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palabras claves

ecológico
socioeconómico
contaminantes
insectos silvestres
polinizadores

Resumen
las especie apis mellifera a sido de gran impacto en todo el mundo ya que en las últimas
décadas se ha presentado un alto índice de pérdida de la especie, algunos de esos
impactos más sobresalientes son los siguientes:
● deforestaciones
● actividades que afecten la calidad del aire
● cultivos agrícolas
● sobre población.
De lo cual generaron un estudio con 3 especies de abejas diferentes para lograr observar
que tipo de actividad las afectaba principalmente y se enfocaro principalmente a productos
quimicos que actuaban indirecta o directamnete con las abejas o colmenas, lo que lograron
observar es que al estar en contacto los quimicos de uso agricola observaron que se notaba
un mayor indice de mortalidad de las abejas dependiendo del tipo de quimico y su nivel de
contracion de lo cual realizaron una serio de pruebas de concetracion para observar cuando
se puede llegar a perder el 50% de las 4 especie de las abejas de lo cual vario
significativamente de lo que generearon una tabla de tipos de quimicos agricolas que se
utilizaron.

Quimico (clase Uso actual Escenario Mecanismo Metabolismo Otra


entre de de acción informaci
paréntesis) exposició ón
n

Clothianidin Tratamiento Nectar, Se une a los El citocromo La


(insecticida sistémico de polen, agua. receptores P450, tales clotianidin
neonicotinoide) semillas;colz nicotínicos de como CYP6G1 a es el
a oleaginosa acetilcolina en ​D primer
/ causando .​Melanogaster metabolito
remolacha.S por​ lo que la del
pray sobreestimula inhibición de tiametoxa
insecticida ción P450 podría m.
dar sinergismo.

Tau-fluvalinato Spray Contacto en Se une a Metabolizado La baja


(insecticida utilizado en campo y canales de por CYP9Q1, afinidad
piretroide) colza. En la productos sodio CYP9Q2 y por los
colmena de colmena. regulados por CYP9Q3 en canales de
varroacida. voltaje para abejas. sodio de las
despolarizar abejas es
los nervios menos
tóxica para
las abejas
que otros
piretroides

Dimetoato Spray Exposición Inhibición de Metabolizado Organofosf


(insecticida insecticida y al follaje y la por CYP3A en ato típico.
organofosforado tóxico de agua colinesterasa rata a La
) referencia potable si después del oxon-metabolit solubilidad
utilizado se usa. metabolismo o en agua
para pruebas del permite la
de toxicidad oxon-metaboli exposición
en abejas to. oral.

Propiconazol Se utiliza Exposición Desmetilación Ampliamente Interactúa


(fungicida) ampliamente foliar de C-14 en la metabolizado con la
como durante la biosíntesis de en ratas.Amplia cadena
fungicida en alimentació ergosterol, gama de respiratori
aerosol en la n de colza que conduce a metabolitos a, por lo
colza. oleaginosa la identificados. que podría
acumulación afectar el
de metil metabolis
esteroles C-14 mo
energético.
Ácido Herbicida Exposición Auxina Diferencias Efectos
2,4-diclorofenox sistémico foliar sintética que significativas de potenciales
iacético, común usado durante la causa el especies en el sobre los
en el control alimentació crecimiento aclaramiento sistemas
de malezas n de colza incontrolado en mamíferos. antioxidant
de hoja oleaginosa del tejido es.
(herbicida)
ancha. vegetal.

Cadmio (metal) Nada más Contacto Daño al ADN, Metalotioneína Uno de los
que uso suelo estrés metales
industrial oxidativo. más
pasado. tóxicos.

Arsénico Ninguno Contacto Daño en el Metalotioneína Toxicidad


(metaloide) excepto el con el suelo ADN, efecto y posiblemente conocida
uso más (especialme epigenético fitotelatinas.
amplio de nte en áreas sobre la
pesticidas cultivables) metilación del
(algunos ADN.
actuales)

los impactos mencionados anteriormente afectan significativamente a las abejas ya que le


altera su hábitat, principalmente están siendo afectadas por las actividades agricolas, lo
2 . material y métodos
2.1 . Estudio de especies

Se utilizaron tres especies de abejas para evaluar los peligros potenciales de


los productos químicos individuales seleccionados. La miel de abeja ​Apis
melliferas​ pp. Es una especie eusocial que es el polinizador manejado más
frecuente en el mundo. Las colonias administradas generalmente se
mantienen en colmenas que contienen miles de individuos (crías y adultos
que comprenden miles de trabajadoras, cientos de drones y una sola reina)
con castas bien definidas, cada una con funciones específicas dentro de la
colonia. Las colonias sanas, reina-derecha, persisten durante varios años.
Para este estudio, las abejas se obtuvieron como colmenas en el núcleo en la
primavera de 2014, de un criador comercial en el norte de Oxfordshire
Reino Unido, cada una con una reina apareada naturalmente el año
anterior. Se establecieron ocho colmenas, se inspeccionaron y mantuvieron
regularmente para garantizar que fueran la reina de la derecha y se
mantuvieran crías saludables y abejas adultas. Los trabajadores se
alimentaron libremente, pero no visitaron la colza oleaginosa (que no
estaba floreciendo) durante el período de prueba (de mediados a fines del
verano, durante el pico de la fuerza de la colonia). No se utilizaron
tratamientos de enfermedades químicas para 4 Meses previos a los ensayos
de prueba.
El abejorro ​Bombus terrestris audax​ es una especie eusocial más primitiva
sin un sistema de castas claro. Es un polinizador silvestre común que
también se cría comercialmente para la polinización en situaciones de
cultivo cerrado o semicerrado. En la zona templada es generalmente una
especie anual que vive en colonias que contienen c. 100–150 trabajadoras
durante el verano. Las colonias de Reino Unido nativa ​B​ . ​t​ . ​audax​ se
obtuvieron como colonias criadas comercialmente con c. 30 trabajadores
(NV Biobest, Bélgica). En el momento de la recepción, las colonias se
alimentaron con una fuente de alimento de sacarosa pura al 50% p / v,
suplementada con polen fresco y libre de enfermedades.

La abeja solitaria ​Osmia bicornis​ es una especie polinizadora silvestre no


eusocial que anida en cavidades. También se produce a pequeña escala para
la polinización comercial ( ​Gruber et al., 2011​ ). La especie produce nidos
únicos que contienen c. 4–8 huevos que solo pueden ser cosechados para
ser analizados durante los meses de primavera. Las pupas utilizadas para
incubar las abejas adultas que se utilizarán para este estudio se obtuvieron
de una población de campo manejada recolectada al final del año anterior,
es decir, < 1 año de edad. El hibernado ​O​ . ​Las​ pupas ​bicornis​ se
obtuvieron de poblaciones comerciales alemanas (Dr Schubert Plant
Breeding, Alemania).

2.2 . Selección química

Los productos químicos se seleccionaron para reflejar las preocupaciones


actuales sobre los efectos de los agroquímicos en los polinizadores y la
presencia generalizada de otros contaminantes traza, como los metales, en
el medio ambiente. Esto se equilibró con consideraciones mecánicas para
garantizar que se representaran diferentes metabolismos (p. Ej., Por el
citocromo P450, esterasas, glicoproteínas ​p​ , melloproteínas) y modos de
acción (p. Ej., Neurotoxinas, toxicidad metabólica, producción de especies
reactivas de oxígeno). Esto dio lugar a una lista que incluía representantes
de diferentes insecticidas, fungicidas y clases de herbicidas, así como un
metaloide y un metal tóxico no esencial ( ​Tabla 1​El dimetoato, un
insecticida organofosforado que se recomienda como un tóxico de
referencia para las pruebas de toxicidad con las abejas, también se incluyó
en la lista y se utilizó como una validación de la sensibilidad de los
individuos y colonias analizadas ( ​OCDE, 1998a​ , ​OCDE, 1998b​ ). Los
pesticidas se obtuvieron como estándares de pesticidas de grado analítico
(PESTANAL®), mientras que el cadmio y el arsénico fueron químicos de
grado analítico (todos fueron suministrados por Sigma-Aldrich®).

. ​2.3 . Exposición a sustancias químicas

El mismo enfoque se utilizó para probar todas las especies. Cada especie fue
expuesta a una serie de concentraciones del producto químico de prueba en
solución de sacarosa y se le permitió alimentarse a voluntad durante un
período de exposición total de 10 días (240 h). El consumo de la solución
de sacarosa dosificada se midió en peso a intervalos de 48, 96 y 240 h. La
mortalidad de las abejas se evaluó 3 veces al día durante las primeras 96 h
de exposición y, posteriormente, diariamente hasta las 10 dias. El diseño
específico de la prueba y las densidades de las abejas se modificaron para
reflejar los diferentes hábitos de cada especie (ver más abajo). La solución
madre de los productos químicos de prueba se preparó en agua (dimetoato,
clotianidina, cloruro de cadmio, arseniato de sodio) o acetona (fluvalinato
de tau, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, propiconazol) dependiendo de las
características de solubilidad. Para ​un​ . ​mellifera​ y ​b​ . ​terrestris​ las
soluciones madre se añadieron a un 50% ​w​ / ​v​ solución de sacarosa (grado
biología molecular, Sigma Chemicals) mientras que para ​O​ . ​Bicornis​ se
utilizó una solución al 20% p / v para imitar más estrechamente las
concentraciones de néctar ( ​Konrad et al., 2009​). Los controles negativos
fueron sacarosa sola o sacarosa con acetona al 1% según sea apropiado para
cada producto químico.

Para todas las especies, los ensayos se realizaron utilizando jaulas de


plástico de 500 ml con una tapa ventilada. Para ​un​ . ​mellifera​ y ​b​ .
Lass​ oluciones de sacarosa dosificadas de ​terrestris​ se suministraron en
jeringas Luer centradas desechables de 50 ml (sin látex ni aceite de
silicona) con la punta cortada en el cuerpo de la jeringa para proporcionar
un orificio para beber de aproximadamente 3 mm de diámetro. Para ​O​ .
Bicornis​ , las soluciones se suministraron en jeringas Luer céntricas
desechables de 5 ml con puntas cortadas. Para fomentar la alimentación de
O​ . ​Bicornis​ los comederos tenían una falsa seda amarilla.falsoPétalo fijado
sobre la punta de la jeringa y pegado en su lugar. Se aplicó un anillo de
pintura UV alrededor de la punta (siguiendo a ​Ladurner et al., 2003​ ) como
una señal de color UV.

Para ​un​ . experimentos de ​mellifera i​ abejas obreras adultas se recolectaron


de marcos que contenían crías jóvenes de cuatro colmenas seleccionadas al
azar. Cada réplica de prueba ( ​n​ = 4) comprendía un grupo de 10 abejas de
una sola colmena mantenidas juntas. Para facilitar el manejo, las abejas se
anestesiaron enfriándose en un congelador a - 20 ° C durante 45 segundos
y luego se cargaron en las jaulas con unas pinzas blandas dentro de la hora
de la recolección.

Para ​B​ . ​En los​ experimentos ​terrestris​ , los trabajadores fueron removidos
directamente de un mínimo de 4 colonias usando un fórceps largo. Las
abejas no fueron anestesiadas, ya que se podían transferir fácilmente a las
jaulas usando este método bajo luz roja, a temperatura ambiente. Cada
réplica de prueba ( ​n​ = 4) comprendía un grupo de 3 abejas de una sola
colonia mantenidas juntas. Durante los experimentos, tanto ​A​ . ​mellifera​ y
b​ . ​terrestris​ se mantuvieron en una habitación a temperatura constante a
25 ± 2 ° C, ~ 60% HR, en la oscuridad.

Antes de los experimentos ​O​ . ​Las​ pupas ​bicornis​ se almacenaron en la


oscuridad a 4 ± 1 ° C, 65 ± 10% de HR para restringir la emergencia. Para
cada experimento se seleccionó una cohorte de pupas, por peso, para dar
un número equilibrado de abejas macho y hembra (las hembras son
generalmente más grandes que los machos). Las pupas se calentaron a 28 °
C para fomentar la emergencia y las abejas que emergieron dentro de las 72
h (> 85% de los individuos) se asignaron al azar a las jaulas de tratamiento
(dentro del sexo). Para todos los experimentos, 5 machos y 5 hembras se
mantuvieron individualmente en jaulas duplicadas. Las abejas se
mantuvieron individualmente en jaulas separadas y se alojaron en una casa
de vidrio de temperatura controlada a 22 ± 2 ° C, ~ 60% HR, en
condiciones de iluminación natural y fotoperíodo. En contraste con ​A​ .
mellifera​ y ​b​ . ​terrestris:​ en los estudios previos se encontró que estas
condiciones conducían a un comportamiento más natural (es decir,
aumento de la alimentación, patrones diurnos naturales) que en la sala de
temperatura constante bajo luz artificial (datos no publicados de Heard et
al.). A través de las pruebas de control de las tasas de mortalidad para
ambos ​A​ . ​mellifera​y ​b​ . ​terrestris​ generalmente se mantuvo en niveles
bajos (c. 10%), incluso después de 240 h de exposición (máximo
mortalidad del control en una sola prueba a 240 h fue del 23% para ​A​ .
mellifera​y 33% para ​B​ . ​terrestris​ ). ​O​ . ​bicornis​ demostró una mayor
mortalidad de fondo (la supervivencia combinada de control masculino y
femenino en todos los experimentos promedió 65% (rango 40-80%) a las
48 h y 75% (rango 60-90%) a las 240 h), lo que sugiere que tal vez se debe
tener precaución Al interpretar los datos.

2.4 . Análisis estadístico

Utilizamos el análisis probit de los datos de mortalidad para predecir la


sensibilidad de la especie y la magnitud de la toxicidad química, expresados
​como valores de CL 5​ 0​ , es decir, la concentración de químico necesaria para
matar el 50% de las abejas de prueba a los tiempos de exposición de 48 h,
96 hy 240 h. Para cada producto químico, las diferencias entre las especies
en cada período de tiempo se probaron mediante pruebas z. También
usamos los LC modeladas 5​ 0​valores en cada período de tiempo para
calcular la relación sensibilidad, ​R​ entre los diferentes puntos finales para ​A
. ​mellifera​ y cada una de las otras especies donde ​R​ = LC 5​ 0 ​Apis​ / LC 5​ 0
Bombus​ u ​Osmia​( ​Arena y Sgolastra, 2014​ ) .​ ​Se utilizó un enfoque de modelo de
Presupuesto Energético Dinámico (DEBtox; ​Kooijman, 1981​ , ​Kooijman y
Bedaux, 1996​ , ​OCDE, 2006​ ) para predecir el curso temporal más largo de
los efectos tóxicos más allá del período de prueba. Fueron 480 h, una vez el
doble de la duración de la prueba; 720 h, un tiempo aproximadamente
equivalente a la vida útil de un trabajador de verano, la miel o el abejorro; y
2160 h, que es una duración aproximadamente equivalente a la vida
durante la invernada de una abeja obrera. Como antes expresamos los
resultados como ratios de la LC 5​ 0.​calculado en cada punto de tiempo. El
enfoque DEBtox utiliza un modelo escalado de un solo compartimento para
describir las tasas de captación y eliminación y un modelo de riesgo para
describir los patrones de supervivencia. Esto lleva a tres parámetros
independientes del tiempo para describir todo el curso del tiempo de los
efectos tóxicos: la concentración sin efecto ( ​NEC​ , por sus siglas en ​inglés​ ),
un umbral toxicológico independiente del tiempo por debajo del cual no se
prevé que se produzcan efectos incluso después de la exposición de por
vida; la tasa de destrucción, que es una medida de la toxicidad del
compuesto (una vez que se excede el ​NEC​ ) y la tasa de eliminación, que es
una medida de la evolución temporal de los efectos tóxicos. Aunque se
generan varios parámetros, aquí nos centramos en el ​NEC.,​ que es el
parámetro DEBtox ambiental más relevante y particularmente importante
para comparar potencias químicas. La observación de estos efectos depende
de la toxicocinética modelada en relación con el período de interés u
observación. Cuando se predice que los productos químicos aumentarán
lentamente una concentración interna, es posible que no se alcance el
riesgo total en una prueba de laboratorio a corto plazo o incluso en una
exposición de por vida, ya que lleva tiempo acumular una concentración
interna y, por lo tanto, exceder el ​NECi​ nterno . Una vez que se excede el
NEC​ interno, la probabilidad de supervivencia de un individuo comienza a
desviarse de la de los controles. La tasa de muertes en combinación con la
toxicocinética determina qué tan rápido irá este proceso. Con una tasa de
matanza infinitamente alta, una vezSe excede el ​NEC. La​ muerte será
inmediata para todos los individuos en la población, pero con una tasa de
matanza baja, lleva más tiempo antes de que la probabilidad de
supervivencia caiga a cero. Dado el tiempo suficiente, la probabilidad de
supervivencia irá a cero. Sin embargo, para algunos compuestos, la
combinación de una cinética lenta con una baja tasa de destrucción implica
que la probabilidad de supervivencia no irá a cero durante toda la vida del
organismo.

3 . Resultados
3.1 . Toxicidad del tóxico de referencia.

Sensibilidad observada por el dimetoato tóxico de referencia mostró muy


buena de acuerdo con las estimaciones publicadas anteriormente para ​A​ .
mellifera​ . Por ejemplo, las 48 h probit LC 5​ 0​ de 2.42 mg L -​ 1 se
equipararon a un LD 5​ 0​ estimado de 3.39 × 10 -​ 4​ mg / abeja basado en
nuestra tasa de consumo medida promedio (± se) de 69 ± 4 μl / abeja día
- 1​ ( ​n​ = 25 macetas replicadas, 2500 abejas) a través del experimento.
Esto se aproxima bien al límite superior del rango del LD ​50​ oral ​.​valores a
las 24 h de 1,0 × 10 ​- 4​ –3,5 × 10 ​- 4​ mg / abeja ( ​OCDE, 1998a​ , ​OCDE,
1998b​ ). Para ​B​ . ​terrestris​ nuestra estimación de 48 h de LC 5​ 0​ fue> 2.188
mg L -​ 1, lo​ que equivale a un LD 5​ 0​ > 9.21 × 10 -​ 4​ mg / abeja (media ±
tasa de consumo en todo el experimento = 421 ± 20 μl / abeja día -​ 1​; ​n
= 24 macetas replicadas, 72 abejas) que está ligeramente por debajo de las
estimaciones publicadas previamente (24–72 h oral LD 5​ 0​ = 17–47 × 10 -​
4​ mg / abeja; ​Ladurner et al., 2005​ ). En general, esto indica una
sensibilidad comparativa de las abejas dentro de las expectativas normales.

3.2 . Toxicidad global y efectos relativos de las especies.

En toda la gama de productos químicos probados, la sensibilidad abarcó


varios órdenes de magnitud dentro y entre los puntos de tiempo. Por
ejemplo, la LC 5​ 0​ para la sustancia química más tóxica, la clotianidina fue
un orden de magnitud menor que la del dimetoato, lo que indica la mayor
potencia del neonicotinoide en comparación con el organofosfato ( ​Fig. 1​ ).
En general, la toxicidad oral de los siete productos químicos mostró una
clasificación ampliamente consistente entre las tres especies de abejas (
Tabla 2​ ; r de Pearson por pares (​ ​Apis​ :​Bombus​ )​ = 1, ​p​ < 0.001, r de Pearson
( ​Apis​ : ​Osmia​ )​ = 0.999,​p​ < 0,001). Después de 240 h de exposición, el
orden de mayor a menor toxicidad fue: clotianidina > dimetoato >
cadmio > arsénico > tau-fluvalinato > 2,4-D > propiconazol. Hubo
cierta variación en la fuerza de los efectos dependientes de la concentración
entre las especies, con diferencias significativas en la CL 5​ 0​ en diferentes
puntos de tiempo (hasta 240 h) para el dimetoato, el cadmio y el
tau-fluvalinato ( ​Tabla 2​). Sin embargo, la mayoría de los tamaños de
efectos interespecíficos para CL 5​ 0​ s en los mismos intervalos de tiempo no
fueron significativamente diferentes. Cuando se expresa como la relación
del efecto del tratamiento, ​R​, El 83% de las pruebas en los tres puntos de
tiempo mostraron una diferencia de menos de 2 veces en la CL 5​ 0​predicha (
mediana de ​R​ = 1,05; ​Fig. 2​ ), pero superó las 10 para ambas especies
expuestas a cadmio durante 240 h (y para dos valores atípicos claras para
tau-fluvalinato en ​O​ . ​bicornis​ en 96 h ​R​ = ​66​ . ​75​ y 240 h ​R=
​ - ​22​ . ​98​ ). En
general ​A​ . ​mellifera​ mostró una mayor sensibilidad a los productos
químicos ( ​R​ < 1) en el 40% de las comparaciones a lo largo del tiempo (
Fig. 2​ ).

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Fig. 1

Tabla 2​ . Toxicidad de seis productos químicos para todas las especies

(productos químicos ordenados por valores medios de LC ​50 de​ 240 h , bajo a
alto): Estimaciones de Probit de los valores de LC ​50​ orales (mg L ​- 1​ ) con SE
entre paréntesis. Los valores no se pudieron calcular para algunos ensayos de
tau-fluvalinato, 2,4-D y propiconazol, ya que los niveles de mortalidad no
fueron suficientes para establecer una relación dosis-respuesta.

Quími Tie LC ​50​ mg L ​- 1​ (SE) puntuación ​z


co mp
o
(h)
Una B O Una Una O​ .​bicornisv
​ s
.​mellif .​terre .​bico .​melliferav ​ s ​b ​ s ​O b​ .​terrestris
.​melliferav
era stris rnis .​terrestris .​bicornis

Clotia 48 0.104 0.037 0.042 3.95 2,87 39.47


nidina (0.016) (0.008 (0.01
) 4)

Clotia 96 0.055 0.025 0.031 3.82 1.78 29.1


nidina (0.008) (0.004 (0.011
) )

Clotia 240 0.017 0.016 0.029 0.05 - 1.01 27.52


nidina (0.004) (0.003 (0.011
) )

Dimet 48 2,42 > 7.73 - - 4 . 92 ​⁎⁎⁎


oato (0,24) 2.188 (1.052
)

Dimet 96 1.16 1.43 3.68 - 0.6 - 4 . 47 ​⁎⁎⁎ 1.24


oato (0.11) (0.18) (0.55
4)
Dimet 240 0.62 0.36 - 1.01 - -
oato (0.079) (0.056
)

Cadmi 48 18.36 22.47 27.38 - 0.81 - 0.47 26.2


o (4.73) (3.17) (18.72
)

Cadmi 96 3.70 9.68 2.21 - 1.38 0.31 - 1.28


o (4.19) (1.32) (2.44)

Cadmi 240 0,57 5.50 1.003 - 2 . 83 ​⁎⁎ 0.56 - 4 . 07 ​⁎⁎⁎


o (1,41) (1.035 (0.33)
)

Arsén 48 25,68 21.15 50.5 0.23 -0.89 50.44


ico (1,76) (393.7 (27.9
1) 2)

Arsén 96 13.56 8.71 3.07 3,27 4.84 - 0.34


ico (0.80) (1.57) (2.02)

Arsén 240 4,03 4.44 - - 0.45 - -


ico (0,37) (0.73)

Tau-fl 48 > 67.08 > 36.02 - - -


uvalin 44.72 3
ato (17.23
)
Tau-fl 96 > 67.08 55.34 1.005 - - - 1 . 94 ​⁎
uvalin (11.31) (14.9
ato 8)

Tau-fl 240 > 67.08 61.96 - 2,35 - - - 4 . 52 ​⁎⁎⁎


uvalin (27.68 (7,83)
ato ) a

2,4-D 48 > 900 > 900 > - - -


1437.
5

2,4-D 96 > 900 > 900 > - - -


1437.
5

2,4-D 240 > 900 > 900 > - - -


1437.
5

Propi 48 - > 300 - - - -


conaz
ol

Propi 96 - > 300 - - - -


conaz
ol

Propi 240 - > 300 - - - -


conaz
ol
una

Valor negativo calculado para ​O​ . ​bicornis​ en este momento era similar al uso de regresión
binaria logística, claramente ya que este valor abarca 0, es decir, una dosis muy baja, que
se conserva aquí para ilustración y prueba z.

p​ ≤ ​0​ . ​05​ .

⁎⁎

p​ ≤ ​0​ . ​01​ .

⁎⁎⁎

p​ ≤ ​0​ . ​001​ .

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Fig. 2 . Distribución de las proporciones de sensibilidad de especies de abejas


(○ = ​A​ . ​Mellifera​ : ​B​ . ​Terrestris​ , Δ = ​A​ . ​Mellifera​ : ​O​ . ​Bicornis​ ) para el LC
50​ para cada producto químico en diferentes puntos de tiempo ( ​negro​ = ​48 h​ ,
gris​ = ​96 h​ , ​abierto​ = ​240 h​ ) ordenados por valores medianos para cada
producto químico. Una proporción de 1 (línea continua) indica que la especie
comparadora tiene la misma sensibilidad al pesticida que ​Una​ .
mellifera​ , los valores> 1 indican una mayor sensibilidad de las especies
comparadoras. La línea punteada representa la diferencia de 10 veces cuando
la relación de la sensibilidad < 1. Nota dos valores han sido excluidos por ​O​ .
bicornis​ tau-fluvalinato exposición: valor negativo para 240 h y gran valor
atípico para el ​A​ . ​mellifera​ : ​o​ . ​Ratio bicornis​ a las 96 h (66.8). Tenga en
cuenta que donde las estimaciones precisas de la dosis relevante se calcularon
como valores de excedencia "mayores que", hemos utilizado ese valor + 0.01
para permitir el trazado.

3.3 . Variación en los efectos del curso temporal.

Se encontró que las dependencias de tiempo de LC ​50​ a través de los


productos químicos eran mayores en magnitud que entre especies, es decir,
los CL 5​ 0​ s calculados a las 48 h eran hasta 25 veces más altos que los
valores calculados a las 240 h (ver ​Tabla 2​). En todas las especies, los
valores medianos para este punto temporal mostraron el efecto temporal
más fuerte para cadmio, arsénico y dimetoato (diferencia de 3,9 a 6,4
veces), un cambio intermedio para clotianidina (2,5–5) y un cambio bajo
para tau-fluvalinato y propoconizol (0,7– 1). Los casos con una fuerte
dependencia del tiempo se asocian con una cinética lenta, reflejada en tasas
de eliminación bajas y tasas de muerte más bajas (causadas por la
toxicodinámica), las cuales aumentarán el tiempo entre la exposición inicial
y el efecto final. Cuando las predicciones a más largo plazo de LC 5​ 0​ s para
las duraciones de la vida útil se estimaron a partir de los parámetros
DEBtox, se acercaron al NEC, lo que significa que las proporciones
calculadas a partir de estos valores fueron a menudo mayores en
comparación con las calculadas utilizando LC ​50​ s a corto plazo .

3.4 . DEBtox derivó concentraciones sin efecto (NEC) y


escala de peso corporal

Los modelos DEBtox para predecir el ​NEC​ para cada compuesto no


convergieron en todos los casos, por ejemplo, propiconazol o 2,4-D. Para
propiconazol había pocos efectos sobre la supervivencia de ​una​ . ​mellifera​ y
b​ . ​terrestris​ , incluso en la concentración máxima de 300 mg ml ​- 1
después de 240 h de exposición, por lo tanto, no se pudieron calcular los
parámetros de DEB (o LC 5​ 0​ ). Del mismo modo, no hubo efectos de 2,4-D
en los abejorros; desde la concentración máxima probada (900 mg ml -​ 1​)
representa la solubilidad en agua máxima para este herbicida, no
predeciríamos riesgo de exposición a través de la alimentación en el campo
por exposición oral a través del agua. A pesar de esta falta de convergencia
hemos utilizado estas estimaciones máximas (+ 0,01) para fines
comparativos especies cruzadas con el fin de trazar ​A​ . ​mellifera​ : ​b​ .
terrestris​ y ​A​ . ​mellifera​ : ​o​ . Proporciones NEC ​bicornis​ para todos los
productos químicos ( ​Tabla 3​ ). En el cálculo de las proporciones ​NEC​ de la
especie , la mayoría (86%) se encontró que eran menos de dos ( ​Fig. 3​ ).
Aunque de un rango similar, los valores para ​A​. ​mellifera​ : ​b​ . ​terrestris​ y ​A
. ​mellifera​ : ​o​ . ​bicornisn
​ o se correlacionaron significativamente ( ​p​ >
0.05). Esta diferencia parece estar impulsado por un aumento de la
sensibilidad relativa de ​O.​ ​bicornis​ a tau-fluvalinato y arsénico con
relaciones de NEC para ​A​ . ​mellifera​ de 5,5 y 3,3, respectivamente, y una
disminución relativa de la sensibilidad de ​B​ . ​terrestris​ a cadmio ( ​fig. 3​).
También corregido estas relaciones de NEC para las diferencias en el peso
corporal, que abarcan un orden de magnitud ( ​B​ . ​Terrestris​ = 170 mg ±
2,5 ​n​ = 582, ​A​ . ​Mellifera​ 100 mg ± 3,5 ​n​ = 582, ​O​ . ​Bicornis​ = 69 mg
± 2,7 ​n​ = 500). Aunque este ajuste no alteró el orden general de las
relaciones de NEC ( ​Fig. 3​ ), la diferencia entre las ajustada al peso pistas
individuales y corporales fue significativa para ​A​ .​mellifera​ : ​b​ . ​terrestris
(una muestra ​t​ (7) = - 9,2, ​p​ < 0,001) lo que sugiere que representan el
peso corporal aumentó significativamente la estimación de la sensibilidad
para ​B​ . ​Terrestris​ por unidad de masa. Para ​O​ . ​bicornis​ de controlar por el
peso corporal bajó estimaciones de la sensibilidad con respecto a ​A​ .
mellifera​ , pero no hubo diferencia significativa entre las pendientes ( ​p​ >
0.05).

Tabla 3​ . Los parámetros DEBtox ​NEC​ calculados para cada especie para todos

los productos químicos. Valores = nivel de exposición máximo + 0.01 para


propiconizol y 2,4-D (ver texto para más detalles).

Compuesto Apis mellifera Bombus Osmia


spp.(μg / abeja) terrestris(​ μg / bicornis​(μg /
abeja) abeja)

Cadmio 0.001 0,55 0.001

Clothianidina 0.0064 0.0075 0.013

Dimetoato 0.049 0.079 0.029

Arsénico 0.5 3.7 0.15

Fluvalinato 8.06 20.4 1.5


de tau

Propiconazol 35.01 150.01 120.01


2,4-D 100.01 486.01 345.01

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Fig. 3 . La relación de NEC de especies de abejas (○ = ​A​ . ​Mellifera​ : ​B​ .


Terrestris​ , Δ = ​A​ . ​Mellifera​ : ​O​ . ​Bicornis​ ) calculado para los individuos
(símbolos sin relleno) o masa por unidad es decir, corregido por las
diferencias en el peso corporal (símbolos rellenos). Una relación de 1 (línea
continua) indica que la especie comparador tiene la misma sensibilidad a los
plaguicidas como ​A​ . ​mellifera​ , los valores> 1 indica una mayor sensibilidad
de las especies ​s​ que ​una​ . ​mellifera​ . La línea de puntos representa una
diferencia de 10 veces cuando la relación de sensibilidad < 1. Tenga en cuenta
que donde los cálculos precisos de la dosis relevante se calcularon como
valores de superación "mayores que", hemos utilizado ese valor + 0.01 para
permitir el trazado.

4 . Discusión
Existe una amplia variación en la historia de vida, características
demográficas, de comportamiento, morfológicas y fisiológicas de las abejas,
pero relativamente pocas especies se han comparado sistemáticamente en
estudios ecotoxicológicos ( ​Arena y Sgolastra, 2014​ , ​Hardstone y Scott,
2010​ ). Nuestros especies ensayadas variaban tanto en sociabilidad
(complejo eusocialidad = ​A​ . ​Mellifera​ vs. primitivamente eusocial = ​B​ .
Terrestris​ vs. solitario = ​O​ . ​Bicornis​ ), el comportamiento de alimentación
(tropholaxis = ​A​ . ​Mellifera​ vs. individual) y el tamaño del cuerpo significan
(69- 170 mg). Si bien se ha sugerido que la diferente modalidad de
alimentación entre abejas solitarias y sociales hace que la comparación
entre especies sea más difícil para las pruebas de toxicidad oral ( ​Ladurner
et al., 2003​ ), nuestros métodos promovieron una buena alimentación y
controlaron las tasas de supervivencia en períodos prolongados. Esto
significaba que podíamos hacer comparaciones durante duraciones que
excedían las exposiciones reglamentarias "estándar" en 144 h. Incorporar
los datos de supervivencia en el tiempo para exposiciones a más largo plazo
en los modelos DEBtox y vincular el efecto a la eficacia fisiológica es un
paso importante para comprender las implicaciones holísticas de los
diferentes efectos toxicológicos en los polinizadores.

Aunque observamos cierta variación en la sensibilidad de las especies,


dentro de las pruebas de exposición generalmente hubo una diferencia < 2
veces mayor en las 240 h CL 5​ 0​ observadas entre las especies. El valor
mediano de la relación de sensibilidad ( ​R​ ) para LC 5​ 0​ en los siete tipos de
productos químicos hasta 240 h fue de 1.05, lo que sugiere una
equivalencia relativa entre las especies en las pruebas para un rango de
diferentes compuestos. Este es un valor más alto que el que se encontró en
un metanálisis reciente de los efectos crónicos y agudos en un número más
amplio de especies y compuestos de abejas ( ​Arena y Sgolastra, 2014​ ). Este
estudio, basado en efectos generalmente a corto plazo en una amplia gama
de compuestos y sistemas de prueba, estimó la relación de sensibilidad
mediana ( ​R)​ Para ser 0,57 (con un intervalo de 0,001 a 2,085.7) que indica
que en la mayoría de los casos la sensibilidad de ​A​ . ​mellifera​ era más alta
que otras especies de abejas. Arena y Sgolastra ( ​Arena y Sgolastra, 2014​ )
también encontraron que la estimación mediana de la relación de
sensibilidad para el LD 5​ 0​ oral agudo era más baja que esto ( ​R​ = 0,39, 97%
de los casos < 10). Nuestras comparaciones se realizaron durante un
período de tiempo más largo y para cuatro de los siete productos químicos
hubo una clara disminución de ​R a​ través del tiempo.
La comparación de la relación de la sensibilidad de los productos químicos
ensayados, la clotianidina neonicotinoide mostró que las otras dos especies
de abejas fueron más sensibles que ​A​ . ​mellifera​ a las 48 h ( ​R ​Osmia​ = 2,5,
R B​ ombus​ = 2,8) y 96 h ( ​R O ​ smia​ = 1,8, ​R ​Bombus​ = 2,2), aunque no
después de 240 h de exposición, cuando ​B​ . ​terrestrisf​ ue igualmente
sensible y ​O​ . ​bicornis​ menos sensible que ​A​ . ​mellifera​(aunque por este
tiempo las tasas de supervivencia de control (60%) para ​O​ . ​bicornis​ eran
sub-óptimo). ​Scott-Dupree et al. (2009)​también comparación 48 h
toxicidad de clotianidina a través de tres no ​A​ . ​mellifera​ especies de abejas
( ​B​ . ​impatiens​ , ​Megachile rotundata​ y ​O​ . ​lignaria​ ) después de la
aplicación tópica. Aunque esta vía de exposición no es directamente
comparable con nuestro enfoque de prueba de toxicidad oral más largo, se
podrían calcular relaciones de sensibilidad similares. Por ejemplo, cuando
las 48 h LC 5​ 0​ (expresadas como porcentaje de solución, w: v) para cada
especie (​Scott-Dupree et al., 2009​ ) se compara con ​A​ . ​mellifera​ datos de (
Bailey et al., 2005​ ), que utilizan el mismo protocolo de exposición, sugiere
que ​B​ . ​impatiens​ era más tolerante que ​A​ . ​mellifera​ a la clotianidina ( ​R
Bombus​ = 0,5) lo que contradice los resultados de este estudio sobre ​B​ .
terrestris​ ( ​R ​Bombus​ = 2.8), mientras que las abejas solitarias eran más
sensibles ( ​R ​Osmia​ = 2, ​R ​Megachile​ = 2.5) lo que confirma el​O​ . Resultados
bicornis​ de este estudio.

En los tres insecticidas probados, los valores medianos para ​R​ para las
comparaciones de especies fueron comparables con los valores (entre
paréntesis) calculados por ( ​Arena y Sgolastra, 2014​ ); 2 (vs 1.06) para los
neonicotinoides, 0.8 (vs 0.5) para los organofosforados y 1.4 (vs 0.33) para
los piretroides. En general, esto apunta a una magnitud relativamente
consistente de la diferencia en la sensibilidad de las especies ​en las​ pruebas
de mortalidad adulta ​a corto y mediano​ plazo.

Un problema al comparar la sensibilidad de las especies en función de los


resultados de las pruebas de toxicidad es que pueden darse concentraciones
de efecto para diferentes tiempos de exposición. Por lo tanto, si los valores
(p. Ej., LC 5​ 0​ s) para diferentes tiempos de exposición se comparan
directamente, la diferencia observada puede resultar tanto de cambios
temporales en los efectos como de la diferencia inherente en la sensibilidad
de la especie. En contraste, como un parámetro invariante en el tiempo, el
DEBtox ​NEC​ se puede usar para comparar el umbral de sensibilidad
previsto para las tres especies analizadas. Para los insecticidas dimethoate y
clothianidin, los valores de NEC para las tres especies fueron ampliamente
comparables, lo que indica una sensibilidad similar. Para el tau-fluvalinato
piretroide, los ​ECNi​ ndicar mayores diferencias en la sensibilidad que para
los otros dos insecticidas con ​O​ . ​bicornis​ que muestra a> 5 veces mayor
sensibilidad que ​A​ . ​mellifera​ . Este insecticida ha sido ampliamente
utilizado para controlar ​Varroa​ ácaros en ​A​ . colonias ​mellifera​ porque,
según se informa, tiene menos impacto en relación con otros piretroides
debido a la desintoxicación por las enzimas P450 y la carboxilesterasa (
Johnson et al., 2013​ ). También se aplica como insecticida de contacto para
controlar el gorgojo de las semillas de la col, los pulgones y el escarabajo
pulga del tallo de la col en cultivos de flores como la colza oleaginosa.
Varias especies de abejas silvestres eusociales y solitarias visitan con
frecuencia estos cultivos (​Woodcock et al., 2013​ ) y es probable que estén
expuestos a este compuesto. Además, se ha demostrado que interactúa con
otros compuestos, incluidos los fungicidas, que pueden aumentar su
toxicidad en 2000 veces ( ​Johnson et al., 2013​ ). Las diferencias en la
sensibilidad que observamos entre las especies podrían ser una
consideración importante para la evaluación del riesgo de este químico.

Los metales también mostraron una amplia variación en las especies


predichas de ECN. Para cadmio, aunque la diferencia en la relación de
sensibilidad para ​A​ . ​mellifera​ : ​b​ . ​terrestris​ fue « 1, en realidad todas las
especies mostró valores bajos NEC (para ​A​ . ​mellifera​ y ​O​ . ​bicornisl​ a NEC
fue efectivamente cero). Para arsénico la variación en la sensibilidad fue
impulsado principalmente por la relativamente baja sensibilidad para ​B​ .
terrestris​ y aumento de la sensibilidad de ​O​ . ​bicornis​. Mientras que ha
habido pocos estudios sobre los efectos de la contaminación de metales
pesados en las comunidades de abejas silvestres, se ha demostrado que el
cadmio, el plomo y el zinc se expresaron cada vez más en polen recogido
por ​O​ . ​bicornis a​ través de un gradiente de contaminación industrial (
Moroń et al., 2012​ ). Para el cadmio esto aumentó de un fondo de 0,8 a 1,3
mg kg -​ 1​ a 6,7 ​a 9,3 mg kg -​ 1​ y en general estuvo altamente
correlacionado con una disminución de 7,5 veces en la riqueza de especies y
una disminución de 4 veces en la abundancia de abejas, especialmente las
especies solitarias . Es evidente que ​una​ . ​mellifera​ mostró sensibilidades
similares.

Algunos estudios han sugerido que la sensibilidad de diferentes especies de


abejas es inversamente proporcional al peso corporal medio ( ​Devillers et
al., 2003​ ) mientras que otros no han encontrado ningún efecto ( ​Helson et
al., 1994​ ). En nuestro estudio cuenta las diferencias en el peso corporal no
alteró los patrones generales de relaciones de NEC, pero para ​B​ . ​terrestris
alteró significativamente la pendiente de la relación de la sensibilidad con ​A
. ​mellifera.​ Aunque estas diferencias fueron relativamente pequeñas,
sugiere que puede haber diferencias claras entre las especies que no se
explican únicamente por las diferencias de peso corporal. Otros estudios
han sugerido que esto puede estar relacionado con diferencias en la
fisiología (p. Ej., Hemolinfa, pH), metabolismo (p . Ej ., ​A. mellifera​ tiene
un número menor de genes del citocromo P450 detoxificante) ( ​Claudianos
et al., 2006​ ), relaciones de volumen a área de superficie, socialidad y
conductas de alimentación o elección de dieta pre-adaptada ( ​Arena y
Sgolastra, 2014​ , ​Cresswell et al., 2012​ ).

Los indicadores comparativos de sensibilidad relativa dependientes del


tiempo (p. Ej., CL ​50​ s) y absolutos (p. Ej., NEC) que observamos en todas
las especies pueden no ser consistentes en el medio silvestre, donde la
probabilidad de exposición diferencial debe considerarse junto con las
sensibilidades de las especies ( ​Brittain y Potts, 2011​ ) . La evaluación de
laboratorio de la toxicidad directa es solo una medida del impacto
potencial, y la mortalidad puede diferir mucho en condiciones naturales
donde la selección de la dieta, las tasas de consumo de polen y néctar, el
almacenamiento y el procesamiento pueden variar ampliamente entre las
especies de abejas ( ​Falk y Lewington, 2005).​). También son probables
otras rutas de exposición orales y no orales, como el contacto con
contaminantes del suelo en especies de anidación en el suelo o material de
anidación en especies de anidación de superficie y aéreas. Además, es
probable que el impacto en la supervivencia de las especies varíe según los
rasgos de las especies. Mientras que ​Api​ especies s tienen colonias (y
reinas) que viven durante años, abeja y solitario ​B​ . ​terrestris​las especies a
menudo exhiben multivoltinismo; Si los reproductores de estas especies
están expuestos a pesticidas u otros contaminantes durante las fases clave
del ciclo de vida, por ejemplo, el establecimiento de nidos, los impactos en
la capacidad reproductiva (y por lo tanto la persistencia de la población)
pueden ser graves. Estas diferencias entre las especies de abejas (tanto en
las rutas de exposición como en la sensibilidad) y el potencial de
interacciones entre diferentes factores resaltan la necesidad de adoptar un
enfoque más holístico para la evaluación de riesgos que los estándares
actuales (es decir, basados ​en el laboratorio, efectos letales a corto plazo en
especies modelo) requieren, especialmente si los resultados se utilizan para
predecir los impactos en las poblaciones, las comunidades y los ecosistemas
y establecer objetivos de protección ambiental significativos ( ​Food and
Authority, 2014​ , ​Sánchez-Bayo y Goka, 2014​ ).

Además de los efectos de las especies, hubo una amplia gama de


dependencia del tiempo en la toxicidad de los siete productos químicos
seleccionados. Una idea clave de esto es que representa un resumen de la
medida en que los resultados de las pruebas de toxicidad a corto plazo
pueden subestimar los efectos a largo plazo. De hecho, estos efectos
temporales fueron mucho mayores que las diferencias interespecíficas. En
la actualidad, las pautas regulatorias evalúan principalmente la
supervivencia de las abejas adultas después de una exposición corta a
pesticidas, generalmente hasta cuatro días, es decir, 96 h ( ​OCDE, 1998a​ ,
OCDE, 1998b​ ). Los estándares regulatorios basados ​en estas pruebas
enfatizan un umbral tóxico que no incluye ninguna dependencia del
tiempo. Si bien algunos autores han destacado la importancia de las
pruebas de toxicidad de mayor duración ( ​Decourtye et al., 2013​) no se han
realizado estudios experimentales sistemáticos a largo plazo que comparen
las especies de abejas. Nuestros datos sugieren claramente que, en un rango
de compuestos y especies, esta suposición de dependencia no temporal no
es realista, una idea establecida en otros estudios ecotoxicológicos (
Heckmann et al., 2010​ ). Las razones de los valores medidos para las
exposiciones experimentales entre 48 y 240 h mostraron diferencias de
hasta 25 veces, mientras que las predicciones de DEBtox a largo plazo
(hasta el promedio de la vida útil total) revelaron relaciones que excedieron
varios órdenes de magnitud. Recientemente ​Rondeau et al. (2014)
exploraron dependencia del tiempo de la imidacloprid neonicotinoide en ​A
​ tilizando datos publicados para trazar el efecto letal. Utilizaron
. ​melliferau
una ley de potencia temporal para adaptarse a las curvas a estos datos y
encontró que para ​una​ . Valores ​mellifera​ LD ​50​ después del tiempo ​t
escalado de ​t ​1.6​ a ​t ​5​ . Cuando se calculó la dependencia del tiempo de
nuestra ​Una​ . ​Los​ datos de ​mellifera​ para la exposición a la clotianidina
neonicitinoide hasta 240 h fueron ​t ​1.4​ (R 2​ ​ = 0.97). Sin embargo, al usar
predicciones de datos de los modelos DEBtox, encontramos que la
dependencia del tiempo era ​t 2​ ​ . ​7​ (R 2​ ​ = 0.84) es decir, altamente
comparable con el enfoque y las conclusiones de ​Rondeau et al. (2014)​ .
Otros compuestos mostraron claramente una mayor dependencia del
tiempo predicho debido a la cinética de eliminación lenta, por ejemplo,
cadmio y arsénico. A este respecto, hay una serie de ventajas de utilizar un
enfoque DEBtox para el análisis de datos de pruebas de toxicidad. El
enfoque de DEB utiliza toda la información disponible en el análisis de los
efectos del curso de tiempo de un peligro que incluye todos los puntos
finales, tratamientos y todos los puntos temporales. Los parámetros
independientes del tiempo resultantes, como el NEC, permiten la
extrapolación educada a situaciones no probadas. En contraste, estadísticas
resumidas como la LC 5​ 0.​derivados de análisis de dosis-respuesta más
descriptivos pueden variar claramente entre los tiempos de exposición. Este
hecho está disfrazado porque el tiempo de exposición a menudo está
estandarizado en los protocolos regulatorios ( ​Baas et al., 2010​ , ​Jager, 2011
). Claramente, las consecuencias ecotoxicológicas de la toxicidad tardía son
potencialmente profundas y, como tales, derivar umbrales tóxicos simples
de estos CL 5​ 0​ agudos a corto plazo para definir niveles residuales seguros
podría subestimar gravemente los riesgos para los organismos. La
protección contra los efectos de exposición a más largo plazo para dichos
productos químicos puede requerir niveles de protección superiores a los
aplicados actualmente.

En general, nuestros resultados sugieren que el enfoque actual de utilizar


una​ . ​mellifera​ como una especie de prueba de abeja sustituta en la
evaluación del riesgo ambiental puede ser suficiente para varios
compuestos cuando se considera la toxicidad oral directa en la
supervivencia, siempre que se aplique un factor de evaluación (por
ejemplo,> 10) a la CL 5​ 0​puntos finales. Sin embargo, para algunos
compuestos hay excepciones claras y se debe tener cuidado si estas
estimaciones se van a utilizar para predecir el peligro ambiental. De mayor
importancia para el medio ambiente es la necesidad de evaluar e incluir los
efectos de toxicidad retardados que resultan de la exposición continua
prolongada para diferentes compuestos dentro de las evaluaciones de
riesgo. El uso de modelos DEBtox y el cálculo de parámetros
independientes del tiempo a partir de ensayos de laboratorio extendidos
ofrece un gran potencial para superar las dificultades intrínsecas de
predecir el peligro ambiental que surgen de los supuestos asociados con
estadísticas descriptivas más estándar.

Contribuciones de autor
DJS, MSH y CS concibieron el estudio original en consulta con AR y J-LD.
Todos los autores diseñaron los experimentos; HH, EL, AR, DS y MSH
llevaron a cabo los experimentos; HH, JB, DJS y MSH analizaron los datos;
MSH, HH y DJS prepararon el manuscrito; Todos los autores editaron el
manuscrito.

Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación otorgada por la
Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria al Centro para Ecología e
Hidrología (CEH), Reino Unido, titulada "Toxicidad de la exposición a
múltiples sustancias químicas en abejas y modelando el efecto en la
dinámica de la población de abejas utilizando modelos DEB-TOX. ".
Número de contrato / concesión: ​OC / EFSA / SCER / 2013/02​ . JB recibió
el apoyo del Programa de becas de investigación Marie Curie dela UE 2012
( ​FP7-PEOPLE-2012-IEF​ ), BIOME , contrato n . ° ​328931​ . El Consejo de
Investigación del Medio Ambiente Natural (NERC) apoyó el trabajo
experimental adicional de abejas a través del proyecto de financiamiento de
Capacidad Nacional ​NEC05585​en la CEH. Estamos muy agradecidos a
Alice Horton y Carolin Schultz para obtener ayuda con el trabajo
experimental diaria y Victor Zaichenko para el asesoramiento sobre ​una​ .
gestión ​mellifera​ .