Journal of Pharmaceutical y Biomedical Analysis 55 (2011) 225-229

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Aislamiento y elucidación de la estructura del principal degradante alcalino de Ezetimiba

Anuradha K. Gajjar * , Vishal D. Shah

Departamento de Química Farmacéutica, Instituto de Farmacia, Universidad Nirma, Sarkhej-Gandhinagar Highway, Ahmedabad 382481, Gujarat, India

información del artículo resumen

Historia del artículo: Este trabajo presenta el aislamiento y la caracterización del producto de degradación alcalina (degradante) de ezetimiba. La
Recibido el 14 de marzo de 2010 ezetimiba, un inhibidor selectivo de la absorción intestinal de colesterol, se sometió a la degradación alcalina. Ezetim-OIE se
recibió en forma revisada 21 de de ◦
hizo reaccionar con una solución de hidróxido de sodio metanolico 0,1 M durante 10 min a 80 C para producir un degradante
diciembre de 2010 Aceptado el 24 de
alcalino en una proporción de 90% de la cantidad inicial del fármaco tomado. Este degradante se detectó mediante cromatografía
de diciembre de 2010 Disponible en
líquida de alto rendimiento (HPLC) a un tiempo de retención relativo (RRT) de 1,48 con respecto a la ezetimiba. El método
Internet el 14 de enero de 2011
HPLC implicó una elución isocrática en una Waters Symmetry C8 150 mm ×4,6 mm, 5 m utilizando tampón de acetato amónico
(pH 4,5, 50 mM) - acetonitrilo (50:50, v / v) como fase móvil a una velocidad de flujo de 1,0 ml / min y detección UV a 242
nm. El producto de degradación se aisló por HPLC preparativa. Se encontró la pureza del sólido aislado era más del 99%. La
palabras clave:
1 13
estructura esclarecimiento estructura del producto de degradación alcalina se confirmó mediante LC-MS, H y C RMN y espectroscopía de IR. Sobre la
ezetimiba base de los datos espectrales, la estructura del degradante se confirmó como ácido 5- (4-fluorofenil) -2 - [(amino 4-fluorofenil)
de degradación alcalina - (4-hidroxifenil) metil] de ácido pent-4-enoico. También se propone la ruta para la formación de este producto de degradación.
HPLC preparativa La determinación de las estructuras de los productos de degradación que se generan durante las pruebas de estrés puede ser útil
azetidinona para los esfuerzos de descubrimiento preclínicos.

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1. Introducción 2. Experimental

La ezetimiba (EZE), un inhibidor selectivo de intestinal choles-terol y 2.1. Materiales y reactivos

absorción fitosterol relacionada, se designa como 1- (4-fluorofenil) -3 (R) - [3-
(4-fluorofenil) -3 (S) hidroxipropil] -
4 (S) - (4-hidroxifenil) -2-azetidinona [1,2] (Figura 1(una)). Se evita
selectivamente la absorción de colesterol mediante la unión a la proteína de
transporte (NPC1L1), Situado en la pared del intestino delgado [3,4].
La estabilidad que indica ensayos de EZE en individuales, así como formas
de dosificación com-combinada por HPLC [5-10]; HPTLC[11] y
cromatografía electrocinética micelar [12]ha sido reportado. Análisis de EZE
en presencia de sus productos de degradación alcalinas por HPLC, TLC y
espectrofotometría derivado se informó por Moghazy et al.[13]. La elucidación
estructural de una impureza relacionada con el proceso de EZE por LC-MS /
MS y RMN es descrito por Raman et al. [14].
En este trabajo se elabora alcalino degradación inducida de EZE para
producir un producto de degradación principal que no se informó en la literatura
hasta la fecha. El presente estudio ilustra la Isola-ción y la identificación del
producto de degradación formada durante la degradación alcalina de EZE y
propone la ruta de degradación.
* Autor correspondiente. Tel .: +91 992 514 0156.
Dirección de correo electrónico: anuradha.gajjar@nirmauni.ac.in (AK Gajjar).
0731-7085 / $ - see front matter © 2011 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
doi:10.1016 / j.jpba.2010.12.033
El estándar de referencia de EZE fue regalado por Torrent Centro de
Investigación, Gandhinagar, India, con una pureza del 99,9%. El metanol y el
acetonitrilo (ambos, de calidad HPLC) fueron adquiridos de Spectrochem
(Mumbai, India). Todos los demás reactivos y productos químicos utilizados en
el estudio tenían calidad analítica. El acetato de amonio y ácido clorhidrico
(35%, v / v) se adquirieron de Ranbaxy Fine Chemicals (Nueva Delhi, India),
ácido acético glacial e hidrocarburos de sodio de Merck India Limited
(Mumbai, India) y filtros de jeringa de nylon (0,45 m) de Millex-HN, Millipore
(Mumbai, India). El agua se purificó utilizando el sistema de Millipore
(Millipore Corp., Bangalore, India).
2.2. Sistema cromatográfico (HPLC analítica)
Un cromatografo Shimadzu modelo LC-2010C (Shimadzu Corporation,
Analytical Instruments Division, Kyoto, Japón) con detector automático,
enfriador de muestras y detector de matriz de fotodiodos (PDA) visible a UV
y visible (SPD 10 mA vp), conectado al sistema de procesamiento de datos, fue
empleado software (Clase-VP 6,13 SP2). En el método desarrollado, una
columna Waters Symmetry (Waters Corporation, EE. UU.) C8 (150 mm × 4,6
mm i.d, tamaño de partícula de 5 m) se mantuvo a temperatura ambiente. La
separación de EZE y su degradante alcalino se logró en condiciones isocráticas
usando una fase móvil de tampón de acetato de amonio (pH 4.5; 50 mM) -
acetonitrilo (50:50, v / v).
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Figura 1. Estructura química de (a) EZE y (b) de degradación alcalina.
El pH de la solución tampón se midió utilizando un PHAN, medidor de pH
LABINDIA (Mumbai, India). El detector de UV se ajustó en 242 nm, ya que
tanto EZE y su producto de degradación alcalina mostraron una buena
respuesta a esta longitud de onda. La velocidad de flujo se ajustó a 1,0 ml / min.
El volumen de inyección se estableció como 20 L para las soluciones estándar
y de prueba.
2.3. degradación alcalina de EZE
EZE se hizo reaccionar con una solución de hidróxido de sodio metanólico
0,1 M para producir alrededor de 90% del degradante principal y este
degradante se detectó por HPLC a un tiempo de retención relativo (RRT) de
1.48 (Fig. 2). Se tomaron aproximadamente 0,5 g de sustancia farmacéutica
EZE en un matraz volumétrico estándar de 100 ml. Se añadió solución de
hidróxido de sodio metanólico (50 ml, 0,1 M) y calentó a reflujo a 80 ◦C en una
temperatura en baño de agua constante (matalab, India) durante 10 min. La
solución se enfrió a temperatura ambiente y se neutralizó con solución de ácido
clorhídrico metanólico 1 M. La solución se cargó en una HPLC preparativa y
se aisló el degradante alcalino presente en RRT de 1,48.
2.4. HPLC preparativa
Se usó el sistema HPLC preparativo Waters (Delta Prep) 4000 (Waters
Cor-poración, Milford, MA, EE.UU.) con una unidad de alta presión de 4000
psi equipado con colector de fracciones. Fue operado a través del software
Empower. La columna preparativa Symmetry (Waters) C18 (100 mm × 30 mm
i.d.) rellena con un tamaño de partícula de 8 m se empleó para la separación y
el aislamiento del degradante. La fase móvil consistió en un tampón de acetato
de amonio (pH 4,5; 50 mM) – acetonitrilo
Figura 2. Cromatograma que representa la separación de EZE y de degradación alcalina.
(50:50, v / v). La velocidad de flujo se mantuvo a 30 mL / min y detección
UV a 242 nm.
2.5. El aislamiento de degradante (producto de degradación) mediante HPLC
preparativa
La solución de la degradación alcalina metanólica de EZE se concentró en
un rotavapor Buchi R-124 (Buchi Labortechnik, Suiza) y se cargó en la columna
preparativa usando condiciones mencionadas en la Sección 2.4. Las fracciones
aisladas se recogieron y se analizaron por HPLC usando condiciones de análisis
mencionados en Sección2.2. Las fracciones aisladas que tenían una pureza
mayor que 99,0% se agruparon y luego se evaporó el metanol mediante
rotavapor con un baño de agua B-490 para obtener la impureza sólida. El sólido
obtenido se secó luego con un liofilizador (Virtis Advantage, EE.UU.).
2.6. Espectrometría de masas
Los espectros de masas de EZE y su degradante alcalino se registraron en
API 2000 espectrómetro Perkin Elmer Sciex-masa (Perkin Elmer,
Beaconsfield, Reino Unido) equipado con una interfaz de tur-boionspray en 375
◦
C. La detección de iones se realizó en ionización por electrospray, modo de
ion positivo. la adquisición y procesamiento de datos se realizaron utilizando el
software MassLynx (versión 4).
2.7. espectrometría de RMN
los 1H RMN y 13experimentos C NMR se realizaron en AVANCE DPX
400 Bruker RMN espectrofotómetro (Fallanden, Suiza). Se utilizó DMSO-d6
como disolvente y tetrametilsilano como estándar interno.
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Fig. 3. fragmentación de masa de producto de degradación alcalina de EZE.

2.8. espectrometría de FT-IR
Los espectros de IR de EZE y su producto de degradación alcalina se
registraron en estado sólido como la dispersión de KBr usando el
espectrofotómetro Bruker (TENSOR 27) FT-IR (Ettlingen, Alemania).
3. Resultados y discusión
3.1. Aislamiento del mayor degradante alcalino de EZE
EZE se sometió a la degradación alcalina como se ha discutido en la Sec-
ción 2.3 para generar 90% del degradante principal, que se detectó a un tiempo
de retención relativo (RRT) de 1,48 con respecto a EZE (Figura 2). Esta
solución degradada se sometió a cromatografía preparativa (Sección2.4) Para
permitir el aislamiento del producto de degradación. La pureza de este sólido
se determinó a más de 99%. A continuación, el producto de degradación se
caracterizó por técnicas espectroscópicas como la RMN (1H y
13
C) y FT-IR mientras que el peso molecular se determinó por espectrometría
de masas.
3.2. Elucidación de la estructura de producto de degradación alcalina de EZE
Como en su degradante alcalino. La presencia de grupo -NH en el degradante
fue confirmado de nuevo por la señal en I = 9,31 ppm en espectro de 1H RMN
del degradante que no se observó en EZE. En la especificación de 13C RMN
de degradante, la señal en 167,37 ppm correspondiente a C O (amida) en EZE
estaba ausente y una nueva señal apareció con desplazamiento campo abajo en
174,41 ppm indica la presencia de C O (ácido carboxílico). La señal en 71.25
ppm de EZE se desplazó campo arriba a 52,99 ppm en el espectro del
degradante confirmando la pérdida de -OH en C7 y la formación de un doble
enlace entre C6 y C7. Las asignaciones espectrales de 1H RMN y
13
C RMN de EZE y su principal producto de degradación alcalina se presentan en
Tabla 2. La estructura del producto de degradación se aclara como 5- (4-fluorofenil)
-2 - [(-fluorofenilamino 4) - (fenil 4-hidroxi) metil] pent-4-enoico (Figura 1(b)).
3.3. vía propuesta de degradación alcalina
La vía de degradación de EZE en condiciones alcalinas es propuesta por la
ruta, que se muestra en la Fig. 4. El anillo de azetidinona de cuatro miembros
de EZE es un sistema altamente tensado y el anillo se rompe en la hidrólisis
alcalina para proporcionar el producto intermedio y calentamiento simultáneo
de este intermedio conduce a la formación de degradante, con la pérdida de una
molécula de agua.

El espectro de masas de la ionización por electropulverización (ESI) del

producto de degradación exhibió un pico de ion molecular a m / z de 410 [M +
H]+ y un ión en 432 [M + Na]+ que soporta un peso molecular de 409 para el
producto de degradación de EZE, que fu igual a la de EZE (pico de ion tabla 1
molecular a m / z de 410 [M + H]+). El espectro de masas del producto de detalles espectrales de los espectros de FT-IR de EZE y de degradación alcalina.

degradación muestra un ion a m / z de 392 amu correspondiente a la pérdida de

No Señor. asignaciones de picos (dispersión KBr) Pico observado en (cm-1 )
H2O del [M + H]+de iones y un ion a m / z de 299 amu correspondiente a la EZE degradante
pérdida de grupo 4-fluoroanilina. Raman et al.[14]han demostrado espectro de
masas y el patrón de fragmentación para EZE. El patrón de fragmentación de 1 -OH (fenólico) tramo 3256 (ancho) 3268 (ancho)
2 tramo de ácido carboxílico O-H - 2847
degradante alcalina importante se muestra en laFig. 3.
3 tramo C-H en el anillo aromático 2962 2976
4 Alifáticos C-H estiramiento 2914 2931
En el espectro IR del producto de degradación, la frecuencia de absorción 5 20 amina -NH tramo - 3310
característica a 3310 cm-1confirma la presencia de amina secundaria d
6 o O estiramiento 1717 (amida) 1778 (ácido)
(estiramiento -NH), que no se observa en el espectro IR de EZE que confirma d
la rotura del anillo de la lactama a la amina secundaria y el ácido carboxílico 7 o C se extiende en el anillo aromático 1511 1510
mediante hidrólisis alcalina. La asignación de picos significativos de los 8 -OH flexión 1356 1364
9 C-O estiramiento 1220 1214
espectros IR tanto de la EZE como del producto de degradación se muestran
10 C-N estiramiento 1068 1108
en latabla 1. 11 C-H de flexión en anillo aromático 828 844
12 C-H de flexión en alcano 1403 1408
Durante los estudios de RMN, se observaron 21 hidrógenos y 24 átomos de 13 N-H de flexión - 1546
carbono de los espectros de RMN 1H RMN y 13C respectivamente, tanto EZE
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Tabla 2
13 C y 1 H RMN asignaciones espectrales de EZE y de degradación alcalina.

13 1
No Señor. C RMN H RMN
Desplazamiento químico Desplazamiento químico (ppm) /
asignaciones (ppm) asignaciones multiplicidad

EZE degradante EZE degradante

1 C-2 167.37 174.42 OH (1H) - on 9,50 (s) 9,79 (s)
do18
2 C-12 158.67 164.63 NH (1H) - 9,31 (s)
3 C-24 157,45 161,91 H- 7,05-7,32 (m) 7,04-7,44 (m)
22,23,25,26,10,11,
13,14,16,20
(10H)
4 C-18 155.67 158,43 H-17,19 (2H) 6,72-6,76 (d) 6,65-6,67 (d)
5 C-15 142.09 140.427 H-4 (1H) 5,25 (m) 4,60 (m)
6 C-9 134,04 135,61 OH (1H) - on C7 4,77-4,78 (d) -
7 C-21 127,94 133,12 OH (1H) - on C2 - 4,64 (s)
8 C-10,14 127,62 129,52 H-7 (1H) 4,47-4,49 (m) 2,087-2,116 (d)
9 C-16,20 127,52 128.95, 128.89 H-3 (1H) 3.7 a 3.24 (m) 2,64-2,71 (m)
10 C-22,26 118.37, 118.22 123.79, 123.73 H-5,6 (4H) 1,72 (m) -
11 C-11,13,17,19,23,25 114,46-115,99 115,90-116,33 H-5 (2H) - 1,96-2,02 (m)
12 C-7 71.25 52.99 H-6 (1H) - 1,48-1,59 (m)
13 C-4 59.85 83.34
14 C-3 59,59 80.78
15 C-6 36.48 34.20
diecis
éis C-5 24.66 29.40
Consulte fórmula estructural para la numeración (Figura 1una de EZE y Figura 1b para degradante); s, singlete; d, doblete; m, múltiple.

Fig. 4. vía propuesta para la degradación alcalina de EZE.

4. Conclusiones estudios de espectroscopía de masas y se elucidó como 5- (4-fluorofenil) -2 -

[(4-fluoro-fenilamino) - (4-hidroxifenil) metil] pent-4-enoico. También se
La determinación de las estructuras de los productos de degradación que propone la vía de degradación alcalina de EZE.
surjan en el curso de las pruebas de estrés puede ser útil para los esfuerzos de
descubrimiento preclínicos durante durante las investigaciones de relación
estructura-actividad. EZE sufre degradación en condiciones alcalinas, que se Reconocimiento
detectó mediante HPLC y se consiguió el aislamiento de producto de
degradación alcalina se logró mediante cromatografía preparativa. La Los autores agradecen al Centro de Investigación de Torrent, Gandhina-gar,
estructura de este producto de degradación se caracterizó por IR, RMN (1H y la India, para proporcionar una muestra gratuita de Eze.
13
C) y
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