Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Química y Biología

Ingeniería en Biotecnología
Química Orgánica II

Variación de actividad
enzimática según factores
fisicoquímicos
Práctico nº 2

Integrantes: -Sofía Miranda A.

-Gabriela Vásquez M.
Profesora: A. Catalina Muñoz R.
Fecha entrega: 15 de noviembre de 2018
Las enzimas son complejos de proteínas (en su gran mayoría), altamente especializadas que actúan
en la catálisis de las reacciones químicas, disminuyendo la energía de activación del proceso,
aumentando la velocidad de la reacción. Esta actividad enzimática puede ser alterada por diversos
factores como la temperatura, el pH, los cuales se analizarán a continuación en la proteína albúmina
utilizando pepsina ácida, una enzima que se encuentra en el estómago capaz de catalizar los enlaces
peptídicos de los aminoácidos aromáticos mediante hidrólisis[1].
Procedimiento experimental:
Actividad 1
 Se preparó una solución madre 1% m/v de pepsina, de la cual se obtuvieron diluciones 0,66
y 0,33% m/v de pepsina.
 A cuatro tubos de ensayo se le agregaron 10 mL de una solución de albúmina previamente
preparada y con la absorbancia ajustada de 0,93. Al tubo 1 se le agregó 1,5 mL de pepsina
1%. Al tubo 2 se le agregaron 3 gotas de HCl 10% para obtener un pH entre 2-3, el cual fue
evaluado con papel pH, este procedimiento se repitió para los tubos 3 y 4. Al tubo 3 se le
agregaron 1,5 mL de la solución de pepsina 1%. Al tubo 4 se le agregó 1,5 mL de pepsina 1%
pero calentada previamente hasta ebullición utilizando un mechero.
 Se llevó a baño maría a 4°C aproximadamente durante 5 minutos, para luego llevar las
muestras a un baño en hielo para ser rápidamente enfriadas.
 Finalmente se midió la absorbancia a 430 nm en un espectrofotómetro.
Actividad 2
 A 4 tubos de ensayo se le agregó 10 mL de albúmina, 3 gotas de HCl 10% hasta obtener un
pH 2 evaluado con papel pH.
 Con una micropipeta se añadieron 1,5 mL de soluciones pepsina: al tubo 1 pepsina 1%, al
tubo 2 pepina 0,66%, al tubo 3 pepsina 0,33% y al tubo 4 se le agregó agua destilada (0%
pepsina) respectivamente. Luego con una varilla de agitación se homogeneizaron las
muestras tomando la precaución de lavar la varilla cada vez que se utilizaba en una muestra.
 Se calentaron las soluciones en un baño de 40°C aproximadamente durante 5 minutos para
luego darles un baño en hielo para enfriar las muestras.
 Finalmente se midió la absorbancia de las muestras a 430 nm con un espectrofotómetro.
Resultados y discusión

Para el cálculo de las diluciones de pepsina 1% se prepararon con las siguientes composiciones

Tabla 1. Cantidades añadidas de agua y pepsina para preparación de diluciones

Concentración requerida Volumen de agua añadida Volumen de pepsina añadida

(%m/v) de pepsina (mL) (mL)

1 100 1 (*)

0,66 2 1

0,33 1 2
(*) Es un gramo de pepsina, ya que es la solución madre.

Actividad 1

Tabla 2. Datos obtenidos de absorbancia a distintas condiciones de pepsina 1%.

Tubo Absorbancia a 430nm En la tabla 2 se representa la absorbancia medida en

430 nm para cada muestra con diferentes
condiciones. El tubo n°3 obtuvo una absorbancia
1 0,891 0,763, siento éste el menor valor medido entre los
cuatro tubos. A diferencia de las demás muestras,
este tubo posee un nivel de pH 2, la temperatura de
2 0,893
40°C, y la solución de pepsina, por lo tanto, cuenta
con las condiciones óptimas para que la enzima
3 0,763 catalice la hidrólisis de los enlaces peptídicos de los
aminoácidos aromáticos presentes en la albúmina. El
tubo n°1 obtuvo una absorbancia elevada y
4 0,9 semejante a la original de albúmina pura, debido a
que la enzima no contaba el pH óptimo dado que no
fue ajustado.
En el tubo n°2, no había presencia de pepsina por lo que no se catalizó la reacción, resultando
nuevamente una absorbancia semejante a la de albúmina pura. El tubo n°4, si bien se ajustó el pH,
la temperatura fue el factor que causó que la reacción no se realizará, puesto que la enzima fue
desnaturalizada irreversiblemente al calentarla hasta ebullición en el mechero.

Actividad 2

Tabla 3. Valores obtenidos de Gráfico 1. Relación entre la absorbancia obtenida y la

absorbancia de pepsinas a distintas concentración de pepsina.
concentraciones
Tubo %m/v Absorbancia a
pepsina 430 nm

1 1 0,785

2 0,66 0,786

3 0,33 0,785

4 0 0,72

A partir del gráfico 1 y su línea de tendencia, se describe una relación directa y lineal de la
absorbancia y la concentración de las muestras. Esto es producto de que a medida que la muestra
posee mayor cantidad de enzima, mayor es la cantidad de aminoácido libre que queda después de
hidrolizar los enlaces de la albúmina. La reacción se llevó a cabo debido a que las condiciones eran
óptimas: el pH y la temperatura estaban en el óptimo para que la enzima catalizara la reacción. La
pendiente positiva de la recta coincide con la Ley de Lambert-Beer, quienes postulan que a una
mayor concentración de compuesto, empíricamente existe una mayor absorbancia. [2]

Conclusión
Una vez finalizada la actividad experimental se logró comprobar que la actividad enzimática se ve
afectada al alterar parámetros como la temperatura y el pH, ya que las enzimas tienen un pH y
temperatura óptima para realizar el proceso de catálisis, como en este caso de la pepsina que
trabaja menor en un ambiente ácido, es por esto que se encuentra en el estómago. Así como
también al calentar la solución de pepsina hasta la ebullición, se corroboró que pierda su capacidad
catalítica ya que el valor arrojado de absorbancia es muy similar al valor de la albúmina sin pepsina.
Finalmente se encontró una relación lineal entre la concentración de pepsina y la absorbancia.
Bibliografía

[1] A. Porto,2017, Enzimas, Recuperado de Curso de biología

http://www.bionova.org.es/biocast/tema14.htm visitado el dia 14 de noviembre de 2018

[2] The Digestion od Protein by Pepsin, John Borroughs School.

http://science.jburroughs.org/resources/MBLabs/16_Protein_Digest_Teach2.pdf visitado el día 14
de noviembre de 2018