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Laboratorio de Microbiología e Inmunología

Química y Farmacia 2019


Laboratorio N°1

“MANEJO DE MICROORGANISMOS EN EL LABORATORIO Y ESTERILIZACIÓN”

Introducción

Los microorganismos son todos los organismos unicelulares microscópicos. Dentro de


estos tenemos algunas especies de hongos, bacterias, arqueas y virus incluso algunas
microalgas. La microbiología estudia estos microorganismos, para conocer sus
características metabólicas, fisiológicas de crecimiento e interacción con el medio, además
de las necesidades nutricionales del microorganismo. Esta rama de la ciencia es el centro
en muchos aspectos importantes para la medicina humana y veterinaria, además de la
agricultura y en algunos procesos industriales. Un ejemplo de esto es que la mayoría de
las enfermedades infecciosas en animales y plantas son causadas por microorganismos.
Por otro lado, para la agricultura existen diversos microorganismos que son esenciales en
la fertilización de suelos y la producción de alimentos para animales domésticos, así como
la utilización de estos en diversas industrias.

En la naturaleza los microorganismos dada su inmensa variedad, existen como complejas


poblaciones de muchos tipos diferentes y en diversos hábitats, desde ambientes en
condiciones normales de temperatura, pH y condiciones salinas a condiciones extremas de
temperatura, pH y salinidad del medio en que se encuentran (microorganismos
extremofilos).

Los microorganismos pueden ser encontrados en todos lados, sobre diferentes tipos de
superficies, en los alimentos, en la tierra, en el aire, sobre suelo, mar y agua. Debido a
esto para la realización de cualquier análisis clínico o de laboratorio, la manipulación del
instrumental, de una muestra biológica o de material quirúrgico, e incluso en la
fabricación de fármacos, es imprescindible que se realice bajo condiciones esterilidad,
esto quiere decir bajo condiciones donde no de encuentre ningún tipo de
microorganismo para evitar una contaminación que pueda ser perjudicial para la salud.

Particularmente, en un laboratorio de microbiología, todo el material de vidrio o plástico y


medios de cultivo utilizados para la realización de experimentos de b e se r
es t er i li z ad o . Además, dentro del laboratorio es importante trabajar sobre superficies
limpias y desinfectadas, en un ambiente de aire filtrado y estéril que puede ser
proporcionado por un gabinete de flujo laminar estéril (Figura 1A) para mantener las
condiciones de asepsia y evitar la contaminación por otros microorganismos. Otra
alternativa es trabajar alreded or de un mechero Bunsen (Figura 1 B) el cual
otorga un ambiente de esterilidad a su alrededor . La llama del mechero
Bunsen alcanza temperaturas superiores a los 1.000°C, por lo que una breve
exposición es suficiente para esterilizar implementos como asas o boquillas de
entrada de frascos y tubos. La llama del mechero genera en su entorno una circulación
de aire en sentido vertical y ascendente, creando un ambiente estéril de
aproximadamente 20 cm de diámetro alrededor de este.

La esterilización de soluciones e instrumentos de trabajo es comúnmente realizada con


calor húmedo a elevadas temperaturas en cámaras presurizadas denominadas
autoclaves (Figura 1C), pero también existen otros métodos físicos de esterilización
como la radiación UV para superficies transparentes, radiación por microondas,
radiación ionizante ó radiación gamma para materiales plásticos o compuestos que no
pueden ser autoclavados, como jeringas o tubos de silicona en los hospitales. Otra forma
de esterilización es la filtración a través de membranas. Esta técnica generalmente se
utiliza para soluciones termolábiles a elevadas temperaturas que no pueden ser
autoclavadas. Por otro lado, un proceso muy utilizado en alimentos para disminuir las
poblaciones microbianas, es la pasteurización, sin embargo, este proceso no esteriliza.

Conforme aumenta la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento


de un microorganismo, se producen efectos letales en estos. La muerte de las bacterias
por el calor húmedo es consecuencia de la desnaturalización de sus proteínas, en tanto
que en una atmósfera seca produce la oxidación de los constituyentes de la célula.
Los enlaces intracelulares e intermoleculares (puentes de hidrógeno), de las proteínas de
los cuales depende su funcionalidad, son más lábiles cuando las proteínas están
hidratadas que cuando no lo están, de tal manera que el "calor húmedo" es más efectivo
en la desnaturalización de enzimas y otros componentes proteínicos importantes para la
célula que el "calor seco". Es por eso que se dice que el calor húmedo tiene mayor
"penetrabilidad" que el calor seco.

Otro aspecto a tener en consideración al momento de trabajar con microorganismos son


los medios de cultivos en los cuales se van a crecer. Un medio de cultivo, es una solución
de nutrientes esenciales para el crecimiento de los microorganismos en el laboratorio, la
cual debe contener las fuentes de carbono y nitrógeno necesarias para el crecimiento
del microorganismo que se desea cultivar. El cultivo debe ser incubado bajo las
condiciones adecuadas de temperatura, pH y presión osmótica para el microorganismo
en estudio prolifere. Estos medios de cultivos se pueden encontrar en forma líquido o
sólido agregando agar-agar al medio líquido.
Una vez esterilizado el medio de cultivo, este está listo para recibir un inoculo de
microorganismo y comenzar el proceso de crecimiento. Esta manipulación requiere de la
técnica aséptica, una serie de pasos realizados para prevenir la contaminación mientras
se manipula un cultivo o un medio estéril.
Cinta de autoclave

Placa Petri

Figura 1. A) Gabinete de seguridad con flujo laminar B) mechero Bunsen para el trabajo en
esterilidad C) Autoclave
Medio de cultivo solido
fundido

Figura 2. Preparación de Placas petri con medio de cultivo solido

Actividad 1.- Preparación de medio de cultivo líquido en tubos.

1. Se entregara un tubo con 50 ml de medio TSB (caldo triptona de soya) o LB (Luria-Bertani)


(medios complejos).

2. Reparta el medio de cultivo en 3 tubos de vidrio con tapa rosca agregando 10 ml de


medio a cada una de ellos, en condiciones de esterilidad (alrededor del halo de
esterilidad producido por el mechero).

3. Rotule cada tubo con el nombre del contenido (medio de cultivo), fecha y nombre
o iniciales de quien lo preparó.

4. Pegue un trozo pequeño de cinta de autoclave a los tubos en un lugar notorio.

5. Rotule cada tubo con: nombre del contenido, fecha y nombre o iniciales de quien lo
preparó.

6. De los tres tubos preparados, solo un tubo con medio se debe autoclavar. De los dos
restantes 1 se dejara a temperatura ambiente (25°C) y el otro se incubara a 37°C.

7. Luego de incubados deben comparar los resultados obtenidos.

Actividad 2.- Preparación de placas con medio de cultivo sólido.

1. Se entregara un frasco con 200 ml TSA (triptona de soya agar) o LB agar preparado
previamente.

2. Este debe ser introducido en el microondas p a r a d e r r e t i r e l a g a r , y


c a l e n t a d o por períodos cortos de tiempo (1 minuto) hasta que el agar esté
totalmente fundido. Alternativamente, este proceso se puede realizar en un baño
termorregulador a 90°C.
3. Una vez fundido el agar, déjelo enfriar un poco hasta que pueda manipular el frasco con
sus manos sin quemarse, pero debe estar caliente. Si se enfría demasiado, volverá a
solidificarse el medio con agar.

4. Reparta en condiciones de esterilidad (alrededor del halo de esterilidad producido por


el mechero) el agar fundido en 3 placas Petri estériles desechables (como se observa en
la Figura 2). Tape y deje enfriar hasta que se solidifique el agar para ser inoculadas
posteriormente.

Actividad 3.- Esterilización de una muestra cultivo mediante la utilización de filtros

1. Tomar las placas preparadas anteriormente y a una de ellas agregar 100 µl del cultivo de
microorganismos en el centro de la placa, para luego mediante rastrillo esparcir por toda
la placa Petri. (figura 3).

2. Para esterilizar el rastrillo previo a su utilización, sumérjalo en etanol y luego


flaméelo para que se encienda el alcohol y retírelo inmediatamente de la llama
(CUIDADO: manténgalo inclinado hacia abajo). Espere que se enfríe o apóyelo
contra el interior de la tapa de la placa Petri.

3. A continuación, mediante una jeringa de 10 ml se tomará 8 ml del cultivo para luego ser
filtrada con un filtro de 0,22 µm estéril para jeringas.

4. Depositar la solución filtrada en un tubo de 15 ml estéril.

5. Luego tome 100 µl del cultivo filtrado, deposite en el centro de la placa y siembre
mediante rastrillo por toda la placa petri al igual que la placa anterior.

6. La tercera placa con medio se dejará sin inocular y se utilizará como control del
procedimiento (manipulación técnica aséptica).

7. Ambas placas deben ser incubadas a 37°C durante 24 horas (las placas deben ser coladas
en forma invertida para evitar que la condensación de agua interfiera en el cultivo).

Rastrillo de vidrio

Figura 3. Siembra con rastrillo


El objetivo del práctico es poder verificar el efecto de la esterilización en medios de
cultivo, utensilios y materiales utilizados, además del trabajo en condiciones de esterilidad
y su importancia en el trabajo de laboratorio.

Todos los cultivos realizados deben ser revisados y fotografiados a las 24 hrs de
incubación.

Materiales

• Medio de cultivo TSB liquido (50ml por grupo)


• Medio de cultivo TSA solido (200ml por grupo)
• Cultivo de Escherichia coli (0,4 OD 600nm)
• Filtro de 0,22 µm estéril (un filtro por grupo)
• Jeringa de 10 ml (1 por grupo)
• Placas Petri (3 por grupo)
• Rastrillos (1 por grupo)
• Puntas Amarillas (una caja por grupo)
• Micro-pipetas P200 (1 por grupo)
• Cinta de autoclave
• Tubos de ensayo para cultivo con tapa (3 por grupo)