvente adecuado,
este será determinado por el poder eluyente del
disolvente el cual aumenta al aumentar su polaridad
y se comprueba empíricamente al determinar en
qué solvente “corre” más eficientemente la muestra,
a esta se le estudia la polaridad y se utilizaran
solventes cada menos polares. los disolventes Imagen 2 (tomada del libro Química Analitica de Gary
deben ser de alta pureza y evitar que contengan Christian)
iones metálicos ya que estos pueden convertirse en desde la línea marcada en la placa hasta donde corrió
catalizadores, no se deben usar mezclas de la mancha, será la distancia del frente del disolvente.
solventes porque esto puede afectar la
reproducibilidad de la técnica. En esta técnica la identificación de los compuestos
analizados que se separaron en la placa, se analizan
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden iluminando la placa con luz ultravioleta, si fluorescen
creciente: serán compuestos aromáticos, también se pueden
visualizar las manchas incoloras o no fluorescentes con
Hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < la aplicación de yodo o vapores de yodo los cuales
aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < interactúan con los componentes para producir
ácidos < amidas colores.
(Esquema tomado de M.cromatograficos UNAM)
Las técnicas cromatográficas permiten el análisis de
El disolvente asciende por la placa por el efecto de múltiples compuestos, pero esto depende de la fase
capilaridad, arrastrando los compuestos de la estacionaria que se utilice y la eficiencia con la que se
muestra en la placa donde las velocidades de cada separen los compuestos de la muestra estará
uno corresponden a la solubilidad y a la capacidad determinada por el solvente que se utilice, a
de retención de la fase estacionaria. Las manchas continuación se presenta una tabla con el tipo de
se moverán a una fracción de velocidad diferente a compuestos que se pueden separar con cada una de
la que se mueve el disolvente y se caracterizan por las fases estacionarias que se pueden utilizar:
su valor de Rf que esta dado por la siguiente
ecuación.

Donde las distancias son medidas desde el punto


donde se deposito la muestra en lado inferior de la
placa, y el frente de la placa será el lugar donde
cruza una línea dibujada con lápiz como se muestra
a continuación:

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sólida (fase estacionaria) y una liquida (fase móvil),
Para que un sistema sea eficiente, se necesitan fases por lo general para la fase estacionaria se utiliza la
poco viscosas, espesores de película delgados y silica gel también llamada acido silícico ya que es
columnas de poco diámetro, para que se favorezca la un polvo blanco poroso que favorece la absorción y
transferencia de masa. La velocidad promedio de la el transporte de las mezclas homogéneas, se aplica
fase móvil también afecta la altura del pico, por lo que en forma de capa delgada, esa capa es fijada a una
hay una velocidad óptima para obtener el máximo de placa firme de vidrio, aluminio o plástico que actúa
eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores como soporte con un tamaño de 20cmx20cm, por
de éste para no perder demasiado tiempo en análisis. esta fase estacionaria transita la fase móvil; la fase
móvil son solventes orgánicos de alta polaridad que
CROMATOGRAFIA DE PLACA PREPARATIVA permiten el transporte de las mezclas.
(Cromatografia )
Todas las técnicas cromatográficas dependen de la
distribución de los componentes de la mezcla entre Esta cromatografía permite separar dos moléculas
dos partes inmiscibles las cuales constan de dos de diferentes polaridades, la molécula más polar
fases: la fase móvil, que se encarga del transporte tendrá una distancia recorrida menor ya que
de las sustancias que se separan y que progresa interactúa con la fase estacionaria mientras que la
con la otra fase denominada estacionaria. La fase menos polar seguirá transitando por la fase
móvil puede ser un líquido o un gas y la estacionaria teniendo mayor distancia recorrida.
estacionaria puede ser un sólido o un líquido.

La separación por cromatografía de placa


preparativa consta de un sistema de dos fases, una

2. SECCIÓN EXPERIMENTAL

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3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN contrario por su alta polaridad arrastro rápidamente


la muestra sobre la placa sin separar los
componentes, mientras que el diclorometano por
Se analizó una muestra de un extracto de la planta su polaridad que se puede considerar media,
Ruda (Ruta Graveolens), que según la literatura arrastró la muestra separándola eficientemente a
contiene 16 tipos de alcaloides y dos tipos de través de la placa.
flavonoides aparte de los aceites esenciales, estos
últimos no se tuvieron en cuenta puesto que el
método de extracción utilizado no corresponde a la
técnica de cromatografía. Durante el proceso se
tomaron muestras en 10 tubos de ensayo los
cuales contenían cada fracción extraida por efecto
de la elución en la columna, esto con el fin de
identificar que fracciones eran las mismas y qué
contenía cada fracción, se puede afirmar que los
alcaloides al tener en su estructura molecular
grupos OH y átomos con pares de electrones libres,
su polaridad va a ser mayor y por ende el proceso
de separación fue continuo debido a la poca
afinidad de las fracciones a analizar con la fase Imagen N° 1 (esquema de arrastre en prueba de
estacionaria pero de mayor afinidad con la fase solventes para cromatografía preparativa)
móvil (diclorometano) puesto que esta al ser de
baja polaridad permitía un arrastre favorable y una
extracción más eficiente en el montaje como se Al tomar cada gota de las fracciones y colocarlas en
pudo comprobar durante la prueba inicial para las placas de capa fina, se lograron analizar nueve
escoger el mejor disolvente, cómo se puede ver en de las fracciones extraídas, cada placa se analizó
la imagen N° 1 el hexano al ser no polar, no en luz ultravioleta donde se pudo evidenciar la
arrastró la muestra ni la separó, el etanol al siguiente información:

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Tabla N° 1 (valores Rf para placas preparativas)

En las tablas se puede identificar el Rf de cada Se determino que probablemente los alcaloides
mancha para cada fracción analizada, se agruparon presentes en esta muestra los cuales fluorescian a
en el mismo orden en que se iban extrayendo la luz UV eran los siguientes:
desde la primera muestra tomada en los tubos de
ensayo hasta la novena, en la primera placa las
muestras eran todas iguales por lo que se unieron
las fracciones, de igual forma en la placa número
dos la cinco y la seis y en la placa tres, las
fracciones siete y ocho eran las mismas, no sólo
porque su Rf era idéntico, también tenían el mismo
color entre sí y las manchas tenían características Tabla N° 2 (alcaloides presentes en la muestra que
similares(color sobre la placa, tamaño de la se detectaron por UV y su Rf)
mancha corrida, y mismo color fluorescente en UV),
Agrupadas las fracciones similares, se ordeno de
el Rf para cada muestra es el valor que se tomó menor a mayor polaridad los alcaloides, y se les
como referencia para identificar según la polaridad
clasificó con su Rf correspondiente teniendo en
de cada alcaloide cual sería entre los 16 posibles ya
cuenta la velocidad con la que se extrajeron de la
que los compuestos más polares se retienen más
muestra con relación a la numeración que se le dio
en la fase estacionaría por los centros activos de
a través del tiempo de la práctica, donde el menos
esta, mientras que los menos polares se eludirán
polar tendería a salir primero que los más polares.
con más rapidez se podría decir que incluso
algunos de los compuestos alcaloides no se Para la práctica realizada con cromatografía de
lograron extraer. Comparando la polaridad que se placa preparativa se obtuvo la separación de la
evidencia en las placas con su estructura molecular, mezcla homogénea en dos analitos de diferentes
se pudo reducir el número eliminando los menos polaridades y tonalidades; obteniendo un analito 3-
conjugados y los que tenían menos átomos con Amino-4-anilino-1H-isocromen-1-ona (imagen 1) de
pares de electrones libres o con carga negativa, tonalidad amarilla y un analito 3-Amino-4- [metil
dejando así las siguientes moléculas. (fenil) amino] -1H-isocromen-1-ona (imagen 2) de
tonalidad roja.

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arrastre del solvente en la placa, aunque existen
métodos cuantitativos y cualitativos que permiten
la identificación precisa de cada sustancia presente
en la muestra.
Se puede aplicar el conocimiento adquirido para
hacer una clasificación inmediata aunque esta no
sea concluyente y solo tenga fines académicos, los
compuestos que se lograron identificar son de igual
forma los que se encuentran en mayor proporción
dentro de la planta de Ruda.
Imagen 1 (3-Amino-4-anilino-1H-isocromen-1-ona)
Es imperativo reconocer la importancia de los
procedimientos básicos para lograr desarrollar las
técnicas de forma más eficiente, puesto que desde
la selección del mejor disolvente si se comete un
error, todo el proceso habría fallado.
La práctica fomentó el uso de técnicas
tradicionales que aunque empiezan a estar en
desuso, su fiabilidad es indudable, además de que
se logró desarrollar la capacidad de resolución de
problemas, al aprender cómo reemplazar las
Imagen 2 (3-Amino-4- [metil (fenil) amino] -1H- herramientas estándar para cada técnica con
isocromen-1-ona) métodos y materiales igual de eficientes sin afectar
los resultados obtenidos.
Analizando cada una de las estructuras se puede
evidenciar que el analito 3-Amino-4- [metil (fenil) La sílica gel permite el análisis de casi cualquier
amino] -1H-isocromen-1-ona es menos polar ya sustancia siempre y cuando se combinen con una
que su carga se encuentra estabilizada por tres fáse móvil adecuada.Los autores deberán incluir las
anillos aromáticos, por ello interactúa menos con la conclusiones de una manera clara según los
fase estacionaria haciendo que la distancia resultados y análisis previamente descritos.
recorrida sea mayor. El analito 3-Amino-4-anilino- Siempre teniendo en cuenta que las conclusiones
1H-isocromen-1-ona es más polar ya que solo son afirmaciones o argumentos relaticos a la
contiene dos anillos aromáticos haciendo que sea experimentación y a la lógica.
más polar que el analito 3-Amino-4- [metil (fenil) En la cromatografía de placa preparativa se pudo
amino] -1H-isocromen-1-ona por lo tanto la obtener que el analito 3-Amino-4-anilino-1H-
distancia recorrida del analito 3-Amino-4-anilino- isocromen-1-ona es una molécula más polar que la
1H-isocromen-1-ona es menor porque interactúa molécula 3-Amino-4- [metil (fenil) amino] -1H-
más con fase estacionaria. isocromen-1-ona por la estabilidad de carga que le
otorga los anillos aromáticos, con ello el analito 3-
4. CONCLUSIONES Amino-4- [metil (fenil) amino] -1H-isocromen-1-
Del extracto de Ruda que se analizó, se logró la ona) tiene mayor distancia recorrida en la fase
separación de 5 alcaloides los cuales se estacionaria permitiendo la separación de los dos
identificaron por la estructura molecular según la analitos sin ninguna complicación.
literatura y comparando su polaridad con el

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5. BIBLIOGRAFÍA

Cromatografia . (s.f.). Obtenido de


https://www.uam.es/docencia/jppid/docum
entos/practicas/actuales/guion-p6.pdf

D.Christian, G. (s.f.). Tecnicas cromatograficas. En


G. D.Christian, Analytical chemistry.
McGrowHill.

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