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DE AREQUIPA
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
Ing. Karina Moran Medina
AREQUIPA-PERÚ-2017
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
AGUSTÍN DE AREQUIPA
AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal
Ing. Karina Moran Medina
AREQUIPA-PERÚ-2017
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PROLOGO
Los Autores
4
ÍNDICE
PROLOGO
ÍNDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES… ................................................................................................... 6
PRÁCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ..................................................................... 7
PRÁCTICA 2 : RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS
IN VIVO, COLORACION VITAL ...................................................................... 12
PRÁCTICA 3 : PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:
SIMPLE Y DIFERENCIAL, TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS .................................................................................................................... 17
PRÁCTICA 4 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO
Y ESTERILIZACIÓN ............................................................................................ 31
PRÁCTICA 5 : MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 36
PRÁCTICA 6 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS ............................................................... 48
PRÁCTICA 7 : CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS……........................................................................................................ 57
PRÁCTICA 8 : CURVA DE CRECIMIENTO ............................................................................... 62
PRÁCTICA 9 : CONTEO DIRECTO DE CÉLULAS MICROBIANAS .................................. 67
PRÁCTICA 10 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN
PLACA.......................................................................................................................... 70
PRÁCTICA 11 : OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA Lessonia 70
PRÁCTICA 12 : AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE
INTERÉS INDUSTRIAL......................................................................................... 70
PRÁCTICA 13 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL rhizobium..................................................... 81
PRÁCTICA 14 : ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS ............ 83
PRÁCTICA 15 : MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS
COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y escherichia coli POR LA
TÉCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MÚLTIPLE (NÚMERO MÁS
PROBABLE O NMP) ............................................................................................... 86
5
Recomendaciones Generales
6
PRÁCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común que tienen la finalidad de
proteger la salud, la integridad física, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a
diferentes riesgos biológicos físicos, psicológicos y mecánicos.
7
2. La piel
• Cortaduras o rasguños.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados
(lápices, bolígrafos, etc.).
3. Los ojos
• Salpicaduras de materiales infecciosos.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados.
4. Los pulmones
• Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).
2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no pueden ser vistas a
simple vista. El poder de resolución de un microscopio está en relación inversa a la longitud de onda
de la luz usada.
1. Parte mecánica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido
- Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales
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- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma
iris y soporte para el espejo
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III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.
IV. CUESTIONARIO
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
11
PRÁCTICA
RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y
CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL
I. OBJETIVOS
12
6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe
nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.
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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS
1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un
portaobjetos (de forma invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar
la preparación con vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.
2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul
de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la
observación, mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar
alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
Material
- Microscopio
- Láminas cubreobjetos
- Láminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Muestra de levaduras in vivo
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos
Metodología
- Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota de líquido
sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota de suero
fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una
suspensión y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.
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Grafique la Observación y Resultados
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COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como técnicas
intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva
teñidas.
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir
el procedimiento (muestra liquida o sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
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OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS
INTRODUCCION
Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras internas propias de las
células eucarióticas. Así, el citoplasma de las procarióticas está rodeado por una membrana
plasmática y una pared celular (como en las células vegetales), pero no hay membrana nuclear
ni, por tanto, núcleo diferenciado. Las moléculas de ADN están en contacto directo con el
citoplasma. Además carecen de mitocondrias, retículo endoplasmático, cloroplastos y aparato
de Golgi. Aunque, en general, las células procarióticas carecen de estructuras internas
delimitadas por membrana, las cianobacterias, sí contienen numerosas membranas llamadas
15
tilacoides, que contienen clorofila y pigmentos fotosintéticos que utilizan para captar la energía
de la luz solar y sintetizar azúcares (fotosíntesis).
Materiales:
Muestra biológicca: Nosstoc (murmunta hidratada)
Procedimiento Experimental
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V. CUESTIONARIO
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
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PRÁCTICA
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL
I. OBJETIVOS
- Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración.
- Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de los Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las especies de Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto posee un índice
de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biológicas para visualizarlos
adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren uno de otro en
cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por
otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son:
C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales cromóforos del
compuesto.
PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de espesor, pudiendo incluso
alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las paredes de las células jóvenes son más delgadas que las
células de cultivo antiguo.
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GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa,
estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que
contiene lipopolisacárido LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmática interna.
Un espesor de 0.0075 m.
c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del material a
estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida de
los microorganismos, debida a la coagulación de las albúminas protoplásmicas. Existe un gran
número de fijadores, tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales
de fijación son: por el calor y alcohol en frío.
a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico, término que no
índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de la molécula es aniónica o
catiónica.
Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear
de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como estructuras
citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido pícrico.
Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno básico. Ej: Wright,
Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej:
Sudán III.
a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfología
y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de metileno, Tinción fucsina.
b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto las
características de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción Gram,
Tinción ácido-alcohol resistente.
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c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto
estructuras bacterianas. como; Tinción de flagelos, Tinción de esporas, Tinción de cápsulas,
Tinción de corpúsculos metacromáticos
Fijación
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra
hacia arriba.
- Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción.
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción de muestra sólida y disuelva en la gota de agua
(cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frotices que se obtengan no
deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar por unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
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Grafique la Observación y Resultados
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TINCIÓN DE SAFRANINA
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua).
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja actuar de unos
5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram, Asas de platino,
Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión.
TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana
luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido
a la naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta,
aún luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y
acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden
la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante
secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han
perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la
safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.
Reactivos
- Solución de Cristal Violeta (Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada=
100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml)
Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas
y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso
de tinción.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de
cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas del
decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10
segundos más o menos. También puede utilizar etanol comercial como decolorante , en
este caso dar más tiempo aproximadamente 1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de caño.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.
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1. ASPERGILLUS
A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS
Características morfológicas del hongo: tamaño y forma de las cabezas conidiales, Morfología de los
conidióforos. En la siguiente figura se muestra las principales estructuras morfológicas del género
Aspergillus:
B. APLICACIONES INDUSTRIALES
22
INVERTASA O SACARASA.
Origen y acción'. La hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azúcar invertido) puede ser realizada
por dos enzimas: la betafructosidasa, que actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa,
y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente
por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae,
Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de
hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
• Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por hidrólisis, pero las
lipasas son solubles en agua y los lípidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrólisis sólo
ocurre en la interfase entre la gota lipídica y la fase acuosa, lo que causa que la reacción sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remoción de manchas
de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinación de búsqueda y manipulación genética
ha conducido a la introducción reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa
Hamicola , que se logró producir en Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".
El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente
celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extracción
de aceite a partir de las semillas de ajonjolí, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de
aceite extraído fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjolí, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite
de cacahuate y de 55.3 a 57.1 %
2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras de la espora-
cojinete.
Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fíales en forma de
botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora
más joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.
23
La ramificación es una característica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no
ramificados y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estípite. Otros pueden tener un
racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda
pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete
de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rápido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca,
a 25 °C (no crecen o crecen pobremente a 37 °C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la
superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulación abundante. Olor
aromático, especiado o afrutado (a manzanao a pina).
ECOLOGIA
El Penicillium es género grande y difícil encontrado casi por todas partes, y generalmente el género más
abundante de hongos en suelos. La ocurrencia común de la especie del Penicillium en alimento es un
problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible
o aún peligroso. Es una buena práctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier
moho.
Se le encuentra en el polvo doméstico, en los edificios húmedos y mohosos donde deteriora diferentes
materiales de construcción, entre los que resaltan el papel de decoración (crece bien en la cola empleada
para su adhesión a las paredes). No muestra una notable variación estacional. Las máximas
concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las áreas urbanas
que en las rurales).
3. RHYZOPUS
Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se
decae y las heces del vehículo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas
ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en
seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rápida. En ciertas especies son patógeno de
24
la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la producción del tempeh, un alimento fermentado
derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el
interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son genético idénticos a su padre, los
zygospores se producen después de que dos mycelia se fundan durante la reproducción sexual, y dan
lugar a las colonias que pueden ser genético diferentes de sus padres.
EL GÉNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente
los medios de cultivo.
EL GÉNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razón por la cual invaden rápidamente los medios de cultivo. En este Género
los esporangióforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides.
EL GENERO ABSIDIA
Los esporangióforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia económica, síntesis de productos industriales: producción de ácidos láctico, cítrico,
succínico, oxálico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas según el medio en que se desarrolle. Una forma típica o
filamentosa, en medios sólidos y otra forma atípica o levaduriforme que por lo general aparece en los
medios líquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentación de mostos
azucarados, en cambio, la forma típica se usa para obtener enzimas (amilasas).
Mucor rouxil: Hidroliza el almidón posteriormente y posteriormente fermenta los azúcares formados
en la hidrólisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una
levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentación alcohólica. Esto es en síntesis
lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma típica se emplea para la fabricación de
amilasas.
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amilolítico, puede hidrolizar el almidón y producir
etanol, pero en menor proporción que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de
fermentación alcohólica, en cambio, en los últimos años se
25
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS
A. MATERIAL
B. MATERIAL BIOLOGICO
Muestras de alimentos con hongos
Cultivo de Aspergillus niger
Cultivo de Penicillium
C. REACTIVOS
I. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS
26
B. PENICILLIUM.
27
a. CUESTIONARIO:
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
28
PRÁCTICA
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL
DE LABORATORIO
I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y
equipos más empleados en un laboratorio de microbiología industrial.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco
debido a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.
29
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de
kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar
rápidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno Pasteur, donde se esteriliza
el material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar
material de vidrio.
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran
húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas
partes del recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre
la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de
cadena única en el ADN, y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede
correlacionarse con la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática,
como resultado de activación o liberación de una nucleasa.
a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos.
b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la acción del vapor de agua y a
temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta.
Se utiliza para materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presión y 121ºC por 15-
20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no
pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización.
♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.
Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través de membranas porosas
que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias termolábiles. El
material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
30
Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente
bactericida en la región espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, éste método
presenta muchas dificultades técnicas.
- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben llevar sus tapones de algodón
respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos
ni cortos, preparados según el método siguiente:
- De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodón de
fibra, extendida, rectangular
- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.
- Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele la forma de cono
truncado, con el diámetro a la medida del recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el
recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones
envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y
amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel kraft y se amarra con
hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparación.
El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con utensilios de vidrio
o metal.
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V. CUESTIONARIO
2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control
microbiológico, por qué?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el
autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a
que se debe tal diferencia.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
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PRÁCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
I. OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un
crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo más empleados en bacteriología.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo más corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboración de cualquier medio de cultivo.
El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con
esto, siempre se requerirá una fuente de energía y una fuente no energética como son las sales,
factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energía son necesarias para su desarrollo.
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azúcares en forma de mono o
disacáridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar
azúcares más complejas para obtener energía., como es el caso del almidón.
Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO2 hecho que es característico de
las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos
como fuente de energía: Ejemplo: Cladosporium.
Por último, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energía un gran
número de componentes hidrocarbonados diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como proteínas completas, que sería el caso de la gelatina o incluso proteínas
aún más complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas
etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrógeno que corresponden a péptidos o
polipéptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son también proteínas que
están parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominación comercial correspondiente a una peptona pépsica de carne.
La caseína en forma de peptona tripsica de caseína se usa para estudiar la formación de indol por
parte de la bacteria debido al alto contenido de triptófano que posee este tipo de peptona. También
es utilizada para estudiar la reducción de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos.
34
La peptona papaínica de soja, es una fuente de nitrógeno especialmente para hongos y ciertos
gérmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrógeno serian: nitratos, nitrógeno orgánico, amoniaco, sales de amonio,
aminoácidos, etc.
A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en
forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir
de algún aminoácido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FÓSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fósforo lo suelen hacer en forma de fosfato.
C. IONES METÁLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio,
el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
También se encuentra otro tipo de iones metálicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentración
pueden inhibir el ‘crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe
el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que aún con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy
lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta además una serie de componentes definidos que
no son capaces de fabricar por sí solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algún tipo
de aminoácido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases púricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, ácido glutámico y ácido nicotinico para el crecimiento
de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias húmedas, lisas y grises del Haemophylus
influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y está enriquecido con otros cofactores,
como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella
pertusis. Se observa colonias en “gotas de mercurio” brillantes es fácil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrógeno suplementario y vitaminas del complejo B para el
crecimiento del Flavobacterium.
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo de microorganismo por bloqueo
de sus procesos metabólicos.
Los antibióticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sódica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los
Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
35
Las sustancias inhibidoras son muy útiles para la identificación y tipificación de pruebas
bioquímicas de las bacterias.
B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.
En general, cualquier medio sólido o líquido requiere cierta proporción de agua.
36
En medios sin agua es muy difícil el crecimiento bacteriano: de ahí que la liofilización y cualquier
método de deshidratación, sea un buen medio de conservación.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo de crecimiento.
- Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalófilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayoría de las bacterias y protozoos son neutrófilos.
La mayoría de hongos prefieren medios ligeramente ácidos, con valores de pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la membrana plasmática
o inhibiendo la actividad de las enzimas y las proteínas transportadoras.
El pH óptimo en la mayoría de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy ácido, a pH próximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos
que se producen por la degradación de los nutrientes por parte de las bacterias. Es típico que en la
fermentación glucídica se produzca acidificación del medio o en la degradación proteica utilizando la
bacteria sales amónicas como fuente de energía se alcalinice el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro
de los límites fisiológicos.
Límite Límite
Microorganismo pH óptimo
inferior superior
Picrophilus oshimae 0 0.7 SD
Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-3.5 6.0
Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.5 4.0
Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8
Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3
Proteus vulgaris 4.4 6.0-7.0 8.4
Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0
Clostridium sporogenes 5.5-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0
Pseudomonas aeuriginosa 5.6 6.6-7.0 8.0
Nitrosomonas 7.0-7.6 8.0-8.8 9.4
Bacillus pasteurii 8.5 SD SD
Bacillus alcalophilus 8.5 10.6 11.5
D. PRESIÓN OSMÓTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que
pueden crecer a concentraciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotónicos; este hecho es
debido a su pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y ésta se rompa.
En las bacterias halófilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de
cloruro sódico; Ej: Staphylococus.
Como la concentración osmótica de un hábitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos,
es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la
actividad de agua (aw).
37
1.00 (agua pura) Sangre Mayoría de Gramnegativos
no halófilos
0.95 Pan Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes
0.90 Jamón Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus
0.85 Salami Staphylococus, Saccharomyces
0.80 Conservas Penicillum
0.75 Lagos salados Halobacterium, Aspergillus
Pescado salado Actinospora
0.70 Cereales, dulces Aspergillus
0.60 Chocolate Saccharomyces
Leche Xeromyces
deshidratada
E. CONCENTRACION DE OXÍGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxígeno atmosférico es AEROBIO, mientras que
otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor
en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto
en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides.
Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energía mediante la respiración aerobia
y deben utilizar vías de fermentación o respiración anaerobia para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son
MICROAEROFILOS que son dañados por el nivel de oxigeno atmosférico 20% precisando para
su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxígeno.
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes clasificaciones. De acuerdo
con esto y según criterios se podrían dividir en:
A. MEDIOS SÓLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre por encima del 15%.
La importancia, de los medios sólidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificación y
visualización del crecimiento en colonias, así como su posible identificación a través de medios
específicos y diferenciales de caracteres, sólidos elaboración de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfología de las colonias.
B. MEDIOS LÍQUIDOS
También denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realización de recuentos
bacteriológicos por turbidimetría, especialmente útil en levaduras, para la realización de inóculos, para
obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibióticos, ácidos
lácticos, etc.
38
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradación de glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la producción de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formación de ácido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difíciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISÓLIDOS
Son medios intermedios entre los líquidos y los sólidos; su proporción en agar suele ser inferior al 5%
pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semisólida. Son útiles
para algunas pruebas bioquímicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, producción de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, producción de Indol y Ornitina.
39
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante
períodos de tiempo relativamente largos manteniéndose tales medios generalmente a temperaturas lo
suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada
que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.
b. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Espátula.
Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.
c. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA .
4.1. PREPARACIÓN
- Para la preparación de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, según la cantidad que está indicada en la
etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y añadir la mitad del volumen de agua que se
requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensión homogénea, después
incorporar el agua restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al
conjunto las partículas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared
interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolución.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolución completa, al agitar no debe adherirse el
medio a la pared interna del recipiente; la solución es viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapón de algodón, envolver con papel Kraft y pabilos.
4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizará el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121ºC.
40
4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55ºC.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo haciéndolo oscilar en sentido circular su
recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en la
posición deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posición lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:
Agar nutritivo
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Agar Sabouraud
o En Tubos: la posición de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)
Agar TSI
Agar LIA
o En Tubos: la posición de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
Agar Citrato de Simmons
o En tubos: la posición de Fondo (aproximadamente 3 ml)
Agar SIM
4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados deberán conservarse en lugar seco, protegidos contra
la luz, a una temperatura de 15ºC a 30ºC, y en envases bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un sólo tiempo limitado de
conservación. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservación
es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 – 8ºC.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, deberán pre encintarse con cinta
adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa.
AGAR NUTRITIVO
Composición
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Según la composición
_________________________________________________________
Según su presentación
_________________________________________________________
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Según la composición
_________________________________________________________
Según su presentación
_________________________________________________________
AGAR TSI
Composición
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa,
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa,
42
Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar – Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g
Agua destilada, 1000 ml
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
MEDIO EMB.
Composición
Fosfato dipotásico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa,
sacarosa, caseina, Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
43
CALDO LURIA BERTANI (LB)
Composición
Extracto de levadura,….. g. ,
Cloruro de sodio……….. g.
Triptona…………………g
Agua destilada…………. ml
Preparación
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
V. CUESTIONARIO
1. Defina Ud. los siguientes términos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios obligados,
Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo.
2. Cuáles son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?
3. Cual es al función del agar-agar en los medios de cultivo?
4. ¿Por qué es difícil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?
5. ¿A qué se denomina medio sintético o definido? De 3 ejemplos.
6. ¿Qué es un medio complejo?. De 3 ejemplos.
7. ¿Qué es un medio selectivo?. De 3 ejemplos.
8. ¿Qué es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.
9. Realice una gráfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el crecimiento microbiano, y
clasifique en categorías diferentes según los rangos de temperatura de su crecimiento (psicrófilos.
Psicrótrofos, mesófilos, termófilos, Hipertermófilos?
10. ¿Con qué sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4.
11. ¿Qué es un medio de transporte y para qué sirve? De 2 ejemplos.
12. ¿Qué medios diferenciales conoce? ¿Qué utilidades tienen?
13. ¿Qué es un medio selectivo y qué función tiene? Mencione por lo menos 3 y ¿qué sustancias se le
agregan para que cumpla esa función?
14. ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?
15. ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos microaerófilos?
44
16. ¿Para qué sirve utilizar un medio de cultivo semisólido? ¿Cómo se obtiene la consistencia del agar
blando?
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
45
PRÁCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I. OBJETIVOS
Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en
condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados.
Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas:
- Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son
contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros.
2.1. SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo adecuados
para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en
condiciones óptimas de temperatura y tiempo de inoculación, puedan desarrollarse y
multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un transplante.
AISLAMIENTO
Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra
problema. Se requiere un medio sólido con gran superficie para que los microorganismos al
ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formación de colonias
separadas. Si se aíslan especies distintas, cada colonia tendrá características especiales, la
morfología bacteriana será también distintiva.
TRANSPLANTE
Significa la separación previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede
ser líquido o sólido.
ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o recta
y en el otro extremo insertado con un mango cilíndrico para un uso sencillo.
Se utiliza para inoculación o siembra por estría en medios sólidos, presentan un arco bastante
cerrado en su extremo cuyo diámetro es más o menos específico es decir muchas asas son
calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra las más utilizadas son las de
0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.
ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de triángulo más o menos abierto. Se utiliza para extender el
inóculo líquido previamente adicionado en la placa, a través de una pipeta pasteur. Se esteriliza
en autoclave, aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y prendiendo la
llama hasta agotar el alcohol del asa.
HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra desecación,
deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a través del hisopo en el medio de
cultivo. Se suele comercializar ya estéril listo para utilizar y desechables.
PIPETAS
47
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por
esterilización o de plástico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen
volúmenes específicos), en cuyo caso su aspiración se realizará con aspiradores para pipeta tipo
pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene volúmenes graduados son muy utilizados en
bacteriología y cuya aspiración se realiza con chupetes de goma. También nos encontramos
con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado medio
de cultivo.
Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio líquido se homogenizará
y se dejará crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para organismos patógenos
coincidirá con la temperatura corporal, dejándolos crecer aproximadamente 24 horas. En
ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilización de un rotavapor para que el crecimiento
se establezca por igual en todo el medio líquido, aunque esto va a depender de su aplicación
posterior y de la cantidad de inóculo que se requiera.
Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de cultivo sólido, se
utilizara diferentes técnicas de siembra y posteriormente se verificará el cultivo, ej. siembra por
agotamiento.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio liquido,
se homogenizará la mezcla inicial por agitación y se dejará crecer a una temperatura de 37ºC
por 24 horas. Es importante que los inóculos sean siempre jóvenes.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y ésta se añade a un medio sólido,
se extenderá con el asa de Digrasky, previamente estéril a través de toda la placa incubándose
a a temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren también cultivos jóvenes.
Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina estéril o caldo de cultivo
base.
48
A veces es necesario partir de un inóculo con un número aproximados de microorganismos
problema. En estos casos, los inóculos se establecen en medios líquidos y el número de
microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparación de medios líquidos con
diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una
batería de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez según la concentración de sulfato
bárico. Cada tubo corresponderá a una determinada concentración de microorganismos.
CLASES DE SIEMBRA
- Siembra por agotamiento o por estrías.
- Siembra por difusión.
- Siembra por diseminación.
- ESTRIA MÚLTIPLE
Se tomará la muestra problema con el asa de siembra previamente estéril y dicho inóculo se
depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un extremo a otro de ésta solo
en la parte superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa repetiremos
el proceso anterior que nos permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedó
la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de
platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma dirección se repite la
49
operación hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que tienen cabida
aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el
interior de la misma.
El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que cada vez que se
va arrastrando y separando más la muestra. Es importante que para separar estas colonias se
realice en cada estría un flameado previo del asa de siembra.
50
Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una
temperatura de 45 a 50ºC) en el tubo, en el tubo se adicionará la cantidad de inóculo que oscila
entre 0,1 a 0,4 y se homogenizará la muestra en el tubo mediante el vibrador.
Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y se dejará solidificar, la
mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenización en este
caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la determinación de CMI
(concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos.
51
c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA
Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas. Este método se lleva a
cabo cuando el medio es sólido y está inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y
posteriormente la siembra por estría ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato
entre otras.
La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en algún método de dilución.
El método más útil y práctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se
inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las células
individuales queden separadas una de otras. Cada célula aislada crece ahora para formar una
colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las células que componen la colonia
son la progenie de una única célula original.
Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para mantener la
esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando asépticamente, el biotecnólogo tome
prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la contaminación o de las soluciones
con microorganismos no deseados.
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III. MATERIALES Y EQUIPOS
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V. CUESTIONARIO
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
54
PRÁCTICA
CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS
I. OBJETIVOS
GENERALIDADES:
Para estudiar las características de los microorganismos (forma, estructura, tamaño, consistencia,
cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de cultivos apropiados según el
tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y
desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios sólidos y líquidos.
Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una Unidad
Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de tamaño generalmente es visible a
simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie
como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los
estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color característicos, que
aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones controladas
y depende de la especie bacteriana que la forme.
Debido a que las características de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo
de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados.
Sin embargo, además de éstas características se requiere también estudiar la fisiología y propiedades
inmunológicas de las bacterias para poder realizar una identificación completa.
La morfología colonial es comparable a una estadística ya que se deriva de una célula individual pero es
la característica de la masa celular. Así pues, por ejemplo, la pigmentación es aparente en la colonia, pero
no en la célula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la
sustancia capsular en aquellas bacterias con cápsula muy grande.
Medida de las colonias. ésta característica es bastante constante dentro de las especies y puede ir desde
colonias muy diminutas hasta un diámetro de varios milímetros.
Forma. Está determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras se pueden observar varias
formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.
55
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede
moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos
mucosos cuando se trata de separarla del agar..
La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas concéntricas
o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa.
Pigmentación. Esta característica es muy común en las bacterias saprófitas en las que las colonias
aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patógenos uno de los pigmentados
más importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se aprecia
en las células individuales a que se debe a gránulos intracelulares muy pequeños para verse con luz
transmitida.
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SUPERFICIE
Lisa
Rugosa
Plegada
CARACTERÍSTICAS ÓPTICAS
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios sólidos, en los medios líquidos las características de la
bacteria sembrada se reflejan en las características que presenta el caldo
Inoculado como son:
Turbidez: Opacidad más o menos densa, signo de crecimiento.
Película: Crecimiento casi continúo sobre el líquido
Sedimento: Depósito de células en el fondo del tubo que se resuspende al agitar
PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
Anote las características coloniales de cada cepa en la tabla, basándose en el Texto, las figuras:
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevación
Superficie
Consistencia
Color
Luz
transmitida
Luz reflejada
MEDIO SEMISÓLIDO
58
Bacteria
Movilidad
IV. CUESTIONARIO
1. Qué método utilizaría para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo puro, joven, injuriado y
envejecido.
2. Por qué algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en caldo una característica
de forma de película.
3. ¿Cómo se visualiza el polisacárido extracelular y a qué bacteria puede corresponder?
4. ¿Qué es la prueba de catalasa, cómo se realiza y qué utilidad tiene?
5. ¿Cómo se interpretan los resultados de una prueba de fermentación de hidratos de carbono?
V. OBSERVACIONES
VI. CONCLUSIONES
59
PRÁCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO
I. INTRODUCCIÓN
Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que
incide sobre ellos. La turbidimetría mide la entidad de luz transmitida por la suspensión, mientras
que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometría. Por estos procedimientos se
puede estimar el número de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o
difractada por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de
células en el cultivo. El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz
transmitida. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo
el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana
es medida por una célula fotoeléctrica e inversamente proporcional a la cantidad de bacterias.
Normalmente la multiplicación bacteriana no se expresa como disminución de la luz transmitida
(transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta última es
directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión. La relación entre la
transmitancia y la absorbancia se expresa matemáticamente de la siguiente manera:
Para el manejo práctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy útil el uso de
matraces con brazo lateral, ya que permite la realización de medidas sin necesidad de tomar
muestras del cultivo, evitando así el riesgo de contaminación por la manipulación.
II. OBJETIVOS
El intervalo para la formación de dos células a partir de una se llama generación y el tiempo
requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación,na entre los
microorganismos, algunos crecen rápidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros requieren
de una a tres horas, otros de varias horas o incluso días.
60
3.1. CURVA DE CRECIMIENTO
Si se inocula un medio liquido con células microbianas, procedentes de un cultivo que ha
crecido a saturación, en el que se ha determinado el número de células variables por minuto
periódicamente y trazamos una gráfica de ello, se obtiene una curva de crecimiento. Esta
curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes:
1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptación, los microorganismos se encuentran
desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados
hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie.
2. Fase Exponencial.- Llamada fase logarítmica, es consecuencia de la división celular y
las nuevas células crecen en progresión geométrica, se sintetiza nuevo material celular a
velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial.
3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metabólicos
tóxicos. Aquí cesa el crecimiento de una población.
4. Fase de Declinación.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el
microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta
alcanzar un nivel sostenido.
Fases de Crecimiento
Latencia Exponencial Estacionaria Muerte
Rezago Logaritmo Nutrientes se agotan
Declinación
Adaptación Divisón celular Acumulan metabolitos tóxicos
Crecimiento Sesa crecimiento
1
9,0
Log 10 organismos
Turbidez 0,75
viables/ml
Densidad óptica
8,0 Viables (densidad óptica)
0,5
7,0
0,25
6,0
5,0 0,1
Tiempo
Equipo
- Mechero Bunsen
- Estufa de incubación a 37ºC
- Microscopio
- Espectrofotómetro
61
V. METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO
Curva de Crecimiento.- Las células que están creciendo en un cultivo discontinuo (en un
matraz en agitación) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento:
una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las
células en fase de latencia, que proceden de una alícuota de un cultivo anterior que ha sido
transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida.
Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rápido.
La duración de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del
inóculo, de la temperatura, de la concentración en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la
aireación, y de la concentración de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo.
Una vez que las células empiezan a crecer rápidamente, se dice que han entrado en la fase de
crecimiento logarítmica (log) o exponencial. En este estadio las células crecen rápidamente,
y a diferencia de las células de las fases de latencia y estacionaria, la mayoría de las células se
hallan en el mismo estado fisiológico. La velocidad de crecimiento durante la fase log
depende del nivel de nutrientes y de la aireación de cultivo. La constante de velocidad de
crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un
crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicación o tiempo de
generación).
Realización (Fig. 1)
(Todas las maniobras que se describen a continuación se deben realizar en condiciones de
esterilidad en las proximidades del mechero.)
1. Añadir solución salina estéril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3
mi) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación.
2. Tomar 0.5 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz
con 50 ml de Caldo nutritivo prparado por componentes, estéril.
3. Incubar el matraz en un baño termostatado a 37 ºC, con agitación (200 rpm).
4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540
nm). Ajustar el espectrofotómetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo
Caldo Nutritivo estéril antes de cada medida.
5. Recoger alícuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubación y colocadas en
refrigeración hasta su lectura
6. Dibujar una curva de multiplicación con los datos obtenidos, colocando en el eje de
abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.
62
VII. CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué se calibra el espectrofotómetro a 100% de transmitancia con medio de cultivo estéril?
2. ¿Por qué motivo puede ser de alguna forma útil conocer la curva de multiplicación de una
bacteria?
3. Identificar en la gráfica las fases del desarrollo microbiano.
4. Proponer otra técnica experimental de evaluación del crecimiento microbiano.
63
VIII. OBSERVACIONES
IX. CONCLUSIONES
64
PRÁCTICA
CONTEO DE CÉLULAS MICROBIANAS
I. OBJETIVO
Determinar el recuento directo de células microbianas con la cámara de contaje celular.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente
simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos
(cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el “Cell Coulter”.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos
basta con una cámara de contaje celular, por ej. La cámara de Neubauer, y un microscopio. Una
cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a
medir. El dispositivo presente unas señales que determina un volumen conocido (x microlitros).
Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se pueden
determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen.
Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas,
la concentración en la suspensión celular será:
65
Concentración en la suspensión (células / mL) == 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el
microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado.
Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.
El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rápida de estimar la cantidad de
células microbianas, sin embargo, tiene algunas limitaciones:
1) No se distinguen las células muertas de las células vivas.
2) Las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio y posiblemente se omitan algunas
células.
3) La precisión es difícil de lograr
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teñido la muestra.
5) El método no es adecuado para suspensiones de células de baja densidad. En el asa de bacterias,
en una suspensión de células con menos de 106 células por mililitro, se podran ver pocas o
ninguna bacteria.
IV. METODOLOGÍA
CARGANDO LA CÁMARA
Agita la suspensión celular con el vórtex. Aspira una pequeña cantidad de suspensión con
una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequeña en la superficie pulida de la cámara de
recuento cerca del extremo del cubre. La suspensión entrará en la cámara por capilaridad.
Una cámara adecuadamente llenada contiene células solo en el espacio contenido entre el
cubre y la cámara de recuento. No debería sobrar fluido que cayera en los surcos.
V. CUESTIONARIO
66
1.- Investigue las características de:
Cámara de cuenta de Petroff – Hausser, equipos automáticos de Contaje celular, Otros métodos de
recuento celular
2.- Indique como diferencia las células viables de células totales.
3.- Describa los métodos directos e indirectos de contaje celular.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
67
PRÁCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE
DILUCIÓN EN PLACA
I. OBJETIVOS
Aprender la técnica de dilución para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes fuentes de inóculo.
II. INTRODUCCIÓN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formación de colonias, la técnica por
vaciado en placa es la más utilizada. La muestra en cantidades conocidas se deposita en cajas petri estériles,
se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de 45°C y se mezcla con la muestra.
Después de la incubación se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas por el inverso de la
dilución que corresponda permite estimar el número de microorganismos viable por gramo o mL de
muestra, obviamente con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoquímicas y tipo
de colonias contadas), el recuento obtenido se referirá a determinado grupo de microorganismos. Esta
técnica permite la mayoría de las veces cuantificar la contaminación en alimentos, medicamentos.
68
Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tinción de Gram, Cajas
Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml,
Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodón, gasa, alcohol.
IV. METODOLOGÍA
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
69
Preparar las muestras según procedimientos recomendados para la preparación y dilución de muestras.
Pipetear a placas Petri estériles, alícuotas de 1 ml. A partir de las diluciones, dilución 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10-6, 10-7.
Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y temperado a 45°C, mezclar
rápidamente con movimientos vaivén y rotación de la placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posición invertida a 37 °C por 48 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos según:
a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias.
b) Tomar la media aritmética de dos recuentos y multiplicar por el factor de dilución utilizada. Reportar
el resultado como numero de m.o. aerobios mesofilos viables por gramo o mililitro, según el caso
c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y mayores que 300,
tomar el promedio de los dos recuentos y computar el recuento para cada una de las diluciones y
establecer la relación de los dos recuentos
V. RESULTADOS
VI. CUESTIONARIO
VII. OBSERVACIONES
VIII. CONCLUSIONES
70
PRÁCTICA
OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA
Lessonia trabeculata
I. OBJETIVO
Aplicar técnicas de extracción de ácido alguinio a partir de algas.
Aplicar técnicas de purificación de ácido alguinio a partir de algas.
II. INTRODUCCIÓN.
Existen variedades de algas pardas que producen ácido algínico, que es la base para producir alginato de Sodio,
Potasio, Calcio, etc. El alga Lessonia trabeculata, crece en grandes cantidades en las costas de Arequipa.
En el litoral sur peruano se encuentran tres especies de algas pardas, tales como: Macrocystis pyrifera,
“sargazos” Lessonia trabeculata (“aracanto”, “palo”) y Lessonia nigrescens (“aracanto negra”), en ambientes
inter y submareales. Existen dos modos de su aprovechamiento: a) por medio de la extracción, y b)
mediante el recojo, colecta y acopio, por lo cual existen disposiciones normativas, que en resumen, en la
actualidad, prohíben la actividad extractiva a nivel de todo el litoral peruano (RM N° 839- 2008-
PRODUCE), y de otro lado, autorizan el recojo, colecta y acopio de algas varadas (RM N° 264-2009-
PRODUCE).
En las algas pardas, el ácido algínico es uno de los principales constituyentes de las paredes celulares,
casi siempre se encuentra con otros polisacáridos, como laminarina (5-30%), fucoidina (2-12%),
diferenciándose de estas dos últimas por la propiedad de insolubilidad en el agua y por encontrarse asociado con
varios cationes: calcio, magnesio y sodio. El ácido algínico es un polisacárido, de fórmula general: (C6H8O6)n,
donde «n» se repite de 80 a 83 veces., y compuesto de ácido manurónico y ácido gulurónico unidos con
enlaces -1,4, en su estado natural se encuentran formando geles con iones Ca+2, Na+, Mg+2, Sr+2 y Ba+
71
Fig… Moléculas constitutivas del ácido algínico.
El ácido algínico se solubiliza en medio alcalino (Na2CO3, NaOH) por intercambio iónico, formándose alginato
de sodio, que es soluble y de fácil extracción.
Al ácido algínico y los alginatos son bastante higroscópicos y un secado completo es muy lento, presentando
una humedad de un 15-25%.
La viscosidad de una solución de alginato es una propiedad que depende o deriva de su peso molecular del
polisacárido, y de la relación de ácido manurónico a ácido gulurónico (M/G).
Material de Laboratorio:
Termómetro, vasos de precipitación, probetas, telas de tocuyo, erlenmyers, fiolas, pH-metro, papeles filtrantes,
pipetas, embudos, etc.
Reactivos:
Ácido clorhídrico, carbonato de sodio anhidro, nitrato de plata, hipoclorito de sodio, etanol, etc.
Equipos:
Potenciómetro, balanza analítica, estufa graduada para baja temperatura.
1.- Pesar 20 gr de alga seca (tallos y hojas) y colocarla en un balón de vidrio de 2 litros, con suficiente
cantidad de agua destilada que cubra las algas. Se produce un hinchamiento de las hojas y ablandamiento
de los tallos, el lavado se repite varias veces para eliminar las sales solubles hasta que los líquidos no den
precipitado con solución diluida de nitrato de plata.
2.- Para eliminar las impurezas, se hacen varios lavados con solución 0,2 N de HCl, los cuales terminan
cuando el líquido del lavado no da turbidez con etanol.
Así se transforman los alginatos en ácido algínico (insoluble).
MCl HAlg HCl MAlg.
3.- Luego se corta la muestra en pequeños trozos, se agrega agua y se calienta hasta 45 C por unos 10
minutos.
5.- Las muestras lavadas se tratan con una solución de Na2CO3 al 10% en peso (ajustando el pH a 9-10),
se calienta hasta 70 °C agitando continuamente, luego dejar en reposo por varias horas, conviene dejarlo
hasta el día siguiente, de tal modo que se macere. Durante la maceración, el ácido algínico se somete a un
tratamiento alcalino para solubilizar el extracto como alginato de sodio, como resultado, la solución
presentará un aspecto lechoso parduzco y viscoso.
6.- Se filtra y el residuo se vuelve a tratar con Na2CO3 al 2% a 70 ºC por 10 minutos, se filtra y el filtrado
se agrega a la solución anterior y, si es necesario, se vuelve a filtrar.
7.- Los filtrados anteriores tienen un aspecto coloidal y de color pardo oscuro. Para blanquearlo o
decolorarlo se agrega una solución de hipoclorito de sodio al 5.25% en la proporción de 1/10 del
volumen de los filtrados resultantes que contiene el vaso de precipitado y se deja actuar por unos 10
minutos.
8.- Al filtrado total contenido en el vaso de precipitados se determina el pH inicial, luego se acidifica con
HCl concentrado, agregando de 10 en 10 ml , midiendo su pH hasta llegar a pH=2:
72
Se observa la formación de una gran masa de precipitación blanquecina, que se deposita en el fondo del
recipiente. Se hace el filtrado empleando tela de tocuyo blanco, lavando el filtrado con ácido clorhídrico
diluido.
9.- La purificación consiste en cambiar de fase el compuesto de interés para eliminar con la otra fase los
contaminantes, en este caso se precipitará con cloruro de calcio el alginato quedando los contaminantes,
en su gran mayoría, en las aguas sobrenadantes.
2NaAlg + CaCl ----- CaAlg + 2NaCl
10.- El precipitado obtenido, Alginato de calcio, se blanquea y desodoriza mediante un lavado con
NaClO. El alginato de calcio es de interés comercial obtenido en forma purificada, a partir de él pueden
obtenerse los restantes.
A continuación el alginato de Calcio se acidifica con ácido clorhídrico al 5%, 11.- para transformarse en
ácido algínico, como se muestra en la siguiente reacción:
CaAlg + 2HCl---- HAlg + CaCl
12.- El ácido algínico se escurre y se seca en estufa de vacío a 50°C hasta peso constante, por unas 5
horas, se enfría y se pesa.
El último producto buscado es el alginato de sodio el que se consigue desde la solución ácida de ácido
algínico por alcalinización con NaOH 5 N, como este alginato es soluble en agua se seca en estufa de
vacío a 50°C hasta peso constante.
HAlg + NaOH ---- NaAlg + H2O
V. CUESTIONARIO
VI. RESULTADOS
73
VII. OBSERVACIONES
VIII. CONCLUSIONES
74
PRÁCTICA
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE
MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL
I. OBJETIVOS
• Seleccionar microorganismos de diferentes fuentes, que puedan servir para la obtención de metabolitos
de interés industrial.
• Aplicar técnicas de purificación de microorganismos aprendidas previamente en microbiología general.
Las áreas de aplicación de la microbiología industrial son muy variadas, y de ellas surge la importancia y
el impacto que tiene esta disciplina en la actualidad.
En primer lugar, se debe destacar la importancia de la microbiología industrial en el mantenimiento de la
salud y tratamiento de enfermedades, fundamentalmente por su aplicación en la producción de
compuestos de actividad farmacológica y de vacunas.
En la industria de alimentos es también significativa la aplicación de la microbiología industrial, en la
producción de bebidas, enzimas, saborizantes, productos lácteos y muchas otras aplicaciones.
La producción agropecuaria se ve también favorecida en sus aspectos de producción vegetal y animal,
por un conjunto variado de procesos microbiológicos.
El área de aplicación en minería está relacionada con la biolixiviación, o sea, con la aplicación de
microorganismos en la extracción de metales de minerales de baja ley.
Finalmente, el área de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicación de microorganismos en la
purificación de efluentes, aspecto fundamental para el mantenimiento de la calidad de vida.
Debido a que el éxito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado,
para la elección del mismo se deben tener en cuenta los criterios generales que se indican a continuación:
75
Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de
fuentes naturales o de una colección de cultivos. En el ámbito industrial, en general, cada firma posee su
propia colección de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados por medio de técnicas clásicas
de mutación o de ingeniería genética. Sin embargo, estas cepas sólo son empleadas por la industria que
las posee, debido al gran valor comercial que representan. En algunos casos se dispone de organismos
modificados genéticamente para llevar a cabo reacciones específicas de biosíntesis, degradación o
biocatálisis, los cuales están protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos
aislados o modificados no está disponible para uso general en laboratorios.
Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales, como agua, suelo, plantas y desechos, la elección
del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las
propiedades que son de interés.
Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas, se podrían encontrar organismos adaptados a la
degradación de estos productos químicos; o en larvas de insectos muertos, agentes causales de la muerte.
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de éxito dependen de la técnica elegida para el mismo;
en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, b) enriquecimiento del cultivo con o sin pre
tratamiento de la muestra.
Materiales y Reactivos
Asa.
Hisopos estériles.
Bolsas plásticas 1 l.
Cuchillo.
Caja Petri con agar nutritivo.
Caja Petri con agar papa dextrosa.
Caja Petri con agar YPD con 10 % de
Aceite de oliva.
Incubadora.
Mechero.
Balanza.
76
3. Incubar las cajas de APD a 30 °C y de AN a 37 °C.
Procedimiento para identificar los microorganismos de interés industrial
Dependiendo del uso que se esté buscando para los microorganismos y la industria donde se emplearán,
será el procedimiento a seguir.
1. En el queso se buscarán levaduras con actividad lipasa o esterasa, para eso se inocularán
diferentes colonias por picadura en la superficie de una caja de agar YPD
Con 10 % de aceite de oliva. De ser positivo, se observará un halo transparente, resultado de
la actividad lipasa positiva.
2. También en el queso se buscarán bacterias del genero Lactobacillus ácido-lácticas, con potencial
para ser utilizadas para la preparación de yogur. Se efectuarán las pruebas bioquímicas
pertinentes para su identificación.
3. En la piña se buscarán hongos del género Aspergillus, productoras de ácido acético, así como
bacterias ácido-acéticas para la producción de vinagre. La identificación del hongo se hará
con base en sus características macroscópicas y microscópicas, y para las bacterias se harán
pruebas bioquímicas.
4. Con la tierra se seguirá el procedimiento dependiendo lo que crezca en la caja de cultivo, ya
sea hongos, levaduras o bacterias. Para el caso de los hongos, se identificarán con base en sus
características macroscópicas y microscópicas; para las bacterias, se harán pruebas
bioquímicas. En el caso de las levaduras, se observarán las características morfológicas de las
colonias y un frotis en fresco al microscopio.
IV. CUESTIONARIO
77
V. RESULTADOS
Queso
Piña
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
78
PRÁCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
I. OBJETIVO
La fijación biológica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su hospedero, lo infecta
a través de los pelos radicales para que en la matriz de las células corticales induzca una meiosis y
mitosis acelerada que da lugar a un tejido hipetrofiado: El nódulo en el sistema radical de la
leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se ha transformado en un
bacteroide, mientras que por la enzima llamada nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio,
que luego transfiere al ribosoma vegetal para la síntesis de proteínas vegetales; simultáneamente
por la fotosíntesis la leguminosa reduce el C02 en carbohidratos que servirán como fuente de
carbono y energía para Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo
activo en el nódulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.
Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicación de fertilizantes
químicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen
el rendimiento en las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de producción y la
contaminación de mantos acuíferos y suelos, es vital para una agricultura sustentable.
79
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Material Biológico
- Raíces de alfalfa con nódulos
Matraces
- Placa Petri
- Pinzas bisturí
- Mecheros
- Vasos PP 100 ml
Reactivos
- Agua destilada estéril
- Hipoclorito de sodio 2.5%
- Bicloruro de Mercurio 0.2%
- Medio PSA (papa sacarsa agar)
IV. METODOLOGÍA
80
V. CUESTIONARIO
- Qué otros medios se utilizarían para el cultivo de Rhizobium.
- Cuál es la ruta metabólica que utiliza el Rhizobium.
- Cuál sería la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.
VI. OBSERVACIONES
VII. CONCLUSIONES
81
PRÁCTICA
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
I. FUNDAMENTO TEORICO
La detección y cuantificación de todos los microorganismos patogénicos potencialmente presentes en el agua demanda tiempo,
los costos son elevados y no siempre se obtienen resultados positivos o que confirmen la presencia de los microorganismos.
El objetivo de la prueba microbiológica del agua es proveer subsidio acerca de su potabilidad, es decir, ausencia de riesgo de
ingestión de microorganismos causadores de enfermedades, mayormente provenientes de la contaminación por excrementos
humanos y de otros animales de sangre caliente. Vale resaltar que los microorganismos presentes en aguas naturales son, en
su mayoría, inofensivos a la salud humana. Pero en la contaminación por desecho sanitario están presentes microorganismos
que podrán perjudicar la salud humana. Los microorganismos patogénicos incluyen virus, bacterias, protozoarios y
helmintos.
El agua potable no debe contener microorganismos patogénicos y debe estar libre de bacterias
indicadoras de contaminación fecal. Como indicadores de contaminación fecal, las bacterias de referencia
elegidas son las del grupo coliforme. El principal representante de ese grupo de bacterias es llamado
Escherichia coli. Ese grupo de bacterias ha sido elegido como indicador de contaminación del agua
debido a los siguientes factores:
a. Están presentes en el excremento de animales de sangre caliente, incluso de los seres humanos;
d. El tiempo de sobrevivencia en el agua es mayor que las bacterias patogénicas intestinales, por
ser menos exigentes en términos nutricionales, además de ser incapaces de multiplicarse en
ambiente acuático o multiplicarse menos que las bacterias entéricas; y. Son más resistentes a
los agentes tensoactivos y agentes desinfectantes que a las bacterias patogénicas.
En este grupo se incluyen cuatro géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella, además de
algunas cepas de Serratia (ver Tabla ).
82
Tabla . Características del grupo coliforme
Gas glucosa + + + +
Lactosa + + + d
Indol + d - -
Rojo metilo + - - +
Voges-Proskauer - + + -
Citrato - + + +
Urea - + +/- d
Movilidad +/- - + +
d= dudoso
El hábitat natural de los coliformes es el tracto intestinal humano y animal, aunque también se
pueden aislar de muestras medioambientales (tierra, polvo, aguas superficiales y vegetales). Así, su
procedencia puede ser tanto fecal como no fecal. Los coliformes son resistentes a condiciones
medioambientales adversas, soportan la desecación, pero no condiciones de congelación o refrigeración.
Esta última característica hace que su investigación en alimentos congelados no tenga ninguna relevancia.
Solamente son útiles como indicadores de la calidad en ciertos tipos de productos terminados o
indicativos de la fase de conservación y almacenamiento.
En el grupo coliforme destacan por su mayor significación sanitaria los coliformes fecales,
entendiendo como tales aquellos capaces de desarrollarse entre 44 y 46ºC (habitualmente 44,5º o 45,5ºC)
con producción de ácido y gas a partir de lactosa.
• Escherichia coli – bacteria del grupo coliforme que fermenta la lactosa y manitol, con producción de
ácido y gas a 44,5 ± 0,2oC en 24 horas, produce indo a partir del triptófano, oxidase negativa, no hidroliza
83
la urea y presenta actividad de las enzimas ß galactosa y ß glucuronidase, que es considerado el más
específico indicador de contaminación fecal reciente y de eventual presencia de organismos patogénicos.
El origen fecal de la E. coli es incuestionable y su naturaleza ubicua poco probable, lo que valida su papel
más específico de organismo indicador de contaminación, tanto en aguas naturales como tratadas.
El Recuento Estándar de Bacterias es muy importante durante el proceso de tratamiento del agua, ya que
permite evaluar la eficiencia de varias etapas del tratamiento. Es importante también conocer la densidad
de bacterias, haya visto que un aumento considerable de la población bacteriana puede comprometer la
detección de organismos coliformes. Aunque la mayoría de esas bacterias no sea patogénica, puede
representar riscos a la salud, como también, deteriorar la calidad del agua, provocando olores y sabores
desagradables.
II. PROCEDIMIENTO
Por razones prácticas, en este experimento sólo vamos a tratar de distinguir la presencia y
cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes:
El método a seguir consistirá en efectuar una serie de diluciones decimales del agua contaminada en
solución fisiológica, siguiendo el esquema que se representa a continuación:
1) Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las diluciones 10-5,
10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar común, e incubarlas a 37ºC durante la noche en posición
invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el número de colonias y se multiplica por los factores de
dilución correspondientes.
84
3) Determinación de Salmonella y Proteus. Se extienden 0.1 ml de las diluciones 10-
5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37ºC durante 24-48 horas. Sobre este
medio Salmonella y Proteus generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las
colonias se vuelvan rosa, mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el
amarillo (una buena forma de detectar coliformes).
Con estos datos, hay que deducir el número de bacterias (por ml) de agua contaminada que dan
colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o Proteus, hay que reinocularlas en caldo de
urea y en TSI. Sobre caldo de urea la estirpe de Proteus debe generar color azul. Salmonella da
negativo para ambas actividades. En TSI únicamente la estirpe de Salmonella debe aparecer
con precipitados negros (por producción de SH2 que genera sulfuro de hierro), apareciendo el resto
de los caracteres siguientes:
III. RESULTADOS
IV. OBSERVACIONES
V. CONCLUSIONES
85
PRÁCTICA
MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS
COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y ESCHERICHIA
COLI POR LA TÉCNICA DE DILUCIONES EN TUBO
MÚLTIPLE (NÚMERO MÁS PROBABLE O NMP)
I. OBJETIVO
II. GENERALIDADES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como
vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador
de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben
tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse
extraintestinalmente.
El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las
características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se
observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de
contaminación fecal en agua; conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la
probabilidad de estar frente a una contaminación reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo
que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En
productos alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción,
etc.), se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.
El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram- negativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso
máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de
fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a
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44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es
Escherichia coli.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia
Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y
animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas.
Estas
E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus factores de virulencia únicos, cada
grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las propiedades de adherencia a las células
epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De
manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterohemorrágica
(EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa
(DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores,
las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos
contaminados.
Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del
viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy
frecuente en países subdesarrollados y afecta principalmente a los niños.
Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolábil
de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y función es similar a la toxina del cólera,
la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de
resistir temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos.
La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en
ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias,
por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser más baja.
Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes
particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las células de la mucosa del
intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células
mucosas. La infección
Por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque ocasiones puede ser crónica.
Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que codificada por el gen eae y
un factor de adherencia que es codificado por plásmido, ambas proteínas permite su unión a los
enterocitos y la destrucción las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y
productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 106
microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli
los cuales pueden ser identificados mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en ocasiones
del antígeno H (flagelar).
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente
relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se
presenta comúnmente en niños de países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos
lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células
epiteliales de la mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC
la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas características importantes de este
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microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como
fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogenicos.
La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon
debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas.
Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así por su efecto
citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de monoverde africano. Existen al
menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica, una
variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico hemolítico, enfermedad capaz de producir
insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene
muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae
tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más común y el único que
puede identificarse en muestras clínicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es
negativa a la prueba de MUG.
La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada,
particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y
sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por las cepas de Escherichia coli
antes descritas.
III. FUNDAMENTO
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable
(NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con
producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C 1 C durante 48 h., utilizando un medio de
cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y
la fase confirmativa.
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En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual
permite la recuperación de los microorganismos dañados que se
encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de
carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde
brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de
tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.
La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir
de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para
fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1 C por
un periodo de 24 a 48 h.
La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se
siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de
metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.
Para la preparación del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o
hielo, consultar el cuadro 1.
1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de fosfatosa
2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución amortiguadora de
fosfatosa
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentración sencilla o
caldo lactosado concentración sencilla con campana de Durhama
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de
Durhamb.
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana de Durhamb.
cajas Petri con agar para métodos estándard 2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Kosere
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V. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe
Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e
Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % VP2e
COLORANTES PARA TINCIÓN DE GRAMd
NOTAS
Material necesario al inicio de la práctica.
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. Material necesario a las 96
h. de iniciada la práctica. Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.
Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica
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DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES
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DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SÓLIDAS O ALIMENTOS
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VII. PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los tubos con
caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. tubos para homogeneizar la muestra.
Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay formación de
gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa producción de gas,
incubar 24 h. más.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro
tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de
Durham.
Agitar los tubos para su homogeneización.
Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h..
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y producción
de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h..
Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes
totales/100 mL.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril
sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham.
Agitar los tubos para su homogeneización.
Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h.
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Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas
después de un período de incubación de 24 a 48 h.
Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes
fecales/ 100 mL.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter
aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estría cruzada en
agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.
Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con centro
negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más
colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las
pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas.
Incubar las placas a 35°C por 18-24 h.
Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o
cocobacilos Gram-negativos.
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inóculo ligero para evitar turbiedad en el
tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
Incubar a 35°C por 96 h.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una prueba positiva.
NOTAS
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Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al agar SIM.
Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogíca de forma recta.
Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el reactivo de
Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono, también se puede
utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de
flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia de una coloración azul debida al vire del indicador
que contiene el medio, indica prueba positiva
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG (4 metil-
umbeliferil- -D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la
enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4-metilumbeliferil-beta-D-
glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz
ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fácil de observar. Cuando
el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formación de gas , tomar
una asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de confirmación EC-MUG.
Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de gas; si no
se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más.
Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura.
Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae
como control negativo.
2. Alimentos
Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estériles y mezclar.
Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en reposo de 2-3
minutos.
Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de trabajar con
muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2°y 5 °C.
Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato
de sodio.
Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo
lauril sulfato de sodio.
Incubar a 35-37°C durante 24-48 h.
Los tubos después de la incubación, se registrarán como positivos si presentan crecimiento y
producción de gas.
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2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a otro
tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de
Durham.
Agitar los tubos para su homogeneización.
Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas,
después de un período de incubación de 24 a 48 h.
Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el número más
probable de organismos coliformes totales por mL.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo
lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de
Durham.
Agitar los tubos para su homogeneización.
Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y producción de gas
después de un período de incubación de 24 a 48 h.
Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el número más probable de organismos
coliformes fecales por mL.
Control de calidad
Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados
positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar McConkey a partir de los tubos que
demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa.
Incubar las placas a 35 ± 0.5°C durante 24 ± 2 h., observar las colonias típicas fermentadoras
de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares.
Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las bacterias.
Seleccionar 1 o más colonias aisladas para realizar pruebas IMViC.
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CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable conforme al procedimiento
señalado en la tabla 1, (que se muestra a continuación y es utilizado para el análisis de agua), para estimar
la población de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con
las diluciones empleadas.
Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar volúmenes de
20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utilizar las siguientes
tablas:
TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de
resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo.
TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de
resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo.
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FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS
USADOS EN LAS DIFERENTES PRÁCTICAS
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BIBLIOGRAFÍA
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FARRAS, Ramón Parés J. “Bioquímica de los Microorganismos”. Ed. Reverté, S.A., España, 1997.
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Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica del número mas
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