Separación de los pigmentos de las plantas por cromatografía en capa fina

RESUMEN
En la práctica se separaron los pigmentos de la muestra madre extraída en el laboratorio anterior de la
espinaca mediante la cromatografía de capa fina a través de dos fases, la fase estacionario fue sílica de
gel la cual fue revestida en cada placa portaobjetos y la fase móvil fueron 4 eluyentes orgánicos que
desplazaron a los pigmentos debido a su carácter polar y estos fueron: el éter de petróleo, la acetona,
el cloruro metileno y una mezcla de acetona con éter de petróleo. Y se pudo identificar debido a su
color característico que la espinaca contiene los siguientes pigmentos: Clorofila b (color verde oscuro),
clorofila a (color verde claro), xantofilas (color amarillo) y carotenos α y β (color anaranjado).

Palabras clave: Pigmentos, cromatografía de capa fina, eluyentes orgánicos, carácter polar.

1. INTRODUCCIÓN

Cromatografía:
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la
cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia; es un conjunto de técnicas basadas en el principio
de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de
partición de los compuestos dan como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y,
por tanto, una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la
mezcla.
La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados
posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las
cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeñas.

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC):

Entre las técnicas cromatográficas cuya fase móvil es un líquido la cromatografía líquida de alta
resolución (HLPC) es la más utilizada. Esta técnica deriva de una evolución de la cromatografía
preparativa en columna, en la que la cromatografía se realiza en columnas de vidrio con diámetros de
1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. Para el flujo de fase móvil fuese razonablemente rápido las
partículas de fase estacionaria debían ser de gran diámetro (150-200 um), lo que se traducía en una
separación y así incrementar la resolución era necesario emplear fases estacionarias con tamaño de

1
partícula mucho menor (entre 2 y 5 um), ya que la difusión de los solutos entre las fases móvil y
estacionaria se hace más rápida. Pero ello implica la necesidad de impulsar la fase móvil con un sistema
de alta presión, nace así la cromatografía líquida de alta resolución (HLPC).

Cromatografía de Adsorción:

En la cromatografía de adsorción el relleno solido de la columna actúa como fase estacionaria. Las fases
estacionarias típicas son sílice y alúmina ambas polares. Como la fase estacionaria es polar suelen
emplearse fases móviles apolares o moderadamente polares. Para seleccionar la fase móvil suele
considerarse no solo la polaridad sino también la fuerza eluyente, que es un parámetro relacionado
con la energía de adsorción del disolvente por unidad de superficie (parámetro que también depende
del adsorbente). Las fases típicas son hexano, isooctano y diclorometano. La selección es empírica y es
frecuente el empleo de mezclas. Esta cromatografía es menos usada que la de reparto.

 Fase estacionaria: Adsorbente

Está constituida por un sólido poroso, finamente granulado, con centros activos polares en su
superficie donde se adsorben las moléculas de los compuestos que se van a cromatografiar.

Cuanto menor sea el tamaño de partícula de este material mayor será la capacidad de
adsorción.

La adsorción se debe a interacciones intermoleculares del tipo dipolo-dipolo, dipolo-dipolo

inducido o enlaces de hidrógeno entre el adsorbente y el soluto. El adsorbente más utilizado
es el gel de sílice (Figura 1) donde las interacciones tienen lugar entre los grupos Si-OH y Si-O-
Si; también se emplea con relativa frecuencia alúmina (Al2O3).
El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a cromatografiar. El gel de sílice presenta
carácter ácido y la alúmina puede adquirirse con carácter neutro, ácido o básico.

Figura 1 Estructura del gel de sílice e interacciones con algunos compuestos

2
  Fase móvil: Eluyente
Es un disolvente en el que los componentes de las mezclas son, al menos, parcialmente
solubles. Al aumentar la polaridad del disolvente aumenta la velocidad de elución de los
compuestos de la mezcla.

Se puede utilizar un único disolvente o una mezcla de disolventes e incluso llevar a cabo la
elución con un gran gradiente de polaridad aumentando progresivamente la proporción del
disolvente más polar.
Las moléculas de soluto S se adsorben en los centros polares de la fase estacionaria X y, a
medida que se produce la elución, van siendo desplazadas por las moléculas de disolvente que
constituyen la fase móvil M. La retención de un soluto se puede justificar por la competencia
que se establece entre S y M por adsorberse a los centros polares de X, es decir depende de los
valores de las constantes de equilibrios que están en función de:
- Polaridad del compuesto a eluir que depende de sus grupos funcionales.
- Naturaleza del adsorbente.
- Naturaleza del disolvente.

Orden de polaridad de los compuestos orgánicos:

Ácidos carboxílicos > Fenoles > Alcoholes y Tioles > Aminas > Ésteres > Aldehídos y Cetonas > Hc.
Aromáticos > Hc. Halogenados > Éteres > Hidrocarburos Insaturados > Alcanos

Nota: Cuanto más polar sea un compuesto más se retendrá en la fase estacionaria.

Orden de polaridad de los eluyentes más habituales:

H2O > CH3OH > (CH3)2CHOH > CH3CN > Dioxano > CH3COOEt > THF > CH2Cl (Cloruro de metileno) > CHCl3
(Cloroformo) > CCl4 (Tetracloruro de carbono) > CH3(CH2)4CH3

- Para un mismo compuesto, un aumento en la polaridad de la fase móvil hace que se desplace
con más facilidad de la fase estacionaria.
- Para compuestos poco polares, que se retienen poco en el adsorbente, se utilizan eluyentes
apolares o poco polares.
- Para compuestos muy polares, que quedan muy retenidos en el adsorbente, se emplean
eluyentes muy polares.
- Para compuestos de polaridad media se emplean eluyentes de polaridad intermedia y son muy
aconsejables en estos caso de las mezclas en distintas proporciones de hexano-acetato de etilo.

Cromatografía analítica en capa fina (CCF)

La técnica de separación CFF consta de un sistema de dos fases, una sólida (fase estacionaria) que se
aplica en forma de capa delgada, adsorbente, usualmente de entre 0.1 a 0.25 mm de grueso para fines
analíticos y en los casos que se desea aislar un compuesto el aluminio o plástico que actúa como

3
soporte. A través de la fase estacionaria transita un líquido o solvente (fase móvil o eluyente). De los
tres materiales usados como soporte, el vidrio es el más popular, aunque el aluminio o el plástico
ofrecen la ventaja de ser flexibles sin provocar disrupción de la fase estacionaria. En la Figura 2 se
muestra un montaje típico de CCF.

Figura 2 Montaje típico para cromatografía en capa fina CFF

Factor de retención: Rf
Se conoce como Rf la relación entre las distancias recorridas por un compuesto y por el disolvente desde
el origen del cromatograma.

Cada compuesto en unas condiciones cromatográficas determinadas: adsorbente, disolvente,

temperatura, etc. Tienen un valor constante y característico de Rf. Sin embargo, solo se pueden
establecer comparaciones entre los Rf de dos compuestos cuando los dos se eluyan juntos en la misma
placa. La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha (Figura 3).

4
Figura 3 Determinación de Rf de dos compuestos A y B

La hipótesis de trabajo entonces es:

“Si realizamos una separación de los pigmentos de la muestra madre (sustancia obtenida de la
espinaca) con un eluyente orgánico entonces podremos obtener pigmentos fotosintéticos como las
clorofilas, xantofilas y carotenos ”.

Asimismo, los objetivos de la práctica son:

Objetivo general: Separar los diferentes pigmentos de la espinaca.

Objetivo específico:
- Conocer la cromatografía como técnica de separación de mezclas de diferentes sustancias.
- Aplicar experimentalmente la separación de pigmentos mediante eluyentes orgánicos.
- Calcular el factor de retención entre la las distancias recorridas por un compuesto y por el
disolvente.
- Observar las diferentes características en cada placa al realizar la cromatografía por capa fina
e identificar que pigmentos contiene la muestra madre mediante los colores observados en las
placas.

2. PARTE EXPERIMENTAL

Lavamos 6 placas porta-objetos de vidrio con detergente, las enjuagamos con agua destilada y las
secamos con papel de filtro. Desde ese momento tomamos las placas por los bordes. Luego preparamos
la fase estacionaria (sílica de gel) pesando 5g de sílica de gel en polvo y vertimos en un vaso de 50 ml,
agregamos agua destilada poco a poco y agitamos con una bagueta hasta que se formó una papilla de
sílica de gel. En consecuencia revestimos las placas con el adsorbente tomando el portaobjetos por los
bordes, vertimos un poco de papilla en el extremo superior de la placa, inclinamos de modo que la

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papilla se extendió por toda la superficie de la placa. Esta operación produjo una capa lisa y uniforme
de gel sobre la superficie de las placas, además fue lo suficientemente espeso para opacar la superficie
del vidrio. Dejamos que las placas sequen y las colocamos en una estufa por 10 minutos para eliminar
el agua, de tal forma que las placas ya estaban listas para ser utilizadas. Finalmente con un tubo de
capilar pequeño extrajimos una cantidad de la muestra madre y lo colocamos en cada placa a una
distancia de 1 cm de su parte inferior, luego colocamos la primera placa en una cubeta de vidrio
cubierta con papel de filtro donde teníamos como solvente al éter de petróleo y tapamos la cubeta con
una luna de reloj y esperamos que el solvente desplace a los pigmentos sobre la superficie revestida en
la placa. Dicho procedimiento se realizó tres veces más pero con distintos solventes, que fueron:
Cloruro de metileno, acetona y una mezcla de acetona con éter de petróleo.

Figura 4 Desplazamiento del pigmento en el solvente de acetona

Diagrama de Flujo del experimento

A continuación, el Diagrama 1 muestra las principales operaciones realizadas durante el experimento:

6
 Al formar una Para eliminar el
papilla. agua.

200 250
150 300
100
350

Agregamos agua destilada Vertemos la papilla para

en la silica de gel y revestir uniformemente las Dejamos por unos 20
agitamos con la bagueta. placas. minutos en un horno.

Se deja enfriar por

unos 5 minutos.
acetona

Eliminamos la fase inferior colocamos la placa en

éter de petróleo un recipiente que
tendrá en sus paredes
un papel de filtro

Aplicar en la placa la
dicloro muestra con un
capilar.

acetona + éter de petróleo

Diagrama 1. Principales operaciones durante la separación de pigmentos

3. RESULTADOS

Utilizaremos la fórmula del Rf para hallar sus valores en cada compuesto

7
 𝑫𝑰𝑺𝑻𝑨𝑵𝑪𝑰𝑨 𝑹𝑬𝑪𝑶𝑹𝑹𝑰𝑫𝑨 𝑷𝑶𝑹 𝑬𝑳 𝑪𝑶𝑴𝑷𝑼𝑬𝑺𝑻𝑶
𝑹𝒇 =
𝑫𝑰𝑺𝑻𝑨𝑵𝑪𝑰𝑨 𝑹𝑬𝑪𝑶𝑹𝑹𝑰𝑫𝑨 𝑷𝑶𝑹 𝑬𝑳 𝑫𝑰𝑺𝑶𝑳𝑽𝑬𝑵𝑻𝑬

3.1 Para la muestra y la acetona:

-Distancia recorridas de las muestras:

X0 = 2.3 cm
Y = 6.0 cm

2.3
𝑅𝑓 = = 0.383333
6.0

3.2 Para la muestra y el dicloro:

-Distancias recorridas de la muestra:

0.4
X0 =0.4 cm 𝑅𝑓 = 5.8 = 0.068966
0.7
X1 = 0.7 cm 𝑅𝑓 = 5.8 = 0.120689
0.9
X2 = 0.9 cm 𝑅𝑓 = 5.8 = 0.155172
1.1
X3 =1.1 cm 𝑅𝑓 = 5.8 = 0.189655
3.0
X4 =3.0 cm 𝑅𝑓 = 5.8 = 0.5172414
Y= 5.8 cm

3.3 Para la muestra y el éter de

petróleo:

8
-Distancias recorridas de la muestra:

0.4
X0 =0.4 cm 𝑅𝑓 = 5.85 = 0.068376
1.8
X1 = 1.8 cm 𝑅𝑓 = 5.85 = 0.307692
2.5
X2 = 2.5 cm 𝑅𝑓 = 5.8 = 0.427350
Y = 5.85 cm

3.4 Para la muestra y acetona con éter de petróleo:

- Distancia recorridas de la muestra:

0.4
X0 = 0.4 cm 𝑅𝑓 = 6.0 = 0.0666667
1.1
X1 = 1.1 cm 𝑅𝑓 = = 0.1833333
6.0
1.9
X2 = 1.9 cm 𝑅𝑓 = 6.0 = 0.316667
2.2
X3 = 2.2 cm 𝑅𝑓 = 6.0 = 0.366667
2.6
X4 = 2.6 cm 𝑅𝑓 = = 0.433333
6.0
3.3
X5 = 3.3 cm 𝑅𝑓 = = 0.550000
6.0
Y = 6.0 cm

4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

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 El principio de la cromatografía en capa fina es se destaca mediante dos fases, la fase
estacionaria que se compone de sílica gel, y la fase móvil que es algún disolvente (eluyente)
que moverá a través de la fase estacionaria los compuestos que existan en nuestra muestra,
este movimiento se basa en la polaridad que tenga nuestra muestra y de igual forma la de
nuestro eluyente. En estos casos nuestros eluyente serán la acetona, dicloro y el éter de
petróleo donde se encuentran en forma decreciente en polaridad. Como un dato a parte se
tiene que saber que la sílica de gel que se coloca sobre la porta objetos también es polar.
Ahora el primer pasó a analizar e el efecto que tiene la concentración en una cromatografía de
capa fina, es decir, cuanta cantidad de nuestra muestra coloquemos en nuestro portaobjetos,
como sabemos su fin de la cromatografía en capa fina es la observación de manchas. A mayor
concentración habrá una mancha de mayor proporción, en este caso tuvimos una pequeña
variación que fue que las manchas se presentaban alargadas, esto lo debemos a que el punto
de aplicación de las muestras en donde se debía poner más de una gota de muestra no fue en
el mismo lugar, aunque no fue un problema mayor ya que la variación del Rf no fue significativa.
El siguiente punto que se analizó en nuestro laboratorio fue el efecto de la polaridad, como ya
se mencionó la distancia que nuestra muestra recorra estará en función de la polaridad,
en el caso de nuestro laboratorio analizamos tres casos, con tres distintos eluyentes, en la
primera el eluyente utilizado fue acetona, en éste caso podemos notar que como la acetona
es un compuesto polar se retuvo en la fase estacionaria. Podemos afirmar entonces que
nuestras muestras son polares ya que se recorrieron una pequeña distancia con respecto
al punto de aplicación ya que tuvieron un pequeña interacción con el eluyente que es un
compuesto polar, es decir, la sílica gel presenta una polaridad similar a la acetona.; el segundo
eluyente fue el dicloro, sabemos que este es un compuesto medianamente polar, en
comparación con la sílica de gel que es polar, recorre una distancia mayor y marca diversos Rf
con respecto al punto de aplicación, ya que éste se retiene menos en el punto de aplicación.
En el tercer eluyente que es el éter de petróleo, que en comparación con los dos eluyentes
anteriores es el menos polar, se repetiría una marcación en el portaobjetos parecida al de la
acetona, donde no recorrería casi nada con respecto al punto de aplicación, con lo cual
demostraría que la sílica de gel es polar y también mucho más polar en comparación con el
éter de petróleo. Finalmente utilizamos nuestro último eluyente que es una mezcla de acetona
y éter de petróleo, donde podemos obtener diversos Rf y observamos que la muestra recorre
una gran distancia con respecto al punto de aplicación. El tercer caso en analizar fue identificar
cuando un compuesto o una muestra es pura, utilizamos el mismo principio de polaridad en
este caso, cuando una muestra es pura solo encontraremos una solo mancha en nuestra placa
ya que todo el compuesto tiene la misma polaridad ya que es un único compuesto, en el caso
de que el compuesto o muestra no sea pura encontraremos dos o más manchas en nuestro
portaobjetos, esto nos afirma que tenemos más de una sustancia presente en nuestra muestra,
en el caso de que las polaridades de las sustancias presentes sean distintas, esto es lo que
podremos apreciar en la placa realizada.

5. RECOMENDACIONES Y CONCLUSIONES

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- Se obtuvieron los pigmentos fotosintéticos de la clorofila, que son los que le dan color a las
hojas de las plantas ya que la fotosíntesis es un proceso que permite a los vegetales obtener la
materia y la energía que necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias
a la presencia en las hojas y en los tallos jóvenes de pigmentos, capaces de captar la energía
lumínica.
- La cromatografía en capa fina resulta un método muy útil, si bien no tanto para separar
sustancias si es muy útil utilizar este principio de separación para observar diferentes
situaciones de una muestra problema como es la pureza o la identificación de compuestos
presentes en ésta muestra de igual manera aplicamos esto para saber cuándo una reacción
ya ha terminado o no, para lograr observar un buen cromatograma debemos de tomar en
cuenta siempre la polaridad tanto del compuesto a analizar así como del eluyente, así
podremos ver las diferencias de Rf y asegurar los puntos anteriores por la distancia
recorrida de cada sustancia y cuando son distintas o cuando son las mismas.
- Gracias a esta práctica, se logró observar comocambian las tonalidades de estos pigmentos
fotosintéticos que componen a las plantas y se3encuentran en los cloroplastos de la célula
vegetal y les dan color al reflejar o transmitir la luz visible, además de que son los que
constituyen el sustrato fisicoquímico de la fotosíntesis.
- Lavar 6 placas “porta-objetos” de vidrio con detergente, enjuáguelas con agua destilada,
secarlas con toallas de papel y finalmente desde ahora al manipular las placas tomarlas por los
bordes. Esto para que al momento de vaciar nuestra muestra y nos de lecturas de Rf no
interfiera ninguna sustancia.
- Al momento de preparar la sílica de gel sobre el “porta-objetos”, debemos de tener en cuenta
que no tiene que ser tan transparente como para que se refleje a través del porta-objetos, ni
tampoco tan aguada, debe ser media espesa.
- Se recomienda también al momento de poner la muestra en el porta objetos y al arrojar los
colores, no medir en ese instante, sino tomarle una foto y luego medirla a escala, ya que los
colores solo duran un cierto tiempo en la sílica de gel y luego se van desvaneciendo, lo cual si
nos demoramos nos saldrá un gran error al hallar nuestros Rf.
- Al momento de cubrir nuestro recipiente con el papel de filtro alrededor de nuestro vaso de
precipitado, recordar que al echarle el eluyente se debe tapar y agitar para que el papel de
filtro lo absorba, tapar es porque son eluyentes volátiles.

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7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[ Experimentos de química orgánica:

1 https://books.google.com.pe/books?id=Otm5wsEeKYEC&pg=PA101&dq=cromatograf%C3%ACa+e
] n+capa+fina&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiBvdvPjbDbAhXCpFkKHclgAuIQ6AEINzAD#v=onepage&q=
cromatograf%C3%ACa%20en%20capa%20fina&f=false

[ Laboratorio de cromatografía : https://es.scribd.com/document/244828905/CROMATOGRAFIA-

2 informe-labo-quimica-organica
]

[ Manual de laboratorio de química orgánica I

3
]

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