Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109671760700047X
Materiales

Bacteria Escherichia coli cepa BW25113​ (usado como cepa salvaje)

Derivado de E. coli K-12

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1681482/pdf/msb4100050.pdf
Cepa XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA)

Permite el screening color azul-blanco para los plásmidos recombinantes y es una cepa
hospedadora excelente para aplicaciones de clonación de rutina que usan vectores plasmídicos o
lambda.

Características

Genotipo

XL1-Blue Genotype: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIq Z∆M15
Tn10 (Tetr )].

(Los genes enumerados significan alelos mutantes. Los genes en el episoma F', sin embargo, son de
tipo salvaje a menos que se indique lo contrario).

Fenotipo

Las células XL-1 son resistentes a tetraciclina. Las células XL1-Blue son deficientes en endonucleasa
(endA), lo que mejora en gran medida la calidad del ADN miniprep, y son deficientes en
recombinación (recA), mejorando la estabilidad de la inserción.

La mutación hsdR evita la escisión del ADN clonado por el sistema de endonucleasa EcoK.

El gen lacIq ZΔM15 en el episoma F'permite el cribado del color azul-blanco.

https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/200249.pdf
Métodos

Construcción de cepas

Cepa JCL16

El episoma F’ de la ​Cepa XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA), ​fue transferido a Escherichia coli cepa
BW25113, con algunas modificaciones en el episoma F’ BW25113/F0 [traD36, proAB+, lacIq
ZDM15].

La mutación traD36 inactiva la transferencia conyugal del episoma F '

Los mutantes proAB requieren prolina para crecer en medios mínimos

El gen lacIq ZΔM15 en el episoma F'permite el cribado del color azul-blanco.

https://www.genomics.agilent.com/files/Mobio/Strains_Host_Gene_Desciptions.pdf
Cepas derivadas de JCL16

Los genes de E.coli JCL16: adhE, ldhA, frdBC, fnr, pflB fueron eliminados mediante la técnica
descrita por (Datsenko and Wanner, 2000)

Basado en “Red system”, la estrategia básica es reemplazar una secuencia cromosómica (por
ejemplo, el gen B de la figura 1) con un gen de resistencia a antibióticos seleccionables que se
generan mediante PCR usando cebadores con extensiones de homología de 36 nucleótidos (H1 y
H2)

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC18686/pdf/pq006640.pdf

Cepas derivadas de JCL16 com diferentes tipos de plásmidos

Vector de construcción de plásmidos: ​pZE12-luc (Lutz and Bujard, 1997).

pJCL16: ​contiene el gen atoB de E.coli MG1655

pJCL17: ​contiene el gen adhE2 de C. acetobutylicum insertado en ​pJCL16

pJCL43: ​contiene el gen thl de C. acetobutylicum ATCC824

Pjcl50: ​contiene el gen thl de C. acetobutylicum ATCC824 insertado en ​pJCL17

Vector de construcción de plásmidos​ : pZE21- MCS1 (Lutz and Bujard, 1997)

PLtetO1: Promotor de pZE21- MCS1

PLlacO-1: ​promotor de pZE12-Luc

Se reemplazó PLtetO1 con ​PLlacO-1 ​en pZE21-MCS1 para crear pSA40.

El gen crt amplificado de C. acetobutylicum ATCC824, se clonó en pSA40, creando el plásmido

pJCL33.

Pjcl35: contiene el gen hbd insertado en pjcl33.

ORI ColE1 de pjcl35 se reemplazó con p15A (ORI PACYC), creando pJCL37

Para eliminar puntos de mutación, el gen crt se amplificó de C. acetobutylicum ATCC824 y se

insertó en pJCL37, creando pJCL66.

El gen de ccr de Streptomyces coelicolor fue amplificado e insertado en pJCL66 para crear pJCL63.

Los genes bcd y etfBA de Megasphaera elsdenii fue amplificado e insertado en pJCL66 para crear
pJCL74.

Vector de construcción de plásmidos: ​pJRB1-rc (pACYC184 derivative, Specs, PBAD)

Pjcl2: ​contiene los genes: crt, bcd, etfBA y hbd de C. acetobutylicum ATCC824 (ATCC)

PLlacO-1: ​promotor de pZE12-Luc

PBAD: Promotor parte del operón arabinosa

Se utilizó pZE12-Luc como PCR molde para amplificar ​PLlacO-1 ​y reemplazarlo en PBAD de pjcl2,
para construir el plásmido ​Pjcl60​.