UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Departamento Académico de Química

Curso: Microbiología General - Laboratorio
INFORME DE LA PRÁCTICA N°3

​ inción diferencial ácido-resistente.

Título:T
Integrantes N° de matrícula

Bullón Lizama, Carlo 20170225

Lopez Carranza, Milagros 20170250

Salazar Sandi, Walter 20170261

Sánchez Portocarrero, José 20170237

Horario de práctica: ​lunes de 11 am a 1pm / Grupo: B*

Apellidos y nombres del profesor: ​Juscamaita Morales, Juan Gabriel
Fecha de la práctica:​ 8 de abril del 2019

Fecha del informe: ​15 de abril del 2019

Mesa: ​N°6

LA MOLINA – LIMA – PERÚ

 I. INTRODUCCIÓN

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver
con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la
utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes
de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales
como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria,
etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente,
aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y
alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en
células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente
fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce
habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las
células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de
las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

En la presente práctica se hará uso de la técnica de tinción diferencial de Dörner y la

de Schaeffer-Fulton para el reconocimiento de endosporas utilizando colorantes,
decolorantes y contrastantes que nos ayudarán a preparar las muestras que serán vista
en el microscopio óptico compuesto, en donde se visualizarán dichas estructuras
coloreadas.

II. OBJETIVO

Identificar endosporas y diferenciarlas de la estructura vegetativa de las muestras a

través de las técnicas de tinción diferencial de Dörner y Schaeffer - Fulton.
III. RESULTADOS

Figura Observación

Se colocó una gota de agua destilada en un

Figura 1. Observación de endosporas por tinción
simple
portaobjetos y con el asa de kölle se tomó una
muestra de cultivo de agar, la cual se esparció
junto con la gota por todo el portaobjetos. Una
vez obtenida una película delgada se fija la
muestra, después se echa colorante verde
malaquita y lo dejamos actuar por 1 minuto para
luego enjuagarlo. Con ayuda del aceite de
inmersión podemos ver que la parte vegetativa
se tiñe de verde y la endospora queda sin
colorante, brillando.

En un tubo de ensayo se introducen una gota de

agua y una muestra de cultivo bacteriano de
agar con 2 gotas de carbolfucsina, se calienta en
baño María por 15 minutos, de esta suspensión
de células hervidas se transfiere una gota a un
portaobjetos. Se le agrega nigrosina y se frota
con otro portaobjetos hasta tener una película
delgada. Se seca la lámina y se examina en el
microscopio con aceite de inmersión. Las
Figura 2. Observación de endosporas por el método
de Dörner
endosporas estarán teñidas de rojo, mientras que
la parte vegetativa incolora.

Se fija una muestra del cultivo bacteriano de

Figura 3. Observación de endosporas por el método
de Schaeffer y Fulton
agar, se le agregan unas gotas de carbolfucsina.
Se calienta ligeramente la lámina portaobjetos
con el mechero hasta observar el
desprendimiento de gases, evitar que el
colorante se seque. Se añade decolorante
alcohol ácido y se enjuaga. Se cubre la
preparación con colorante verde malaquita y se
enjuaga otra vez. Se seca la lámina y se examina
en el microscopio con aceite de inmersión. Se
observa que la endospora está teñida de color
verde y la parte vegetativa de color rojo.

Se hace lo mismo que en Dörner, nuestra

Figura 4. Observación de endosporas por el método
de Juscamaita
variante va a ser que una vez sacado el tubo de
muestra del calor se extrae una gota de este y se
fija en un portaobjetos, se le pasa el decolorante
alcohol ácido, se enjuaga y luego se le añade el
colorante verde malaquita y una vez que pasen 2
minutos se enjuaga y pasa al microscopio con
aceite de inmersión para observar las
endosporas que deben ser de color rojo, la parte
vegetativa será verde.
IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En la práctica para lograr observar las endosporas de la muestra de bacterias de un

agar nutritivo, se utilizó dos clases de tinción diferencial ácido-resistente: la técnica de
Dörner y la de Schaeffer y Fulton. En ambas técnicas se emplean como colorante
primario a la carbolfucsina. El fenol de la carbolfucsina y el calor suministrado en
ambos casos ayuda a que el colorante penetre en las bacterias, pero la diferencia entre
el modo de suministro de calor (directo e indirecto) se reflejan en el tamaño y
volumen de éstas (Keller PJ., 2011).

Las endosporas son formas de resistencia altamente deshidratadas y con una serie de
cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difíciles de teñir , excepto si se
calienta la preparación para permeabilizarlas; sin embargo, pueden evidenciarse en
preparaciones a fresco o con diversas tinciones, pues las esporas aparecen como
estructuras refringentes no coloreadas (Rodríguez, 2005). Donde por medio de una
tinción simple se pudo comprobar que las esporas se presentaba incolora por lo
resistentes que son y lo que se tiñó fue la parte vegetativa.

Una característica resaltante viene a ser el uso de tinta china como agente decolorante
y de tinción negativa en la técnica de Dörner. La tinta china es una suspensión de
partículas de carbono coloidal que decolora la parte vegetativa de las células pero no
la endospora ya que la corteza de ésta que se encuentra en su membrana contiene
peptidoglucano y más las otras complejas estructuras causan una impermeabilidad que
impiden la decoloración de la endospora de tal manera que cuando se utilizó este
método pudimos observar y afirmar como la parte vegetativa se encontró incolora
mientras que las esporas se tiñeron de un color rojo (Díaz, Gamazo y López-Goñi,
1995).

En la técnica de Schaeffer y Fulton se emplea el colorante primario verde de

malaquita a un extendido fijado con calor. Donde el calor ayuda a que el colorante
atraviese la pared de la endospora donde será enjuagado para quitar el colorante de
todas partes de la célula excepto de la endospora y donde a continuación se adiciona
safranina para teñir de rojo la parte vegetativa. Donde en un extendido adecuado la
endospora se presentará verde dentro de células rojas o rosadas (Tortora, 2007).
Comprobando así que las endosporas se tiñeron verdes pero no pudimos observar
mucho la parte teñida de rojo en la célula o parte vegetativa ya que seguro la muestra
no fue totalmente adecuada por algún error que se haya cometido en el proceso.
V. CONCLUSIONES

● Por medio de la tinción simple se comprobó esporas incoloras.

● Se comprobó que con la tinción de Dörner las esporas se tiñeron de rojo.
● Usando la técnica de Schaeffer y Fulton se observó esporas verdes y poca parte
vegetativa roja.

VI. CUESTIONARIO

● ¿Cuál de los dos métodos le permitió observar mejor las endosporas

bacterianas? ¿A qué atribuye la diferencia?

Si bien al aplicar ambas técnicas nos permitió reconocer las endosporas bacterianas,
en la técnica de Schaeffer y Fulton se observó con mayor precisión y nitidez la
ubicación de las endosporas, pudiéndose notar que las endosporas bacterianas se
encontraban teñidas de color rojo diferenciándose de la parte vegetativa teñida de
color verde.

● ¿Qué efecto produciría el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante

como el alcohol cetona?

Las bacterias ácido-alcohol resistentes está determinada por la composición de la

pared celular, la cual además de contener peptidoglicano está constituída por un alto
porcentaje de glucolípidos hidrofóbicos. Un componente importante de estos, son los
ácidos micólicos. La presencia de estas capas hidrofóbicas previenen la penetración de
soluciones acuosas, siendo esta la causa por la cual estos microorganismos no pueden
teñirse con los métodos convencionales (tinción de Gram). Una vez que el colorante
penetra a la célula bacteriana, este se combina con las mismas estructuras con las que
se combina en cualquier otra bacteria (ácidos nucleicos, proteínas, etc.) y además
reacciona con ácidos micólicos libres, lo cual hace que la pared celular se vuelva aún
más hidrofóbica. Con la tinción de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias ácido-alcohol
resistentes como las no ácido-alcohol resistentes se tiñen con el colorante primario.
Sin embargo, al aplicar el agente decolorante, compuesto por una mezcla de
alcohol-ácido, este no solubiliza los lípidos de la pared de las bacterias ácido-alcohol
resistentes con lo cual se decoloran fácilmente, por lo que se vuelven a teñir al aplicar
el colorante de contraste. Teniendo en cuenta este concepto, el uso de otros
decolorantes como el alcohol cetona debido a su naturaleza química podría
efectivamente decolorar las estructuras teñidas, de modo tal que no se podría notar
una diferenciación clara entre la endospora bacteriana y la parte vegetativa (Villa,
Fernandez y Castillo, ​2012).
● ¿Qué otros géneros de bacterias pueden formar endosporas?

Cuadro 1. Géneros más representativos de bacterias esporoformadoras.

GÉNERO CARACTERÍSTICA

Desulfotomaculum Bacilos. Reductores de sulfato.

Sporolactobacillus Microaerofílicos, catalasa negativa,

productores de ácido láctico.

Alicyclobacillus Acidófilos (pH=3).

Heliobacterium Fotótrofos anoxigénicos que producen

una única forma estructural de
bacterioclorofila. Alcalófilo (pH=9).

Sporosarcina Forma de cocos. Son microorganismos

aerobios estrictos, esféricos u ovalados.

Fuente: ​Madigan, Martinko y Parker, 2004.

● Revise otras técnicas de tinción de esporas y comparelas con las usadas en este
ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.

El método de Moeller utiliza cloroformo y ácido crómico en un primer momento

después se lava con agua destilada y procede a teñirse con fucsina fenicada de
Ziehl-Neelsen (carbolfucsina) en caliente para sensibilizar y colorear la espora. La
decoloración se realiza con alcohol clorhídrico y se usa como colorante de contraste
azul de metileno. Las esporas se observarán de color rojo (debido a su tinción con
carbolfucsina), la parte vegetativa presentará un color azul (debido a su tinción con el
azul de metileno). Este método presenta cierta similitud en el procedimiento que
utiliza la técnica de Schaeffer y Fulton, además que aplica a la muestra la misma
solución colorante la cual es carbolfucsina; la diferencia es que el método de Moeller
utiliza azul de metileno en cambio la técnica de Schaeffer y Fulton utiliza verde
malaquita (​García, Colom y Jaramillo, 2003).

Ventajas: Gran utilidad para la observación de las endosporas bacterianas.

Desventajas: Un lavado excesivo con alcohol clorhídrico puede alterar los resultados.

Otro ejemplo es el método de Wirtz, en el cual se tiñe con verde malaquita en caliente
para sensibilizar y colorear la espora, después se lava con agua destilada. No se realiza
ninguna decoloración, se procede a usar como colorante de contraste safranina o
 fucsina diluida, finalmente se lava otra vez. Las esporas se observarán de color verde
(debido a su tinción con verde malaquita), la parte vegetativa presentará un color rojo
(debido a su tinción con safranina o fucsina diluida). Este método utiliza las mismas
soluciones colorantes que la técnica de Schaeffer y Fulton; la diferencia es que el
método Wirtz no emplea ninguna solución decolorante en cambio en la técnica de
Schaeffer y Fulton utiliza el alcohol ácido, además en esta técnica la espora queda
teñida de un color rojo y la parte vegetativa de un color verde (​Granados y Villaverde,
1997).

Ventaja: La utilización de pocos reactivos aumenta la posibilidad de observar con

claridad las endosporas bacterianas.
Desventaja: Un lavado excesivo con agua destilada puede alterar los resultados.

VII. BIBLIOGRAFÍA

Díaz, R., Gamazo, C., y López-Goñi, I. (1995). ​Manual práctico de Microbiología​.

Barcelona: MASSON.

García, M., Colom, M. y Jaramillo, J. (2003). ​Manual del Auxiliar de Laboratorio (2a.
ed). Sevilla: MAD.

Granados, R. y Villaverde, M. (1997). ​Microbiología Tomo 1: Bacteriología,

características y clasificación bacteriana; Virología, características y técnicas
bioquímicas.​ Madrid: Paraninfo.

Keller, PJ. (2013) Imaging morphogenesis: technological advances and biological

insights. ​Science, 340​(6137).

Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). ​Brock, B ​ iología de los

microorganismos​ (10a. ed.). Madrid: Prentice Hall.

Rodríguez, E. (2005). B ​ acteriología general : principios y prácticas de laboratorio​.

San José: Editorial de la Universidad de Costa Rica.
Tortora, G. (2007). ​Introducción a la microbiología 9° Edición.​ Buenos Aires:Médica
Panamericana.

Villa, M., Fernandez, E. y Castillo, C. (2012). ​Bacteriología y micología veterinaria:

Manual de Prácticas de Laboratorio.​ México: Benemérita Universidad
Autónoma de Puebla. Recuperado el 13 de abril de 2019 de:
http://files.gerardo-castillo.webnode.mx/200000059-1ad5b1bc4c/MANUALB
ACTERMUM.pdf