Microscopía - Walter Manya

U. N. M. S. M.
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA - ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
PRÁCTICA N° 1
MICROSCOPÍA
I- INTRODUCCIÓN.
En el estudio de estructuras biológicas microscópicas, se presentan 3 grandes

problemas que dificultan una buena observación, estas serían:
1) Las pequeñas dimensiones de las células y sus organelas.

2) Su transparencia a la luz visible, lo cual origina la falta de contraste entre las
diferentes estructuras y entre éstas y el medio que los rodea.
3) Su falta de estabilidad en el tiempo.
Para superar el primer problema se inventaron, construyeron y perfeccionaron

microscopios capaces de aumentar significativamente las imágenes revelando
los por menores de las estructuras. Para resolver el segundo problema, se
desarrollaron técnicas de coloración y tinción, que permiten aumentar el
contraste entre las diferentes estructuras y entre ellas y su entorno haciéndolas
claramente visibles y diferenciables. La estabilidad y preservación de las
estructuras biológicas llevó al desarrollo de técnicas de deshidratación, fijación
e inclusión que nos permiten tener muestras permanentes.
Todo esto dio origen al desarrollo de disciplinas como la Citología, la

Histología, la Microscopía, etc.
MICROSCOPIO. Es un instrumento óptico que nos permite observar una

imagen amplificada de un objeto pequeño; siempre y cuando sus dimensiones
estén dentro del límite de resolución del microscopio.
La cantidad de detalles que puede registrar un sistema óptico depende de la
naturaleza ondulatoria de la luz.
Como se aprecia en la Figura 1; si P es un punto luminoso que irradia ondas

luminosas en todas las direcciones; éstas llevan información del punto P, pero
solo una fracción de ellas es captada por la lente AB y son utilizadas para
formar la imagen P1 del punto P. Es por esta razón que ni el mejor instrumento
óptico conocido puede darnos una imagen perfectamente puntual del objeto
bajo observación.
MANUAL DE LABORATORIO – BIOLOGÍA CELULAR

Autor: Walter Fernando Manya Agurto
Facultad de Ciencias Biológicas – Departamento Académico de Biología Celular y Genética
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U. N. M. S. M.
Figura Nº 1
APERTURA NUMÉRICA. Es la expresión numérica de la fracción de ondas

luminosas que emitidas por el objeto atraviesan la lente y sirven para formar su
imagen.
Figura Nº 2
En la Figura 2 podemos observar que la lente AB recibe un cono de rayos

luminosos provenientes del punto P; si 2µ es el ángulo de este cono, la
cantidad de rayos que penetra en la lente, denominada Apertura Numérica, se
mediría por la siguiente expresión:
AN = n . Sen µ
Donde:
AN = Apertura numérica
n = Índice de refracción del medio entre P y la lente.
Sen µ = Seno del semi-ángulo de apertura.

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Puesto que la función Seno está definida en el intervalo [-1 , 1] entonces el Sen
µ no puede ser mayor de 1, y dado que el índice de refracción de los mejores
medios ópticos conocidos no es mayor de 1.6; usando aceite de inmersión,
podemos deducir que la máxima Apertura Numérica que puede lograrse en una
lente es de 1.4.
La Apertura Numérica es una constante óptica para cualquier lente y determina

la capacidad de la lente para dar detalles finos del objeto observado.
Su valor está grabado en las lentes objetivo.
PODER DE RESOLUCIÓN. Es la capacidad del sistema óptico que nos

permite distinguir 2 puntos situados uno muy cerca del otro como si fueran
unidades independientes y por lo tanto formando imágenes separadas.
Dos puntos forman imágenes separadas entre sí siempre y cuando entre ellos
exista una distancia mínima.
LÍMITE DE RESOLUCIÓN. Es la distancia mínima que debe existir entre 2

puntos para que puedan ser visualizados como entidades independientes.
Si la distancia que separa a los 2 puntos es menor que el límite de resolución,
formarán una sola imagen es decir, sus imágenes se superponen.
Ejemplo: El límite de resolución del ojo humano es de 0.1mm por lo que, 2

puntos separados por una distancia menor a 0.1 mm (100 micras) serán
visualizados como uno solo. Por otro lado, el límite de resolución del
microscopio de luz visible es de 0.2 micras (0.0002 mm); por lo que los puntos
serán visualizados como independientes.
El límite de resolución es una constante óptica y su valor puede ser calculado

por la siguiente fórmula:
r = 0.61 
AN
Donde:
r = Límite de resolución
 = Longitud de onda de la luz empleada en la observación

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En general, la radiación de una determinada longitud de onda no puede ser

usada para observar detalles más pequeños que su propia longitud de onda;
este hecho representa una limitación fundamental en todo microscopio
compuesto.
Como hemos visto, la máxima apertura numérica que puede lograrse es de 1.4
por lo tanto, el límite de resolución de un microscopio compuesto depende, en
última instancia, de la longitud de onda de la luz empleada en la observación; la
cual está en el rango de 0.4 - 0.7 micras dependiendo de su color.
En términos prácticos, las bacterias y las mitocondrias, las cuales están
alrededor de 0.5 micras (500 nanómetros), son las estructuras más pequeñas
que pueden ser vistas con el microscopio compuesto. Estructuras más
pequeñas que estas no podrán ser visualizadas por efectos de la difracción
óptica.
Unidades Usadas en Microscopía
1 milímetro = 1mm = 1000 micras = 103 

1 micra = 1 = 1000 nanómetros = 103 nm
1 nanómetro = 1nm = 10 Angstrom = 10 A0
MECANISMO DE LA FORMACIÓN DE IMÁGENES EN EL MICROSCOPÍO
Para el caso del microscopio compuesto nos interesa conocer el mecanismo de

formación de imágenes a través de lentes biconvexas.
Una manera fácil de entender el funcionamiento del microscopio es,

considerarlo como un sistema óptico formado por dos lentes convergentes: el
ocular y el objetivo. La imagen formada por estas lentes puede construirse por
simple geometría.
FORMACIÓN DE LA IMAGEN EN LA LENTE OBJETIVO. Como puede

apreciarse en la Figura 3, la imagen resultante, P1Q1 es más grande que el
objeto PQ y además es invertida. Esta se conoce como imagen primaria; pues
es la primera que se forma y es real; porque puede recogerse en una pantalla
situada en el plano de la imagen, puede proyectarse y fotografiarse.

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Figura Nº 3
FORMACIÓN DE LA IMAGEN EN LA LENTE OCULAR. Como puede

observarse en la Figura 4, la lente ocular toma como objeto la imagen formada
por la lente objetivo, P1Q1 para producir su propia imagen, P2Q2. La imagen
resultante es más grande e invertida con respecto a la imagen del objetivo y
derecha con respecto al objeto. Esta imagen se conoce como imagen
secundaria pues es la segunda imagen que se forma y virtual porque no puede
ser recogida en una pantalla, no puede proyectarse ni fotografiase.
Figura Nº 4

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U. N. M. S. M.
En la Figura 5 se aprecia el mecanismo completo de la formación de la imagen

en un microscopio compuesto, es importante señalar que también interviene
una tercera lente que es el cristalino del ojo del observador.
Figura Nº 5
PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
PARTE MECÁNICA:
 Tubo óptico. Cilindro metálico relacionado en su parte superior con la

lente ocular y en la parte inferior con el revólver que porta a las lentes
objetivo. En su parte posterior posee un engranaje llamado cremallera.
Cuando el microscopio posee un solo tubo óptico se llama monocular y
si posee 2 se llama binocular.
 Brazo. Dispositivo metálico que en su parte postero-superior lleva un

engranaje que coincide con la cremallera; sirve para fijar el tubo óptico.
En su parte inferior se relaciona con la base por medio de un tornillo
llamado charnela el cual permite inclinar el brazo del microscopio. El
brazo porta además los tornillos macrométrico y micrométrico.

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 Tornillo macrométrico. Situado en la parte superior y lateral de brazo,

sirve para desplazar rápidamente el tubo óptico acercando los objetivos
al objeto. Nos da un enfoque grosero del objeto observado.
 Tornillo micrométrico. Situado en la parte inferior y lateral del brazo,

sirve para desplazar lentamente el tubo óptico y enfocar al objeto. Nos
da un enfoque fino del objeto observado.
 Platina. Placa metálica que se encuentra fija en la parte inferior del

brazo, presenta una abertura central llamada abertura de la platina
destinada a dar paso a los rayos luminosos proyectados por el espejo y
a través de la cual puede observarse la lente condensador. En la parte
posterior y lateral lleva pinzas que sirven para fijar la lámina porta objeto.
 Revólver. Sistema discoidal giratorio que va montado en la parte inferior

del tubo óptico, posee 3 ó 4 aberturas donde se atornillan las lentes
objetivo. Este dispositivo permite el intercambio de las lentes objetivo las
cuales al girar deben disponerse en el retén indicando que se
encuentran en posición de observación.
 Tornillo del condensador. Permite desplazar verticalmente el

condensador. Para una óptima observación; el condensador debe estar
en su posición más alta.
 Base. Llamada también pie o estativo, sirve para dar estabilidad al

microscopio.
PARTE ÓPTICA:
 Ocular. Situado en la parte superior del tubo óptico. Recibe ese nombre
por ser la lente situada más cerca al ojo del observador. Existen
oculares de diferentes poderes de amplificación: 4x, 5X, 10x, 12x, y 16x.
Su valor se encuentra grabado en la lente la cual actúa como una lupa
proporcionando una imagen más grande, virtual y derecha de la imagen
del objetivo.
 Objetivo. Lentes dispuestas en el revólver, en la parte inferior del tubo

óptico. Reciben este nombre por ser las lentes que se sitúan más cerca
al objeto.

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Existen objetivos de diferentes poderes de amplificación: 4x, 10x, 40x,

43x, 63x y 100x. El objetivo de 100X recibe el nombre de objetivo de
inmersión.
Cada objetivo lleva grabado 2 números que corresponde a su poder de
amplificación y a su apertura numérica. Los objetivos nos proporcionan
una imagen amplificada, real e invertida del objeto.
 Condensador. Concentra los rayos luminosos sobre el objeto.
 Diafragma. Situado debajo del condensador, es un dispositivo con una

abertura central la cual puede ser regulada aumentando o disminuyendo
su diámetro. Sirve para regular la intensidad luminosa y es muy útil
cuando los objetos observados son muy trasparentes puesto que nos
permite contrastarlos sobre un fondo luminoso.
 Espejo. Se encuentra situado debajo de la platina y está montado es un

soporte que permite girarlo en cualquier dirección.
Es un elemento fundamental del sistema de iluminación del microscopio
puesto que al dirigirlo hacia la fuente de luz permite reflejar los rayos
luminosos hacia el objeto. Posee una cara plana que es usada cuando
se trabaja con luz natural y una cara cóncava que se utiliza cuando se
trabaja con luz artificial.
En microscopios modernos es reemplazado por un foco.
PODER DE AMPLIFICACIÓN TOTAL
El poder de amplificación total de un microscopio compuesto, para cualquier

combinación de oculares con objetivos, se obtiene multiplicando los respectivos
poderes de amplificación.
Ejemplo: Si usamos un ocular de 10x combinando con un objetivo de 40x

entonces, el poder de amplificación total es de 400x
Al usar esta combinación de lentes observamos una imagen amplificada 400
veces el diámetro del objeto.

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U. N. M. S. M.
Oculares
Tubo óptico
Cabezal
Revólver
Brazo Objetivos
Platina Condensador
Foco
Base
Micrométrico
Macrométrico
MICROSCOPIO COMPUESTO

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II- OBJETIVOS
 Reconocer cada una de las partes de un microscopio compuesto.

 Determinar la función que cumple cada una de la partes.
 Conocer lo cuidados que deben tenerse para el uso correcto del
microscopio.
 Lograr un uso eficiente del microscopio.
III- MATERIALES
Proporcionados por el estudiante:
- 1 franela
- 3 láminas portaobjetos
- 3 láminas cubre objeto (laminillas).
- 1 frasco gotero.
- Papel lente
- Tijera, pinza, bisturí y estilete
- Hebras de lana y algodón
- Papel bond escrito a maquina
- Papel milimetrado.
Proporcionados por el laboratorio:
- Microscopio compuesto
- Aceite de inmersión
- Alcohol absoluto: éter etílico (1:2)
IV- MÉTODOLOGÍA
El microscopio es un instrumento de precisión, delicado y caro. Por más sólido

que parezca no debe ser sometido a un trato rudo pues esto afectaría su
delicado mecanismo. Es necesario familiarizarse con sus partes y a
continuación seguir los siguientes pasos:
 El microscopio se transporta cogiendo con una mano el brazo y con la otra

se soporta la base.
 Limpie la mesa de trabajo con un paño limpio.

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U. N. M. S. M.
 Elegir un lugar, en la mesa de trabajo, de manera que el microscopio esté

estable.
 Limpie la parte mecánica del microscopio: tubo ocular, brazo, platina,
tornillos macrométrico y micrométrico, tornillo del condensador y base.
Use un paño limpio y seco.
 Proceda a limpiar el sistema óptico: ocular, objetivos, condensador y
espejo. Esta limpieza se lleva a cabo usando únicamente PAPEL LENTE
y cuidando de no colocar los dedos sobre las lentes.
 Seleccione el objetivo de menor aumento.
 Desplazar el tubo óptico a su mínima posición.
 Verificar que el diafragma esté completamente abierto.
 Con ayuda del respectivo tornillo, desplace el condensador a su posición
más alta.
 Verifique que entre el espejo y la fuente de luz no existan obstáculos.
 Mirando por el ocular, dirigir el espejo, por su cara cóncava, hacia la
fuente de luz hasta que el campo de microscopio se ilumine intensamente
y en forma homogénea.
Una vez completado este procedimiento, el microscopio está enfocado, apto

para proceder a la observación de las muestras deseadas y no debe ser
cambiado de lugar pues la posición del espejo con respecto a la fuente de luz
varia y habría que enfocarlo nuevamente.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
 Limpie una lámina porta objeto con un paño limpio y seco. Maneje la
lámina únicamente por los bordes.
 Con sumo cuidado limpie una lámina cubre objeto.
 Con un gotero, coloque una o dos gotas de agua en el centro de la lámina
porta objeto.
 Recorte una letra “e” minúscula y, con ayuda de la pinza y el estilete,
colóquela en la gota de agua en posición de lectura.
 Cubra la muestra con una laminilla cubre objeto evitando la formación de
burbujas de aire.
 Seque el exceso de agua con papel absorbente.
 Disponga esta preparación; llamada preparación húmeda, sobre la platina
y sujétela con las pinzas.
 Proceda a observar con el objetivo de menor aumento. Dibuje sus
observaciones.

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U. N. M. S. M.
 Observando por el ocular cierre lentamente del diafragma anotando los

cambios en la imagen.
 Desplace la lámina porta objeto hacia arriba, luego hacia abajo y describa
el desplazamiento de la muestra.
 Desplace la lámina porta objeto hacia la derecha, luego hacia la izquierda
y describa el desplazamiento de la muestra.
 Gire el revólver para seleccionar el objetivo de mediano aumento. Dibuje
sus observaciones.
 Realice la misma operación para el objetivo de mayor aumento.
Una vez terminada la práctica, limpie la parte mecánica con la franela y el

sistema óptico con papel lente. Seleccione el objetivo de menor aumento, abra
completamente el diafragma, coloque el tubo ocular en su mínima posición y
guarde el microscopio.
V- CUESTIONARIO
1- ¿Qué es difracción óptica? Explique cómo influye este fenómeno en

microscopia.
La difracción óptica es un fenómeno físico en el que una onda de cualquier

tipo se extiende al pasar por el borde de un objeto sólido o por espacios de
una rendija estrecha.
El poder de resolución de un microscopio tiene que ver con el poder de
distinguir dos objetos que están muy juntos y la difracción permite eso, un
objeto se distingue de otro debido a los efectos de difracción.
2- ¿Qué es refracción y cómo influye en microscopia?
La refracción es el cambio de dirección del rayo de luz al pasar de un cuerpo

a otro que tenga una distinta densidad, un ejemplo de esto sería un rayo de
luz desde un foco en el aire hasta un vaso de agua.
En el caso del microscopio, se puede hablar de refracción cuando la luz
pasa a través de los lentes, la luz cambia de dirección cuando pasa por las
lentes y es por eso que las lentes deben cuadrarse bien antes de mirar la
imagen.
3- La fuente luminosa de un microscopio compuesto es radiación ultravioleta,

de 2000 Aº de longitud de onda y lo usamos con objetivos de aperturas

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U. N. M. S. M.
numéricas 0.25 y 0.65 ¿Calcular el límite de resolución del microscopio para

cada uno de los objetivos?
R1= (2000 X 0,61)/0,25 = 1219,75

R2 (2000 X 0,61)/0,65 = 1876,92308
4- El PPLO (organismo del tipo de la pleuroneumonía) mide 0.1 µ de diámetro.

Exprese su tamaño en milímetros, nanómetros y Angstrom.
0,1 u = 0,0001 mm
100 nm
1000 Angstrom
5- ¿De qué factores depende el aumento microscopio?
El aumento del microscopio depende de lo que se quiera visualizar, del

tamaño de la muestra que se tenga y de los objetivos que se puedan usar.
6- ¿Qué otros tipos de microscopios existen?
Microscopio óptico.
Microscopio simple.
Microscopio de luz ultravioleta.
Microscopio de fluorescencia.
Microscopio petrográfico.
Microscopio de campo oscuro.
Microscopio de contraste de fases.
Microscopio de luz polarizada.

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 Brazo. Dispositivo metálico que en su parte postero-superior lleva un

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 Tornillo micrométrico. Situado en la parte inferior y lateral del brazo,

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 Tornillo del condensador. Permite desplazar verticalmente el

 Base. Llamada también pie o estativo, sirve para dar estabilidad al

 Objetivo. Lentes dispuestas en el revólver, en la parte inferior del tubo

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Existen objetivos de diferentes poderes de amplificación: 4x, 10x, 40x,

 Condensador. Concentra los rayos luminosos sobre el objeto.

 Diafragma. Situado debajo del condensador, es un dispositivo con una

 Espejo. Se encuentra situado debajo de la platina y está montado es un

PODER DE AMPLIFICACIÓN TOTAL

El poder de amplificación total de un microscopio compuesto, para cualquier

Ejemplo: Si usamos un ocular de 10x combinando con un objetivo de 40x

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