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Enterocytozoon Hepatopenaei (EHP)

El Enterocytozon; es un microsporidio; y fueron identificados inicialmente como protozoos.


Actualmente se encuentran clasificados como hongos, con alrededor 1,200 especies conocidas,
aunque solo 15 de ellas se reconocen como patógenas para el humano.

Durante los últimos 150 años han sido conocidos por su impacto patógeno en los insectos de
importancia comercial (entre ellos abejas, gusanos de seda), animales de granja y mascotas (peces
de ornato), pero las infecciones en humanos eran prácticamente desconocidas antes de la epidemia
de HIV/SIDA, cuando se identificó a Enterocytozoon bieneusi como principal agente causal de
cuadros diarreicos en pacientes con cuentas linfocitarias CD4+ bajas. (Choudhary et al. 2011). En los
últimos 25 años han cobrado relevancia en seres humanos, sobre todo en personas con alteraciones
inmunológicas, aunque se desconoce gran parte de la biología, epidemiología, especificidad por
hospederos y mecanismos de transmisión.

Tratamiento.
Microsporidiosis intestinal. Diversos fármacos han sido probados con resultados variables:
albendazol, un inhibidor del ensamblaje microtubular, es muy efectivo contra Encephalitozoon
intestinalis pero no suele ser tan contundente contra Enterocytozoon bieneusi. Ambas especies
responden al tratamiento con fumagilina y con su análogo TNP 470.
Microsporidiosis ocular. Isotionato de propamidina 0.1% tópica o itraconazol sistémico pueden ser
utilizados en casos de queratoconjuntivitis. Han sido usadas combinaciones de neomicina,
polimixina B, bacitracina y fumagilina (antibiótico insoluble secretado por Aspergillus fumigatus) vía
tópica. Deberán ser utilizados conjuntamente esteroides tópicos y en algunos casos es necesaria la
queratoplastia.
Pacientes VIH+ con SIDA. El tratamiento anti-retroviral altamente activo (HAART) especialmente con
inhibidores de proteasa posee efecto inhibidor de los microtúbulos en Enterocytozoon. El apego al
mismo es fundamental para el control de la enfermedad y la disminución de la incidencia.
Los estudios terapéuticos recientes se han enfocado en desarrollar fármacos que tengan como
blancos a los componentes de los microsporidios como, poliaminas (análogos de poliamina),
metionina aminopeptidasa 2 (fumagilina y derivados), quitina (nicomicina) y topoisomerasas
(fluoroquinolonas).

Prevención.
El manejo adecuado de los fluidos corporales (excretas y secreciones) del paciente junto con las
medidas higiénicas básicas y la desinfección con cloro u ozono del agua son indispensables para
evitar la propagación de la enfermedad.

¿Qué es EHP?

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP, por sus siglas en inglés) es un Microsporidio y


Los microsporidios (Microsporidia) son un conjunto de microorganismos parásitos intracelulares
de animales. Hay descritas unas 800 especies.
Han sido clasificados como protozoos, como protistas y también como hongos. En realidad son un
grupo basal de hongos parásitos obligados que descienden de organismos unicelulares similares a
las rozelas, que en el proceso evolutivo de su adaptación a la vida parasitaria, han perdido
las mitocondrias.

Este parásito microsporidiano se caracterizó por primera vez y recibió el nombre del camarón tigre
negro o gigante Penaeus monodon de Tailandia en 2009 (Tourtip et al. 2009. J. Invertebr. Pathol.
102: 21-29).

Se descubrió en camarones de crecimiento lento, pero no se asoció estadísticamente con un


crecimiento lento en ese momento.

EHP se limita al hepatopáncreas (HP) del camarón y se asemeja morfológicamente a un


microsporidista sin nombre que se informó anteriormente en el HP de Penaeus japonicas de
Australia en 2001.

Juntos, estos estudios sugieren que el EHP no es un patógeno exótico sino que es endémico de
Australasia. Más tarde, se descubrió que EHP también podía infectar exóticos Penaeus vannamei
importados para el cultivo en Asia y que podría transmitirse directamente de camarón a camarón
por vía oral (Tangprasittipap et al. 2013. BMC Vet Res. 9: 139).

Esto difería del microsporidiano más común reportado previamente en el camarón de algodón,
donde la transmisión requería un hospedador intermedio de peces, lo que permitía interrumpir la
transmisión por exclusión de peces del sistema de producción.

¿Por qué es importante EHP?

Si bien EHP no parece causar mortalidad, la información de los productores de camarón indica que
está asociada con un retraso grave del crecimiento en P. vannamei. Por lo tanto, comenzamos a
advertir a los agricultores y criaderos asiáticos después de 2009 para que monitoreen P. vannamei
y P. monodon para EHP en reproductores y post larvas (PL).

Sin embargo, las advertencias no fueron atendidas debido al enfoque abrumador sobre el síndrome
de mortalidad temprana (EMS) o la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND).

Los científicos temían que la falta de interés en EHP llevaría a su acumulación en los sistemas de
producción y que su propagación quedaría enmascarada por EMS / AHPND porque mata a los
camarones antes de que los efectos negativos de EHP en el crecimiento sean evidentes. También
temían que la solución del problema EMS / AHPND probablemente condujera a problemas
generalizados exitosos con un crecimiento lento. De hecho, esto parece haber ocurrido en el último
año o así.

Los científicos ahora tienen información que indica que los brotes de EHP están ocurriendo
ampliamente en China, Indonesia, Malasia, Vietnam y Tailandia. Muy recientemente, también han
recibido muestras PCR-positivas para EHP de camarón de crecimiento lento en la India. Por lo tanto,
EHP es un problema emergente que se encuentra bajo una necesidad urgente de control.

Cómo controlar la propagación internacional de EHP


Un método de detección de PCR anidado y un método LAMP están disponibles para verificar las
heces de reproductores y para verificar la presencia de EHP en todo el PL (Tangprasittipap et al.
2013. BMC Vet Res. 9: 139; Suebsing et al. 2013. J Appl Microbiol 114: 1254-1263).

El patógeno también puede detectarse mediante microscopía de luz utilizando un objetivo 100
veces mayor con secciones de tejido HP teñidas o frotis HP, pero esto se basa en encontrar las
esporas características que son extremadamente pequeñas (menos de una micra de longitud) y
algunas veces se producen solo en Pequeños números, incluso en especímenes muy infectados. Por
lo tanto, se prefiere el método de detección por PCR.

Los científicos tienen datos que indican que la mayoría de las existencias de SPF de P. vannamei
importadas a Tailandia son negativas para EHP, pero que a menudo se contaminan en las
instalaciones de crianza de los receptores y en los criaderos debido a la baja bioseguridad.

Una falla grave en la bioseguridad es la práctica generalizada de usar animales vivos (p. Ej.,
Poliquetos, almejas, etc.) de fuentes locales o como importación para alimentar camarones
reproductores, a pesar de nuestras constantes advertencias en contra de la práctica.

Los científicos tienen datos firmes de que algunos poliquetos vivos de fuentes locales e importadas
en Asia pueden dar resultados positivos en las pruebas de PCR tanto para la bacteria AHPND como
para la EHP. Sin embargo, también existe la posibilidad de que algunas acciones importadas de P.
vannamei etiquetadas como SPF también sean positivas para EHP, ya que no está en la lista de la
OIE que utilizan muchos proveedores de SPF o agencias de cuarentena responsables de confirmar
el estado de SPF.

Este problema podría solucionarse agregando EHP a la lista SPF de proveedores y agencias de
cuarentena. Las heces de los reproductores se pueden analizar para detectar la presencia de EHP
mediante PCR anidada.

El mejor enfoque para las instalaciones de maduración y criadero para evitar el EHP es nunca utilizar
animales vivos (por ejemplo, poliquetos vivos, almejas, ostras, etc.) como alimento para
reproductores. Si se ignora este consejo, como mínimo, dichos alimentos deben congelarse antes
de su uso, ya que esto al menos mataría a las bacterias AHPND y EHP.

Mejor sería la pasteurización (calentamiento a 70 ° C durante 10 minutos), ya que también mataría


a los principales virus del camarón (que la congelación no lo haría). Otra alternativa sería utilizar la
irradiación gamma con alimentos congelados.

Cómo controlar EHP en criaderos.

Las bacterias EHP y AHPND se han encontrado en reproductores de China, Vietnam y


Tailandia. Ambos también se han reportado en muestras de poliquetos vivos utilizados para
alimentar camarones de reproductores. Se puede sospechar de EHP si las larvas de postventa de
cualquier criadero crecen más lentamente de lo que se esperaría.

Por lo tanto, el primer problema es garantizar que las instalaciones de maduración de los
reproductores y las instalaciones de incubación estén LIMPIAS. Para lograr este objetivo, todos los
camarones deben retirarse del criadero y se deben lavar, luego se limpian con una solución de
hidróxido de sodio al 2,5% (25 g de NaOH / L de agua fresca) y la solución se deja y se lava después
de tres horas de contacto. .

Este tratamiento debe incluir todos los equipos, filtros, depósitos y tuberías. Después del lavado
para eliminar el NaOH, el criadero debe secarse durante siete días. Luego debe enjuagarse con cloro
acidificado (200 ppm de solución de cloro a pH <4. 5 = "" p = "">.

El siguiente tema es la reproducción de los reproductores. Como se indicó anteriormente, algunos


reproductores de camarón SPF dieron resultados positivos de la prueba de PCR para EHP pero
ninguno para las bacterias AHPND. Por lo tanto, los supuestos reproductores de SPF también deben
ser revisados para EHP mientras están en cuarentena y antes de ser admitidos en una instalación de
crianza y cría limpia.

El trabajo científico en Tailandia reveló que los reproductores criados localmente en estanques
derivados de las existencias de SPF importadas inicialmente libres de EHP mostraron niveles muy
altos de prevalencia para la infección por EHP. Como se indicó anteriormente, las heces de los
reproductores pueden verificarse para EHP mediante PCR anidada utilizando extractos de ADN de
las heces como plantilla. La confirmación se debe realizar en el tejido HP una vez que la utilidad de
los reproductores haya expirado.

Cómo controlar EHP en granjas

Para los agricultores, hay dos cuestiones principales con las que lidiar. El primer problema es
asegurarse de que el PL utilizado para almacenar estanques no esté infectado con EHP. Esto se
puede hacer más fácilmente mediante pruebas de PCR. Si ya se ha extraído ADN de la PL para
verificar la presencia de bacterias AHPND mediante PCR, se puede usar una porción del mismo
extracto de ADN para analizar el EHP. Un agricultor no debe usar lotes de PL positivos para ninguno
de estos patógenos para almacenar estanques.

El segundo tema para el agricultor se refiere a la preparación adecuada de los estanques entre ciclos
de cultivo, especialmente cuando un estanque de cultivo ha sido afectado previamente por EHP. Las
esporas de EHP tienen paredes gruesas y no son fáciles de desactivar. Incluso los niveles altos de
cloro por sí solos no son efectivos. Además, los posibles portadores ambientales son actualmente
desconocidos. Ambos pueden permanecer en un estanque después de la cosecha y es importante
que ambos estén inactivados antes del próximo ciclo de cultivo.

Para desinfectar los estanques de tierra de las esporas de EHP, aplique CaO (cal viva, cal quemada,
cal apagada o cal) a 6 ton / ha. Arar el CaO en el sedimento seco del estanque (10-12 cm) y luego
humedecer el sedimento para activar la cal. Luego dejar reposar durante una semana antes de secar
o rellenar. Después de la aplicación de CaO, el pH del suelo debe aumentar a 12 o más durante un
par de días y luego volver a caer en el rango normal, ya que absorbe dióxido de carbono y se
convierte en CaCO3.

Una advertencia especial para México.

Hay rumores de que los brotes de AHPND en México se originaron a partir de reproductores
contaminados de P. vannamei importados ilegalmente a México desde Asia para la producción de
PL hasta estanques de cría de ganado. Si estos rumores son ciertos, dada la alta prevalencia de EHP
en Asia, es muy probable que el camarón importado también se haya infectado con EHP.

Por lo tanto, es urgente que las autoridades mexicanas de cuarentena verifiquen sus muestras de
ADN actuales y archivadas utilizadas para monitorear la presencia de bacterias AHPND mediante
PCR para verificar también la presencia de ADN diana de EHP mediante PCR. Si lo encuentran,
apoyaría la hipótesis de que las bacterias AHPND se importaron de Asia.

También es posible que las medidas preventivas oportunas o la vigilancia continua de las
poblaciones de camarones vivos importados puedan impedir la infortunada introducción y el
establecimiento de lo que probablemente sea un parásito exótico para México y el resto de las
Américas.

Aparición de Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) en Penaeus (Litopenaeus)


vannamei cultivado en la India

Reflejos:
• Enterocytozoon hepatopenaei se identificó y caracterizó a partir de Penaeus
vannamei cultivado en la India por primera vez.
• El parásito se aisló de animales con crecimiento retardado y síndrome fecal blanco (FSM).
• La principal patología fue la necrosis grave del tejido hepatopancreático.
• La prevalencia global de EHP estimada por el análisis de PCR anidado fue del 63,5%.
• Alta prevalencia (96.4%) de infección detectada en camarones afectados con WFS.
• La secuencia del gen ssu rRNA mostró un 100% de identidad con el EHP reportado en Vietnam,
Tailandia y China.

Resumen:
Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), un parásito microsporidiano, se ha convertido en un patógeno
grave que, según se informa, está asociado con un crecimiento retardado en el camarón cultivado
en muchos de los países productores de camarón en Asia. Como parte de la vigilancia de la
enfermedad en curso entre los camarones cultivados, hemos investigado Penaeus (Litopenaeus)
vannamei cultivada en la costa sureste de la India para la infección por EHP mediante microscopía
electrónica de luz y de barrido, histopatología, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y in situ
hibridación. La preparación de aplastamiento de hepatopáncreas y cadenas fecales blancas mostró
un gran número de esporas de microsporidios. Las esporas al microscopio electrónico de barrido
aparecieron ovales y medían 1.7 × 1.0 μm. La histología de animales infectados mostró una
degeneración severa de los túbulos hepatopancreáticos. Se encontraron inclusiones basófilas que
se asemejan a las etapas de desarrollo de EHP en las células epiteliales y se observó un gran número
de agregaciones de esporas en la luz tubular. En algunos casos, también se observó agrandamiento
de los senos hemales y encapsulación de los túbulos hepatopancreáticos. El ADN extraído de
hepatopáncreas se sometió a amplificación por PCR utilizando cebadores dirigidos al gen ssu rRNA
de microsporidian. La PCR produjo un producto esperado de ~ 951 pb y las secuencias mostraron
una identidad del 100% con el EHP reportado en Vietnam, Tailandia y China. Se realizó un examen
adicional de las muestras de campo utilizando PCR anidada empleando cebadores específicos de
EHP. De los 137 juveniles de P. vannamei.las muestras analizadas, 10 resultaron positivas en el
primer paso y 77 en la PCR anidada. La prevalencia general de EHP se estimó en 63.5%. Sin embargo,
solo las muestras positivas para PCR de primer paso mostraron un número discernible de esporas
en el hepatopáncreas bajo un microscopio óptico. Se encontró que las postlarvas de P.
vannamei recolectadas en un criadero eran PCR negativas para EHP. En el lugarla hibridación
utilizando una sonda marcada con DIG específica para EHP mostró señales positivas en tejido
hepatopancreático infectado. Los animales recolectados en el estanque afectado por el síndrome
de las heces blancas (WFS) mostraron una mayor prevalencia de HAP (96.4%) en comparación con
los del estanque no afectado (39.7%). Por el contrario, los animales de crecimiento lento mostraron
una baja prevalencia (58.5%) en comparación con los animales que normalmente crecen
(80.8%). Aunque se pudo detectar EHP en animales de crecimiento lento y en animales afectados
por WFS, el presente estudio no pudo dilucidar de manera concluyente la asociación de EHP con
estos signos clínicos mediante ensayos de infección experimentales. Este informe constituye el
primer registro de la aparición de la infección por EHP en SPF P. vannamei cultivado en la India.

Declaración de relevancia:

E. hepatopenaei (EHP), un parásito microsporidiano, es un patógeno emergente que tiene graves


consecuencias económicas para el camarón cultivado en Asia. Este informe constituye el primer
registro de la aparición del parásito en P. vannamei cultivado en la India y presenta una descripción
completa del patógeno y su impacto en el huésped.

Abreviaturas

EHP: Enterocytozoon hepatopenaei

WFS: síndrome de heces blancas

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

ISH: hibridación in situ

HP : hepatopáncreas

Palabras clave

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

Penaeus (Litopenaeus) vannamei

Enfermedad emergente

Enfermedad del camarón

Crecimiento lento

Síndrome de las heces blancas (WFS)


El microsporidio Enterocytozoon hepatopenaei no es la causa del síndrome
de las heces blancas en el camarón blanco Penaeus ( Litopenaeus) vannamei
Resumen

Fondo

El microsporidio Enterocytozoon hepatopenaei se describió por primera vez en Tailandia en 2009 en


el camarón tigre gigante indígena Penaeus (Penaeus) monodon . El reservorio natural para el
parásito es aún desconocido. Más recientemente, se encontró un microsporídico que se parecía
mucho a él en morfología y preferencia de tejido en el exótico camarón blanco Penaeus
(Litopenaeus) vannamei cultivado en Tailandia que presenta el síndrome del excremento blanco
(WFS). Nuestro objetivo fue comparar el patógeno recientemente encontrado con E.
hepatopenaei y determinar su relación causal con WFS.

Resultados

Los cebadores genéricos utilizados para amplificar un fragmento del gen del ARN ribosómico de la
subunidad pequeña (ssu rRNA) para la clonación y la secuenciación revelaron que el nuevo parásito
de los estanques WFS tenía una identidad de secuencia del 99% con la de E. hepatopenaei , lo que
sugiere que era específico. El análisis histológico normal con cortes de tejido teñidos con
hematoxilina y eosina (H&E) reveló que relativamente pocas células epiteliales de túbulos exhibían
esporas, lo que sugiere que las infecciones eran leves. Sin embargo, los resultados de H&E fueron
engañosos ya que la PCR anidada y el análisis de hibridación in situ basado en el fragmento del gen
ARNr ssu clonado revelaron infecciones muy fuertes en células epiteliales de túbulos en la región
central del hepatopáncreas en ausencia de esporas. A pesar de estos resultados, alta prevalencia
de E. hepatopenaei.en los camarones de estanques que no exhibieron WFS y un estanque que se
había recuperado de WFS no indicó una asociación causal directa entre estas infecciones y WFS. Esto
fue apoyado por ensayos de prueba orales de laboratorio que revelaron transmisión horizontal
directa a camarones no infectados pero no hay signos de WFS.

Conclusiones

El microsporidio recién encontrado en P. vannamei es conspecífico con E. hepatopenaei descrito


anteriormente y no está asociado de manera causal con WFS. Sin embargo, la gravedad engañosa
de las infecciones (mucho mayor que la reportada previamente en P. monodon ) sin duda tendría
un efecto negativo en el crecimiento y la eficiencia de la producción de camarón blanco y esto podría
verse agravado por la posibilidad de transmisión horizontal revelada por pruebas de laboratorio. Por
lo tanto, se recomienda que los métodos de PCR e hibridación in situ desarrollados aquí se usen
para identificar las especies de reservorio natural para que puedan eliminarse del sistema de cría de
camarón.

Fondo

Varios microsporidianos han sido reportados como patógenos de camarones peneidos [ 1 ]. De


estas, se ha informado que dos especies infectan los camarones cultivados en Tailandia. Una de ellas
es una especie de Agmasoma llamada Thelohania que infecta el tejido muscular y el tejido
conjuntivo en el camarón tigre gigante Penaeus (Penaeus) monodon y el langostino Penaeus
(Feneropenaeus) merguiensis [ 2 - 4 ]. Se parece morfológicamente al microsporidiano Agmasoma
penaei que infectó a Penaeus (Litopenaeus) setiferus y Penaeus (Farfantepenaeus) duorarum [ 1 ,5 ]
en las Américas. Más recientemente, en Tailandia se ha informado que también infecta los mismos
tejidos en Penaeus (Litopenaeus) vannamei [ 6 - 8 ]. También se han descrito esporas de un
microspridiano no identificado en los músculos de P. monodon de Madagascar [ 9 ].

El otro microsporidio reportado en Tailandia fue una especie descrita


recientemente Enterocytozoon hepatopenaei [ 10 ] restringida a células epiteliales de túbulos del
hepatopáncreas de P. monodon . En 2010, también se informó sobre E. hepatopenaei de P.
monodon con síndrome de heces blancas (WFS) en Vietnam [ 11 ]. Aquí mostramos infecciones
generalizadas de un microsporidiano con E. hepatopenaei que se encontró en el exótico camarón
blanco P. vannamei , cultivado en Tailandia .exhibiendo WFS. Además, se describe un protocolo de
detección de PCR anidado junto con su uso en el examen de camarón blanco de estanques de cultivo
y de pruebas de provocación oral utilizando tejido hepatopancreático de camarón con infecciones
por microsporidios.

Resultados

Análisis de fragmentos de genes de ARN ribosomal de subunidades pequeñas

Cuando se utilizaron los cebadores MF diseñados a partir de las secuencias de ARNr de ssu de
la especie Enterocytozoon [ 12 ] con extractos de ADN hepatopancreático de plantilla de P.
vannamei infectados con el microsporidian, se obtuvo un amplicón de 951 pb (archivo
adicional 1 ). Esto estuvo dentro del rango del tamaño esperado de aproximadamente 900-1000 pb,
basado en las regiones conservadas de las secuencias de ARNr de Enterocytozoon ssu enumeradas
en GenBank ( FJ496356 ) y el amplicón anterior de 886 pb obtenido de P. monodon infectado
con Enterocytozoon hepatopenaei [ 12]. La clonación y la secuenciación de 3 clones revelaron
secuencias idénticas al 100% para 2 clones y solo 2 nucleótidos variables para un tercer clon. Se
concluyó una secuencia de consenso a partir de los dos clones idénticos y una parte de 913 pb de la
secuencia de amplicón (excluyendo las secuencias de cebadores, número de acceso de
Genbank KF362130 ) se sometió a una búsqueda general de BLASTN que produjo resultados solo
para los registros de secuencias de microsporidios. Los principales resultados de la búsqueda de
BLASTN incluyeron Enterocytozoon aislado de P. monodon (GenBank FJ496356 ) a 96% de
identidad, Nucleospora salmonis (GenBank U10883 ) a 89% de identidad y E.
bieneusi (GenBank: AY257180) al 89% de identidad. Los cebadores MF1 y MR1 también se usaron
para amplificar la diana del gen ssu rRNA a partir del material archivado de P.
monodon infectado utilizado en un trabajo publicado previamente [ 12 ] que dio lugar al
registro FB496356 de GenBank . Se estableció una secuencia de consenso a partir de 3 clones
también de 913 pb cada uno y se denominó Pm-Entero (número de acceso de
Genbank KF362129 ). La alineación clustal de nuestra secuencia de 913 pb de P. vannamei con
nuestra secuencia de 913 pb de P. monodon reveló una identidad del 99%, lo que indica que las
infecciones surgieron de la misma especie de microsporidian (Figura 1 ).

PCR y detección de hibridación in situ del microsporidian en P. vannamei

Con una muestra de campo preliminar de 11 camarones tomados de un estanque WFS y 10 de un


estanque normal cercano, las pruebas de PCR que utilizan cebadores específicos para E.
hepatopenaei (Tabla 1 ) revelaron que 10/11 camarones del estanque WFS fueron positivos,
mientras que los 10 de el estanque normal fue negativo (tabla 2 ). Sin embargo, un conjunto
posterior de muestras (Tabla 3 ) dio resultados menos claros, ya que algunos estanques sin signos
de WFS dieron una alta prevalencia (9/10 de camarón) positiva para E. hepatopenaei por PCR
(aunque en su mayoría para la etapa anidada ), mientras que otros estanques con signos manifiestos
de WFS dieron una baja prevalencia de camarones con PCR positiva (4/10). Además, un estanque
recuperado sin signos de WFS (Tabla 4) tuvieron una alta prevalencia de camarones (8/9) con
infecciones extensas según lo determinado por la hibridación in situ. Esto constituyó una
correlación deficiente entre los signos generales de WFS y la gravedad de la infección por E.
hepatopenaei .

Histopatología e hibridación in situ de infecciones en P. vannamei

Como se informó anteriormente sobre las infecciones por E. hepatopenaei en P. monodon , el


número de células hepatopancreáticas que mostraban formación de esporas en P.
vannamei (Figura 2 ) era pequeño, lo que daba una impresión superficial de que la extensión de las
infecciones era muy limitada. El tamaño de las esporas (aproximadamente 1 μm de longitud y
menos de 1 μm de ancho) y la localización citoplásmica también fueron similares a las descritas
anteriormente para E. hepatopenaei en P. monodon . Sin embargo, las diferencias en P.
vannamei incluyeron la formación de esporas exclusivamente en células B (Figura 2) y la infección
extensa de las células epiteliales del túbulo medial y proximal del hepatopáncreas en ausencia de
esporas, como lo revela la hibridación in situ (Figura 3 ). Esta no fue la situación de informes
anteriores sobre E. hepatopenaei en P. monodon , donde relativamente pocas células produjeron
esporas o mostraron plasmodios reconocibles, y solo esas células fueron positivas
por hibridación in situ [ 12 , 13 ]. Las células que dan reacciones de hibridación in situ positivas en P.
vannamei.estaban restringidos a la región central de la HP y no se extendían a la región distal
compuesta por células E. En la zona de transición entre las células medial y distal, las reacciones de
hibridación in situ positivas precisassugirieron que las etapas tempranas de la infección ocurrieron
cuando las células HP se diferenciaron de las células E en las células B, F y R. Los portaobjetos de
control negativo que usan la sonda GFP-DIG no dieron reacciones de hibridación in situ positivas (no
se muestra). Con un aumento bajo y medio por tinción H&E (Figura 3 a, c, e), no hubo características
citoplásmicas distintivas que revelaron los elementos microsporidianos que dieron lugar a in
situ positivoReacciones de hibridación en secciones de tejido adyacentes. En el mayor aumento por
tinción con H&E (lente de emersión de aceite), se incluyeron inclusiones basófilas, citoplásmicas de
forma, tamaño y número altamente variables (Figura 3 g) en las células teñidas con H&E y algunas
de ellas pueden haber sido de origen microsporidiano pero no podría distinguirse de manera
inequívoca de otras estructuras citoplásmicas basófilas normales del huésped. Debido a este
fenómeno, la evaluación histopatológica de la gravedad de estas infecciones por tinción con H&E
puede ser engañosa, si el criterio utilizado fue el número de células que muestran esporas u otras
estructuras de microsporidios fácilmente reconocibles.

Discusión

Debido a la especificidad de tejido idéntica, el tamaño de esporas idéntico y una identidad de


secuencia del 99% obtenida en comparación con los fragmentos del gen ssu rRNA de 913 pb,
llegamos a la conclusión de que el microsporidio recién encontrado en P. vannamei era idéntico al
de E. hepatopenaei informado previamente por P. monodon . Sin embargo, secuenciamos solo 3
clones (98-99% de identidad) de cada especie de camarón para obtener las secuencias de consenso
que utilizamos para la comparación filogenética. Así, según las tablas de muestreo veterinarias [ 14],
podría haber perdido secuencias de otras copias del gen ssu rRNA que podrían haber estado
presentes por debajo del nivel de prevalencia del 64% en la plantilla de ADN y que podrían haber
diferido de nuestras secuencias de consenso en más del 1 o 2%. Por lo tanto, se necesitaría un
análisis genético más detallado de los genes de ARN de subunidades completas, pequeñas y
grandes, regiones ITS y quizás otros genes para confirmar completamente nuestra conclusión de
que E. hepatopenaei infecta estas dos especies de camarones.

No tenemos ninguna explicación con respecto a la discrepancia entre una fuerte 1 st resultado
positivo de la prueba PCR -Step a pesar de la aparición de una luz in situ reacción de hibridación para
uno de los especímenes de Pond 13 BAP. De particular importancia fue un tercer conjunto de
muestras de un estanque WFS recuperado donde la mayoría de los camarones (8/9)
mostraron infecciones graves por E. hepatopenaei por hibridación in situ (Tabla 4 ) a pesar de la
ausencia de heces blancas. Desafortunadamente, ninguna de las muestras de HP de estos últimos
camarones se preparó para la PCR. En general, estos resultados y los de la prueba de desafío oral
indicaron una asociación causal improbable entre el FSM y la infección por E. hepatopenaei. Por otro
lado, es posible que la gravedad de las infecciones por E. hepatopenaei se incremente por las causas
subyacentes desconocidas de la CMA, dando una impresión superficial de la causa.

La extensa naturaleza de las infecciones por E. hepatopenaei en muchos de los especímenes


examinados sugiere que habría una alta demanda de energía para el parásito en desarrollo y que
esto tendría un efecto negativo en el crecimiento del huésped. Dada la dificultad de evaluar la
gravedad de la infección por tinción normal de H&E, parece prudente monitorear los estanques
para detectar E. hepatopenaei mediante PCR, especialmente si las tasas de crecimiento son más
bajas de lo previsto en ausencia de otras causas más obvias. Tenemos información anecdótica de
que una operación agrícola tailandesa ha adoptado una política de terminación y repoblación de
estanques de cultivo que muestran una alta prevalencia y severidad de E. hepatopenaeiinfección
indicada por reacciones positivas de PCR de un solo paso durante el primer mes de cultivo, ya que
sus registros muestran que estos estanques exhiben un crecimiento de camarón poco rentable.

Nuestras pruebas (que no se muestran) han revelado que E. hepatopenaei no está presente en las
larvas de los postes que se originan a partir de las poblaciones de SPF de P. vannamei y se utilizan
para almacenar los estanques de cultivo en Tailandia. Esto indica que las infecciones encontradas
en los estanques de cultivo se produjeron después de que se almacenaron los estanques, y sugiere
que se debieron a la transmisión desde una fuente de estanque natural como una especie de
reservorio local desconocida. Esta afirmación se apoya en el hecho de que E. hepatopenaei se
descubrió en Tailandia en el P. monodonindígena mucho antes de que se encontrara en el exótico P.
vannamei [ 10 , 13]. Por lo tanto, nuestros resultados indican que la mejor estrategia para controlar
sus infecciones en los estanques de cultivo sería centrarse en la identificación de las especies
reservorio y en eliminarlas del sistema de cultivo de camarón. Este enfoque ha sido exitoso para el
control de Agmasoma penaei en camarones cultivados en Tailandia. También valdría la pena
(debido a la capacidad de transmisión horizontal de E. hepatopanaei ) determinar si sus esporas
residuales en un estanque de brotes de enfermedades se eliminan mediante procedimientos
actuales para la preparación de estanques entre ciclos de cultivo.

Conclusiones

Aunque hemos demostrado que el microsproidian E. hepatopenaei se encuentra a menudo en P.


vannemeicultivado que exhibe WFS, es poco probable que el parásito esté asociado causalmente
con WFS, aunque la gravedad de las infecciones por E. hepatopenaei puede verse exacerbada por
las causas subyacentes de WFS. . Dado que este microsporidiano no está presente en las
poblaciones de SPF de Tailandia, las infecciones en los estanques probablemente se inicien por
transmisión de una o más especies de reservorios locales. Por lo tanto, la estrategia de control más
efectiva sería identificar las especies reservorio y excluirlas (ellas) del sistema de producción de
camarón. El método de PCR y el método de hibridación insitu desarrollado aquí serán útiles para
identificar especies de reservorio.

Métodos

Fuentes de WFS y especímenes de camarón cultivado muy normales

Dado que los Principios éticos y las Directrices para el uso de animales del Consejo Nacional de
Investigación de Tailandia (1999) se aplican solo a los vertebrados y no existe una norma oficial para
los invertebrados, adaptamos sus principios a los camarones. También seguimos las pautas del
gobierno del estado de Australia y Nueva Gales del Sur para la recolección humanitaria de peces y
crustáceos ( http://www.dpi.nsw.gov.au/agriculture/livestock/animal-
welfare/general/fish/shellfish ; 30 de marzo de 2013) con respecto a los detalles sobre el transporte
de camarones y su mantenimiento de laboratorio. Con respecto al procesamiento del camarón para
el análisis histológico o para matar al final de un experimento, se utilizó el método de agua salada /
suspensión de hielo tal como se recomienda en las directrices australianas.

Un grupo de muestras de camarón se recolectó en la provincia de Surathani en el sur de Tailandia


el 28 de octubre de 2010 y consistió en camarones de 2 estanques que exhiben WFS, 1 estanque
recuperado de WFS y 2 estanques normales. Después del aturdimiento, los camarones se limpiaron
con etanol al 70% y se eliminó el caparazón para que aproximadamente 100 mg de tejido
hepatopancreático externo (excluyendo la contaminación de la porción interna del estómago y el
intestino medio) pudieran transferirse asépticamente al tampón de extracción de ADN (ver más
abajo) . El resto del hepatopáncreas completo (incluido el ciego del intestino medio anterior, la
cámara posterior del estómago y una porción del intestino medio) se inyectó con el fijador de
Davidson y se procesó para el análisis histológico como se describió anteriormente [ 15 ]. Un
segundo conjunto de juveniles de P. vannamei.los especímenes que exhiben el síndrome de las
heces blancas se recolectaron en una granja de camarones intensiva en la provincia de Chanthaburi,
Tailandia, entre agosto y septiembre de 2011, junto con camarones muy normales de un estanque
cercano. Algunos de estos camarones se procesaron para la extracción de ADN de tejido
hepatopancreático como se describió anteriormente, mientras que los restantes se usaron en
pruebas para la transmisión del microsporidio alimentando tejido hepatopancreático infectado a
camarones normales.

Preparación de plantillas de ADN.


El tejido hepatopancreático se homogeneizó en un tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA
50 mM, SDS al 1%, NaCl 10 mM) que contenía 5 μg / ml de proteinasa K. El ADN genómico se aisló y
se purificó mediante el método de fenol-cloroformo [ 16 ] y las concentraciones se determinaron
midiendo la absorción de UV a 260 nm. Todas las plantillas de ADN se ajustaron a una concentración
de 50 ng / μl con agua destilada para las pruebas de PCR.

Clonación de un fragmento del gen del ARN ribosomal de una subunidad pequeña microsporidiana

Se amplificó un fragmento del gen ARNssporidian ssu rRNA de WFS P. vannamei por PCR como se
describió anteriormente [ 12 ]. Brevemente, los cebadores MF1 y MR1 (Tabla 1 ) se diseñaron a
partir de un fragmento sRNA rRNA de Enterocytozoon hepatopenaei aislado de P. monodon y
relativo a las posiciones 242–260 y 1165–1183, respectivamente, del registro de
Genbank FJ496356 . El proceso de PCR se llevó a cabo en una mezcla de reacción de 25 μl que
contenía tampón de PCR, dNTP 0.2 mM, MgCl 21.5 mM ., Cebadores 0.1 μM, 0.625 unidades de ADN
polimerasa Taq (Invitrogen) y plantilla de 1 μl. El protocolo de PCR consistió en 35 ciclos de
desnaturalización a 94 ° C durante 20 segundos, recocido a 64 ° C durante 20 segundos y extensión
a 72 ° C durante 45 segundos, seguido de una extensión final de 5 minutos a 72 ° C. Se amplificó y
clonó un fragmento del gen srRNA de 900 a 1.000 pb utilizando un kit de clonación fácil de pGEMT
(Promega). Los plásmidos se extrajeron de tres clones, se purificaron utilizando un kit de extracto
de plásmido (Geneaid) y se secuenciaron en ambas direcciones mediante dos cebadores de vectores
universales, SP6 y T7, de Macrogen, Corea. La secuencia de consenso obtenida (menos los
cebadores) se sometió a una búsqueda BLASTN ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ) en la base
de datos GenBank y luego se alineó con la región correspondiente de la secuencia de ARNr ssu de E.
hepatopenaei(Genbank: FJ496356 ) utilizando Clustal-W2
( http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ ). Entre las tres secuencias de clones, dos secuencias
fueron 100% idénticas, mientras que una fue diferente en 2/951 bases analizadas. El clon
denominado MF12 se utilizó como plantilla de control positivo para las reacciones de PCR.

Para verificar el registro de GenBank FJ496356 para la secuencia de ARNr de ssu del
microsporidian E. hepatopenaei de P. monodon [ 12 ], utilizamos el mismo protocolo de PCR
descrito anteriormente para volver a amplificar y volver a clonar el fragmento del gen ssu rRNA del
ADN archivado utilizado Como la plantilla que dio origen al registro FJ496356 . El amplicón se clonó
y se secuenciaron 3 clones para obtener una secuencia de consenso.

Detección por PCR de la infección por microsporidios en P. vannamei.

Se diseñaron dos pares de cebadores específicos, ENF779 / ENR779 y ENF176 / ENR176 a partir del
amplicón descrito anteriormente para un protocolo de PCR anidado para mejorar la especificidad y
la sensibilidad para la detección del nuevo microsporidian (Tabla 1 ). La amplificación por PCR se
llevó a cabo en 25 µl de mezcla de reacción que contenía 200 mM de dNTP, 1.5 mM de MgCl2 ., 0,1
mM cebadores y 0,625 unidades de polimerasa Taq (Invitrogen). Para el primer paso de la reacción
de PCR, el protocolo consistió en una desnaturalización inicial a 94 ° C durante 3 minutos, seguida
de 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 20 segundos, recocido a 58 ° C durante 20
segundos y extensión a 72 ° C durante 45 minutos. Sec con una extensión final a 72 ° C durante 5
min. La segunda reacción de PCR anidada se llevó a cabo utilizando 1 μl del primer producto de PCR
como plantilla. Las condiciones de reacción de la PCR consistieron en una desnaturalización inicial a
94 ° C durante 3 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 20 segundos,
recocido a 64 ° C durante 20 segundos y extensión a 72 ° C durante 20 segundos con una extensión
adicional. a 72 ° C durante 5 min. Los productos de la PCR se visualizaron mediante electroforesis
en gel de agarosa al 1,5%, tinción con bromuro de etidio y colocación de gel en un transilumador
UV. Para determinar la sensibilidad de detección,6 - 1 copias de plásmido) se prepararon y se
sometieron al protocolo de PCR anidado.

Hibridación in situ

Se usó un kit de marcaje Dig-PCR (Roche, Alemania) para preparar una sonda para hibridación in situ
utilizando los cebadores que se muestran en la Tabla 1 . Se usó una sonda GFP-Dig similarmente
marcada como control negativo. Los clones de plásmidos MF12 y pEGFP-N1 (Clontech) que
contienen inserciones relevantes se utilizaron como plantillas para Enterocytozoon sp. y el control
negativo, respectivamente. Las sondas marcadas con Dig se purificaron utilizando un kit de
purificación por PCR (Geneaid) y la eficacia del marcaje se determinó mediante hibridación dot
blot. Los camarones se fijaron en el fijador de Davidson durante la noche antes del procesamiento
para la inclusión de parafina de rutina [ 15]. Las secciones de tejido se digirieron con 10 μg / ml de
proteinasa K (Invitrogen, EE. UU.) En tampón TNE durante 10 minutos a 37 ° C. Cada sección se
superpuso con 200 µl de solución de prehibridación [4 × SSC y 50% (v / v) de formamida desionizada]
y se incubó a 37 ° C durante 30 minutos antes de que la solución se reemplazara con 200 µl de
mezcla de hibridación que contenía el DIG. sonda marcada (aproximadamente 20 ng / diapositiva)
y cubierta con un cubreobjetos. La reacción de hibridación se llevó a cabo a 42 ° C durante 20 h en
una cámara húmeda para evitar la evaporación. Después de lavar las secciones con gran rigor, se
incubaron con solución de bloqueo al 0,5% (Roche, Alemania) durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Las secciones se incubaron con anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa
alcalina (dilución 1: 500).2 , pH 9.5). La señal se desarrolló mediante la adición de sustrato NBT-BCIP
(Roche, Alemania) y la contratinción se realizó con Bismarck brown Y (Sigma, EE. UU.). Las
diapositivas se observaron y fotografiaron utilizando un microscopio Olympus con una cámara
digital.

Pruebas de desafío de laboratorio

Los camarones blancos del Pacífico que pesaban entre 6 y 8 gramos se obtuvieron de una granja en
la provincia de Chanthaburi, Tailandia, y se aclimataron en el Laboratorio del Centro de Investigación
Empresarial de Acuicultura, Facultad de Pesca, Universidad de Kasetsart durante 1 semana. Durante
el período de aclimatación, los camarones fueron alimentados con alimento comercial de
pellets. Después de eso, 60 camarones se almacenaron al azar en 6 acuarios (80 l cada uno) con 10
camarones por acuario. Los camarones se dividieron en 2 grupos de 30 animales (es decir, 3
acuarios) por grupo. Los camarones del grupo de tratamiento fueron alimentados con tejido
hepatopancreático de E. hepatopenaei.Los camarones se infectaron todos los días durante 7 días
(una vez al día y otra comida alimentada con pienso comercial), mientras que los camarones del
grupo de control se alimentaron con un pienso comercial dos veces al día. El oxígeno disuelto (OD),
la salinidad, el pH y la temperatura durante el período de aclimatación y el experimento se
mantuvieron a 4 ppm, 25 ppt, 7.8–8.0 y 28 ° C, respectivamente. La prueba se terminó después de
7 días. Se tomaron muestras de los camarones (uno de cada acuario) los días 2, 4 y 7 después de la
alimentación para las pruebas de PCR utilizando los cebadores de E. hepatopenaei . También fueron
monitoreados por mortalidad y signos de WFS.
CAMBIOS BIOQUÍMICOS Y DISTRIBUCIÓN TISULAR DE ENTEROCYTOZOON HEPATOPENAEI
(EHP) EN CAMARONES BLANCOS INFECTADOS CON EHP DE FORMA NATURAL,
LITOPENAEUS VANNAMEI (BOONE, 1931), EN LA INDIA
Se observó un crecimiento atrofiado en Litopenaeus vannamei criado en estanques en diferentes
granjas ubicadas en Tamil Nadu y Andhra Pradesh, India. No se asoció mortalidad con retraso del
crecimiento. El ensayo de PCR en estas muestras reveló la presencia de Enterocytozoon
hepatopenaei (EHP) en camarones atrofiados. La distribución tisular de EHP en camarones
infectados de forma natural y experimental se estudió mediante PCR e histología. El examen
histológico reveló la presencia de EHP en el hígado y el intestino, pero no en otros órganos. El ensayo
de PCR reveló la presencia de EHP en todos los órganos probados en camarones infectados de forma
natural y experimental. Los camarones sanos fueron desafiados con E. hepatopenaei por inyección
intramuscular y vía oral, y no se observó mortalidad en ambas rutas después de 30 días después de
la prueba. Se observaron diferentes etapas de desarrollo del parásito microsporidiano en las células
epiteliales hepatopancreáticas. Parámetros bioquímicos tales como proteína total, albúmina,
aspartato transaminasa (AST), alanina transaminasa (ALT) y fosfatasa alcalina se midieron en la
hemolinfa de camarones infectados con EHP de forma natural y experimental. Se encontró que
todos los parámetros bioquímicos mencionados son significativamente más altos en los camarones
infectados con EHP en comparación con los camarones normales. Este es el primer informe que
relaciona los niveles de AST y ALT con la infección por EHP en camarones infectados de forma natural
y experimental. alanina transaminasa (ALT) y fosfatasa alcalina se midieron en la hemolinfa de
camarones infectados con EHP de forma natural y experimental. Se encontró que todos los
parámetros bioquímicos mencionados son significativamente más altos en los camarones
infectados con EHP en comparación con los camarones normales. Este es el primer informe que
relaciona los niveles de AST y ALT con la infección por EHP en camarones infectados de forma natural
y experimental. alanina transaminasa (ALT) y fosfatasa alcalina se midieron en la hemolinfa de
camarones infectados con EHP de forma natural y experimental. Se encontró que todos los
parámetros bioquímicos mencionados son significativamente más altos en los camarones
infectados con EHP en comparación con los camarones normales. Este es el primer informe que
relaciona los niveles de AST y ALT con la infección por EHP en camarones infectados de forma natural
y experimental.

Desarrollo de hibridación in situ y ensayos de PCR para la detección


de Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), un parásito microsporidian que
infecta camarones peneidos
Reflejos
• La histología de EHP incluye inclusiones basófilas dentro de las células del hepatopáncreas.
• Desarrollamos un ensayo de hibridación in situ EHP específico utilizando una sonda marcada con
digoxigenina.
• Se desarrolló una PCR específica para EHP dirigida a su región del gen ARNr 18S.
• Por PCR, se detectó EHP en los camarones infectados, sus heces y muestras de agua.
• Por PCR, se detectó EHP en alguna biomasa de Artemia.

Resumen

Un parásito microsporidiano, Enterocytozoon hepatopenaei (abreviado como EHP), es un patógeno


emergente para los camarones peneidos. Se ha encontrado EHP en varios países de cultivo de
camarón en Asia, incluyendo Vietnam, Tailandia, Malasia, Indonesia y China, y se informa que está
asociado con el retraso del crecimiento en el camarón de cultivo. Examinamos las características
histológicas de los camarones infectados recolectados de Vietnam y Brunei, que incluyen la
presencia de inclusiones basófilas en las células epiteliales del túbulo hepatopáncreas, en las cuales
se encuentra EHP en varias etapas de desarrollo, que van desde los plasmodios hasta las esporas
maduras. Por una PCR dirigida al gen 18S rRNA, un 1.1 Se amplificó el fragmento del gen rb 18S de
kb de EHP, y esta secuencia mostró una identidad del 100% con EHP encontrada en Tailandia y
China. Este fragmento se clonó y se marcó con digoxigenina-11-dUTP, y se hibridó in situ a secciones
de tejido de Penaeus vannamei infectado (de Vietnam) y P. stylirostris (Brunei). Los resultados de la
hibridación in situ fueron específicos, la sonda solo reaccionó al EHP dentro de las inclusiones
citoplasmáticas, no a una Pleistophora-como el microsporidio que está asociado con la enfermedad
del camarón de algodón. Posteriormente, desarrollamos un ensayo de PCR a partir de esta región
del gen 18S rRNA, se ha demostrado que esta PCR es específica de EHP, no reaccionó a otros 2
patógenos parásitos, una ameba y la enfermedad del camarón de algodón microsporidium, ni al
ADN genómico de varios crustáceos, incluidos Poliquetos, calamares, cangrejos y krill. Se detectó
EHP, mediante PCR, en tejido hepatopancreático, heces y agua muestreadas de tanques de
camarones infectados, y en algunas muestras de biomasa de Artemia.

Gráficamente abstracto

Científicos reportan la presencia de EHP en camarones de Venezuela


Un grupo internacional de científicos reportó la presencia del microsporidio Enterocytozoon
hepatopenaei (EHP) en camarón Penaeus vannamei de cultivo en Venezuela; sin embargo, ellos
indican que no procede del sudeste de Asia.

El microsporidio EHP es un parásito intracelular que se ha convertido en un amenaza crítica para la


industria camaronera del sudeste de Asia. Este parásito se replica en el hepatopáncreas y el intestino
medio, y el camarón infectado deja de alimentarse y registra un retraso severo en el crecimiento.

El EHP fue detectado por primera vez en Penaeus monodon en Tailandia en el año 2004, y ha sido
reportado en algunos países del sudeste de Asia.

Científicos del Shrimp Vet Laboratory (Vietnam), de la University of Arizona (EEUU), Prince of
Songkla University (Tailandia) y del CJ CheilJedang Feed & Livestock Research Institute (Corea)
describieron el primer caso de camarón blanco Penaeus vannamei de cultivo infectado con EHP en
Venezuela.

“En el 2016 recibimos muestra de camarón blanco del Pacífico desde granjas de Venezuela. Estas
fueron recolectadas de poblaciones de camarón que mostraban signos de enfermedad,
especificamente grandes variaciones en los tamaños y un crecimiento retrasado” informaron los
científicos.

A través de diversos procedimientos de diagnósticos, ellos reportaron que los camarones estaban
infectados con dos patógenos: Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) y el virus del síndrome Taura
(TSV).

De acuerdo con los científicos, la histopatología de los camarones afectados en Venezuela es muy
similar al EHP del sudeste de Asia; sin embargo, destacan que el EHP no fue introducida del sudeste
de Asia.

Ellos también reportan que en la granja en donde se identificó el EHP, también se detectó el virus
del síndrome Taura (TSV), que no era reportada desde el año 2011.
“El surgimiento de EHP y la ocurrencia de TSV en Venezuela tendrán un impacto significativo sobre
la producción camaronera si se disemina a otras granjas. Por lo tanto, el camarón cultivada dentro
de ese país debe ser monitoreada continuamente para determinar la presencia de EHP y TSV”
concluyeron los científicos.

Referencia:
Kathy F.J. Tang, Luis Fernando Aranguren, Patharapol Piamsomboon, Jee Eun Han, Irina Y.
Maskaykina, Margeaux M. Schmidt , Detection of the microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei
(EHP) and Taura syndrome virus in Penaeus vannamei cultured in Venezuela, aquaculture (2017),
doi: 10.1016/j.aquaculture.2017.07.043

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S004484861731030X

Detección del microsocidio Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) y el virus


del síndrome de Taura en Penaeus vannamei cultivado en Venezuela

Reflejos
•Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) es una amenaza crítica para la industria del cultivo de
camarón.
•Se detectó EHP de Penaeus vannamei cultivada en Venezuela en 2016.
•Basado en comparaciones de secuencias, este EHP de Venezuela no se introdujo recientemente
desde el sudeste asiático.
•TSV también fue detectado en el P. vannamei por RT-qPCR y análisis de secuencia.
•Se determinó que el TSV es un genotipo de Venezuela basado en el análisis filogenético.
Resumen

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) es un parásito intracelular que se ha convertido en una


amenaza crítica para la industria del cultivo de camarón en el sureste de Asia. Este parásito se replica
en el hepatopáncreas y el intestino medio , y el camarón infectado presenta una alimentación
reducida y un crecimiento muy retardado. En este estudio, describimos el primer caso
dePenaeus vannameiinfectado con EHP cultivado en Venezuela. Su histopatología es muy similar a
la de SE Asia EHP, con camarones infectados que muestran inclusiones basófilas en el
hepatopáncreas. Tras la hibridación in situ de un fragmento de gen EHP 18S rRNA marcado
con digoxigenina , la sonda reaccionó intensamente a las inclusiones basófilas dentro
del citoplasmaDe las células infectadas. También comparamos las similitudes en la secuencia
de nucleótidos en el gen 18S rRNA (1095-bp), en los genes de β-tubulina (583-bp) y de la proteína
de la pared de esporas (431-bp) entre los aislamientos de Venezuela EHP y SE Asia; y los resultados
mostraron identidades de 99%, 93% y 91%, respectivamente. Esto sugiere que el EHP de Venezuela
no se introdujo recientemente desde el sudeste asiático. En una granja de camarones afectada por
EHP, el virus del síndrome de Taura (TSV) también se detectó en la RT-qPCR y en los exámenes
histológicos. TSV es un patógeno importante en la acuicultura de camarones peneidos P.
vannamei. y ha causado pérdidas económicas sustanciales durante las últimas 2 décadas, sin
embargo, el TSV no se ha reportado desde 2011. Este TSV se determinó como un genotipo
de Venezuela basado en el análisis filogenético en el gen dela proteína de la cápside2 y mostró
tener identidades de secuencia de 97% (nucleótido) y 98% (aminoácido) a un aislado de Venezuela
encontrado en 2005. La aparición de EHP y la aparición de TSV en Venezuela tendrán un impacto
significativo en la producción de camarón si se extienden a otras granjas. Por lo tanto, los camarones
cultivados en el país deben ser monitoreados de cerca para detectar la presencia de EHP y TSV.

Poblaciones densas de microsporidios Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)


en heces de Penaeus vannamei que presentan síndrome de heces blancas y
vías de transmisión a camarones sanos

Reflejos
•El síndrome de las heces blancas (WFS) es un problema emergente para el cultivo de camarón en
el sudeste asiático.
•Enterocytozoon hepatopenaei(EHP) esporas en las heces blancas.
•Se detectó EHP en todas las muestras de camarón recolectadas en estanques afectados por WFS.
•EHP se puede transmitir a través de la convivencia.