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manuscrito aceptado

Título: Propiedades de una novela glucosa isomerasa termoestable extraído de oshimai


Thermus y su aplicación a la preparación de jarabe de maíz de alta fructosa

Autor: <ce: autor id = "aut0005" autor-id =


"S0141022917300017-
364ff75026657c0063ad74bddca2b8ee "> Dong-Xu Jia <ce: autor id ="
aut0010" autor-id =
"S0141022917300017a6b1649326a48f2f32492d1dc8b1ae22"> Lin Zhou <ce:
autor id = "aut0015" autor-id =
"S0141022917300017171131cbeb7e53b11eaa89bc2527affd"> Yu-Zheng
Guo

PII: S0141-0229 (17) 30001-7


DOI: http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.enzmictec.2017.01.001
Referencia: EMT 9031

Aparecer en: Enzima y Tecnología Microbiana

Fecha de recepción: 30-8-2016


Fecha revisada: 17-11-2016
Fecha de aceptación: 02/01/2017

Por favor citar este artículo como: Jia Dong-Xu, Zhou Lin, Zheng Yu-Guo.Properties de una novela glucosa
isomerasa termoestable extraído de Thermus oshimai y su aplicación topreparationof jarabe de maíz alto en
fructosa. Tecnología Enzimática andMicrobial
http://dx.doi.org/10.1016/j.enzmictec.2017.01.001

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Propiedades de una novela glucosa isomerasa termoestable extraídos de Thermus

oshimai y su aplicación a la preparación de jarabe de maíz de alta fructosa

Dong-Xu Jia 1,2 #, Lin Zhou 1,2 #, Yu-Zheng Guo 1,2 *

1 Clave Laboratorio de Síntesis Bioorganic de la provincia de Zhejiang, Colegio de

Biotecnología y Bioingeniería, Universidad Tecnológica de Zhejiang, Hangzhou

310014, República Popular China

2 Centro de Investigación de Ingeniería de bioconversión y Biopurification del Ministerio de

Educación de la Universidad de Tecnología de Zhejiang, Hangzhou 310014, República Popular China

* : Autor correspondiente:

Yu-Guo Zheng, Tel: + 86-571-88320630 Fax: + 86-571-88320630. Email:

zhengyg@zjut.edu.cn.

# : Igualmente contribuido al primer autor.

1
Gráficamente abstracto

Reflejos

• 1 El descubrimiento de novela termoestable T. oshimai GI a través de enfoque minería genoma.

• 2 Mejora de su actividad enzimática y la termoestabilidad mediante la adición de Mn 2+.

• 3 Mayor eficiencia catalítica de Togi hacia D-glucosa debido a la menor K metro

y más alto k gato/ K metro.

• 4 Realización de preparación de HFC a temperatura elevada.

RESUMEN: se utiliza glucosa isomerasa (GI) in vitro para convertir D-glucosa para

D-fructosa, que es capaz de jarabe de maíz de alta fructosa producción comercial

(HFC). Para la fabricación de HFC a temperatura elevada y reducir el costo de

jarabes enriquecedoras, novela IG refractarios de Thermoanaerobacterium xylanolyticum

(TxGI), oshimai Thermus ( Togi), thermocatenulatus Geobacillus ( GTGI) y

2
Thermoanaerobacter siderophilus ( TsGI) fueron seleccionados a través de enfoque minería genoma.

La investigación características enzimáticas mostraron que Togi tenía mayor catalítica

la eficiencia y la termoestabilidad superiores hacia D-glucosa entre las indicaciones geográficas apantallados. Sus

temperatura óptima alcanzó 95 o C y podría retener más del 80% de la actividad inicial

en presencia de Mn 20 mM 2+ a 85 o C durante 48 h. los K metro y k gato/ K metro valores para togi

eran 81,46 mM y 21.77 min- 1 · mm- 1, respectivamente. Además, el máximo

rendimiento de conversión de 400 g / L de D-glucosa a D-fructosa a 85 o C era 52,16%.

Teniendo en cuenta su excelente estabilidad térmica alta y aplicación ameliorable

rendimiento, togi podría ser prometedor para la realización de la futura producción industrial

de JMAF a temperatura elevada.

PALABRAS CLAVE: glucosa isomerasa, la minería genoma, la caracterización enzimática,

termoestabilidad, jarabe de maíz de alta fructosa

3
1. Introducción

JMAF hecha de almidón de maíz es un edulcorante importante. La ventaja de JMAF sobre

sacarosa se refiere a una mejor solubilidad, la dulzura y menor precio, lo que hace ampliamente

utilizado en diversos campos industriales, tales como bebidas, el bicarbonato y productos farmacéuticos [1].

JMAF ha sido tradicionalmente categorizado como HFCS-42, HFC-55 y HFC-90. A

fecha, HFC-42 (que contiene 42% de D-fructosa) es el principal producto industrial a través

enfoque bioconversión utilizando las IG moderadamente termoestables [2]. Sin embargo, el JMAF-55

con mayores concentraciones de D-fructosa es más favorable para la aplicación industrial.

55% HFC deben derivarse de enriquecimiento cromatográfico de grado 42% a 90%

y mezcla de los dos [3].

GI (CE 5.3.1.5) cataliza la isomerización reversible entre D-glucosa y

D-fructosa in vitro ( Fig. 1), este proceso de isomerización sirve como industrial

la fabricación de HFC [2,4]. IG se clasifican en dos grupos, a saber, la clase I y

clase II. Su principal diferencia es que las enzimas de clase II contienen un inserto adicional de

unos 40-50 residuos de aminoácidos en el dominio N-terminal [5]. Las estructuras cristalinas de

algunas indicaciones geográficas de microorganismos tales como Streptomyces rubiginosus, Streptomyces

olivochromogenes y Actinoplanes missouriensis Se han identificado y revelar una

alta homología estructural [6]. El bolsillo catalítica enzimática y la unión de dos metales

sitios ubicados en el N-terminal del monómero GI plegada como un (β / α) 8- barril, y el

dominio C-terminal plegada como un bucle grande es capaz de solapamiento el N-terminal de

otra subunidad con el fin de formar un dímero fuertemente unido [7]. Actualmente, las IG comercial

utilizado como productores de JMAF provienen principalmente de Bacillus coagulans, Streptomyces

4
murinus y S. rubiginosis [ 8]. Sin embargo, la desventaja de la utilización de estas enzimas

es su pobre rendimiento catalítico mientras que el aumento de isomerización mayor temperatura

de 60 o C, y la siguiente separación cromatográfica es caro para obtener

HFC con concentración de D-fructosa deseado [9,10]. Por lo tanto, la búsqueda de

IG termoestable para la producción de HFC en la toma de temperatura elevada para una mayor

rendimiento D-fructosa se considera que es eficaz para reducir los costos enriquecedoras.

Algunos IG termófila y hyperthermophilic partir de diversos microorganismos

han sido identificados y caracterizados. Por ejemplo, el termófilo Clase I GI de

Thermus thermophilus ( TtGI) ha sido clonado y expresado en Bacillus brevis utilizando

plásmido pNU210, su temperatura óptima y medio-vivo (t 1/2) a 85 o C en presencia

de Mg 2+ eran 95 o C y 20 h, respectivamente [11]. El GI recombiant de Acidothermus

cellulolyticus tenía una temperatura óptima de 80 o C, retuvo 50% de su inicial

actividad a 75 o C durante 4 h [12]. Por el contrario, las IG clase II son más variables en

termoestabilidad, y algunos tienen por lo general una mejor estabilidad térmica que el de clase I IG.

Thermotoga maritima GI (TMGI) se aisló de la marina más termófila

anaerobio, que se distingue por su más alta informó temperatura óptima de

105 a ll0 o C. Su t 1/2 fue de 10 min a 120 o C, y retenido más del 50% de su original,

la actividad después de la incubación de 24 h a 80 o C [10,13]. Similar, Thermotoga neapolitana

GI expresa en E. coli Tenía, t 1/2 de 24 min a la temperatura óptima de 95 o C [14].

Sin embargo, no hubo evidencia obvia sobre las variaciones en la estabilidad aunque

prolinas adicionales y menos residuos de asparagina y glutamina térmicamente lábiles

situado en la clase más termófila II IG [15]. A pesar de la aparición de una serie de

5
IG termófilas, su estabilidad térmica y repetidas veces de reutilización a alta temperatura

todavía puede afectar a la productividad del catalizador en comparación con el arte de la producción actual de

JMAF a 60-65 o C. Por esta razón, ninguna de las indicaciones geográficas y termófilo hipertermofílico

están disponibles comercialmente en la industria. Por lo tanto, es deseable desarrollar nuevos

IG refractario y explorar su aplicación a la preparación de HFC en elevado

temperatura.

En este estudio, con el fin de realizar la producción de HFC con alto en fructosa

concentración a temperatura elevada, novedosos IG refractarios de T. xylanolyticum, SOL.

thermocatenulatus, T. oshimai y T. siderophilus fueron extraídos de la National

Centro de Información sobre Biotecnología (NCBI) usando la base de datos T. maritima GI como sonda.

Entonces, sus genes fueron sintetizados basados ​en el uso de codones preferido de E. coli y

expresado adicionalmente en E. coli BL21 (DE3). Después de la purificación de GI, la biológica

características de Togi y TsGI se exploraron en detalle. Por último, utilizando como togi

biocatalizador, el rendimiento de conversión máximo de 400 g / L de D-glucosa a D-fructosa a

85 o C alcanzó 52,16%, que indica que Togi podría tener potencial industrial para

producción de JMAF a alta temperatura.

2. Material y métodos

2.1 Materiales y cepas

D-glucosa y D-fructosa fueron adquiridos de Aladdin Reactivo Inc. (Shanghai,

China) y Solarbio Ciencias de la Vida (Pekín, China), respectivamente. isopropílico

β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y kanamicina (Kan) fueron adquiridos de

Sangon Biotech (Shanghai, China). E. coli BL21 (DE3) cepa se adquirió de

6
Novagen (Madison, EE.UU.). E. coli células con plásmidos se cultivaron aeróbicamente y

inducida en Luria-Bertani (LB) que contenía 50 mg / ml Kan. El Bio-Rad

purificador y los materiales utilizados para la purificación de proteínas se adquirieron de Bio-Rad

(Hercules, EE.UU.). Todos los demás compuestos eran de calidad reactivo o superior calidad.

2.2 Selección de la novela IG refractario de base de datos NCBI

minería Genoma para la novela IG refractario se realizó en la base de datos NCBI utilizando

con la herramienta explosiva T. maritima GI (GenBank adhesión no. AKE27551.1) como plantilla.

[13] Las secuencias de aminoácidos de alineación y resultado la generación de múltiples se realizaron

por ClustalX y ESPript, respectivamente.

2.3 la síntesis de genes y expresión en E. coli BL21 (DE3)

Las secuencias de nucleótidos de las IG se optimizaron basan en el sesgo de codones de MI.

coli. Los genes se sintetizaron químicamente y se ligaron en el vector de expresión de

pET-28b (+) entre Xba yo y Xho ⅰ sitios por Sangon Biotech (Shanghai, China).

Además, el C-terminal de la GI recombinante se fusionó a un 6 × His-tag que era

conveniente para la purificación. A continuación, los plásmidos recombiant albergar diferentes GI

gen se transformaron en E. coli BL21 (DE3) para la expresión.

El transformante se inoculó en 50 ml de medio LB en 250 ml de frasco de agitación

que contiene 50 mg / ml Kan y se cultivó a 37 o C hasta que su densidad óptica a 600 nm

(SOBREDOSIS 600) alcanzado 0,6, la fase de expresión de la proteína se inició después de la inducción por 0,1

IPTG mM. Después de eso, 1 g de los cultivos cosechados se resuspendió en 20 ml 50 mM

tampón de Tris-HCl (pH 7,0) y se sonicó en hielo durante 20 min (39 W, 30 s de trabajo, 30 s

en reposo), el sobrenadante soluble obtenido por centrifugación fue utilizado como el crudo

7
enzima para el análisis, tales como SDS-PAGE y ensayo de actividad.

2.4 Purificación de GI recombinante

La solución de enzima en bruto se calentó en primer lugar en 75 o C durante 15 min y la célula

suspensión se separó por centrifugación, a continuación, el sobrenadante se inyectó a la

purificador de Bio-Rad través de la columna SuperFlow níquel-NTA (1 × 10 cm 2) que había sido

previamente equilibrada con tampón de unión (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 300 mM,

imidazol 20 mM, pH 8,0). Las proteínas se eluyeron de la columna mediante un 0-500 mM

gradiente de imidazol usando el tampón de elución (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM,

imidazol 500 mM, pH 8,0). Las fracciones se recogieron para su posterior investigación.

2.5 Bioconversión de D-glucosa a D - fructosa utilizando células Togi recombiant

La mezcla de reacción contenía 25 g / L de células húmedas biocatalizador, Mn 20 mM 2+, 400

g / L D-glucosa y Na apropiado 50 mM 2 HPO 4- NaH 2 correos 4 tampón (pH 8,0) en un total

volumen de 100 mL. La reacción se llevó a cabo en un agitador de baño de agua a 85 o DO.

Se tomaron muestras periódicamente para la cromatografía líquida de alta presión (HPLC)

análisis.

2.6 Ensayo enzimático y el análisis de proteínas

modificación adecuada se llevó a cabo de acuerdo con Liu et al. [16], en resumen, la

composiciones de mezcla de reacción fueron como sigue: 200 mM de D-glucosa, mM Mg 10 2+,

Co 1 mM 2+, 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) y una cantidad apropiada de enzima en un total

volumen de 5 mL. La reacción de isomerización se realizó a 85 o C durante 20 min y

seguido por incubación a 0 o C durante 10 min. D-fructosa formado en la mezcla de reacción

se midió a través del análisis HPLC. Una unidad de la actividad enzimática se definió como

8
la cantidad de enzima que produce 1 mol de D-fructosa por minuto en el ensayo

condición descrita anteriormente.

La concentración total de proteína se determinó por el keygen Biotech BCA

kit de ensayo (Nanjing, China) utilizando albúmina de suero bovino como estándar.

2.7 El análisis por HPLC

La detección de concentraciones de D-glucosa y D-fructosa se realizó con una

sistema de HPLC Waters (Milford, EE.UU.) y un detector de índice de refracción Aguas 2414

(Milford, EE.UU.). La columna analítica fue Hypersil NH 2 columna HPLC (250 x 4,6

mm, 5 micras) (Elite Analytical Instruments Co., Ltd., Dalian, China). La fase móvil

era 80% ( v / v) de acetonitrilo en agua. La temperatura de la columna se fijó en 30 o C, el flujo de

tasa se mantuvo a 1,0 ml / min, y el volumen de inyección fue de 10! l.

Si no se indica específicamente, todos los experimentos en este estudio se realizaron en

triplicado.

3. resultados

3.1 glucosa isomerasa genes de cribado novedosas y de expresión en E. coli BL21 (DE3)

El enfoque de la minería del genoma ha sido ampliamente utilizado para buscar novela industrial

enzimas en los últimos años, tales como β-glucosidasa [17], Baeyer-Villiger monooxigenasa

[18] y nitrilasa [19]. Con el fin de obtener nuevos isomerasas de glucosa termoestables, las

secuencia de aminoácidos de TMGI refractaria con óptimo de temperatura 105-ll0 o C [13]

fue elegido como plantilla para la explosión en NCBI. Posteriormente, cuatro soldados potenciales de

microorganismo termófilo que tiene 29 a 73% de identidades de aminoácidos con la plantilla

9
fueron desarrollados (Tabla 1).

Streptomyces rubiginosus GI (SrGI) era una clase típica I glucosa isomerasa

utilizado comercialmente como enzima inmovilizada para la producción de HFC, la estructura de

SrGI cristalina y sus grupos funcionales cruciales se han determinado [20]. los

secuencias de aminoácidos de SrGI y cuatro IG potencial se compararon y analizaron en

Fig. 2. Dos secuencias de firma de GI, designado VXW (GP) GREG (YSTA) E y

(LIVM) EPKPX (EQ) P [21], se altamente conservada en cuatro IG apantallados. Adicionalmente,

la mayor parte de las características estructurales específicas, tales como sitios de unión de iones metálicos y el sustrato

sitios de unión (Glu181, Glu217, Asp245, Asp287, His220, Thr90, Trp137, Phe94,

Phe26, His54) también fueron conservados. A diferencia de SrGI y togi, hubo un incremento

40-50 aminoácidos en inserto N-terminal en GTGI, TsGI y TxGI, indicando que se

deben clasificarse como de clase II IG.

Los plásmidos recombinantes pET-28b (+) que alberga diferentes IG potenciales eran

transformado en E. coli BL21 (DE3) para la investigación de su nivel de expresión y GI

actividad. Como se muestra en la Fig. 3, el análisis SDS-PAGE mostró que se expresaron todas las indicaciones geográficas

como proteínas solubles, y la cantidad de expresión de TsGI fue aparentemente más alto que

la de los demás. Sus actividades hacia la D-glucosa a 85 o C se calcula para ser 2,54

(TsGI), 2,42 (Togi), 1,29 (GTGI) y 0,63 U / (mg · proteína total) (TxGI), respectivamente.

Este trabajo proporciona un nuevo enfoque de la minería del genoma para el descubrimiento y el contraste

de nuevas indicaciones geográficas termoestables utilizando los mismos métodos de ensayo, y los resultados se

persuasivo. Como resultado, TsGI (clase II) y Togi (clase I) con la actividad más alta y

cantidad de expresión aceptable fueron finalmente elegido como biocatalizadores para la siguiente

10
investigación.

3.2 Efecto de iones metálicos sobre la actividad de TsGI y Togi

Cada monómero GI contiene dos sitios de unión a metal y requiere un catión divalente

o una mezcla de diferentes cationes divalentes para la actividad máxima [22]. A fin de que

evaluar los efectos de diversos iones metálicos en TsGI y la actividad Togi, tanto el

enzimas recombinantes se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo mediante el calentamiento y la

cromatografía de afinidad de níquel, sus actividades relativas se determinaron bajo

condición de ensayo estándar en presencia de diferentes iones metálicos. La actividad sin

Además de cualquier ion metálico sirvió como control. Como se muestra en la Fig. 4, TsGI mostró la

mayor actividad en presencia de Mg 10 mM 2+, que alcanzó el 194% de la actividad

de control. Ha de observarse, la mejor activador enzimática de Mn 2+ para togi podría aumentar

la actividad en un 125%. Cu 2+, Zn 2+, Licenciado en Letras 2+, Fe 2+, Ni 2+ y Ca 2+ inhibe o en parte

inhibió las actividades de dos indicaciones geográficas. Kovalevsky et al. informaron que la inhibición de

actividad catalítica de GI podría tener lugar si el radio iónico del ión metálico era más grande que

0,8 Å [23]. Probablemente debido a la baja radios de Mg 2 + ( 0,65 Å) y Mn 2 + ( 0,75 Å) [24],

y la correcta unión a sitios de unión de metal contribuyeron a su enzima elevado

ocupaciones. Además, los efectos de activación sinérgica de dos iones de metal en TsGI y

se investigaron aún más la actividad Togi. Se demostró que cualquier combinación de

diferentes iones metálicos no mejoraron la actividad de ambas indicaciones geográficas en comparación con su

correspondiente OPTIMUN ion único metal.

11
3.3 Efecto de la temperatura sobre la actividad y la termoestabilidad de TsGI y Togi

Durante el proceso de catálisis GI, mayor temperatura desplaza el equilibrio de la

isomerización de D-glucosa a D-fructosa. En teoría, el 55% jarabes de fructosa puede ser

directamente producido utilizando la temperatura de isomerización a por encima de 85 o C [21]. Por lo tanto,

es necesario investigar alta temperatura en el intervalo entre 65 y 100 o C en

actividad enzimática de TsGI y Togi. Como se muestra en la Fig. 5A, el purificada TsGI y

Togi exhibió actividad máxima a la temperatura óptima de 90 y 95 o DO,

respectivamente. Tanto las actividades de TsGI y Togi disminuyeron gradualmente por encima o

por debajo de su respectiva temperatura óptima. La actividad específica de Togi a 95 o do

alcanzado 20,33 U / (mg · proteína), que fue 2,9 veces mayor que la de TsGI en 90 o DO,

lo que indica que Togi dio como resultado mejoras significativas en la actividad en mayor

temperatura de TsGI.

También se determinó el efecto de la temperatura sobre la estabilidad de dos indicaciones geográficas. Como

se muestra en la Fig. 5B, tanto de TsGI purificado y Togi perdieron más de 60% de su original,

actividad a 85 o C después de la incubación de 1 h y completamente inactivado después de la incubación de

4 h. Bandlish et al. descrito que GI podría tener una estructura rígida y estable en el

presencia de cationes metálicos que contribuyeron a la termoestabilidad superior de [25]. por

ejemplo, la estabilidad térmica de mutante (Trp139Phe) de Thermoanaerobacterium

saccharolyticum GI cepa B6A se incrementó en un 92% en presencia de Mg 5 mM 2+

y 250? M Co 2+ a 80 o C durante 24 h [26]. La estabilidad térmica de GI de Bacilo

thermoantarcticus retenido 141% de actividad residual en la presencia de Co 1 mM 2+ a

70 o C durante 24 h, que era 9,4 veces mayor que en ausencia de cationes metálicos

12
[27]. En este caso, TsGI retenido 11,42% de la actividad inicial después de 8 h con Mg 20 mM 2+

a 85 o C y completamente inactivada a 20 h. En contraste, cuando se incubó Togi

con Mn 20 mM 2+ a 85 o C, se podría retener remarkablely más de 80% de inicial

la actividad después de la incubación de 8 h, y se mantuvo la misma actividad incluso con extendida

tiempo de incubación a 48 h (Fig. 5B, inserto). Este resultado sugiere que la holo-togi tenía

mayor termoestabilidad a 85 o C que la de holo-TsGI y otro representante

IG refractario reportado en literatura, como Thermoanaerobacterium

thermosulfurigene GI [28], gonensis Anoxybacillus G2 T GI [9], TMGI [13] y TtGI

[11]. Este resultado también fue no idéntico al punto de vista de que la termoestabilidad de

IG clase II eran generalmente mejor que la clase I IG [16].

3.4 Efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de TsGI y Togi

El efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de TsGI purificado y Togi eran

determinado en el intervalo entre pH 5,0 y pH 10,0. Como se muestra en la Fig. 6A, la

pH óptimo de TsGI y Togi eran alrededor de pH 6,5 y pH 8,0, respectivamente.

Teniendo en cuenta la tolerancia al pH de enzimas tiene un efecto importante en su almacenamiento

condición [29], la estabilidad de pH de la TsGI purificado y Togi fueron exploradas por

de incubación en tampón de pH diferente en 4 o C durante 24 h, se midió la actividad residual

y la actividad original sin incubación se tomó como 100%. La Fig. 6B mostró que

Togi retuvo más del 87% de su actividad original entre pH 5,0 y pH 10,0. por

TsGI, menos del 35% de su actividad original fue retenido cuando el pH fue inferior a 6,5,

pero era estable cuando el pH varió de 6,5 a 10,0.

13
3.5 Los parámetros cinéticos de TsGI y togi

Las propiedades cinéticas de TsGI y Togi se determinaron hacia D-glucosa

que van desde 50 a 400 mM. Como se muestra en la Fig. 7, de acuerdo con la Lineweaver-Burk

trama, el K metro y V máx de TsGI se estimaron en 199,03 mM y 72,46 mol / min,

mientras que la K metro y V máx de Togi eran 81,46 mM y 22,73 mol / min, respectivamente.

Cuando K metro fue mayor de 100 mM de D-glucosa, el requisito de elevada

concentraciones de enzima deben ser considerados para empujar la reacción a cerca

equilibrio dentro de un período de tiempo práctico [8]. Por lo tanto, la superioridad del sustrato de

afinidad de Togi podría ser ilustrado debido a su menor K metro hacia D-glucosa, que

fue favorable para la reducción de la cantidad de adición del biocatalizador durante el

biotransformación en la producción de HFC. además, el k gato/ K metro valor de Togi era

21,77 min- 1 · mm- 1, más alto que 14,54 min- 1 · mm- 1 la de TsGI, lo que indica que Togi

tenía la ventaja de una mayor eficiencia catalítica hacia D-glucosa sobre TsGI.

3.6 Biotransformación de glucosa a fructosa por Togi recombinante

El potencial de aplicación de Togi recombinante en la conversión de D-glucosa para

D-fructosa se evaluó adicionalmente en un entorno sinóptico de proceso industrial. los

reacción se realizó en 100 ml de tampón fosfato (pH 8,0) con Mn 20 mM 2+ a

85 o concentración C. El sustrato y la cantidad de células húmedas utilizados fueron 400 y 25 g / L,

respectivamente. El resultado mostró que la tasa de conversión de D-fructosa aumentó

rápidamente durante el proceso preliminar de reacción y alcanzó 42,5% dentro de 1 h, la

rendimiento máximo D-fructosa observada fue 52,16% después de 5 h y se mantuvo la misma

nivel con el tiempo prolongado a 8 h (Fig. 8). Bhosale et al. informó de que el 54,7% de fructosa

14
podría lograrse cuando la temperatura de isomerización se fijó en 85 o C [21]. A pesar de que

nuestro resultado anterior han indicado que la holo-togi podía retener más del 80% de

actividad inicial después de la incubación de 48 h, la actividad enzimática podría ser inhibida durante

proceso de conversión a tan alta sustrato y la concentración del producto. Karlsen et al.

se describe que durante el proceso de reacción pequeña cantidad de glucosa podría ser degradado

y subproductos tales como manosa, psicosa, y otros compuestos ácidos sería

generado, lo que resultó en el cambio de color [29,30]. En este caso, análoga a Xu

et al. [26] y Deng et al. [5], marrón subproductos se acumuló gradualmente en el

reacción de isomerización con el acrecentamiento de tiempo de conversión de acuerdo con la

medición a OD 425 nm ( datos no mostrados). Estos subproductos podrían bloquear el activo

centro de togi y por lo tanto affacted su termoestabilidad. Estas razones anteriores fuerzas

explicar por qué el rendimiento máximo D-fructosa en este experimento no alcanzó el

nivel teórico (54,7%).

Basado en esto, aún más mejoras factibles se consideran y se enumeran a continuación

para permitir a un proceso para la producción de HFC con el rendimiento teórico D-fructosa de

54,7% a los 85 o C. (1) Mejora de la actividad y la termoestabilidad de biocatalizador. GI sirve como

un modelo perfecto para el estudio de las relaciones estructura-función de la ingeniería de proteínas

estrategia, y la mutagénesis dirigida al sitio pueden participar directamente para mejorar togi

con una mejor actividad y estabilidad térmica específica. Hlima et al. identificado crítica

residuos Gly219 y Phe53 para la actividad enzimática y la termoestabilidad de Streptomyces

sp. SK GI, el mutante (Phe53Leu / Gly219Ala) que contribuyó a los cambios importantes

en la región del sitio activo y el desplazamiento de dos iones metálicos, que se muestra más alta óptima

15
temperatura (100 o C), de alta eficiencia catalítica y ya t 1/2 ( 2,5 h a 85 o C) como

en comparación con la enzima de tipo salvaje [7]. casos similares se refieren a Sriprapundh et al [28]

y Zhu et al [31]. (2) El desarrollo de la tecnología de inmovilización. el inmovilizado

biocatalizador generalmente showes mejorada termoestabilidad y estabilidad a largo plazo operación

durante condiciones de aplicación. Yu et al. descrito que SrGI inmoviliza covalentemente

sobre el soporte GAMM podría retenido 91% de su actividad inicial después de reciclaje para 18

continuas veces re-uso de [32]. En este documento, mayor rendimiento y la productividad de producto pueden estar

logrado mediante la repetición de las reacciones de isomerización utilizando la tecnología de inmovilización

debido a la excelente estabilidad de holo-togi. (3) Reducción de los subproductos. Lama et

Alabama. describe que la isomerización a pH ácido podría reducir los possibities de

subproductos formación [27]. En este caso, Togi retuvo la actividad de al menos 90% cuando el

pH varió de 6,5 a 7,5. Por lo tanto, el proceso de isomerización a pH ácido de 6,5

puede ser valiosa para la resolución de problemas de generación de subproductos. (4) Extracción

sustrato y la inhibición del producto. Biorreactores incluyendo lecho móvil simulado (SMB)

o en el lugar retirada del producto (ISPR) puede adoptarse a escala industrial con el fin de

resolver inhibición de sustrato-producto y combinar isomerización y separación

simultaneouly.

dieciséis
4. Conclusión

El presente estudio minería genoma se describe, la expresión heteróloga,

la purificación y la caracterización bioquímica de la novela de IG. además, el

potencial aplicación utilizando GI con una mejor eficiencia catalítica y termoestabilidad se

también evaluó a través de la conversión de D-glucosa a fructosa. Los resultados desarrollaron siempre

una importante plataforma para la investigación adicional para llevar a cabo la producción industrial de

JMAF a temperatura elevada.

Conflicto de intereses

No hay conflicto de interés declarado.

Expresiones de gratitud

Este proyecto fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de

China (Nº 31401527), el 58 de clase general Financiera Beca de la porcelana

Fundación Postdoctoral Science (No. 2015M580522), el Fondo de Preferencia del Postdoctoral

Proyecto de Investigación Científica de Zhejiang (núm BSH1502149) y la Investigación

Fundación del Departamento de Educación de Zhejiang (núm Y201431321).

17
referencias

[1] S. Bhasin, HA Modi, Optimización de medio de fermentación para la producción de

glucosa isomerasa usando Streptomyces sp. SB-P1, Biotechnol. Res. En t. 2012 (2012)

874.152.

[2] B. Fatima, Z. Hussain, isomerasas xilosa a partir de Thermotogales, J. Anim. Plant Sci.

25 (2015) 10-18.

[3] SM Moeller, SA Fryhofer, AJ Osbahr III, CB Robinowitz, los efectos de alta

jarabe de fructosa, J. Am. Coll. Nutr. 28 (2009) 619-626.

[4] F. Zhang, XG Duan, S. Chen, D. Wu, J. Chen, J. Wu, la adición de Co 2+

mejora la eficiencia catalítica y termoestabilidad de glucosa recombinante

isomerasa de fusca Thermobifida, Proceso Biochem. 48 (2013) 1502-1508.

[5] H. Deng, S. Chen, D. Wu, J. Chen, J. Wu, expresión heteróloga y

caracterización bioquímica de la isomerasa de glucosa a partir de fusca Thermobifida,

Bioprocesos Biosyst. Ing. 37 (2014) 1211-1219.

[6] JW Cho, BG Han, SY Park, SJ Kim, MD Kim, Lee BI, sobreexpresión,

cristalización y preliminar de rayos X análisis cristalográfico de un xilosa putativo

isomerasa de Bacteroides thetaiotaomicron, Acta Crystallogr. Secta. F-Struct. Biol.

Crist. Commun. 69 (2013) 1127-1130.

[7] HB Hlima, S. Bejar, J. Riguet, R. Haser, N. Aghajari, Identificación de crítico

los residuos para la actividad y termoestabilidad de Streptomyces sp. SK isomerasa de glucosa,

Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (2013) desde 9715 hasta 9726.

[8] R. DiCosimo, J. McAuliffe, AJ Poulose, G. Bohlmann, Uso industrial de

18
enzimas inmovilizadas, Chem. Soc. Rev. 42 (2013) 6437-6474.

[9] H. Karaoglu, D. Yanmis, FA Sal, A. Celik, S. Canakci, AO Belduz, Biochemical

caracterización de una isomerasa de glucosa a partir de novela gonensis Anoxybacillus G2 T ese

muestra un alto nivel de actividad y la estabilidad térmica, J. Mol. Catal. B-Enzym. 97

(2013) 215-224.

[10] RL Starnes, RM Kelly, SH Brown, Método para la isomerización de la glucosa usando

xilosa isomerasa purificada a partir de Thermotoga maritima y Thermotoga neapolitana,

Patente de Estados Unidos (1993) 5268280.

[11] K. Dekker, A. Sugiura, H. Yamagata, K. Sakaguchi, S. Udaka, Efficient

producción de termoestable Thermus thermophilus isomerasa de xilosa en Escherichia

coli y Bacillus brevis, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36 (1992) 727-32.

[12] WM Mu, XL Wang, QH Xue, B. Jiang, T. Zhang, M. Miao, Caracterización

de una glucosa isomerasa termoestable con un óptimo de pH ácido a partir de Acidothermus

cellulolyticus, Res alimentos. En t. 47 (2012) 364-367.

[13] SH Brown, C. Sjöholm, RM Kelly, purificación y caracterización de una

isomerasa de glucosa altamente termoestable producida por el extremadamente termófilo

eubacteria, Thermotoga maritima, Biotechnol. Bioeng. 41 (1993) 878-886.

[14] C. Vieille, JM Hess, RM Kelly, JG Zeikus, xylA clonación y secuenciación y

caracterización bioquímica de isomerasa de xilosa a partir de Thermotoga neapolitana, Appl.

Reinar. Microbiol. 61 (1995) 1867-1875.

[15] KL Epting, C. Vieille, JG Zeikus, RM Kelly, Influencia de los cationes divalentes sobre

La termoestabilidad y la inactivación térmica estructurales cinética de clase II xilosa

19
isomerasas, FEBS J. 272 ​(2005) 1454-1464.

[16] ZQ Liu, W. Zheng, JF Huang, LQ Jin, DX Jia, HY Zhou, JM Xu, CJ

Liao, XP Cheng, BX Mao, YG Zheng, mejora y caracterización de una

glucosa isomerasa hyperthermophilic de Thermoanaerobacter ethanolicus y es

aplicación en la producción de jarabe de maíz de alta fructosa, J. Ind. Microbiol. Biotechnol.

42 (2015) 1091-1103.

[17] ZZ Zou, HL Yu, CX Li, XW Zhou, C. Hayashi, J. Sun, BH Liu, T. Imanaka,

JH Xu, Un nuevo termoestable β-glucosidasa extraído de Dictyoglomi:

Propiedades y rendimiento en la síntesis de octil glucósido a altas temperaturas,

Bioresour. Technol. 118 (2012) 425-430.

[18] MW Fraaije, J. Wu, DPHM Heuts, EW van Hellemond, JHL Spelberg, DB

Janssen, Descubrimiento de un termoestable de Baeyer-Villiger monooxigenasa por genoma

minería, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66 (2005) 393-400.

[19] O. Kaplan, K. Bezouška, A. Malandra, AB Veselá, A. Petříčková, J. Felsberg, A.

Rinágelová, V. Křen, L. Martínková, la minería del genoma para el descubrimiento de nuevos

nitrilases en hongos filamentosos, Biotechnol. Letón. 33 (2011) 309-312.

[20] A. Vuolanto, S. Uotila, M. Leisola, K. Visuri, la solubilidad y cristalización de

isomerasa de xilosa a partir de Streptomyces rubiginosus, J. Cryst. Crecimiento 257 (2003)

403-411.

[21] SH Bhosale, MB Rao, VV Deshpande, Molecular y aspectos industriales de

glucosa isomerasa, Microbiol. Mol. Biol. Rdo. 60 (1996) 280-300.

[22] C. Vieille, KL Epting, RM Kelly, JG Zeikus, cationes bivalentes y amino-ácido

20
composición contribuye a la termoestabilidad de Bacillus licheniformis xilosa

isomerasa, Eur. J. Biochem. 268 (2001) 6291 a 6301.

[23] AY Kovalevsky, L. Hanson, SZ Fisher, M. Mustyakimov, SA Mason, VT

Forsyth, MP Blakeley, DA Keen, T. Wagner, HL Carrell, AK Katz, JP Glusker,

Metal papeles de iones y el movimiento de hidrógeno durante la reacción catalizada por la D-xilosa

isomerasa: una de rayos X y difracción de neutrones estudio conjunto, Struct. 18 (2010) 688-699.

[24] CW Bock, AK Katz, GD Markham, JP Glusker, manganeso como un reemplazo

para el magnesio y zinc: comparación funcional de los iones divalentes, J. Am. Chem.

Soc. 121 (1999) 7360-7372.

[25] RK Bandlish, J. Michael Hess, KL Epting, C. Vieille, RM Kelly,

conversión de glucosa-fructosa a altas temperaturas con xilosa isomerasas (glucosa)

desde Streptomyces murinus y dos hipertermofílico Thermotoga especies,

Biotechnol. Bioeng. 80 (2002) 185-194.

[26] H. Xu, D. Shen, XQ Wu, ZW Liu, QH Yang, Caracterización de un mutante

isomerasa de glucosa a partir de Thermoanaerobacterium saccharolyticum, J. Ind. Microbiol.

Biotechnol. 41 (2014) 1581-1589.

[27] L. Lama, B. Nicolaus, V. Calandrelli, I. Romano, R. Basile, A. Gambacorta,

Purificación y caracterización de la xilosa isomerasa termoestable (glucosa) a partir de

Bacillus thermoantarcticus, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 27 (2001) 234-240.

[28] D. Sriprapundh, C. Vieille, JG Zeikus, Determinantes moleculares de xilosa

isomerasa estabilidad térmica y actividad: análisis de termoenzimas por dirigida al sitio

mutagénesis, Protein Eng. 13 (2000) 259-265.

21
[29] Ö. Faiz, A. Colak, Y. Kolcuoglu, NS Ertunga, Clonación, expresión y

caracterización de xilosa isomerasa de termófilo Geobacillus

caldoxylosilyticus cepa TK4, Turk. J. Biochem. 36 (2011) 6-14.

[30] OB Jørgensen, LG Karlsen, NB Nielsen, S. Pedersen, S. Rugh, una nueva

glucosa isomerasa inmovilizada con alta productividad producida por una cepa de

Streptomyces murinus, Almidón-Starke 40 (1988) 307-313.

[31] GP Zhu, C. Xu, MK Teng, LM Tao, XY Zhu, CJ Wu, J. Hang, LW Niu,

YZ Wang, el aumento de la termoestabilidad de la D-xilosa isomerasa por la introducción de una

prolina en la vuelta de una espiral al azar, Protein Eng. 12 (1999) 635-638.

[32] H. Yu, YL Guo, DL Wu, WC Zhan, GZ Lu, la inmovilización de la glucosa

isomerasa sobre el soporte GAMM para la isomerización de la glucosa en fructosa, J. Mol. Catal.

B: Enzym. 72 (2011) 73-76.

22
Figuras legendarias

Figura 1 Isomerización de D-glucosa a D-fructosa usando GI.

Figura 2 El alineamiento múltiple de secuencia de SrGI (GenBank adhesión no. AAA26838.1),

Togi, GTGI, TsGI y TxGI. Los aminoácidos idénticos eran de color rojo en caja, amino similares

ácidos eran huecos en caja. línea de onda denota α-hélice, y la flecha denotada β-strand.

Fig. 3 El análisis de SDS-PAGE de la expresión soluble de las indicaciones geográficas potencial en E. coli BL21

(DE3). Carril M, marcador de peso molecular; carril 1, vacío pET28b (control); carril 2,

inducción de pET28b / TxGI en 28 o C por IPTG 0,1 mM; carril 3, la inducción de

pET28b / Togi en 28 o C por IPTG 0,1 mM; carril 4, la inducción de pET28b / GTGI en 28 o C por

IPTG 0,1 mM; carril 5, la inducción de pET28b / TsGI en 28 o C por IPTG 0,1 mM.

Fig. 4 Efecto de iones metálicos bivalentes sobre la actividad de TsGI y Togi. La actividad GI era

determinado en presencia de 10 mM único ion metálico bivalente o en presencia de

Mg 10 mM 2+ y Co 5 mM 2+, Mg 10 mM 2+ y Mn 5 mM 2+, Mn 10 mM 2+ y 5 mM

Co 2+, respectivamente. Otros manipulación fue el mismo que el ensayo enzimático originales. los

actividad sin adición de ningún ion metálico sirvió como control.

Fig. 5 Efecto de la temperatura sobre la actividad y la estabilidad de TsGI y Togi.

A. Efecto de la temperatura sobre la actividad. actividad GI se midió bajo ensayo estándar

estado y la temperatura indicada. Su actividad máxima se definió como 100%,

respectivamente.

B. Efecto de la temperatura sobre la estabilidad. La enzima se incubó a 85 o C. El

la actividad residual se midió en condiciones de ensayo estándar, la actividad original

sin incubación se tomó como 100%. El inserto presenta la termoestabilidad de

23
dos IG incubación con iones metálicos óptimas repective.

Fig. 6 Efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de TsGI y Togi.

A. Efecto del pH sobre la actividad. actividad GI se midió en 50 mM

N / A 2 HPO 4- NaH 2 correos 4 tampón (pH 5,0-9,0) y tampón 50 mM de glicina-NaOH (pH

9,0-10,0) a 85 o C, respectivamente. Otros manipulación era la misma que la enzima original de

ensayo. Su actividad máxima se definió como 100%.

B. Efecto del pH sobre la estabilidad. La enzima se incubó a diferentes valores de pH y

4 o C. La actividad residual se midió en condiciones de ensayo estándar, el original

actividad sin incubación se tomó como 100%.

Fig. 7 Lineweaver-Burk para TsGI y togi. Las velocidades de reacción iniciales eran

determinado en tampón 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) a 85 o DO.

Fig. 8 Isomerización de D-glucosa a D-fructosa. 400 g / l de glucosa se añadieron en 100

ml Na 2 HPO 4- NaH 2 correos 4 tampón (pH 8,0) con Mn 20 mM 2+, cantidad de células húmedas era 25

Se realizó g / L, y la reacción en por lo 85 o DO.

24
Figura 1

25
Figura 2

26
Fig. 3

27
Fig. 4

28
Fig. 5

29
Fig. 6

30
Fig. 7

31
Fig. 8

32
Mesas

tabla 1 Aminoácidos identidades de secuencia de ácido entre la plantilla de TMGI y SIG seleccionado.

fuente GI Identidad (%) GenBank adhesión no.

Thermoanaerobacterium xylanolyticum 69% WP_013788885.1

oshimai Thermus 29% WP_016329521.1

Geobacillus thermocatenulatus 66% WP_025950753.1

Thermoanaerobacter siderophilus 73% WP_006569355.1

33