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Southern blot
1. Método
• Obtención de ADN
2. Aplicaciones
3. Limitaciones.
La técnica demanda bastante trabajo y puede tomar 7-14 días entregar un resultado.
Generalmente involucra el uso de material radiactivo, lo que requiere un entrenamiento especial y precauciones
de seguridad para el personal del laboratorio.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
1. Método
Amplificación
2. Aplicaciones.
• Una ventaja es que únicamente se requieren cantidades pequeñas de ADN (1 ug o menos, o únicamente
una sola célula).
• Una limitación es que se debe conocer la información de la secuencia para sintetizar los cebadores
oligonucleótidos que son esenciales para la PCR.
Secuenciación de ADN
La manera más precisa de caracterizar un segmento de ADN es obtener la secuencia de ADN exacta y de ésta
manera identificar variantes anormales.
1. Método.
Se utilizan dos métodos para determinar la secuencia de ADN, los cuales se basan en la separación de fragmentos
que varían en longitud por un solo nucleótido.
2. Aplicaciones.
Se pueden utilizar para secuenciar rápidamente los fragmentos que resultan de una reacción de PCR.
No se utiliza en forma rutinaria para el diagnóstico de ADN, pero su importancia se incrementa en la medida en
que la tecnología mejore y los costos disminuyan.
3. Ventajas y limitaciones.
Permite detectar directamente si el gen de un paciente tiene cualquier cambio en la secuencia cuando se
compara con un control normal y además determinar si es una variante polimórfica o una mutación deletérea.
1. Método.
• Utiliza dos sondas oligonucleótidas sintéticas: una sonda específica para el gen normal y otra sonda
específica para una mutación genética conocida.
• Las sondas ASO para el gen normal y el mutante se utilizan como sondas de hibridación para determinar
si un paciente tiene dos copias de un gen normal o de una mutación responsable de una enfermedad
particular.
2. Aplicaciones.
Es de mayor utilidad para diagnosticar enfermedades genéticas que típicamente surgen por una sola mutación
predominante (ejemplo, anemia falciforme, deficiencia de alfa-1 antitripsina).
3. Ventajas y limitaciones.
Se puede utilizar sobre ADN que se ha amplificado selectivamente por PCR, y generar un diagnóstico por ADN
rápido y seguro.
Se requiere un conocimiento preciso de la estructura del gen normal y la base molecular de la mutación.
1. Método.
Bajo condiciones apropiadas está técnica permite la identificación de diferencias entre secuencias de ADN de un
paciente con una enfermedad particular y de un control normal.
2. Aplicaciones.
Detecta tanto polimorfismos o variantes normales de ADN como las variantes en secuencia que generan
enfermedad por lo que se debe complementar con secuenciación del fragmento alterado.
3. Ventajas y limitaciones.
Las mutaciones que se pueden detectar directamente son reordenamientos grandes de genes (delecciones,
inserciones, duplicaciones) y mutaciones de punto (sustituciones de un solo nucleótido).
Sin embargo, el 50% de los casos de alfa-talasemia, distrofia muscular de Duchenne (DMD), y distrofia
muscular de Becker (DMB) son generados por delecciones de los genes alfa-globina y distrofina,
respectivamente.
E gen normal debe estar clonado y en disposición de usarlo como una sonda.
Si los reordenamientos son suficientemente grandes, y se conoce la secuencia genética que los rodea, estos
reordenamientos se pueden detectar fácilmente por Southern blot o PCR.
Características clínicas:
Bases genéticas:
Diagnóstico:
Se puede diagnosticar utilizando la tecnología de ADN bien sea detectando la alta frecuencia de delecciones en
el desorden o usando marcadores polimórficos dentro y alrededor del gen.
En este caso, el análisis de ADN por Southern blot reveló que el niño
tiene una delección grande en su gen distrofina. Su mamá tiene una
delección similar y es portadora de DMD. El análisis de ADN de la tía
del niño mostró que ella no tiene la delección en el gen DMD. Por lo
tanto, su descendencia no tiene un riesgo aumentado de tener DMD.
Distrofia muscular de Becker (DMB)
Características clínicas:
Bases genéticas:
Se ha demostrado que es alélica a DMD, también con defectos en el gen distrofina que genera una presentación
de los síntomas más leve.
Diagnóstico:
Hipercolesterolemia familiar
Características clínicas:
En personas con HF, el colesterol LDL no se elimina apropiadamente de la circulación debido a mutaciones en
el receptor LDL de tal manera que los niveles aumentados de LDL generan daño en las paredes de los vasos
sanguíneos y arterosclerosis prematura.
Ocurre en la población general en ~ 1/500 personas, pero en ciertas partes del mundo (Quebec, Canadá;
Sudáfrica) en ~ 1/100 personas.
Es importante el barrido de HF debido a que genera una alta frecuencia de ataques cardiacos prematuros y
muerte temprana.
El tratamiento se enfoca en disminuir los niveles de colesterol, para posteriormente disminuir el riesgo de eventos
arterioscleróticos.
Bases genéticas:
Mutaciones de Punto
Las mutaciones de punto representan el tipo más común de mutaciones en las enfermedades genéticas.
Algunas mutaciones de punto son de cambio de sentido (“missense”) y otras son sin sentido.
2. Estrategia de detección.
El diagnóstico directo del ADN requiere que el gen normal este clonado y disponible para usar como sonda.
El análisis Southern blot o la amplificación por PCR y digestión con la enzima apropiada puede revelar un patrón
alterado de fragmentos de restricción entre las personas normales y afectadas.
Enfermedad de Tay-Sachs
Características clínicas:
Bases genéticas:
Aun en la población Judío-Ashkenazi ocurre la heterogeneidad molecular, pero hay una mutación predominante
que altera un sitio de restricción.
Anemia falciforme
Las mutaciones de punto similares que alteran sitios de restricción pueden ayudar en el diagnóstico de la anemia
falciforme.
Las personas con anemia falciforme tienen un fragmento de ADN anormalmente largo que se detecta después
de hibridación con ADN beta-globina digerido con la enzima apropiada.
Hay mutaciones de punto que no alteran directamente sitios de restricción.
Características clínicas
Bases genéticas
Aproximadamente en el 70% de pacientes blancos con FQ se ha demostrado una delección de 3 pares de bases
(3 pb) que no altera un sitio de restricción.
El análisis por sondas ASO es una manera simple y rápida de hacer un barrido de las mutaciones más comunes
en la población general.
En algunos casos, estos desordenes se pueden diagnosticar indirectamente, usando marcadores para el gen
mutante.
Estas etiquetas (“tags”) son variaciones en el ADN que no causan la enfermedad pero que están muy cerca o
ligados al gen o mutación de interés.
A. Se necesita un gran número de familiares para determinar la forma en que el marcador segrega con el gen
mutante en la familia.
Cuando se utiliza la aproximación indirecta al diagnóstico del ADN, es importante conocer la probabilidad de
heterogeneidad genética (si hay mutaciones en diferentes loci que responden por una enfermedad particular en
diferentes familias).
El gen responsable de ERP ya se identificó. Se ha encontrado que ERP lo causan mutaciones en un gen sobre el
cromosoma 16 en la mayoría de las familias. Sin embargo, algunas personas con ERP tienen una mutación
causante sobre otro cromosoma.
Si se utiliza en todas las instancias para determinar el riesgo de alguien de tener el gen mutante un marcador
de ADN cerca del gen sobre el cromosoma 16, el resultado de la prueba de ADN probablemente será incorrecto
en las familias donde el gen causante esta sobre otro cromosoma.
El descubrimiento de la heterogeneidad genética ha hecho que el diagnóstico por ADN de ERP sea
difícil.
En cada caso, la probabilidad de que el gen mutante en ese paciente este sobre el cromosoma 16 se debe
determinar antes de que se utilice el análisis adicional de ADN para estimar el riesgo de la enfermedad.
A. Cuando el gen causante de enfermedad está identificado pero la mutación específica en una familia particular
no se conoce.
• Las variaciones en la región no codificadora dentro del gen que puede ser un STR o que alteren un sitio
de restricción pueden ayudar a marcar el gen anormal y trazar su herencia.
• La seguridad de la prueba será muy alta, debido a que la distancia entre la variación de ADN no dañina
que altera un sitio de restricción y la variación del ADN que causa la mutación probablemente es pequeña.
Ejemplos clínicos de diagnóstico de ADN indirecto.
B. Prueba
Después del consejo inicial, se colecta sangre de diversos y apropiados miembros de la familia afectados y no
afectados para análisis de ADN.
El análisis revela que el probando (III-1) heredó el marcador que estaba segregando con el gen.
C. Resultados
D. Discusión
Se pudo estimar el riesgo debido a que numerosos marcadores de ADN estaban disponibles y a que esta
enfermedad tiene un riesgo muy bajo de heterogeneidad genética.
El primo de 1er grado del probando (III-2) también solicitó una prueba predictora y se encontró dos marcadores
AA. Debido a que el marcador A no se hereda con la enfermedad, el primo del probando tiene un riesgo muy
bajo de haber heredado la enfermedad.
A. Presentación
Una pareja joven (25 años) tienen una niña de 5 años con PKU, desorden autosómico recesivo causado por un
defecto del gen de la fenilalanina hidroxilasa.
La niña afectada está bajo una dieta especial y presenta un retraso leve del desarrollo.
Recientemente la pareja se dio cuenta de que estaban esperando otro bebé, y anhelan saber si este bebé tendrá
PKU.
B. Prueba de ADN
C. Resultados
El análisis de ADN reveló que el niño afectado heredó un marcador B de la madre y un marcador B del padre
(Figura).
En ambos padres la mutación debe haber ocurrido en el gen PKU que tenía un marcador B.
A la mamá se le realizó biopsia de vellosidades coriónicas a las 10 semanas de gestación, y el análisis de ADN
reveló un patrón AB (el feto es portador de PKU, pero no estará afectado).
D. Discusión
La seguridad de esta predicción es de cerca del 100% debido a la distancia muy pequeña entre la variante de
ADN usada como etiqueta para el gen de PKU y el sitio actual de la mutación en el gen PKU.
BANCOS DE ADN
Frecuentemente, cuando se desconoce la mutación especifica responsable de una enfermedad, se requiere ADN
de los parientes afectados y no afectados para realizar un análisis de ADN y determinar cuál forma del marcador
se está heredando con el gen de la enfermedad y con el gen normal.
Las fuentes de ADN más importantes para estos análisis son las de las personas afectadas por la enfermedad y
sus padres.
Los bancos de ADN almacenan ADN de parientes cruciales en un esfuerzo por asegurar que a ningún
miembro de la familia se le niegue la prueba de ADN debido a que no hay ADN informativo.
En situaciones que se necesite gran cantidad de ADN para análisis, los linfocitos se pueden inmortalizar después
de exponerlos al virus Epstein-Barr o recientemente por métodos de amplificación completa del genoma (“Whole
Genome Amplification”).