ARTICOL

Extrem de sensibil Biosensing Utilizarea matricilor

de plasmodice Au Nanodisks realizate de
nanoimprint litografie
Seung-Woo Lee, † Kyeong-Seok Lee, ‡ Junhyoung Ahn, †, ^ Jae-Jong Lee, §, ^ Min-Gon Kim, †, ^, * •i Yong-Beom Shin †, ^, *

† Coreea de Institutul de Cercetări Bioscience •i Biotehnologie (KRIBB), 111 Gwahangno, Yuseong-gu, Daejeon 305-806, Coreea de Sud, ‡ Coreea de Institutul de •tiin•ă •i Tehnologie (Kist), 39-1

Hawolgok-dongWolsong-gil, 5, Seong-Buk-gu, Seoul 136-791, Coreea de Sud, § Coreea de Institutul de Masini si materiale (KIMM), 104 Sinseongno, Yuseong-gu, Daejeon 305-343, Coreea de Sud, •i ^

Universitatea de •tiin•ă •i Tehnologie (UST), 176 Gajung-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-350, Coreea de Sud

L senzori (LSPR) au fost studiate intens ca fiind

unul dintre celedemai
rezonan•a promi•ătoare
suprafa•ă nanobiosensors
a plasmonului ocalized

pentru diagnostic medical, monitorizarea bolilor, precum

ABSTRACT Vom descrie fabricarea eliptice matrice nanodisk Au ca rezonan•a plasmonilor de suprafa•ă localizate (LSPR)

substrat de detec•ie pentru immunoassay clinică prin intermediul litografie nanoimprint termică (NIL) •i cre•terea în

•i detectarea de poluan•i de mediu din cauza
sensibilitate ridicată, detectarea lor nemarcată, volume
ale probelor mici,
cost scăzut instrumente,
•i detectarea în timp real. 1-3 În general, Biosensing bazat
pe LSPR utilizează o bandă de extinc•ie puternică în
sensibilitatea detectării prostatei-speci Fi antigen c (PSA) folosind precipitarea fosfatului de 5-brom-4-clor-3-indolil p- toluidină
/ tetrazolium nitro albastru (BCIP / NBT), catalizată de fosfatază alcalină. nanodisks Au fost fabricate pe sticla printr-o
evaporare înclinată neconven•ională, care ar putea păstra grosimea rezisturi imprimat •i de a crea un bene subtăiere Fi cială
la ulterioare Lift-o ff proces, fără nici o deteriorare a dimensiunii de model •i de sticlă în timp ce îndepărtarea polimerilor
reziduale. Pentru a investiga proprietatea optic anizotrope a senzorilor LSPR, o lumină sondă cu polarizare paralelă liniar •i
perpendicular pe axul lung al matricei nanodisk eliptice a fost utilizat, iar sensibilitatea lor la indicele de refrac•ie în vrac (RI)

intervalul vis-NIR. Extinc•ia provine de oscila•ie colectivă a fost măsurată ca 327 •i 167 nm / RIU, respectiv. Din cuno•tin•ele noastre, acest lucru este Fi aplicare prima de reac•ie

a electronilor de conduc•ie în nanoparticula metalic (NP), enzimă-substrat pentru sandvi• pe bază de teste imunologice biosenzorilor LSPR care anterior su ff perit de la o sensibilitate
indusă de fotoni incidente sau electronii cu speci Fi c
redusă din cauza scurt adâncimea de penetrare a plasmonilor Fi ELD, în special atunci când anticorpii de mari dimensiuni
energia rezonantă. Lungimea de undă de vârf,
au fost folosite ca bioreceptors. Ca urmare, o schimbare mare în indicele de refrac•ie local, datorită precipita•iilor pe Au
magnitudinea extinc•ia spectre LSPR •i lungimea
nanodisks ampli Fi ed deplasarea lungimii de undă a vârfului LSPR în spectrul vis-NIR, rezultând în limite de detec•ie
putrezire a LSP Fi ELD depind foarte mult de mărimea,
femtomolar, care a fost ~ 10 5- ori mai mici decât detectarea nemarcată fără precipitarea enzimei. Această metodă poate fi
forma, spa•ierea interparticole •i compozi•ia nanostructuri
noblemetal. 4-6 În•elegerea modului în care structurile extinsă cu u•urin•ă la alte diagnostic clinic cu o sensibilitate ridicată.

NP-o ff ECT aceste proprietă•i LSPR, optimizarea

design-nanostructură, •i îmbunătă•irea limita lor de
sensibilitate / detectare sunt aspecte importante ale
cercetării actuale LSPR biosenzor. 7 În această lucrare, ne
vom concentra pe fabricarea u•oară a nanostructuri CUVINTE CHEIE: matrice nanodisk • nanoimprint litografie • rezonan•a plasmonilor de suprafa•ă localizată • prostata

metalice •i sporirea sensibilită•ii LSPR la o limită extrem speci Fi antigen c • precipitarea enzimatică

de scăzută de detec•ie (LOD).

litografie cu fascicul de ioni focalizat. litografie

Tehnica nanofabricarea dorit pentru
nanostructuri-legat de substrat ar avea unele
caracteristici remarcabile, inclusiv fabricarea low-cost,
suprafa•ă mare patternuri, reproductibilitate •i tunability
proprietă•ilor lor optice. Din acest motiv, abordări
neconven•ionale la adresa nanofabricarea, cum ar fi
nanoimprint Soft a fost folosit pentru a dezvolta o clasa
de cristal plasmonice cvasi-3D, care este format din
multilaryered, tablouri regulate de nanostructuri
subwavelength metalice. nanostructuri lor cvasi-3D au
fost fabricate prin depunerea Au pe suprafa•a imprimată
a unui polimer, care rezultă cu răspunsul plasmonică fiind
reprezentat într-o combina•ie de răspuns LSPR •i
* Adresa de coresponden•ă
rezonan•e val Bloch. 8,9 NSL este una dintre cele mai ybshin@kribb.re.kr , mgkim@kribb.re.kr.

litografie nanoimprint moale, 8,9

utilizate tehnici, deoarece poate produce matrice
biosenzor la scară largă cu un proces de fabricatie
Primit pentru reexaminare 16 august 2010 •i a
nanosphere litografie (NSL), 10,11 litografie coloidal, 12 litografie simplu. Aceasta tehnica utilizeaza o masca nanosphere acceptat 03 ianuarie 2011.

nanoimprint (NIL), 13 •i sinteza în faza de solu•ie 14,15 close-packed hexagonală care permite metalului directă
publicat online 11 ianuarie 2011
10.1021 / nn102041m

par să fie mult mai preferabilă apropierilor conven•ionale,

cum ar fi litografie e-beam •i C 2011 American Chemical Society

LEE ET AL. VOL. 5 ' NU. 2 ' 897 - 904 ' 2011 897

www.acsnano.org

depunerea să pe un substrat prin regiunile intersti•iale ale themask.
Formarea-ambalate aproape matrice nanoshere este pasul cel mai
critic in NSL la anduniformnanostructures producewell-ordonate. 10,11
Desigur, trebuie remarcat faptul că limitările inerente ale NSL includ
formarea defect de matrice nanosfere •i designul său model cu efect
limitat. 12,13 Recent, NIL a fost propusă ca o tehnică alternativă care nu
poate depă•i numai limitările NSL, ci, de asemenea, produc senzori
LSPR vandabile. 13 Se iswell-cunoscut faptul că NIL este o •tampilă pe
bază, low-cost, •i high-throughput metoda litografică, care poate genera
zone în mare parte nanopatterned cu 10 nm sub rezolu•ie. 16 În ciuda
poten•ialului său mare, cu toate acestea, aplica•iile practice ale NIL ca
nanofabricationmethod pentru senzorii LSPR au fost rareori raportate
până în prezent. Acest lucru este, probabil, atribuit două constrângeri
asupra NIL: (a) fabricarea unui timbru suprafa•ă mare, cu densitate
mare caracteristică, 17 •i (b) dezvoltarea unui e foarte FFI proces cient
pentru un transfer model de succes. 18
În general, sensibilitatea LSPR la vrac RI este mult mai mic, din
cauza lungimii de degradare mai scurtă a plasmonilor Fi ELD decât în
​SPR, a•a numita înmul•ire plasmonilor de suprafa•ă rezonan•ă (PSPR),
care este generat în semi-in Fi metalic continuu infinit Fi Ramură. 19 In
plus, sensibilitatea imunosenzori LSPR este considerabil redusă în
timpul etapelor de activare a suprafe•elor de senzori, cum ar fi
func•ionalizarea suprafe•elor metalice, imobilizarea probelor de captură
•i reducerea nonspeci Fi c legarea pe suprafa•a cip. De exemplu,
nanoparticule de Ag triunghiulare fără strat de acoperire de adsorbat
(191 nm RIU- 1) •i suprafe•ele de modi Fi ed cu un monostrat de CH 3 ( CH 2)
15 SH (150 nm RIU- 1)
di expus ff Sensibilitatea erent la RI în vrac. 10 Când moleculele mari ca
receptori au fost imobilizate pe Au nanoisland chips-uri, sensibilitatea in
detectarea evenimentelor de legare moleculară a fost observat pentru a
fi vizibil mai scăzută. 20-22 grupul Van Duyne a demonstrat strategii
alternative de îmbunătă•ire a limitei de sensibilitate / detectare LSPR
bazat pe formatul de test sandwich. 10,11 Această abordare cre•te în plus
e ff ective schimbare în RI în apropiere de nanostructuri metalice
prin intermediul macromolecule 11 sau cuplarea rezonan•a plasmonică. 10
În plus, s-a raportat anterior că enzima-catalyzedprecipitation duce la o
schimbare mare în RI la cele fl la suprafa•a metalului Fi lme în SPR. 23,24
In acest studiu, am demonstrat o noua abordare a unui imunosenzor
LSPR ultrasensitive, în care enzymecatalyzed precipita•ii pe
nanostructuri ordonate rază lungă este introdusă ca o metodă de
cre•tere după legarea între PSA ( ~ 36 kDa) •i a fosfatazei alcaline ale
acestuia (ALP) -tagged anticorp de detec•ie. Deoarece plasmonilor Fi ELD
lângă nanostructuri metalice 3-D în LSPR este concentrată în principal
în intervalul de câteva zeci de nanometri de pe suprafe•ele metalice,
adsorb•ia densă a precipitatului cu o constantă dielectrică ridicată în
apropierea suprafe•elor metalice este
LEE ET AL.
ARTICOL
de a•teptat să fie mai e ff ective în inducerea mari schimbări în semnalul
de detec•ie decât în ​SPR. Mai mult, din punctul de vedere al aplicării,
conjuga•i enzymeantibody au un avantaj asupra conjuga•i NP-anticorp
care au mai mul•i factori de limitare, cum ar fi nonspeci Fi c adsorb•ie
sau legare, varia•ia dimensiunii, agregare, •i lipsa de stabilitate. 3 Eliptică
matrice nanodisk Au cu o suprafa•ă mare sunt fabricate pe un substrat
de sticlă prin litografiere nanoimprint termic (NIL) cu o •tampilă
lithographyassisted interferen•ă cu laser. Ca e FFI cientă postprelucra
de NIL, cum ar fi îndepărtarea stratului polimeric rezidual •i creând o
degajare interioară a polimerului cu model, o metodă de evaporare
înclinată este folosită pe modele de ră•ină de imprimat la scara unei
plachete. În final, proprietă•ile anizotrope optic sunt analizate într-un
PDMS fl uidic systemwith un dispozitiv LSPR de transmisie pentru
aplicarea unei nanobiosensor LSPR based.
REZULTATE SI DISCUTII
Fabricarea eliptice matrice nanodisk Au pe un substrat de sticlă este
ilustrat schematic în figura 1. In acest studiu, modelul nanodisk matrice
pe un timbru Si a fost transferat pe o plăcu•ă de sticlă prin NIL termic •i
procesele ulterioare (evaporare înclinat, O 2 gravarea cu plasmă,
depunere de metal, lift-o ff) cu un grad ridicat Fi delity. Un timbru scalate
vafele a fost fabricat folosind litografie interferenta cu laser (LIL). Este
bine cunoscut faptul că LIL este o tehnologie care permite maskless
modele uniforme •i periodice submicrometrica peste zone foarte mari.
O •tampilă Si a fost ob•inut la un cost redus, prin LIL patterning •i
ulterior gravare uscată Si cu timp de prelucrare scurt (Figura 2A). În
general, gravare anizotropică ion reactiv (RIE) •i bistrat lift-o ff sunt
utilizate pentru a îndepărta un strat de polimer rezidual în procesul de
transfer nanopatterns supraimprimată nanostructuri metalice pe un
substrat în NIL. 16,18,25 Trebuie remarcat faptul că această amprentare •i /
sau procesul de corodare este probabil să provoace pere•i laterali u•or
te•ite sau marginile rotunde ale polimerului imprimat, rezultând lift-o ff e•ec.
Cu toate acestea, în acest studiu, mă•ti metalice create prin evaporare
inclinata ar putea proteja perfect marginile ră•inii de a fi gravat •i a
produs o degajare interioară, în pere•ii laterali ai structurilor
inscrip•ionate în timpul O 2 gravarea cu plasmă. Ca rezultat, am fost
capabili să transfere cu u•urin•ă modelul •tampilei matricele nanodisk
de metal de pe plachetă de sticlă. Figura 2B arată că dimensiunea (axa
lungă •i axa scurtă lungimi; L L •i L s) •i smoală de preparate eliptice
matrice nanodisk Au pe un substrat de sticlă se află, de Fi definit prin
dimensiunile •tampilei. Media L l, L s, •i pas al matricelor nanodisk Au fost
162, 105, •i 340 nm, respectiv. Consiliul Europei FFI cient de varia•ie (CV)
pentru sizewas mai pu•in than5%, ceea ce indică faptul că eliptice matrice
nanodisk Au fost fabricate cu o uniformitate bună. Acest rezultat arată că
punerea în aplicare noastră, inclusiv NIL este un e ff ective mod de a fabrica
nanostructuri cu un ordin de rază lungă de ac•iune într-o scară de plachetă.
VOL. 5 ' NU. 2 ' 897 - 904 ' 2011 898
www.acsnano.org
 ARTICOL
Figura 1. Fabricarea de matrice nanodisk Au folosind litografie nanoimprint (NIL). (A) supraimprimarea eliptice Au matrice nanodisk. (B) depunerea stratului masca de Cr
prin evaporare înclinat pentru a crea o degajare interioară. (C) îndepărtarea stratului rezidual de O 2
gravarea cu plasmă. (D) evaporatoare 1 nm Ti / 20 nm Au Fi lm. (E) o ridicare ff ră•ina amprenta.

Informa•ie). Deoarece rezultatul calculului, sa constatat că fostele

corespunde răspunsului rezonant pe axa scurtă a nanodisks eliptice
(s-vârf, Figura 3B) •i acesta din urmă axa sa lungă (l-vârf, Figura 3C).
În plus, pozi•iile de vârf ale maxim de extinc•ie a variat 630-830 nm atât
analiza teoretică •i rezultatele experimentale, în func•ie de direc•iile de
polarizare (a se vedea figurile S1 •i S2 în informa•iile de sus•inere).

Pentru a analiza caracteristicile de detec•ie ale eliptice matrice

nanodisk Au pe sticla ca senzor LSPR, am examinat brie fl y
sensibilitatea lor la vrac RI. Sensibilită•ile atât s-vârf •i l-vârf au fost
determinate experimental prin panta liniară Fi t pe parcela de vârf LSPR
lungime de undă ca răspuns la RI vrac utilizând solu•ii apoase care
con•in 0-60% glicerol, rezultând 167 •i 327 nm RIU- 1, respectiv (Figura
3D).

Este cunoscut faptul că PSA este un serummarker important pentru

diagnosticarea cancerului de prostata si ar trebui sa fie detectate la
fiziologice (<4 ng ml- 1) •i clinice (410 ngmL- 1) niveluri. 27 Themodi Fi cation
de MUA (10mM) pe goale matrice nanodisk Au •i imobilizarea ulterioară
a anticorpilor de captură (0,1 mg ml- 1

Figura 2. Imaginile SEM ale (A) modelul matrice de eliptic Si nanopillars pe un

anti-PSA) a indus totalul 19.1 •i 28 schimburi medii nm monoclonali în
timbru LIL •i (B), modelul de matrice de eliptic Au nanodisks fabricate pe o
plăcu•ă de sticlă.
s-vârf •i l-vârf lungimea de undă a benzii LSPR, respectiv. Cu toate
acestea, în cazul în care schimbările de vârf ale evenimentului
LSPRbandwereobservedduring thebinding de PSAontoanti-PSA, o u•oară
Eliptic nanodisks Au arată două vârfuri de extinc•ie datorită
schimbare ( Δ λ max = 2nm) în l-peakwas detectedonly la concentrationof 2,8
anizotropiei lor geometrice. Figura 3A prezintă spectrul de extinc•ie a
nM PSA. Nu cativ Fi schimburi de vârf poate juca ( Δ λ max < 1 nm) au fost
matrice nanodisk Au pe plachetă de sticlă observate folosind lumină
detectate la concentratii PSA mai mici de 10 ng ml- 1
nepolarizată în aer. Acest lucru indică faptul că matricele nanodisk
expuse două vârfuri în vizibil •i apropiat IR variază. Pentru a oferi o
descriere calitativă a rezultatelor experimentale, analiza teoretică a fost (280 pM) pentru ambele s-vârf •i l-vârf atunci când linia de bază pentru
realizată folosind apropierea dipol discrete metoda (DDA) 26 LOD a fost dé Fi definit ca de trei ori mai mare decât zgomotul instrumental.

În plus, chiar •i evenimentul ulterior legarea detectarea anticorpilor-enzimă

conjugat nu poate provoca o cativ Fi schimbare poate juca în semnalul

(A se vedea detaliile de calcul în SUS•INEREA LSPR.

LEE ET AL. VOL. 5 ' NU. 2 ' 897 - 904 ' 2011 899

www.acsnano.org

Figura 3. (A) extinc•ie experimentală spectrumof ca preparat eliptice matrice nanodisk Au, inclusiv s-vârf •i l-vârf. Rezultatele teoretice ale unui nanodisk eliptic Au analizat
prin DDA, expunerea (B) s-vârfuri •i (C) l vârfuri ( φ: direc•ia poarization luminii incidente împotriva axa lungă a nanodisk Au). (D) Sensibilitatea la RI în vrac pentru s-vârf /
l-vârf al preparate eliptice matrice nanodisk Au, măsurată în modul de transmisie.
Pentru a în•elege pe deplin aceste fenomene, este în valoare de
examinarea caracteristicilor fundamentale ale LSP
Fi ELD inmetal 3-D nanostructuri. Amplitudinea LSP Fi ELD este dublu
exponen•ial atenuat în direc•ia normală la suprafa•a metalică, astfel
încât adâncimea de penetrare a LSP Fi eld in 3-D nanostructuri
metalice este de aproximativ 25 nm. 28 Mai specific Fi din punct de
vedere, LSP Fi ELD este distribuit în principal în regiunile cu rază scurtă
( ~ 5-6 nm) de pe suprafa•a metalică. 10 A fost experimental con Fi rmat
printr-o depunere strat cu strat de polielectrolit care nanorods Au sunt
cele mai sensibile în Fi rst 10 nmof suprafa•ă. 14 Din acest motiv,
moleculele de analit adsorbit pe suprafa•a nanodisks Au care au fost
functionalizate cu anticorpi mari ( ~ 15 nm) •i linkerii ( ~ 2 nm) sunt greu
detectabile, chiar dacă acestea sunt încă în adâncimea de detectare a
LSP Fi ELD. Prin urmare, este mai mare dimensiunea de anticorpi
imobiliza•i, reduce sensibilitatea detectării nemarcată de molecule •intă.
A•a cum se arată în Figura 4, nu cativ Fi Deplasările cant in ambele
s-vârf •i l-peakwavelength a LSPR bandwere observat la
PSAconcentrations than280pM inferior, până când precipitationwas
theenzymatic introdus. Evenat un concentrationof 2,8 nM PSA, detectie
nemarcată a PSA a fost dovedit a fi di FFI cult (a se vedea figura S3 în
informa•iile care sus•in). Pe de altă parte, reac•ia de precipitare a condus
la
LEE ET AL.
ARTICOL
Deplasările dramatic mari pe o gama larga de concentratii PSA, astfel
încât chiar •i legarea 10 pg ml- 1 ( 280 fM) PSA in0.1% BSA / PBSwas
găsită tobedetectableas 4.7and
5.5 nm în s-vârf •i l-vârf schimburi, respectiv (a se vedea tabelul S1 în
informa•iile de sus•inere).
Figura 5A prezintă o imagine SEM a matricelor nanodisk după
legarea de 2,8 nMPSA •i reac•ia de precipitare Fi nally efectuate. Sa
observat că precipitatele se află chiar în jurul nanodisks, furnizând
informa•ii suplimentare care anticorpul de captură a fost imobilizat e FFI cient
numai pe nanodisks Au, prin intermediul monostraturile auto-asamblate
din MUA pe suprafe•ele metalice. Mai mult, nonspeci Fi c legarea pe
suprafa•a de sticlă a PSA •i anticorp-enzimă conjuga•i pare a fi practic
neglijabilă. O analiză compozi•ională prin spectroscopie cu dispersie de
energie cu raze X (EDX), de asemenea, arată că precipite pe
nanodisks Au fost produse datorită reac•iei enzimatice a substratului
BCIP / NBT (vezi Figura S4 în informa•iile de sus•inere). Pentru a
investiga în continuare schimbarea themorphological a nanodisks •i
ob•ine date cantitative ale precipitatelor, am efectuat măsurători
topografice 3-D folosind microscopie de for•ă atomică (AFM) (a se
vedea figurile S5 •i S6 în informa•iile de sus•inere). Am putea vedea di ff Diferen•a
din mărimea •i forma nanodisks
VOL. 5 ' NU. 2 ' 897 - 904 ' 2011 900
www.acsnano.org

Figura 4. Spectrele LSPR în conformitate cu fiecare etapă de legare după legarea (A) 280 pM, (B) 28 pM, (C), 02:08, •i (D) 280 fM PSA în 0,1% BSA / PBS.
Figura 5. (A) imagine SEM •i (B) imagine AFM eliptice matrice nanodisk Au după
reac•ia de precipitare cu bindingof 2.8 nMPSA. Panglica prezintă imaginea
anAFM a matrice nanodisk chiar înainte de reac•ia de precipitare.
între probele înainte •i după reac•ia de precipitare (2,8 nM PSA) în
Figura 5B; acest lucru ar putea fi
LEE ET AL.
ARTICOL
observată chiar •i cu legarea de 280 pM PSA (vezi Figura S7 în
informa•iile de sus•inere). Cele nanodisks acoperite cu precipitatele au
avut suprafe•e denivelate cu di ff înăl•imi erent, variind de 34.1-52.2 nm
(2,8 nM PSA) •i 28.5-39.7 nm (280 pM PSA), respectiv. Mare di ff erence
în înăl•ime totală pe aceea•i nanodisk poate fi atribuită precipitarea
neomogenă pe suprafa•a metalică, care rezultă din distribuirea
aleatorie •i orientarea biomolecule. Medie înăl•imile nanodisks a
crescut cu 11,4 nm (2,8 nM PSA) •i 2,1 nm (280 pM PSA) după reac•ia
de precipitare, rezultând 37.1 •i
18.0 Deplasările nm ro•u în lungimea de undă s-vârf a benzii LSPR,
precum •i 48,1 •i 29,1 nm în l-vârf, respectiv. Comparativ cu
biomolecule cum ar fi PSA •i conjugat anticorp-enzimă, chiar •i o
cantitate mică de precipitat situată în interiorul LSP Fi ELD ar putea
provoca relativ mari schimburi ro•ii în ambele vârfuri. Aceasta rezultă
din faptul că precipitatul, inclusiv brom •i clor, are o constantă
dielectrică ridicată •i este dens adsorbit în imediata apropiere a
suprafe•elor metalice. Prin urmare, această abordare precipitare ar
putea fi o simplă •i e ff ective mod de a îmbunătă•i sensibilitatea
senzorilor LSPR.
Mai mult decât atât, din moment ce e catalitică FFI cien•a reac•iei
enzymesubstrate este mare, timpul de reac•ie poate fi redusă la un
fewminutes. Am măsurat varia•ia vârf lungimea de undă LSPR în timp
real în timpul reac•iei catalizate de enzimă (5 μ L min- 1 fl ow rată de
VOL. 5 ' NU. 2 ' 897 - 904 ' 2011 901
www.acsnano.org

Figura 6. (A) Pozi•iile de vârf ale benzii LSPR ca func•ie de timp în timpul unei
reac•ii de precipitare catalizată de enzimă (5 μ L min- 1 fl ow rată, 40 min) •i spălare
ulterioară PBS (100 μ L min- 1 fl ow rată, 30 min) cu legarea de 2,8 nM PSA.
Panglica prezintă reac•ia solu•iei de substrat •i PBSwashingwithout atât bindingof
PSAand reac•ia conjugate enzimă-anticorp. (B) Curba de calibrare pentru reac•ia
de precipitare pe suprafa•a nanodisk Au. Toate experimentele au fost repetate de
mente de trei ori. Barele de eroare reprezintă devia•ia standard a Deplasările de
vârf LSPR în func•ie de fiecare concentra•ie; liniu•ă ro•ie •i liniile dot albastre
reprezintă suma trecerea medie •i devia•ia standard a l-vârf •i s-vârf deplasări ale
benzii LSPR într-un experiment de control negativ, fără a se lega PSA, respectiv.
40 min) •i spălare ulterioară PBS (100 μ L min- 1
fl ow rată timp de 30 min) după legarea de 2,8 nM PSA (Figura 6A).
Schimbarea în pozi•ia de vârf a atins aproximativ 90% din valoarea
maximă în 10 minute după injectarea solu•iei de substrat. In plus, cele
mai multe dintre legarea slabă a precipitatului indusă de nonspeci Fi reac•ia a fost ampli Fi ed de catalizată de enzimă precipitarea BCIP / NBT,
c a fost îndepărtată în cadrul 5min. BCIP / NBT solu•ie rămasă în
camera de PDMS a fost fl ushed în acela•i timp. Panglica din Figura 6A
prezintă rezultatul experimental pe orice posibil e ff ect de
auto-precipitare sau adsorb•ie a solu•iei de substrat. Atunci când
reac•ia de precipitare •i spălarea ulterioară cu PBS au fost efectuate
fără PSA •i
SECTIUNEA EXPERIMENTALA
Materiale. albumină serică bovină (BSA), N- hidroxisuccinimidă (NHS), acid
11-mercaptoundecanoic (MUA), etanolamina,
LEE ET AL.
ARTICOL
conjuga•i anticorp-enzimă, pozi•ia de vârf a benzii LSPR a revenit la
pozi•ia ini•ială după spălare cu PBS timp de 3 min.
În cele din urmă, un experiment de control negativ a fost efectuat
pentru a determina LOD, de Fi definită ca cea mai mică concentra•ie la
care răspunsul senzorului a fost distins statistic (Figura 6B). LOD în
experimentele de detectare a etichetei fără senzori LSPR se determină
în general, pe baza de trei ori devia•ia standard a zgomotului
instrumental luată ca bază. 10 Cu toate acestea, acest lucru nu
baselinemay să fie acceptabil în formatul test sandwich, deoarece chiar
•i un pic nonspeci Fi c legarea detectarea conjuga•ilor anticorp pot fi
extrem de ampli Fi ed prin reac•iile enzimatice. Într-adevăr, o cantitate
mică de nonspeci Fi c legare a fost observată în experimentele noastre
de control efectuate fără PSA atunci când linia de bază pentru LOD a
fost dé Fi definit ca trecerea medie, plus devia•ia standard. 14 Aceste
valori au fost 3,37 •i 4,5 nm pentru s-vârf •i, respectiv, l-vârf. Pe baza
acestui experiment de control efectiv, LOD a fost determinată să fie ~ 0.012
ng ml- 1
(333 fM) •i ~ 0,003 ng ml- 1 ( 83 fM), ceea ce înseamnă că LOD a fost
îmbunătă•ită ~ 10 5 ori de ampli semnal enzimatic Fi cation peste cea
ob•inută cu experimentul nemarcată. Acesta este un rezultat mai bun
decât rezultatele anterioare, care au limita de detec•ie
1,0 ng ml- 1 în probele de ser diluate 29 •i 0,15 ng ml- 1 în 3% BSA în probele
de PBS 30 folosind senzori SPR comerciale, cu teste de tip sandwich aur
coloidal îmbunătă•ite. Mai mult decât atât, ne a•teptăm ca LOD poate fi
îmbunătă•it mult mai mult prin intermediul strategii pentru mai e FFI reducerea
cientă a nonspeci Fi c legare pe suprafe•e metalice.
CONCLUZII
Am demonstrat fabricarea eliptice matrice nanodisk Au prin
intermediul NIL termic pentru un senzor LSPR. Longrange a ordonat
matrice nanodisk pot fi fabricate folosind reproductibil
lithographicmethods low-cost (LIL andNIL), care ar putea permite
high-throughput fabricarea de LSPR cipuri biosenzor. Cele Au
nanoarrays eliptice fabricate pe sticlă au un răspuns l-vârf, care este
mai sensibilă la RI în vrac decât cea a s-vârf în spectrul LSPR. Pentru
aplicarea PSAdiagnostics toclinical, thepeak schimbare a benzii LSPR
având ca rezultat o cre•tere remarcabilă a limitei de detec•ie, care este
mult sub nivelul de diagnostic de 4-10 ng ml- 1 PSA. Metoda de
precipitare enzymecatalyzed în senzorul LSPR putea beextended
todetect analyteswith lowmolecularweight si alte biomarkeri clinice, la
concentra•ii scăzute în probe clinice reale.
-Straptavidin fosfatază alcalină (ALP), 5-brom-4-clor-3-indolil fosfat p- toluidină
(BCIP) •i tetrazoliu albastru nitro (NBT) au fost achizi•ionate de la Sigma-AIdrich
(St. Louis, MO).
VOL. 5 ' NU. 2 ' 897 - 904 ' 2011 902
www.acsnano.org

Figura 7. Ilustrarea schematică a procedurii de detectare a PSA, inclusiv Modi de suprafa•ă Fi cation •i reac•iile de legare biochimice. (A) Modi Fi cationwithMUA. (B)
Imobilizarea anticorpului PSA. (C) Legarea PSA la anticorp. (D) legarea alcalină anticorp conjugat fosfataza-detectare a PSA Sandwich. (E) reac•ia enzimatică a
substratului BCIP / NBT. (F) precipitarea produsului pe nanodisk.
antigen recombinant uman specific prostatic (PSA), anticorpi monoclonali de
captură •i anticorpii biotinila•i de detec•ie policlonali au fost achizi•ionate de la
sistemele D (Minneapolis, MN), R &. Sodalime napolitane de sticlă au fost
ob•inute de la Buysemi (Suwon, Gyeonggido, Coreea), •i 1-etil-3-
(3-dimetilaminopropil) -carbodiimidă (EDC) a fost achizi•ionat de la ThermoFisher
Scientific (Waltham, MA). Glicerol (SigmaUltra, g 99%) a fost achizi•ionat de la
Sigma-Aldrich, Inc.
Fabricarea de Eliptice Au Nanodisk Arrays. Au matrice nanodisk pe un
glasswafer au fost fabricatedby procesele de serie ale NIL, evaporare înclinată, O 2 gravarea
cu plasmă, depunere de metal, •i lift-off. În primul rând, o •tampilă Si cu
caracteristici nanoscale a fost preparat prin interferen•a cu laser litografie (LIL),
apoi suprafa•a timbrului Si a fost modificat cu produse chimice hidrofobe pentru
eliberarea u•oară a •tampilei de ră•ină după supraimprimare. Timbrul cu modele de
matrice nanopillar a fost presat pe o ră•ină care se întăre•te termic folosind un
NILmachine termic, a•a cum se arată în Figura 1. Ră•ina (mr_I8030E, Micro Resist
Technology GmbH, Germania) a fost diluat cu diluant său la un raport de 3: 2 •i de
spin pe o plăcu•ă filmate de sticlă la 3000 rpm timp de 30 s, reprezentând
grosimea de ră•ină de 170 nm. Această amprentare a fost realizată sub presiunea
de 50 bari la 180 C timp de 10 min (vezi Figura S8 în informa•iile de sus•inere) •i
men•inută până când temperatura a scăzut sub 50 C (Figura 1a). Pentru a proteja
un strat superior al ră•inii model fromO 2 gravare cu plasmă, un strat de 2 nm de
crom a fost depozitat într-un unghi înclinat de aproximativ 70 de patru ori în diferite
direc•ii într-un evaporator e-fascicul (Figura 1b). Stratul rezidual a fost îndepărtat
prin O 2 gravare cu plasmă (Finish Plasma, Wertheim, Germania), la o O 2 Rata de
300 ml min- flux 1 •i 300 Wpower timp de 6 min (figura 1c). În cele din urmă, un strat
de Ti / Au (1 nm / 20 nm) a fost depus prin evaporare e-fascicul (Figura 1d) •i
ridica•i-off a fost realizată prin agitare cu ultrasunete în acetonă (Figura 1e).
Modificarea Surface Nanodisk •i biochimice de legare.
Figura 7 prezintă modificarea suprafe•ei a nanodisks •i procedura de legare
pentru detectarea PSA. (A) preparate Au nanodisk chips-uri matrice au fost
tratate într-un „ soluţie Piranha “( H 2 ASA DE 4 / H 2 O 2 = 3: 1) pentru a cură•a suprafa•a
nanodisks, urmată de spălare cu apă deionizată (DI) •i uscate sub un curent de
azot. A•chiile nanodisk cură•ate au fost imersate într-o solu•ie de etanol care
con•ine 10 mM MUA timp de 12 ore. Ulterior, terminale grupe carboxilat de
suprafe•e mua au fost activate într-o solu•ie de 0,1 M EDC •i 0,025 M NHS in DI
apa timp de 15 min. (B) Pentru a imobiliza anticorpii de captură pe suprafa•a
MUA activat, cipurile au fost incubate cu tampon inphosphate salin (PBS, pH 7,4),
con•inând
0.1mgmL- 1 de anticorpi anti-PSA timp de 1 oră. Legarea nespecifică a fost
împiedicată prin utilizarea 1,0 M etanolamină / HCl (pH 8,5) timp de 15 min •i apoi
10 mg ml- 1 de BSA în PBS timp de 1 oră. (C) Reac•ia antigen-anticorp a fost
efectuat timp de 1 oră în PBS con•inând 1 mg ml- 1 BSA •i concentra•ii variate
(100,
10, 1, 0,1, 0,01 ng ml- 1) PSA recombinant. (D) Testul de tip sandwich a fost
efectuat timp de 30 minute într-o solu•ie de 1 μ g ml- 1
LEE ET AL.
ARTICOL
biotinilat anti-PSA •i 1 μ g ml- 1 fosfatază alcalină streptavidină în 1 mg ml- 1 BSA /
PBS. (E) Reac•ia de precipitare catalizată de enzimă a fost declan•ată prin
adăugarea de BCIP 0,1 M •i 1mgmL- 1 NBT în 0.1MTris-HNO 3 la pH 9,8 pentru
30min. (F) În final, reducerea substratului BCIP / NBT a dat precipitate insolubile
pe suprafe•ele nanodisk •i a crescut modificarea semnalului LSPR.
Transmiterea LSPR Spectroscopia printr-un canal Fluidic PDMS. Spectrul de
LSPR Au matrice nanodisk a fost colectată prin utilizarea unei surse de lumină
albă (KL 1500, Carl Zeiss) •i un spectrometru de fibră optică (HR4000,
OceanOptics) printr-un polidimetilsiloxan (PDMS) canal fluidic în modul de
transmisie. Camera PDMS a cărei dimensiune a fost de 2 mm 2 mm 1 mm (lă•ime
lungime înăl•ime) •i a fost turnat pe un poli (metacrilat de metil) (PMMA)
maestru. A 1: 11mixture unui agent de întărire •i monomeri PDMS (Dow Corning,
Michigan, SUA) a fost turnat pe matri•ă •i coaptă într-un cuptor timp de 4 h, după
degazare. Spectrele LSPR au fost măsurate după fiecare proces biochimic pentru
legare •i spălarea ulterioară. Solu•iile de probă au fost livrate cu ajutorul unei
pompe seringi în modul aspirare. Debitul a fost de 5 •i 100 μ L min- 1 pentru legarea
moleculară •i spălare, respectiv. Lungimea de undă de vârf a benzii LSPR a fost
determinată prin aplicarea unei a cincea comandă fit polinomial.
Confirmare. Aceasta cercetare a fost sustinuta de un grant de la Centrul
pentru nanometrică Mecatronica & Manufacturing, unul dintre programele de
cercetare secolul 21 Frontier (08K1401-
00313), un grant de la Centrul de Cercetare Programul convergente prin Fundatia
Nationala de Cercetare Coreea (NRF) (2009-0082335), care sunt sus•inute de
către Ministerul Educa•iei, •tiin•ei •i Tehnologiei, Coreea, precum si un grant de
Cercetare KRIBB Initiative programul (KRIBB, Coreea).
Sprijinirea Informa•ii disponibile: Calcularea extinc•ie teoretice a nanodisk
matrice, compozi•ional analizele precipitatelor •i analizele AFM, etc. Acest material
este disponibil în mod gratuit prin intermediul internet la http://pubs.acs.org.
REFERIN•E •I NOTE
1. Stewart, M .; Anderton, C .; Thompson, L .; Maria, J .; Gray, S .; Rogers, J .;
Nuzzo, R. Nanostructured plasmonice Senzori.
Chem. Rev. 2008, 108, 494 - 521.
2. Haes, A .; Duyne, Studii preliminare R. •i Aplica•ii poten•iale de suprafa•ă
Localizate Plasmon Resonance Spectroscopie în domeniul diagnosticului
medical. Expert Rev. Mol. Diagn. 2004, 4, 527 - 537.
3. Gomez-Găini, A .; Fernandez-Romero, J .; Aguilar-Caballos,
M. nanostructuri Instrumente analitice ca în bioteste. Trends Anal. Chem. 2008,
27, 394 - 406.
4. Haynes, C .; Van Duyne, R. nanosfere Lithography: Un versatil Nanofabrication
instrument pentru Studii de optica nanoparticula Dimensiune dependente. J.
Phys. Chem. B 2001, 105, 5599 - 5611.
VOL. 5 ' NU. 2 ' 897 - 904 ' 2011 903
www.acsnano.org

5. Kelly, K .; Coronado, E .; Zhao, LL; Schatz, GC optice Proprietă•i de metal:
Nanoparticule din fl uen•a de dimensiune, formă, •i dielectrică Mediu. J.
Phys. Chem. B 2003,
107, 668 - 677.
6. Chan, GH; Zhao, J .; Schatz, GC; Duyne, RPV Surface Plasmon Resonance
Localizate Spectroscopie triunghiulara aluminiu Nanoparticles. J. Phys.
Chem. C 2008, 112,
13958 - 13963.
7. Anker, J .; Hall, W .; Lyandres, O .; Shah, N .; Zhao, J .; Van Duyne, R.
Biosensing cu plasmonice Nanosenzorii. Nat. Mater. 2008, 7, 442 - 454.
8. Stewart, ME; Mack, NH; Malyarchuk, V .; Soares, JANT; Lee, T.-W .; Gray, SK;
Nuzzo, RG; Rogers, JA cantitativă Multispectral Biosensing •i 1D Imaging
Folosind Cristale quasi-3D plasmonice. Proc. Natl. Acad. Sci. Statele Unite ale
Americii 2006, 103,
17143 - 17148.
9. Stewart, ME; Yao, J .; Maria, J .; Gray, SK; Rogers, JA; Nuzzo, RG
Multispectral Thin Film Biosensing •i cantitative Imaging Folosind cristale
3D plasmonice. Anal. Chem.
2009, 81, 5980 - 5989.
ARTICOL
25. Faircloth, B .; Röhrs, H .; Tiberio, R .; Ruo ff, R .; Krchnavek, R. bistratificate
nanoimprint litografie. J. Vac. Sci. Technol., B
2000, 18, 1866 - 1873.
26. Draine, BT; Flatau, PJ Discrete-dipole Apropierea pentru Risipindu Calcul. J.
Opt. Soc. A.m. A 1994, 11,
1491 - 1499.
27. Healy, D .; Hayes, C .; Leonard, P .; McKenna, L .; O'Kennedy,
R. biosenzor Evolu•ii: Aplicarea la prostata-Speci Fi c Antigen Detection. Trends
Biotechnol. 2007, 25, 125 -
131.
28. Yonzon, C .; Stuart, D .; Zhang, X .; McFarland, A .; Haynes, C .; VanDuyne,
R. Spre avansată chimice •i biologice Nanosenzorii; O privire de ansamblu. Talanta
2005, 67, 438 - 448.
29. Huang, L .; Reekmans, G .; Saerens, D .; Friedt, J .; Frederix, F .; Francis, L
.; Muyldermans, S .; Campitelli, A .; Copită, C. prostatic Speci Fi c Antigen
Immunosensing Bazat pe monostraturi Asamblate Self-mixte, Camel
Anticorpii •i Aurul coloidal îmbunătă•ită sandvici. Biosens. Bioelectron. 2005,
21, 483 - 490.
30. Besselink, G .; Kooyman, R .; van Os, P .; ENGBERS, G .; Schasfoort, R.

10. Haes, AJ; VanDuyne, RP ANanoscaleOptical biosenzor: Sensibilitatea •i Signal Ampli Fi cation pe plani andGel tip Suprafe•e de senzori în Surface

Selectivitatea unei abordări bazate pe Surface Localizate rezonan•a Plasmon Detectarea Resonance-Based de prostata-Speci Fi c Antigen. Anal.

plasmonică Spectroscopie triunghiulara Silver Nanoparticles. J. Am. Biochem.

Chem. Soc. 2002, 2004, 333, 165 - 173.

124, 10596 - 10604.

11. Haes, A .; Chang, L .; Klein, W .; Van Duyne, R. Detectarea unui biomarker
pentru boala Alzheimer din probe sintetice •i clinice Utilizarea unui
nanometrică optic Biosensor.
J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2264 - 2271.
12. Zheng, Y .; Juluri, B .; Mao, X .; Walker, T .; Huang, T. Investigarea sistematică
a suprafe•ei Localizate Plasmon Resonance Long-Range Comandat Au
Nanodisk Arrays. J. Appl. Phys.
2008, 103, 014308.
13. Lucas, B .; Kim, J .; Chin, C .; Guo, L. nanoimprint litografie abordare bazata
pe pentru fabricarea de suprafete mari, orientate-Uniform plasmonice
Arrays. Adv. Mater. 2008, 20,
1129 - 1134.
14. Marinakos, S .; Chen, S .; Chilkoti, A. plasmodice Detectarea aModel
Analizat în Serumby aGoldNanorod senzor. Anal. Chem. 2007, 79, 5278 - 5283.

15. Lee, S .; Mayer, KM; Hafner, JH îmbunătă•ită a suprafe•ei Localizate

Plasmon Resonance Immunoassay cu aur Bipyramid Substraturi. Anal.
Chem. 2009, 81, 4450 - 4455.
16. Chou, S .; Krauss, P .; Renstom, P. nanoimprint Lithography.
J. Vac. Sci. Technol., B 1996, 14, 4129 - 4133.
17. Zankovych, S .; Ho ff mann, T .; Seekamp, ​J .; Bruch, J .; Torres,
C. nanoimprint Lithography: provocări •i perspective.
Nanotehnologie 2001, 12, 91 - 95.
18. Hu, W .; Wilson, R .; Xu, L .; Han, S .; Wang, S. partitionarea cu densitate mare
Matricile magnetice prin nanoimprint nano punctiforme Lithography. J. Vac. Sci.
Technol., A 2007, 25, 1294 - 1297.
19. Haes, A .; Van Duyne, R. A Uni Fi ed Vezi propage •i
Suprafata Localizate rezonan•a plasmonică Biosenzori. Anal. Bioanal. Chem. 2004,
379, 920 - 930.
20. Shin, Y.-B .; Lee, J.-M .; Park, M.-R .; Kim, M.-G .; Chung, BH; Pyo, H.-B .;
Suprafa•a Maeng, S. Analiza expresiei proteinei recombinant utilizând
Localizate Plasmon Resonance (LSPR). Biosens. Bioelectron. 2007, 22, 2301
- 2307.
21. Kim, H .; Jin, S .; Lee, S .; Kim, M .; Shin, Detectarea Y. Biomolecular
Legarea prin Enhancement Surface Plasmon Resonance Localizate
(LSPR) de aur Nanoparticles. senzori 2009, 9, 2334 - 2344.

22. Frederix, F .; Friedt, J .; Choi, K .; Laureyn, W .; Campitelli, A .; Mondelaers, D

.; Maes, G .; Borghs, G. Biosensing Bazat pe absorb•ie a luminii de aur •i
argint la scară nano particule.
Anal. Chem. 2003, 75, 6894 - 6900.
23. Kim, M .; Shin, Y .; Jung, J .; Ro, H .; Chung, B. Sensibilitatea îmbunătă•ită
a rezonan•a plasmonică de suprafa•ă (SPR) imunocercetări folosind o
reac•ie Peroxidaza catalizată Precipitarea •i aplicarea sa la un microarray
de proteine.
J. Immunol. metode 2005, 297, 125 - 132.
24. Li, Y .; Lee, H .; Porumb, R. Detectarea biomarkerilor proteine ​folosind ARN
Aptamer microarrays •i Ampli enzimatic Fi ed Surface Plasmon Resonance
Imaging. Anal. Chem.
2007, 79, 1082 - 1088.

LEE ET AL. VOL. 5 ' NU. 2 ' 897 - 904 ' 2011 904

www.acsnano.org