DNA POLIMORFICO AMPLIFICADO AL AZAR (RAPD)

DNA polymorphic amplified to random (RAPD)

María Fernanda Suarez Tirado

Daniela Pérez Cabrera
Natalia Margarita Pinedo Cano
Darío Arrieta García

Universidad de Córdoba, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Biología,

Biología Molecular. Montería – Córdoba

RESUMEN
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es una de las
herramientas tecnológicas más innovadoras para el estudio de los ácidos nucleicos. Se
caracteriza por ser una técnica de alta sensibilidad, reproducibilidad y eficiencia, que genera
resultados confiables en poco tiempo y fáciles de analizar. Por ello, se ha convertido en el
método de elección de muchos investigadores para los estudios genéticos y de biología
molecular. En esta revisión nuestro objetivo se basó en amplificar ADN mediante la técnica
RAPD, que es una de las técnicas más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990. Es
muy cómoda, rápida, requiere poco ADN que además no necesita estar muy puro, no
presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rápida y
simultáneamente muchos organismos.
PALABRAS CLAVES: ADN, PCR, amplifición, polimerasa, técnica.

ABSTRACT
polymerase chain reaction (PCR) is one of the most innovative technological tools for the
study of nucleic acids. It is characterized for being a technique of high sensitivity,
reproducibility and efficiency, which generates reliable results in a short time and easy to
analyze. Therefore, it has become the method of choice for many researchers for genetic and
molecular biology studies. In this review our objective was based on amplifying DNA using
the RAPD technique, which is one of the most versatile techniques since it was developed in
the year 1990. It is very comfortable, fast, requires little DNA that also does not need to be
very pure, presupposes prior knowledge about the sequence, and many organisms can be
quickly and simultaneously distinguished.
KEYWORDS: DNA, PCR, amplification, polymerase, technique.
INTRODUCCION
La gran complejidad de los procesos
biológicos en los seres vivos ha sido por
años la razón por la que los investigadores
han centrado su atención en descifrar los
mecanismos que se esconden detrás de
esos procesos. Desde las primeras
observaciones de Gregorio Mendel hasta
la actualidad, se tiene la noción de que
parte de la explicación de los diferentes
fenómenos biológicos se encuentra
escondida en lo más recóndito del genoma
celular y que una de las claves para
entender dichos fenómenos es el estudio
de los genes. Uno de los descubrimientos
más importantes de la historia que marcó
el inicio de una nueva era en el estudio y
conocimiento de los ácidos nucleicos fue
el de Watson y Crick, al descifrar la
estructura del ADN1 (ácido
desoxirribonucleico). Desde entonces,
varios grupos han mostrado un gran interés
por desarrollar métodos sensibles y
reproducibles que les permitan
estandarizar protocolos experimentales
para estudiar los ácidos nucleicos. Es así
como han ido apareciendo diferentes
tecnologías cuyos protocolos están
dirigidos al estudio del ADN;
probablemente, la más importante sea la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR,
por sus siglas en inglés), desarrollada por
Kary Mullis1 y que revolucionó la
biología molecular y la forma en cómo se
estudiaban los ácidos nucleicos en ese
momento. Actualmente sabemos que la
misión de la PCR es copiar millones de
veces una secuencia específica de ADN
blanco mediante una poderosa catálisis
llevada a cabo por una enzima conocida
como ADN polimerasa, de tal manera que
cantidades pequeñas de ADN pueden ser
sintetizadas y copiadas finalmente para
analizarse con diferentes fines. El
desarrollo de esta técnica permitió estudiar
y manipular mejor al ADN, facilitando el
establecimiento de protocolos
experimentales en biología molecular. El
progreso de esta técnica ha sido muy
notable y ha ido en paralelo con los nuevos
retos para estudiar y comprender mejor el
rol de los genes, tanto en condiciones
fisiológicas como patológicas. Es por ello
que una de las formas recientes para
detectar y cuantificar a los ácidos
nucleicos es a través de la PCR en tiempo
real, la cual es una modalidad de la PCR
considerada como una técnica cuantitativa.
Hoy en día, la PCR se aplica en diferentes
áreas de las ciencias biológicas y de la
salud, formando parte del quehacer
científico de muchos laboratorios de
investigación que la utilizan
principalmente para expresión génica,
genotificación, detección de patógenos y
análisis de mutaciones. En esta revisión se
hace una descripción de los fundamentos
de la PCR convencional o también
conocida como punto final; además se
explica qué se necesita para que la
reacción sea exitosa, cómo se lleva a cabo
y cómo se analizan los resultados.
Finalmente, introducimos al lector a la
PCR en tiempo real con la finalidad de que
comprenda las diferencias básicas con la
PCR punto final.
OBJETIVO

 Amplificar ADN mediante la técnica

RAPD (DNA polimórfico amplificado
al azar).

3. Para finalizar los tubos se colocaron en

termociclador previamente a una
DISEÑO METODOLÓGICO
temperatura programada.
MATERIALES Y REACTIVOS

 Buffer 10 x
 Mg, Cl2
 dNTPs
 primer
 Taq polimerasa
 ADN
 Hielo
 Pipeta 0.2-2 µ l
 Pipeta 1-10 µ l
 Pipeta 20-200 µ l
 Pipetas 100-1000 µ l
 Puntas para pipeta
 Guantes
 Gafas de protección
 Espátula
Fig.1 termociclador programado.
 Marcador de punto fina

PROCEDIMIENTO

Para llevar a cabo esta práctica de

laboratorio se realizaron 3 pasos
importantes:

1. En un tuvo de eppendort estéril de 1.5

ml se adiciono los siguientes reactivos
para el coctel de la reacción según la
siguiente tabla.

2. Se agrego el coctel a cada una de las

muestras- se utilizó tubos para PCR.
RESULTADOS Y ANÁLISIS
Los marcadores RAPD se analizan
habitualmente empleando ADN
genómico, aunque también puede
emplearse ADN cloroplástico o Demasiado poco o mucho puede reducir la
mitocondrial. El ADNpuede proceder de
cualquier organismo. Aunque no es
necesaria gran cantidad, sí es
recomendable trabajar con ADN de
calidad, limpio y de peso molecular
elevado. La baja calidad del ADN es uno
de los motivos más frecuentes de
obtención de patrones RAPD poco
precisos. En ocasiones si la calidad del
ADN no es muy buena puede mejorarse la
precisión del marcador disminuyendo o
aumentando la concentración. La
concentración óptima puede variar con el
método de extracción empleado. Suelen
emplearse cantidades entre 5 y 50 ng de
ADN por reacción, variando la cantidad
óptima también entre distintos
organismos. En cada caso, es necesario
poner a punto el procedimiento, probando
un rango de concentraciones para
seleccionar la que resulte en el patrón de
bandas más útil para nuestros objetivos.
Durante el análisis de marcadores RAPD
es necesario tener precaución con las
contaminaciones. Cualquier
contaminación de nuestra muestra con
ADN de otro individuo/organismo puede
provocar la aparición de un patrón de
bandas diferencial, conduciendo a un
resultado erróneo.
El agua destilada se utiliza con el fin de
alcanzar el volumen indicado y diluir el
Cloruro de magnesio. El MgCl2 es un
cofactor necesario para la actividad
enzimática de las DNA polimerasas. La
concentración óptima de MgCl2 debe
determinarse empíricamente para cada
polimerasa, secuencia y par de cebadores.
eficiencia de amplificación o generar
productos inespecíficos, respectivamente.
Además, hay que tener en cuenta que la
concentración libre de magnesio en el tubo
de reacción disminuye proporcionalmente
con la de agentes quelantes como el
EDTA.
Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato
(dNTP), sustratos para polimerizar nuevo
ADN.
Dos cebadores o iniciadores,
oligonucleótidos que son, cada uno,
complementarios a una de las dos hebras
del ADN. Son secuencias cortas, de entre
seis y cuarenta nucleótidos, normalmente
de dieciocho a veintidós, que permiten que
la polimerasa inicie la reacción. Deben
estar enfrentados y a no mucha distancia.
Delimitan la zona de ADN a amplificar, es
decir, corresponden a los nucleótidos que
definen los extremos de la secuencia que
se desea replicar.
Una solución tampón o buffer que
mantiene el pH adecuado o las
concentraciones óptimas de iones potasio
y magnesio para el funcionamiento de la
ADN polimerasa.
Taq polimerasa: es una enzima ADN-
polimerasa termoestables extraída de
bacteria thermus aquaticus. Esta enzima
tiene la propiedad de restituir la doble
cadena de ADN mediante su síntesis a
partir de un punto determinado fijado en  Higuchi R, Fockler C, Dollinger G,
este caso por el primer. Watson R. Kinetic PCR analysis: real-
time monitoring of DNA amplifi
En aparatos diseñados especialmente para
cation reactions. Biotechnology. 1993;
este fin llamado Termociclador, el aparato
11: 1026-1030.
que mantiene la temperatura necesaria en
cada una de las etapas que conforman un
ciclo.

CONCLUSION
La Reacción en cadena de la Polimerasa
genera a partir de un único fragmento de
DNA un gran número de copias de ella
misma. Es considerable tener en cuenta
que cuando se valla a utilizar PCR la serie
de oligonucleótidos que se empelara como
cebador es uno de los parámetros más
importantes debido a su alta sensibilidad y
a que puede ser muy susceptible a 6
contaminarse, por eso es importante tener
un ADN de control negativo para controlar
esta variable, se deben separar las áreas de
las muestras pre PCR, los productos de la
reacción post PCR, las soluciones y
esterilizar los materiales.

BIBLIOGRAFIA

 Mullis KB. The unusual origin of the

polymerase chain reaction. Sci Am.
1990; 262: 56-61.

 Isabel N., J. Beaulieu, P. Theriault y J.

Bousquet. 1999. Direct evidence for
biased gene diversity estimates from
dominant random amplified
polymorphic DNA (RAPD)
fingerprints. Molecular Ecology 8:
477-483
ANEXOS

Fig. 2