UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
NOMBRE: Michelle Apunte
NRC: 3734
FECHA: 06/02/2018
Ensayo de RT-PCR multiplex en tiempo real en un paso para detectar y genotipificar cepas de
rotavirus de tipo salvaje y cepas de vacunas (Rotarix® y RotaTeq®) en muestras de heces
La gastroenteritis aguda en niños menores de 5 años que ya ha provocado 53,000 muertes anualmente
se origina por la infección con retrovirus del grupo A. El genoma de Retrovirus consiste en 11
segmentos de RNA bicatenario que codifica 6 proteínas estructurales y otras 6 no estructurales. La
carga total de la enfermedad en un 80-90% viene dada por 6 genotipos combinados del retrovirus. Dos
vacunas orales atenuadas proporcionan protección a la diarrea grave ocasionada por estos virus. Sin
embargo, al ser vivas pueden replicarse y recombinarse entre sí para producir variantes.

Las secuencias consenso permitieron realizar ensayos Taq Man para cada gen que se dirigía a regiones
génicas y sustituciones de nucleótidos. Se diseñaron primers universales en el extremo 5´ de los genes
VP7 y VP4. Se usó el mismo cebador directo para todas las QRT-PCR VP7 y de igual forma para el
otro gen. Se diseñaron sondas y primers a las que se introdujeron en bases degeneradas para identificar
la variación de nucleótidos entre las mismas cepas de genotipo con la secuencia de los genes. Se
verifico la especificidad de los primers y las sondas, se revisó los sitios de auto asociación, formación
de bucle en horquilla y la complementariedad. Para la extracción de RNA, se prepararon suspensiones
de 98ul al 10% de muestras de heces y cepas de referencia en solución preparado en tampón fosfato.
Para confirmar los dos genotipos presentados y las cepas de cada vacuna se usó RT-PCR, se realizaron
los genes y los ampliaciones resultantes se secuenciaron. El master mix contenía 5 uL de buffer, 2.4
uM dNTPs, 2.5 mM Mn, 2.5 U / uL rTth polimerasa o 5.0 U / uL rTth polimerasa, cebador directo,
cebador inverso, sonda a concentraciones finales específicas para cada ensayo de componente y 2ul de
RNA.

El ensayo de qRT-PCR multiplex permitirá caracterizar el genotipo de las cepas del retrovirus que
causan infecciones. De esta forma se podrá determinar cómo están las cepas una vez que se ha
vacunado, es decir permitirá reconocer nuevas cepas de retrovirus originadas por la recombinación
entre las cepas vacunas y las cepas silvestres.
Gautam, R., Mijatovic-Rustempasic, S., Esona, M. D., Tam, K. I., Quaye, O., & Bowen, M. D.
(2016). One-step multiplex real-time RT-PCR assay for detecting and genotyping wild-type
group A rotavirus strains and vaccine strains (Rotarix® and RotaTeq®) in stool samples.
PeerJ, 4, 1-30. doi:10.7717/peerj.1560
 Estudios de genética molecular en población saudí; variantes identificadas de GWAS y
metanálisis en apoplejía
El accidente cerebrovacular es un trastorno neurológico común que afecta toda la población se origina
tanto por problemas genético como por factores ambientales, es decir tiene una herencia multifactorial.
Se ha descubrir la predisposición a accidentes cerebrovasculares en las variantes genéticas. Este avance
podría suponer expansión de pruebas de diagnósticos mejoradas. De esta forma la identificación de
dicho riesgo es a través de polimorfismos de un solo nucleótido. Se han identificado varios
polimorfismos de diferentes genes se encuentran en un locus con alto riesgo de estos accidentes. El
gen Sortilin (SORT1) se ha identificado que se encuentra en las neuronas como en células no
neuronales y codifica una proteína que puede absorber lípidos. Las variantes funcionales se encuentran
dentro gen, pero una disminución de la expresión de este gen está estrechamente relacionada con el
riego de accidentes. La selección del gen OLR1 se dio por una sobreexposición que se ha asociado con
hipertensión, infarto de miocardio y aterosclerosis carotídea y, lo que es más importante está
estadísticamente relacionado con el riesgo.

Se utilizaron 414 pacientes saudíes con información demográfica y perfil lipídico. SE recogieron 5ml
de sangre periférica para el análisis bioquímico y la extracción de DNA genómico. Para los análisis
bioquímicos se usó el suero de la sangre y se verifico el colesterol total, triglicéridos, colesterol de
lipoproteínas de alta densidad y baja densidad. El DNA genómico se aisló mediante un kit comercial,
se seleccionaron dos SNPs basados en otros estudios, los primers fueron diseñados para el análisis del
Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción de Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR-RFLP). La amplificación se dio mediante PCR térmica en una mezcla de 25ul. Los productos
de PCR se digirieron por 16 horas y se analizaron en gel de agarosa al 3%. Para confirmar la calidad
se realizó en ambos SNP de casos y controles mediante la determinación de los genotipos en la
frecuencia total y en las frecuencias alélicas menores, indicando ~ 10% de muestras aleatorias, es decir,
30 casos y 30 muestras de control se han realizado el análisis de secuenciación de ADN.

Se confirmaron las variantes de los estudios de asociación de genoma completo y de metanálisis. El

presente estudio confirmo la asociación positiva a las variantes del alelo SORT1 y OLR1. Ambos
genotipos se asociaron con los triglicéridos y con ello la prevalencia de accidente cerebrovascular.
Estudios genéticos posteriores podrían establecer como marcador molecular de la población saudita.

Khalaf, K., Ali Khan, I., Abdullah, M., Saud, A., Abdulaziz, H., Abdullah, N., . . . Al-Sulaiman, A.
(2018). Molecular genetic studies in Saudi population; identified variants from GWAS and
meta-analysis in stroke. Saudi Journal of Biological Sciences, 25(1), 83-89.
doi:10.1016/j.sjbs.2017.08.014
 Identificación y diferenciación de las especies de Verticillium y V. longisporum por ensayos de
PCR Simplex y Multiplex
Los hongos de genero Verticillium con solamente 10 especies incluye a 7 patógenos de importancia
para las plantaciones agrícolas ya que causan perdidas económicas significantes. La identificación
exacta de cada especie y sus estructuras de descanso presentes en el suelo se ha vuelto indispensable
para saber cómo controlar las enfermedades en las plantas. Se ha identificado que una especie de este
género, la V. longisporum está constituida 3 grupos híbridos que evolucionaron independientemente y
muestran la diversidad genética del género. Por esta razón, la presente investigación busca la
identificación mediante PCR de las especies Verticillium y linajes de V. longisporum.

Se obtuvieron 104 secuencias de DNA de las 10 especies del género del Gen bank, que representaban
34 aislados y mostraban la diversidad genética. Los aislamientos fúngicos fueron recuperados del
laboratorio Subbarao, de ahí se procedió a cultivar y a extraer el DNA. Se diseñaron 18 primers para
11 ensayos de PCR y 4 para el multiplex. El diseño se basó en datos de la secuencia de DNA de
aislados de Verticillium en cinco loci. Las PCR se realizaron con GoTaq Colorless Master Mix, en los
tubos de PCR se agregó 10ul de dilución que contenía 1, 10 y 100 ng de DNA, 2,5ul de los primers y
12,5ul de master mix para un volumen de 25ul. El PCR consistió en la desnaturalización inicial de 2
min a 94 ° C, 32 o 35 ciclos de 10 segundos a 94 ° C, 20 segundos a la temperatura de alineación
dependiente del ensayo de PCR y 1 minuto a 72 ° C, seguido de una extensión final de 7 min a 72 ° C;
que se realizó en 3 máquinas distintas. El PCR fue seleccionado para cada grupo, para la identificación
de V. dahliae y V. longisporum, el V. dahliae - V. longisporum se usó multiplex, mientras que simplex
se usó para el resto. Finalmente, se procedió a realizar una electroforesis en gel de agarosa durante 30
y 70 minutos a 70-90V con distintas concentraciones para observar el patrón de bandas distintivo.

La identificación del genero se la realizo morfológicamente, al identificar estructuras de paredes

gruesas pigmentadas y células conidiogénicas largas y angostas dispuestas en verticilos. Se encontró
que Verticillium dahliae y V. longisporum son los más difíciles de identificar por PCR ya que el
primero resulta ser el padre del linaje del segundo. Para la identificación de estas dos especies la PCR
se dirige a un alelo presente solo en V. longisporum. Para la identificación de los linajes de V.
longisporum se observaron patrones de bandas diferentes con el multiplex, en el caso de D1 se
observan una banda de 1020pb y en el de A1 es de 310pb.

Inderbitzin, P., Davis, R., Bostock, R., & Subbarao, K. (2013). Identification and Differentiation of
Verticillium Species and V. longisporum Lineages by Simplex and Multiplex PCR Assays.
PLoS ONE, 8(6), 1-12. doi:10.1371/journal.pone.0065990