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Por favor citar este artículo como: Jia Dong-Xu, Zhou Lin, Zheng Yu-Guo.Properties de una novela glucosa
isomerasa termoestable extraído de Thermus oshimai y su aplicación topreparationof jarabe de maíz alto en
fructosa. Tecnología Enzimática andMicrobial
http://dx.doi.org/10.1016/j.enzmictec.2017.01.001
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Propiedades de una novela glucosa isomerasa termoestable extraídos de Thermus
* : Autor correspondiente:
zhengyg@zjut.edu.cn.
1
Gráficamente abstracto
Reflejos
RESUMEN: se utiliza glucosa isomerasa (GI) in vitro para convertir D-glucosa para
2
Thermoanaerobacter siderophilus ( TsGI) fueron seleccionados a través de enfoque minería genoma.
la eficiencia y la termoestabilidad superiores hacia D-glucosa entre las indicaciones geográficas apantallados. Sus
temperatura óptima alcanzó 95 o C y podría retener más del 80% de la actividad inicial
rendimiento, togi podría ser prometedor para la realización de la futura producción industrial
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1. Introducción
sacarosa se refiere a una mejor solubilidad, la dulzura y menor precio, lo que hace ampliamente
utilizado en diversos campos industriales, tales como bebidas, el bicarbonato y productos farmacéuticos [1].
fecha, HFC-42 (que contiene 42% de D-fructosa) es el principal producto industrial a través
enfoque bioconversión utilizando las IG moderadamente termoestables [2]. Sin embargo, el JMAF-55
D-fructosa in vitro ( Fig. 1), este proceso de isomerización sirve como industrial
clase II. Su principal diferencia es que las enzimas de clase II contienen un inserto adicional de
unos 40-50 residuos de aminoácidos en el dominio N-terminal [5]. Las estructuras cristalinas de
alta homología estructural [6]. El bolsillo catalítica enzimática y la unión de dos metales
otra subunidad con el fin de formar un dímero fuertemente unido [7]. Actualmente, las IG comercial
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murinus y S. rubiginosis [ 8]. Sin embargo, la desventaja de la utilización de estas enzimas
IG termoestable para la producción de HFC en la toma de temperatura elevada para una mayor
rendimiento D-fructosa se considera que es eficaz para reducir los costos enriquecedoras.
actividad a 75 o C durante 4 h [12]. Por el contrario, las IG clase II son más variables en
termoestabilidad, y algunos tienen por lo general una mejor estabilidad térmica que el de clase I IG.
105 a ll0 o C. Su t 1/2 fue de 10 min a 120 o C, y retenido más del 50% de su original,
Sin embargo, no hubo evidencia obvia sobre las variaciones en la estabilidad aunque
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IG termófilas, su estabilidad térmica y repetidas veces de reutilización a alta temperatura
todavía puede afectar a la productividad del catalizador en comparación con el arte de la producción actual de
JMAF a 60-65 o C. Por esta razón, ninguna de las indicaciones geográficas y termófilo hipertermofílico
temperatura.
En este estudio, con el fin de realizar la producción de HFC con alto en fructosa
Centro de Información sobre Biotecnología (NCBI) usando la base de datos T. maritima GI como sonda.
Entonces, sus genes fueron sintetizados basados en el uso de codones preferido de E. coli y
características de Togi y TsGI se exploraron en detalle. Por último, utilizando como togi
85 o C alcanzó 52,16%, que indica que Togi podría tener potencial industrial para
2. Material y métodos
6
Novagen (Madison, EE.UU.). E. coli células con plásmidos se cultivaron aeróbicamente y
(Hercules, EE.UU.). Todos los demás compuestos eran de calidad reactivo o superior calidad.
minería Genoma para la novela IG refractario se realizó en la base de datos NCBI utilizando
con la herramienta explosiva T. maritima GI (GenBank adhesión no. AKE27551.1) como plantilla.
pET-28b (+) entre Xba yo y Xho ⅰ sitios por Sangon Biotech (Shanghai, China).
(SOBREDOSIS 600) alcanzado 0,6, la fase de expresión de la proteína se inició después de la inducción por 0,1
tampón de Tris-HCl (pH 7,0) y se sonicó en hielo durante 20 min (39 W, 30 s de trabajo, 30 s
en reposo), el sobrenadante soluble obtenido por centrifugación fue utilizado como el crudo
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enzima para el análisis, tales como SDS-PAGE y ensayo de actividad.
previamente equilibrada con tampón de unión (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 300 mM,
gradiente de imidazol usando el tampón de elución (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM,
imidazol 500 mM, pH 8,0). Las fracciones se recogieron para su posterior investigación.
volumen de 100 mL. La reacción se llevó a cabo en un agitador de baño de agua a 85 o DO.
análisis.
modificación adecuada se llevó a cabo de acuerdo con Liu et al. [16], en resumen, la
se midió a través del análisis HPLC. Una unidad de la actividad enzimática se definió como
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la cantidad de enzima que produce 1 mol de D-fructosa por minuto en el ensayo
kit de ensayo (Nanjing, China) utilizando albúmina de suero bovino como estándar.
sistema de HPLC Waters (Milford, EE.UU.) y un detector de índice de refracción Aguas 2414
(Milford, EE.UU.). La columna analítica fue Hypersil NH 2 columna HPLC (250 x 4,6
mm, 5 micras) (Elite Analytical Instruments Co., Ltd., Dalian, China). La fase móvil
triplicado.
3. resultados
3.1 glucosa isomerasa genes de cribado novedosas y de expresión en E. coli BL21 (DE3)
El enfoque de la minería del genoma ha sido ampliamente utilizado para buscar novela industrial
enzimas en los últimos años, tales como β-glucosidasa [17], Baeyer-Villiger monooxigenasa
[18] y nitrilasa [19]. Con el fin de obtener nuevos isomerasas de glucosa termoestables, las
fue elegido como plantilla para la explosión en NCBI. Posteriormente, cuatro soldados potenciales de
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fueron desarrollados (Tabla 1).
SrGI cristalina y sus grupos funcionales cruciales se han determinado [20]. los
Fig. 2. Dos secuencias de firma de GI, designado VXW (GP) GREG (YSTA) E y
la mayor parte de las características estructurales específicas, tales como sitios de unión de iones metálicos y el sustrato
sitios de unión (Glu181, Glu217, Asp245, Asp287, His220, Thr90, Trp137, Phe94,
Phe26, His54) también fueron conservados. A diferencia de SrGI y togi, hubo un incremento
Los plásmidos recombinantes pET-28b (+) que alberga diferentes IG potenciales eran
actividad. Como se muestra en la Fig. 3, el análisis SDS-PAGE mostró que se expresaron todas las indicaciones geográficas
como proteínas solubles, y la cantidad de expresión de TsGI fue aparentemente más alto que
la de los demás. Sus actividades hacia la D-glucosa a 85 o C se calcula para ser 2,54
(TsGI), 2,42 (Togi), 1,29 (GTGI) y 0,63 U / (mg · proteína total) (TxGI), respectivamente.
Este trabajo proporciona un nuevo enfoque de la minería del genoma para el descubrimiento y el contraste
de nuevas indicaciones geográficas termoestables utilizando los mismos métodos de ensayo, y los resultados se
persuasivo. Como resultado, TsGI (clase II) y Togi (clase I) con la actividad más alta y
cantidad de expresión aceptable fueron finalmente elegido como biocatalizadores para la siguiente
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investigación.
Cada monómero GI contiene dos sitios de unión a metal y requiere un catión divalente
o una mezcla de diferentes cationes divalentes para la actividad máxima [22]. A fin de que
evaluar los efectos de diversos iones metálicos en TsGI y la actividad Togi, tanto el
enzimas recombinantes se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo mediante el calentamiento y la
Además de cualquier ion metálico sirvió como control. Como se muestra en la Fig. 4, TsGI mostró la
la actividad en un 125%. Cu 2+, Zn 2+, Licenciado en Letras 2+, Fe 2+, Ni 2+ y Ca 2+ inhibe o en parte
inhibió las actividades de dos indicaciones geográficas. Kovalevsky et al. informaron que la inhibición de
actividad catalítica de GI podría tener lugar si el radio iónico del ión metálico era más grande que
ocupaciones. Además, los efectos de activación sinérgica de dos iones de metal en TsGI y
diferentes iones metálicos no mejoraron la actividad de ambas indicaciones geográficas en comparación con su
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3.3 Efecto de la temperatura sobre la actividad y la termoestabilidad de TsGI y Togi
directamente producido utilizando la temperatura de isomerización a por encima de 85 o C [21]. Por lo tanto,
actividad enzimática de TsGI y Togi. Como se muestra en la Fig. 5A, el purificada TsGI y
respectivamente. Tanto las actividades de TsGI y Togi disminuyeron gradualmente por encima o
alcanzado 20,33 U / (mg · proteína), que fue 2,9 veces mayor que la de TsGI en 90 o DO,
lo que indica que Togi dio como resultado mejoras significativas en la actividad en mayor
temperatura de TsGI.
También se determinó el efecto de la temperatura sobre la estabilidad de dos indicaciones geográficas. Como
se muestra en la Fig. 5B, tanto de TsGI purificado y Togi perdieron más de 60% de su original,
4 h. Bandlish et al. descrito que GI podría tener una estructura rígida y estable en el
70 o C durante 24 h, que era 9,4 veces mayor que en ausencia de cationes metálicos
12
[27]. En este caso, TsGI retenido 11,42% de la actividad inicial después de 8 h con Mg 20 mM 2+
tiempo de incubación a 48 h (Fig. 5B, inserto). Este resultado sugiere que la holo-togi tenía
[11]. Este resultado también fue no idéntico al punto de vista de que la termoestabilidad de
y la actividad original sin incubación se tomó como 100%. La Fig. 6B mostró que
Togi retuvo más del 87% de su actividad original entre pH 5,0 y pH 10,0. por
TsGI, menos del 35% de su actividad original fue retenido cuando el pH fue inferior a 6,5,
13
3.5 Los parámetros cinéticos de TsGI y togi
que van desde 50 a 400 mM. Como se muestra en la Fig. 7, de acuerdo con la Lineweaver-Burk
mientras que la K metro y V máx de Togi eran 81,46 mM y 22,73 mol / min, respectivamente.
equilibrio dentro de un período de tiempo práctico [8]. Por lo tanto, la superioridad del sustrato de
afinidad de Togi podría ser ilustrado debido a su menor K metro hacia D-glucosa, que
21,77 min- 1 · mm- 1, más alto que 14,54 min- 1 · mm- 1 la de TsGI, lo que indica que Togi
tenía la ventaja de una mayor eficiencia catalítica hacia D-glucosa sobre TsGI.
nivel con el tiempo prolongado a 8 h (Fig. 8). Bhosale et al. informó de que el 54,7% de fructosa
14
podría lograrse cuando la temperatura de isomerización se fijó en 85 o C [21]. A pesar de que
nuestro resultado anterior han indicado que la holo-togi podía retener más del 80% de
actividad inicial después de la incubación de 48 h, la actividad enzimática podría ser inhibida durante
proceso de conversión a tan alta sustrato y la concentración del producto. Karlsen et al.
se describe que durante el proceso de reacción pequeña cantidad de glucosa podría ser degradado
centro de togi y por lo tanto affacted su termoestabilidad. Estas razones anteriores fuerzas
para permitir a un proceso para la producción de HFC con el rendimiento teórico D-fructosa de
estrategia, y la mutagénesis dirigida al sitio pueden participar directamente para mejorar togi
con una mejor actividad y estabilidad térmica específica. Hlima et al. identificado crítica
sp. SK GI, el mutante (Phe53Leu / Gly219Ala) que contribuyó a los cambios importantes
en la región del sitio activo y el desplazamiento de dos iones metálicos, que se muestra más alta óptima
15
temperatura (100 o C), de alta eficiencia catalítica y ya t 1/2 ( 2,5 h a 85 o C) como
en comparación con la enzima de tipo salvaje [7]. casos similares se refieren a Sriprapundh et al [28]
sobre el soporte GAMM podría retenido 91% de su actividad inicial después de reciclaje para 18
continuas veces re-uso de [32]. En este documento, mayor rendimiento y la productividad de producto pueden estar
subproductos formación [27]. En este caso, Togi retuvo la actividad de al menos 90% cuando el
puede ser valiosa para la resolución de problemas de generación de subproductos. (4) Extracción
sustrato y la inhibición del producto. Biorreactores incluyendo lecho móvil simulado (SMB)
o en el lugar retirada del producto (ISPR) puede adoptarse a escala industrial con el fin de
simultaneouly.
dieciséis
4. Conclusión
también evaluó a través de la conversión de D-glucosa a fructosa. Los resultados desarrollaron siempre
una importante plataforma para la investigación adicional para llevar a cabo la producción industrial de
Conflicto de intereses
Expresiones de gratitud
17
referencias
glucosa isomerasa usando Streptomyces sp. SB-P1, Biotechnol. Res. En t. 2012 (2012)
874.152.
[2] B. Fatima, Z. Hussain, isomerasas xilosa a partir de Thermotogales, J. Anim. Plant Sci.
25 (2015) 10-18.
18
enzimas inmovilizadas, Chem. Soc. Rev. 42 (2013) 6437-6474.
(2013) 215-224.
[15] KL Epting, C. Vieille, JG Zeikus, RM Kelly, Influencia de los cationes divalentes sobre
19
isomerasas, FEBS J. 272 (2005) 1454-1464.
42 (2015) 1091-1103.
403-411.
20
composición contribuye a la termoestabilidad de Bacillus licheniformis xilosa
Metal papeles de iones y el movimiento de hidrógeno durante la reacción catalizada por la D-xilosa
isomerasa: una de rayos X y difracción de neutrones estudio conjunto, Struct. 18 (2010) 688-699.
para el magnesio y zinc: comparación funcional de los iones divalentes, J. Am. Chem.
21
[29] Ö. Faiz, A. Colak, Y. Kolcuoglu, NS Ertunga, Clonación, expresión y
glucosa isomerasa inmovilizada con alta productividad producida por una cepa de
isomerasa sobre el soporte GAMM para la isomerización de la glucosa en fructosa, J. Mol. Catal.
22
Figuras legendarias
Togi, GTGI, TsGI y TxGI. Los aminoácidos idénticos eran de color rojo en caja, amino similares
ácidos eran huecos en caja. línea de onda denota α-hélice, y la flecha denotada β-strand.
Fig. 3 El análisis de SDS-PAGE de la expresión soluble de las indicaciones geográficas potencial en E. coli BL21
(DE3). Carril M, marcador de peso molecular; carril 1, vacío pET28b (control); carril 2,
pET28b / Togi en 28 o C por IPTG 0,1 mM; carril 4, la inducción de pET28b / GTGI en 28 o C por
IPTG 0,1 mM; carril 5, la inducción de pET28b / TsGI en 28 o C por IPTG 0,1 mM.
Fig. 4 Efecto de iones metálicos bivalentes sobre la actividad de TsGI y Togi. La actividad GI era
Mg 10 mM 2+ y Co 5 mM 2+, Mg 10 mM 2+ y Mn 5 mM 2+, Mn 10 mM 2+ y 5 mM
Co 2+, respectivamente. Otros manipulación fue el mismo que el ensayo enzimático originales. los
respectivamente.
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dos IG incubación con iones metálicos óptimas repective.
Fig. 7 Lineweaver-Burk para TsGI y togi. Las velocidades de reacción iniciales eran
ml Na 2 HPO 4- NaH 2 correos 4 tampón (pH 8,0) con Mn 20 mM 2+, cantidad de células húmedas era 25
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Figura 1
25
Figura 2
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Fig. 3
27
Fig. 4
28
Fig. 5
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Fig. 6
30
Fig. 7
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Fig. 8
32
Mesas
tabla 1 Aminoácidos identidades de secuencia de ácido entre la plantilla de TMGI y SIG seleccionado.
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