Mikroalga C. Protothecoides akan siap panen ketika mamasuki usia 144 jam terhitung dari awal penambahan mikroalga kedalam kultivasi. Pada usia tersebut, sel heterotropik C. Protothecoides yang berada didalam kultivasi erlemenyer flask dan substrat CPH telah mencapai nilai konsenterasi biomassa maksimum sebesar 3,92 g/L (H Xu et al, 2006). Mikroalga c. protothecoides dipanen menggunakan prinsip wet route. Wet route adalah proses panen mikroalga yang diganggu untuk mendapatkan produk intraseluler(Rahul et al, 2018). Kata”diganggu” memmiliki arti bahwa c. protothecoides yang dipanen masih berebentuk bubuk basah dan belum kering sepenuhnya. Proses memanen sel mikroalga dibagi menjadi 2 tahap, yaitu pra- harvesting dan harvesting. Pra-harvesting atau screening adalah tahap pemisahan awal c. protothecoides dengan substrat dengan cara disaring (A.I Barros et al, 2014). Pada tahap ini, sel c. protothecoides disaring menggunakan alat microstrainer dengan bukaan penyaring berukuran 3-30 mikrometer. Setelah melalui tahap penyaringan, c. protothecoides sebagai residu akan diteruskan ketahap harvesting. Harvesting adalah proses inti dari panen mikroalga. Dari proses ini, mikroalga c. protothecoides akan menjadi kering dengan kandungan air yang sangat sedikit. Proses ini juga rentan memengaruhi konten lipid dari mikroalga jika terjadi kerusakan sel c. protothecoides. Untuk menghindari hal tersebut, diperlukan pemilihan metode harvesting yang tepat dengan mempertimbangkan level kelembapan, konsenterai garam, densitas, dan ukuran sel agar tidak ada sel yang rusak selama proses harvesting. Centifugation merupakan metode harvesting terbaik yang memiliki kelebihan proses yang cepat, effisiensi tinggi, dan cocok dengan mayoritas mikroalga (A.I Barros et al, 2014). Selanjutnya, sel-sel c. protothecoides kering berbentuk bubuk dibilas kembali menggunakan air aquades untuk menghilangkan sisa-sisa bahan kimia substrat yang masih menempel. Bubuk c. protothecoides basah inilah yang menjadi bahan baku utama pembuatan biodiesel.
1.3.Ekstraksi Minyak c. protothecoides
Minyak atau asam lemak yang terkandung dalam mikroalga c. protothecoides adalah bahan baku utama dalam pembuatan biodiesel. Minyak ini diekstrak dari sel- sel c. protothecoides berbentuk bubuk basah melalui metode microwave assisted extraction (MAE). MAE adalah metode ekstraksi menggunakan bantuan gelombang microwave untuk mempercepat reaksi selektif melalui pemanasan pelarut secara cepat dan efisien (Jain et al, 2009). Panas radiasi gelombang mikro memanaskan dan menguapkan air sel bahan. Tekanan pada dinding sel meningkat. Akibatnya, sel membengkak (swelling). Tekanan mendorong dinding sel dari dalam, meregangkan, dan memecahkan sel tersebut (Calinescu et al., 2001). Rusaknya matrik bahan mempermudah senyawa target (dalam hal ini minyak) keluar dan terekstraksi (Jain et al., 2009). Keuntungan dari penggunaan metode ini adalah tingginya kuantitas dan kualitas minyak yang dihasilkan serta waktu ekstraksi yang singkat (M. Mubarak et al, ). Ekstraksi minyak mikroalga c. protothecoides berjalan dengan menggunakan pelarut berupa kloroform dan methanol. Larutan pelarut dibuat dengan mencampurkan larutan kloroform dan methanol dengan rasio perbangingan 1:1. Selanjutnya, bubuk basah c. protothecoides di larutkan kedalam pelarut dengan rasio perbandingan pelarut dan bubuk c. protothecoides 40:1. Proses ekstraksi 200 mg bubuk basah c. protothecoides yang dilarutkan dalam 8 mL pelarut dengan pengaturan microwave 254 W selama 4 menit telah dapat mengektraksi 17% dari berat kering lemak (Rahul et al, 2018). Dengan mengubah sedikit pengaturan pada microwave, seperti menaikkan suhu pada 95oC dan waktu ekstraksi selama 30 menit, maka minyak c. protothecoides dapat terekstraksi hingga 77% dari konten minyak total. 1.4.Produksi Biodiesel Minyak mikroalaga yang telah di ekstrak dari sel-sel c. protothecoides selanjutnya akan dirubah menjadi biodiesel dengan reaksi transesterifikasi asam. Minyak mikroalga direaksikan dengan methanol pada suhu 30oC dengan rasio perbandingan molar methanol dengan oil 56:1 (Xu et al, 2006). Reaksi ini berlangsung bantuan asam sulfat sebagai katalis dan pemberi suasana asam. Berat katalis yang disesuaikan dengan berat minyak yang direaksikan dengan perbandingan 1:1 (Xu et al, 2006). Reaksi berlangsung selama 4 jam dan menghasilkan produk berupa asam lemat metil ester (biodiesel) serta menurunkan specific gravity dari 0,912 ke 0,864 (Xu et al ,2006)
Gliserol kemudian akan dipisahkan dari metil ester di separator, sedangkan
metil ester melanjutkan ke proses penghilangan methanol dengan metode ekstraksi cair-cair.
Metil ester yang sudah terekstraksi dari pelarut methanol selanjutnya
dinetralkan dan dicuci menggunakan air dan alkali. Alkali berfungsi untuk menaikkan pH biodiesel agar mencapai pH standar dengan nilai 7. Pencucian dengan air berfungsi untuk menghilangkan katalis, gliserol, dan methanol yang tersisa pada metil ester (Lynn et al, 2006). Setelah itu, air bekas cucian dipisahkan dari metil ester menggunakan corong pisah. Pada tahap terakhir, metil ester di keringkan untuk menghilangkan kandungan air dengan cara dipanaskan pada suhu 100oC selama 5 menit hingga air menguap. Hingga kemudian jadilah biodiesel dengan spesifikasi :