Obdulio López Mayorga. Departamento de Química Física. Universidad de Granada.

1.- Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC).

1.1.- Introducción.

La calorimetría Isotérmica de Titulación es una técnica analítica ampliamente

usada en áreas de investigación muy diferentes: química y bioquímica, física y biofísica,
biotecnología, biomedicina, farmacología; así como en las industrias de cosméticos y
alimentación, procesos de control, etc. Básicamente esta técnica mide directamente el
calor liberado o absorbido en una reacción que pone en juego interacciones
intermoleculares e intramoleculares; las asociaciones proteína-ligando, proteína-
proteína, proteína-ADN / ARN son ejemplos de indudable interés biológico ( Ladbury,
J. E. & Chowdhry, B. Z., (1996). Chemistry & Biology, 3,791-801). Si el efecto térmico
neto de la interacción es suficientemente grande, la estequiometría, la entalpía de
formación y la constante de unión de estos complejos puede determinarse sin
ambigüedad. Consecuentemente, la energía de Gibbs de formación del complejo puede
calcularse, ∆G = − RT ln K , y subsiguientemente la entropía del proceso,
∆H − ∆G
∆S = . Repitiendo los experimentos de titulación calorimétrica a diferentes
T
temperaturas será posible además determinar el cambio de capacidad calorífica; el valor
de este parámetro nos permite estimar los efectos de deshidratación de grupos polares y
apolares que acompaña la formación del complejo.
El éxito de esta técnica se debe a varios hechos relevantes. En principio
cualquier interacción libera o absorbe calor. Este calor se mide directamente a presión
constante, es decir se mide directamente la verdadera entalpía de la reacción
subyacente; esta peculiaridad contrasta con las medidas de una entalpía aparente,
deducida de la dependencia de la constante de asociación con la temperatura (ecuación
de van‘t Hoff), obtenidas con técnicas tales como diálisis en equilibrio, ultrafiltración o
cromatografía de exclusión. Existe una base metodológica y teórica bien establecida
para analizar los datos experimentales, incluso de sistemas relativamente complejos
(Christensen, J. J. et al., (1973). Rev. Sci. Instrum., 44, 481. Wiseman, T. et al., (1989),
Anal. Biochem., 179, 131-137. Freire, E. et al., (1990), Annu. Rev Biophys. Chem., 19,
159-88). Como consecuencia, es posible en muchos casos obtener una caracterización

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completa de una interacción intermolecular, siendo la única técnica que proporciona

simultáneamente la estequiometría y los parámetros termodinámicos.
No obstante, la inespecificidad intrínseca en la detección del efecto térmico y
consecuentemente la incapacidad de la titulación calorimétrica para identificar la
interacción que origina el calor, se precisa de la ayuda de otras técnicas especificas para
interpretar los valores de los parámetros termodinámicos en términos moleculares.

1.2. - Instrumentación.

Adoptando como criterio de clasificación el principio de funcionamiento, los

Calorímetros Isotérmicos de Titulación de elevada sensibilidad utilizados durante las
dos últimas décadas en los estudios de interacción de biopolímeros, se engloban en dos
categorías o tipos; por un lado aquellos que utilizando un bloque de elevada capacidad
calorífica, a temperatura constante, se basan en la conducción de calor a través de los
sensores que detectan el efecto térmico producido por la interacción ( McKinnon, I. R.
et al., (1984), Anal. Biochem., 139, 134-139. Freire, E. et al., (1990) Anal. Chem., 62,
950-958. García-Fuentes, L., et al., (1998), Anal. Chem., 70, 4615-23. Velázquez-
Campoy, A. et al., (2000), Rev of Sci. Instrum., 71,1824-1840 ) Por otro lado, aquellos
que podemos llamar adiabáticos porque utilizan el mismo principio que el calorímetro
de barrido, previamente descrito, es decir son calorímetros que funcionan por
compensación del efecto térmico en un entorno adiabático (Wiseman, T. et al., (1989),
Anal. Biochem., 179, 131-137).
El primer tipo de calorímetro ITC responde en general a la configuración
esquematizada en la figura 1. En este diseño se utiliza siempre la configuración
diferencial, conocida entre los especialistas de microcalorimetría como principio
“Twin” o de células gemelas, en la cual una de las células actúa como vaso de reacción
y la otra como referencia. Los efectos térmicos que se producen en cada una de las
células se detectan por el correspondiente sensor o termopila; ambos sensores se
conectan en oposición, así los efectos comunes accidentales o no deseados que se
produzcan con la misma amplitud y velocidad en ambas células, se cancelan en gran
parte. En el caso de máxima simetría el experimento se realiza usando dos jeringas
idénticas, que contienen uno de los reactivos, frecuentemente el ligando, L, disuelto en
tampón B (normalmente el tampón de la última diálisis de preparación de la disolución

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del biopolímero), manteniendo la agitación permanentemente e inyectando

simultáneamente en ambas células. La célula de reacción contiene la disolución del otro
reactivo, frecuentemente el biopolímero, M, mientras que la célula de referencia
contiene solo tampón. No obstante algunos de los microcalorímetros de este tipo no
incluyen ni la inyección bilateral ni la agitación simultánea de ambas células,
haciéndose un uso pasivo de la célula de referencia que se suele llenar con agua o el
tampón. En estos casos se precisa de un experimento en blanco para determinar los
efectos térmicos asociados principalmente a la agitación. En todo caso la medida tiene
su fundamento en la ley de Newton del enfriamiento, que establece una sencilla relación
de proporcionalidad entre el flujo de calor y la diferencia de temperaturas, como se
indica en la figura 1.2, y que se cumple bien para valores pequeños de la diferencia de
temperaturas.
Por otro lado, las termopilas de semiconductor que se utilizan en estos
microcalorímetros son elementos Peltier que cumplen la ecuación de Seebeck y por
consiguiente generan una fuerza electromotriz proporcional a la diferencia de
temperaturas de sus superficies opuestas. El resultado final, como indica la figura 1.2, es
una señal eléctrica proporcional al flujo de calor o potencia térmica neta. La
configuración diferencial introduce dos efectos térmicos simultáneos: WRX(t) + WA(t)
en la célula de medida y RWA(t) en la célula de referencia, siendo WRX(t) la potencia
R
térmica de reacción y WA(t) ( o WA(t) en la referencia) la potencia de efectos
accidentales( fluctuaciones de Ts, fricciones, diluciones, etc.). En un sistema diferencial
perfecto o sistema “Twin” ideal se cumple que WA(t) =RWA(t) y el efecto térmico neto
medido sería el correspondiente a la reacción, WRX(t).
Este tipo de microcalorímetros alcanza sus mejores características cuando se
implementa un procedimiento de medida por compensación de potencia con elementos
Peltier adicionales (Velázquez-Campoy, A. et al., (2000), Rev of Sci. Instrum., 71,1824-
1840).
El microcalorímetro descrito por Wiseman, figura 1.3, representa una serie de
instrumentos comercializados por MicroCal, Inc. y ampliamente distribuidos entre la
comunidad científica especializada en estudios tales como interacciones proteína-
pequeños ligandos, enzima-inhibidor, proteína-proteína, hormona-receptor, DNA-
proteína, lípido-proteína, cinéticas enzimáticas y plegamiento de proteínas.

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JERINGAS DE
INYECCIÓN

L L

B B
PALETAS DE
AGITACIÓN
SOBRE LAS
AGUJAS DE
INYECCIÓN
CÉLULA DE CÉLULA DE
REFERENCIA REACCIÓN

L L
ML
B
TERMOSENSORES B M
DE
SEMICONDUCTOR
- + - +

SUMIDERO DE CALOR
TS CONSTANTE

Figura 1.1.- Esquema general de un calorímetro isotérmico de titulación

basado en el principio de conducción del calor a través de sensores de baja
impedancia térmica. M, L y B representan moléculas de biopolímero, ligando y el
Tampón, respectivamente.

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Ley de Newton del enfriamiento:

dQ TC ∆T (t ) = T C (t ) −T S (t )
= W (t ) = α ⋅ ∆T (t )
dt E (t ) = ε ⋅ ∆T (t )
α : Coeficiente de intercambio de calor.
TS ε : Coeficiente Seebeck

La fuerza electromotriz generada por la termopila

es, aproximadamente, proporcional al flujo de
calor o potencia térmica:
ε
E (t ) = ⋅W (t ) = k ⋅W (t )
α

Figura 1.2. - Ley de Newton del enfriamiento y ecuación de Seebeck para un

elemento Peltier. Señal eléctrica proporcional a la potencia térmica en cada instante.

Como hemos dicho anteriormente se trata de un calorímetro que funciona por

compensación del efecto térmico en un entorno adiabático. Es un calorímetro diferencial
que hace un uso pasivo de la célula de referencia. Ambas células calorimétricas,
construidas con la aleación “hastelloy C”, tienen forma de cilindros planos (elevada
relación base / altura del cilindro) sobre cuyas caras externas se extienden finas
termoláminas y cuyas caras internas están en íntimo contacto térmico con un elemento
Peltier de 264 uniones PN de cristales de teluro de bismuto. Durante un experimento
una pequeña potencia constante, inferior a un milivatio, se disipa en la termolámina de
la célula de referencia y se activa el sistema de compensación que iguala las
temperaturas de ambas células y produce la línea base experimental. Un efecto
exotérmico o endotérmico aparta transitoriamente la potencia de compensación del
valor estacionario y se produce un pico característico sobre la línea base de cuya
integración extraemos el calor implicado en el proceso. Las células están suspendidas
solamente mediante largos tubos de acceso en el interior de un cilindro; con objeto de
crear para las células un entorno adiabático la temperatura de este cilindro se controla de

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forma que esté en todo momento tan próxima a la temperatura de las células como sea
posible; para ello una termopila formada por 20 uniones bimetal mide continuamente la
diferencia de temperatura células-cilindro y un sistema de control en lazo cerrado actúa
sobre una termolámina distribuida uniformemente por la superficie del cilindro. Agua,
circulando desde un baño termostático externo, actúa de foco térmico en el sistema de
control de temperatura. Para acentuar la adiabaticidad y eliminar la condensación del
vapor de agua (tanto más importante cuanto menor la temperatura de trabajo) se realiza
vacío en el interior del cilindro.
El subsistema de inyección - agitación es una de las partes mas críticas del
instrumento porque de su correcto funcionamiento depende la fiabilidad de los
volúmenes de inyección, de 2 a 5 µL en un experimento estándar, la eficacia de la
homogeneización de la mezcla reaccionante y un bajo nivel de ruido compatible con la
alta sensibilidad requerida para detectar efectos térmicos que típicamente suelen ser de
pocas decenas de microcalorías. Las jeringas de inyección son de precisión de vidrio,
con volúmenes entre 250 y 500 µL provistas de largas agujas de acero inoxidable que
tienen en su extremo terminal una pequeña paleta para agitar, figura 1.3.
La jeringa se fija firmemente sobre un dispositivo de rodamiento de muy baja
fricción que incluye una rueda estroboscópica usada para mantener constante, mediante
un dispositivo electrónico de regulación, la velocidad del motor de agitación y
monitorizar la velocidad de rotación. El émbolo de la jeringa está acoplado a un motor a
pasos digital de alta precisión, 6400 pasos por pulgada. Todas las variables
experimentales dependientes del instrumento, temperatura, número de inyecciones,
volumen por inyección, velocidad de rotación del agitador, tiempo entre inyecciones,
etc. se programan desde el soporte software que incluye el instrumento y el experimento
se realiza de forma completamente automática.
En ambos tipos de microcalorímetros isotérmicos de titulación la señal asociada
al efecto térmico transitorio de una reacción no demasiado lenta, tras la inyección de un
determinado volumen de uno de los reactivos (generalmente el ligando) sobre el otro
reactivo que llena la célula de reacción (generalmente la macromolécula), presenta un
pico con la forma característica de la respuesta de un sistema de segundo orden a un
pulso de potencia de corta duración (García-Fuentes, L. et al., (1998), Anal-Chem., 70,
4615-23), figura 1.4 . El calor correspondiente se obtiene del área delimitada por el pico
y la línea base interpolada entre la señal estacionaria previa y posterior a la inyección.

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EMBOLO DE LA JERINGA

JERINGA DE INYECCIÓN

FIJADOR DE LA POSICIÓN
VERTICAL DE LA JERINGA

EMBOLO DE LA JERINGA

RODAMIENTOS
DEL SISTEMA DE
AGITACIÓN
CILINDRO DE TEFLON

TUBO PARA
TUBOS DE PRODUCIR VACÍO
ACCESO A LAS
CÉLULAS

CILINDRO PARA
CREAR ENTORNO
ADIABÁTICO
TUBOS DE CIRCULACIÓN
PARA TERMOSTATIZAR
CÉLULA DE REACCIÓN

PALETA DE AGITACIÓN
SOBRE LA AGUJA DE
INYECCIÓN
CÉLULA DE REFERENCIA

Figura 1.3. - Esquema de las células calorimétricas, cilindro adiabático y el

conjunto agitador / inyector de un calorímetro de titulación basado en el principio de
medida por compensación del efecto térmico, en un entorno adiabático.

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W(t)

tf

Q = ∫W (t ) ⋅ dt
ti

l. b.

ti tf t

Figura 1.4.- Pico característico de respuesta a una inyección de un reactivo

(ligando ) sobre otro que llena la célula calorimétrica ( proteína ). El calor generado
en la reacción se obtiene integrando la función W( t ) sobre la línea base, l. b.

1.3.- Formulación y análisis del experimento en ITC.

El diseño de un experimento de interacción macromolécula-ligando, previo a su

realización, y el análisis de datos posterior se hacen sobre la base de un modelo de la
interacción. En aquellos casos de interacción proteína-ligando que no muestran un
efecto cooperativo, positivo o negativo, ni la proteína presenta diferentes clases de sitios
de unión para el ligando, el comportamiento del sistema interaccionante se describe
adecuadamente a través del modelo de unión de un ligando a una macromolécula con
sitios idénticos e independientes . El término “idénticos” implica la misma constante
de unión microscópica a cualquiera de los n sitios y el término “independientes” que la
unión a un sitio cualquiera no modifica la afinidad de los restantes.
El análisis termodinámico estadístico de un proceso de unión con estas
características nos demuestra que la función de partición de unión, que describe las
poblaciones de los diferentes estados moleculares accesibles del sistema, es (Gill,S.J. et
al., (1990). Journal of Chemical Education, 67, 928-931):
Z = (1 + k [L ] ) n [1.1]

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donde k es la constante microscópica aparente del equilibrio de unión, [L] la

concentración de ligando libre y n es el número de sitios de unión de la macromolécula
para el ligando.
La razón de la concentración de ligando unido, [L ]b , a la concentración de

macromolécula total, [M ]T , conocida como parámetro de unión, está relacionada con

la función de partición de unión por:

[L ]b ∂ ln Z
ν= = [1.2]
[M ]T ∂ ln [L ]

[L] representa la concentración de ligando libre en equilibrio con las otras especies
moleculares presentes en el sistema interaccionante (M, ML, ML2 , ..., MLn ). Por
consiguiente la concentración de ligando unido por mol de macromolécula para un
sistema representado por el modelo de n sitios idénticos e independientes será:

n k [L ]
ν= [1.3]
1 + k [L ]

Un experimento convencional en ITC consiste en una serie de inyecciones de un

determinado volumen de disolución del ligando, constante o variable, separada cada una
por un intervalo de tiempo suficiente para asegurar que se ha alcanzado el equilibrio y
se ha transferido o compensado todo el calor liberado o absorbido; la disolución de
macromolécula llena completamente la célula de reacción y se agita permanentemente
el contenido de ésta (o de ambas células) a velocidad constante. Suponiendo en
principio que no existen otros procesos concomitantes, tales como ionización del
tampón, en una inyección cualquiera de la serie el calor liberado o absorbido será:

kcal
q i = ∆H b ( ) ⋅ ∆( moles L b ) [1.4]
mol L b

donde Lb representa el ligando unido y ∆H b es el cambio de entalpía por mol de

ligando unido. Si VC representa el volumen de la célula que coincide con el volumen
inicial de la muestra, la ecuación anterior puede expresarse más explícitamente como:

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q i = ∆Η b .VC .([L]b ,i − [L]b,i−1 ) = ∆Η b .VC .( νi .[M ]i − ν i−1 [M ]i−1 )

[1.5]

Consideramos, en una razonable aproximación, que el volumen efectivo que

interviene en la reacción es aquel que llena la célula y por consiguiente las
concentraciones de macromolécula y ligando actuales en la célula han de corregirse por
las pequeñas cantidades de estos componentes contenidas en el volumen desplazado
fuera de la célula; así la concentración actual de M en la célula
( [M]i = [M]+[ML]+[ML2 ]+…) será:

−V in
[M ]i = [M ]i −1 ⋅ V C
VC

y la concentración total del ligando en la célula de reacción:

(VC − Vin ).[L]T,i−1 + Vin .[L]0

[L]T,i =
VC

donde Vin y [L] 0 son el volumen de inyección y la concentración en jeringa del ligando.
El calor total acumulado después de N inyecciones:

nk [L]
Q = ∑ q i = VC ⋅[M ]N ⋅ ∆Hb ⋅ν N = VC ⋅ [M ]N ⋅ ∆H b ⋅
N
[1.6]
i =1 1 + k [L]

En ITC el valor de la variable [L] no es conocida por lo que operativamente conviene

expresarla en función de las variables experimentales [L] T y Q:

[L ] = [L ]T − [L ]b = [L ]T −
Q
[1.7]
V C ∆H b
Sustituyendo [L] en la ecuación [1.6] por la expresión [1.7] se obtiene una ecuación de
segundo grado en Q cuya solución es:

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V C ∆H b
Q= ⋅ 1 + k [L ]T + nk [M ]T − (1 + k [L ]T + nk [M ]T )2 − 4nk 2 [M ]T [L ]T  [1.8]
2k 
Esta ecuación relaciona el calor total acumulado después de N inyecciones con las
variables experimentales VC, [L] T y [M] T y los parámetros n, k y ∆Hb a determinar en el
análisis de los datos de un experimento de ITC convencional. Por otro lado la ecuación
[1.7] puede rescribirse como:

nk [L ]
[L ] = [L ]T − [L ]b = [L ]T − [M ]T ⋅
1 + k [L ]

y despejando [L] podemos expresar ésta concentración libre de ligando en términos de

n, k, [L] T y [M] T:

[L ] = 1
2k
[
⋅ − (1 + nk [M ]T − k [L ]T ) + (1 + nk [M ]T − k [L ]T ) 2 + 4k [L ]T ] [1.9]

Derivando la ecuación [1.8] respecto a [L] T obtendremos una expresión para del calor
por mol de ligando añadido asociado a cada inyección:

1 dQ 1 ∆Q ∆H b  1 + k [M ]T θ − nk [M ]T 
⋅ ≈ ⋅ = 1 −  [1.10]
VC d [L ]T VC ∆[L]T 2  (1 + k [M ]T θ − nk [M ]T )2 − 4 nk 2 [M ]T 2θ 


donde θ =
[L ]T
[M ]T

Las figuras 1.5 y 1.6 corresponden a la simulación de un experimento

convencional de ITC consistente en 20 inyecciones de 5 µL de una disolución de
ligando 5 mM sobre un volumen VC =1.35 mL de una disolución de macromolécula,
inicialmente 1.8.10-4 M con un único sitio de unión para el ligando, n =1. Se consideran
cuatro posibles valores de la constante de unión, 2.5.106 , 2.5.105 , 2.5.104 y 2.5.103 , que
abarcan un intervalo desde una relativa alta afinidad hasta una baja afinidad.

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Las ecuaciones anteriores se utilizan para diseñar experimentos, utilizando

cualquier parámetro ya medido (estequiometría, afinidad, etc.) o algorítmicamente
predicho en base a la estructura, o simplemente valores esperados por analogía con
sistemas similares. Siempre que sea posible se seleccionará un valor para [M]T que
optimice la forma de la isoterma esperada (Wiseman, T. et al., (1989), Anal. Biochem.,
179, 131-137). Así mismo, estas ecuaciones se utilizan como modelo para la
determinación de los parámetros termodinámicos n, k y ∆Hb mediante procesamiento
por regresión no lineal de los datos experimentales. De las dos posibles formas de tratar
los calores experimentales que hemos mencionado, la del calor por mol de ligando
añadido asociado a cada inyección tiene la ventaja de evitar la propagación de errores
experimentales que se produce en el caso de calores acumulados, por lo que es la forma
mas adecuada para el análisis de la isoterma experimental.
Con frecuencia hay intercambio de H+ entre el tampón y el complejo MLn
durante su formación. La protonación o desprotonación del tampón representa una
contribución energética que puede ser mayor que la propia energía de la interacción
M-L. Una forma de evitar esta superposición de efectos térmicos, que enmascararían el
verdadero valor del cambio de entalpía de la unión, consiste en utilizar un tampón de
muy bajo calor de ionización, tales como el cacodilato y el glicerol-2-fosfato; pero esto
no siempre es factible porque estos tampones pueden interferir compitiendo con el
ligando por la unión a la macromolécula, o simplemente el experimento ha de hacerse a
un pH fuera del intervalo de tamponamiento eficaz de estos tampones. Otra alternativa
para solventar el problema es repetir las valoraciones calorimétricas en tres o más
tampones de diferente entalpía de ionización y, o bien extrapolar linealmente las
entalpías aparentes obtenidas a entalpía de ionización del tampón nula, o bien incluir en
la función de regresión no lineal explícitamente la contribución de la protonación o
desprotonación del tampón, de acuerdo con las ecuaciones que planteamos a
continuación.

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k.[M]T
20 ----------
450
45

dQ / d[L]T
15 4.5
0.45

10

0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

[L] T /[M] T

Figura 1.5.- Simulación del calor acumulado para un experimento ITC con
los siguientes parámetros experimentales: VC =1.35 mL; [M] inicial en célula =
1.8x10-4 M; 20 inyecciones de 5 µL; [L] en la jeringa de inyección = 5 mM; un único
sitio de unión para el ligando, n =1 y cuatro posibles valores de la constante de unión,
2.5.106 , 2.5.105 , 2.5.104 y 2.5.103 M-1 .

-3
4,5x10

-3 k.[M]T
4,0x10
----------
3,5x10
-3 450
45
Q acumulado (cal)

-3
3,0x10 4.5
0.45
-3
2,5x10

-3
2,0x10

-3
1,5x10

-3
1,0x10

-4
5,0x10

0,0
0,0 -5 -4 -4 -4 -4 -4 -4
5,0x10 1,0x10 1,5x10 2,0x10 2,5x10 3,0x10 3,5x10

[L] T (Molar)

Figura 1.6.- Simulación del calor por mol de ligando añadido asociado a cada
inyección para un experimento ITC con los siguientes parámetros experimentales: V C
=1.35 mL; [M] inicial en célula = 1.8.10-4 M; 20 inyecciones de 5 µL; [L] en la
jeringa de inyección = 5 mM; un sol sitio de unión para el ligando, n =1 y cuatro
posibles valores de la constante de unión, 2.5.106 , 2.5.105 , 2.5.104 y 2.5.103 M-1 .

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El cambio de entalpía global por mol de ligando unido será:

∆H = ∆H b + p ⋅ ∆H i [1.11]

donde ∆H b es la entalpía de unión por mol de ligando unido, p el número de moles de

protones por mol de ligando unido tomados (n>0) o cedidos (n<0) por el complejo MLn
a saturación.

El calor liberado o absorbido en cada inyección será ahora:

q i = VC ( ∆Hb + p ⋅ ∆H i ) (νi [M ]i −νi −1 [M ]i −1 ) [1.12]

El calor acumulado después de N inyecciones:

n k [L]
Q = ∑ q i = VC ⋅ [M ]N ( ∆H b + p ⋅ ∆H i ) ⋅
N
[1.13]
i =1 1 + k [L]

Y finalmente el calor por mol de ligando añadido asociado a cada inyección:

1 ∆Q ( ∆H b + p ⋅ ∆H i )  1 + k [M ]T θ − nk [M ]T 
⋅ = 1 −  [1.14]
VC ∆[L]T 2  (1 + k [M ]T θ − nk [M ]T )2 − 4nk 2 [M ]T 2θ 


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