Nanopartículas de Upconversão para Imagem Biomédica

1. introdução

Recentemente, o rápido desenvolvimento das ciências da vida e da medicina estimulou a

investigação da imagem biomédica. Esta crescente área de pesquisa inclui uma
abundância de métodos de bioensaio, como a tomografia computadorizada (CT) [1-5],
tomografia por emissão de pósitrons (PET) [2, 3, 5-8], tomografia computadorizada de
emissão de fotón único (SPECT) [4, 5, 9] e ressonância magnética (MRI) [5, 8, 10-12].
Essas técnicas de imagem tomográfica desempenham um papel importante na imagem
biomédica devido à sua superioridade de profundidade de penetração ilimitada. No
entanto, eles também sofrem de desvantagens inevitáveis, tais como resolução espacial
limitada e incapacidade de visualizar dinâmicas em tempo real devido ao seu longo tempo
de aquisição [13].

Além disso, essas técnicas de imagem tomográfica sempre requerem fontes radioativas e
agentes de contraste radioativos que podem ser prejudiciais para pacientes e pessoal
médico. Comparado com as técnicas de imagem tomográfica, a imagem biomédica óptica
tem a vantagem de feedback rápido, alta sensibilidade e alta resolução. Os avanços
recentes neste campo basearam-se no desenvolvimento e uso de sondas baseadas em
fluorescentes, como corantes orgânicos e pontos quânticos (QDs). No entanto, as sondas
fluorescentes atuais têm desvantagens que limitam seu uso para imagens in vivo de alto
contraste. Por exemplo, os corantes orgânicos sintéticos são rapidamente fotovelados,
tornando-os inadequados para experiências de rastreamento longitudinal. Os QDs
binários comuns (por exemplo, CdTe, PbS) contêm elementos altamente tóxicos, o que
dificulta significativamente a sua aplicação clínica. Para resolver este problema, Cd-free
QDs (por exemplo, CuInS) foram desenvolvidos recentemente. No entanto, a eficácia das
emissões destes QDs diminui consideravelmente quando são excitados em comprimentos
de onda mais longos (> 700 nm). Para entender a dependência do comprimento de onda
do desempenho da imagem óptica, devemos considerar as propriedades ópticas do tecido
biológico [14].

Quando o tecido biológico é irradiado com um feixe de luz, os principais fatores que
levam à atenuação do sinal proporcional à profundidade da característica de interesse são
a absorção e dispersão dos fótons induzidos pelo tecido biológico e pela água. Esse tipo
de atenuação é especialmente grave na região de imagem visível tradicional (400-750
nm) [15]. Como resultado, a profundidade de penetração na região de imagem visível é
limitada a 1-3 mm. Para superar este problema, foi feito muito esforço para desenvolver
e implementar agentes de imagem fora da região de imagem visível e dentro da "janela
de transparência biológica" ou a janela NIR (750-900 nm) (Fig. 6.1a) [16-19].

A profundidade de penetração óptica do tecido é geralmente determinada pela absorção

e dispersão da excitação e emissão de luz, Bashkatov etc. propuseram uma fórmula para
calcular: d ¼ ð3la ðla þ ls 0ÞÞ? 1 = 2, onde μa é a extinção óptica de extinção Coeficiente
que depende do comprimento de onda (Fig. 6.1b), ls 0 (* λ-w) é o coeficiente de dispersão
reduzido, e δ é a profundidade de penetração resultante. O expoente (w) depende do
tamanho e da concentração de dispersores no tecido e varia de 0,22 a 1,68 para diferentes
tecidos (Fig. 6.1c) [20, 21].

A partir da fórmula e das figuras acima mencionadas, podemos saber que a absorção de
água e a dispersão de tecido são muito mais fortes na região visível do que na região NIR,
demonstrando a superioridade da luz NIR na análise teórica. Desde a década de 1990, a
imagem biométrica NIR obteve grande atenção devido à sua penetração mais profunda
no tecido biológico do que a luz visível [22-26]. Até à data, vários materiais
luminescentes, incluindo corantes orgânicos NIR [27], complexos metálicos NIR [28,
29], NIR QDs [30] e nanotubos de carbono de parede única (SWNTs) [21, 31], foram
desenvolvidos como NIR Sondas fluorescentes para imagens biomédicas de
fluorescência. No entanto, os QDs do NIR sempre contêm elementos tóxicos como
mercúrio, chumbo e arsênico, que são indesejáveis em aplicações biomédicas [32, 33].
NIR Ag2S QDs, apesar da baixa toxicidade, sofrem de branqueamento tanto do ar quanto
da luz de irradiação. Embora os SWNTs tenham revelado um bom desempenho em
imagens biomédicas de infravermelho de curto alcance (SWIR) [21], existem várias
desvantagens que não podem ser ignoradas antes de serem amplamente aplicadas como
um agente de imagem SWIR, como ampla largura total a meio máximo (FWHM ) E alta
energia de excitação. Normalmente, os picos de emissão do SWNTs são de * 400 nm,
dificultando a sua capacidade no comprimento de onda espectral, o que os coloca em
desvantagem na imagem de várias etiquetas por causa dos sinais sobrepostos. Os SWNTs
também requerem fontes de excitação pulsadas de alta potência (> 2 W) para obter
proporções de sinal / fundo suficientes (SBRs). Além disso, estudos de nanotoxicologia
adicionais ainda são necessários para provar sua biocompatibilidade [34]. Assim, o
desenvolvimento de sondas NIR eficientes e biocompatibles com excitação ou emissão
dentro desta janela NIR é de grande interesse para a imagem óptica de alto contraste de
tecidos profundos, levando em consideração cuidadosamente os seguintes parâmetros:
eficiência óptica, capacidade tunelétrica, fotoestabilidade e biocompatibilidade. .

Em comparação com as sondas NIR acima mencionadas, as UCNP DADAD de

lantanídeos (Ln) têm a capacidade de absorver e converter luz NIR em luz visível / UV /
NIR de forma eficiente através de um processo de conversão ascendente, o que leva a
muitas vantagens únicas para a imagem ótica e bioensaio, Como baixa fluorescência de
fundo, profundidade de penetração de luz profunda e fotodinâmica mínima para
organismos vivos. Assim, espera-se que a imagiologia da luminosidade de conversão
(UCL) em vivo seja a técnica de imagem de fotoluminescência (PL) de próxima geração,
uma vez que proporciona alta sensibilidade e resolução espacial [35-40]. Em segundo
lugar, as propriedades ópticas acima mencionadas do tecido biológico demonstram que o
obstáculo mais importante para a imagem óptica é a profundidade de penetração limitada
que não é um problema na imagem tomográfica [29]. Portanto, a combinação de imagens
ópticas e imagens tomográficas seria uma boa abordagem para cancelar seus problemas
e combinar seus méritos, alcançando desempenho de imagem de alto contraste. Os
UCNPs se deslocaram no centro das atenções como uma plataforma eficiente para a
construção de nanoprobes multifuncionais. Devido aos radios iônicos e propriedades
químicas similares dos íons Ln, o doping é um método muito comum para incorporar os
diferentes íons Ln funcionais nas UCNPs para propriedades multifuncionais desejadas.
Por exemplo, as UCNP doadas com Gd / Gd foram usadas como agentes de contraste de
modalidade dual para ressonância magnética e imagens ópticas. As UCNP doces, Gd-,
Yb e Lu, com número atômico mais elevado e atenuação de raios X mais forte, serviram
de excelente contraste de TC / MRI / contraste óptico. Além disso, os radionuclídeos,
como o 18F e o 153Sm, com capacidade de imagem de PET ou SPECT também podem
ser facilmente introduzidos na rede de UCNPs [36, 38, 40]. Como resultado, as técnicas
de imagem multimodal que integram a imagem UCL com diferentes modalidades de
imagem foram desenvolvidas rapidamente, o que pode permitir que a imagem médica
seja mais sensível e precisa [38].

1. Avaliação de Toxicidade In Vitro e In Vivo

A toxicidade potencial e a biocompatibilidade das UCNPs são de grande importância para

suas aplicações biomédicas. Semelhante a muitos outros nanocristais inorgânicos, as
UCNPs não podem ser facilmente degradadas em ambiente biológico. Assim, a
compreensão dos comportamentos das UCNPs em sistemas biológicos, bem como seus
perfis de toxicologia, é uma questão crítica fundamental a ser abordada para usar essa
classe de nanomateriais em aplicações médicas no futuro. As considerações de toxicidade
devem ser integradas na seleção de materiais, pois os elementos com perfis de não
toxicidade são provavelmente aceitos para aplicações biomédicas. Portanto, as UCNP
baseadas em NaYF4 são mais investigadas, uma vez que o ítrio possui uma propriedade
de toxicidade inócua. O manganês é um tipo de elemento traço essencial nos corpos
humanos, mas o limite tolerável do manganês é menor que o do itrio. Outros elementos,
como os íons Gd3 +, são tóxicos, que precisam de mais investigação quando são
utilizados in vivo [38].

1.1.Progressos recentes na avaliação da toxicidade de UCNPs

Até à data, várias linhas celulares foram usadas para avaliar a citotoxicidade de diferentes
UCNPs através dos ensaios CCK-8, MTT e MTS [41-55]. A maioria dos resultados
sugeriu que as UCNPs não eram citotóxicas para uma ampla gama de linhas celulares
testadas dentro de um certo intervalo de concentrações e um período de incubação
limitado. A distribuição de UCNPs em células HeLa vivas também foi investigada pela
técnica de imagem de luminescência [56]. As partículas foram internalizadas através da
endocitose, transportadas por proteínas motoras dependentes de microtúbulos (dineínas),
acumuladas na região perinuclear, transportadas por outro tipo de proteínas motoras
(cinesinas) e, finalmente, liberadas para fora das células. Como um dos organismos
eucarióticos multi-celulares mais simples com um sistema nervoso, Caenorhabditis
elegans (C. elegans) também foi usado como animal modelo para avaliar a toxicidade das
UCNPs. O grupo de Lim [57], o grupo de Yan [58] e o grupo de Xu [59] relataram estudos
de toxicidade in vivo com a alimentação de UCNPs no C. elegans através da ingestão e
excreção de UCNPs, observando a vida útil, a viabilidade do ovo, a taxa de crescimento
De worms tratados com UCNPs, e assim por diante. Os resultados indicaram que as
UCNPs não eram significativamente tóxicas, exceto em altas concentrações de 10 mg /
mL ou mais [38].

A toxicidade in vivo de UCNP também foi avaliada através de estudos em animais. Para
novas aplicações de UCNPs em biociências e medicamentos, a questão mais importante
ainda é a potencial toxicidade a longo prazo das UCNPs e seus nanocompositos. Sabe-se
que a toxicidade a longo prazo das UCNP em animais pequenos pode ser avaliada por
medição do peso corporal, análise histológica, ensaios de bioquímica sérica, etc. Muitos
grupos relataram que os ratos tratados com UCNP poderiam sobreviver por mais de 1
mês sem Quaisquer efeitos adversos aparentes para a saúde [45, 60-62]. Por exemplo, Li
et al. [60] examinaram a biocompatibilidade das UCNP revestidas com uma camada de
sílica ou uma camada de moléculas de ácido azelaico. Eles descobriram que essas UCNPs
não tinham essencialmente nenhum efeito sobre a viabilidade celular das células KB de
carcinoma epidérmico nasofaríngeo humano após incubação durante 20 h a uma
concentração de 800 mg / mL. Shan et al. [63] também relataram que há pouca ou
nenhuma toxicidade de UCNP funcionalizadas com carboxilo e amino após incubação
por 9 dias com células de osteossarcoma humano. Zhang et al. [64] relataram a bio-
distribuição ex vivo de UCNPs modificadas com PEI e NaOF4: Yb, Er / Tm revestidas
com SiO, medindo a concentração de Y3 + usando espectroscopia de emissão atômica de
plasma acoplado. Eles observaram que as UCNP revestidas com SiO2 primeiro
acumulado no pulmão e coração, foram gradualmente excretadas pela urina ou fezes e,
finalmente, foram removidas do corpo normal de um rato Wistar em 7 dias. Para
investigar sua biocompatibilidade e distribuição de tecidos por períodos mais longos,
ratos saudáveis foram injetados por via intravenosa com PAA-UCNPs. Os resultados da
biodisponibilidade mostraram que a absorção e retenção de PAA-UCNPs ocorreu
principalmente no fígado e no baço. A maioria dos PAA-UCNPs foram excretados do
corpo de camundongos de maneira muito lenta. Além disso, os resultados da análise
histológica, hematológica e bioquímica indicaram que não havia toxicidade aparente de
PAA-UCNPs em camundongos em tempos de exposição longos (até 115 dias) [60]. O
grupo de Zhao [65, 66] avaliou os efeitos tóxicos in vivo de UCNPs contendo Gd / Mn
usando camundongos machos e fêmeas. Trinta dias após a injeção, a taxa de
sobrevivência dos ratos foi de 100%. E os pesos dos ratos não diminuíram sensivelmente.
Estes resultados indicaram que as UCNP contidas em Gd / Mn apresentaram baixa
toxicidade, embora Gd e Mn sejam geralmente considerados como elementos tóxicos. O
motivo da sua baixa toxicidade pode ser que os íons Gd3 + / Mn2 + foram confinados em
uma matriz rígida de NCs de hospedeiro e não são facilmente liberados para o meio
ambiente. Isto foi confirmado por análise por espectrometria de massa por plasma
indutivamente acoplado (ICP-MS). No entanto, para garantir a adequação das UCNPs
para aplicações biológicas in vivo, são necessários estudos de toxicidade a longo prazo
(até vários meses) sobre tamanho de partícula, forma e química de superfície [38].

1.2. Métodos de Avaliação para a Toxicidade de Longo Prazo de UCNPs em

Animais Pequenos
1.2.1. Observação de comportamento

A observação comportamental é um método direto para avaliar a toxicidade de UCNPs

em animais pequenos. Muitos grupos de pesquisa descreveram os comportamentos de
pequenos animais após a injeção com várias UCNPs. Por exemplo, Li et al. [60] relataram
que não foram observadas alterações na alimentação, bebida, cor da pele, comportamento
exploratório, atividade e estado neurológico para os ratos injetados com PAA-UCNPs e
para os grupos controle. Eles [62] também relataram que NaGdF4: Yb / Er / Tm ratos
nanocristalados podem sobreviver por mais de 1 mês sem mostrar comportamento
anormal [54].

1.2.2. Medição do peso corporal

A flutuação no peso corporal é um indicador útil para estudar os efeitos de toxicidade das
UCNPs. O peso corporal de dois grupos de ratos com e sem injeção da veia da cauda de
15 mg / kg de PAA-UCNP foi registrado [60]. Apenas observaram pequenas diferenças
de peso entre os ratos dos dois grupos, indicando a baixa toxicidade de PAA-UCNP em
camundongos. Além disso, os ratos injetados com PAA-UCNPs foram submetidos a
avaliações observacionais por 115 dias. Além disso, Zhang et al. [44] relataram que os
nanocristais NaYF4: Yb / Er revestidos com sílica não apresentaram efeito tóxico no peso
corporal de ratos a uma dose de 10 mg / kg [54].

1.2.3. Análise histológica

Geralmente, a avaliação histológica dos tecidos foi realizada para determinar se os

nanocristais causam ou não danos causados por tecidos, inflamações ou lesões causadas
por exposição tóxica. Em uma dose de 15 mg / kg PAA-UCNPs [60], as estruturas dos
órgãos (coração, pulmão, fígado, baço e rim) dos ratos expostos eram normais e
dificilmente diferentes das do grupo controle. O tecido muscular cardíaco nas amostras
do coração não apresentou degeneração hidropica. Os hepatócitos nas amostras de fígado
pareciam normais e não havia infiltrados inflamatórios. Não foi observada fibrose
pulmonar nas amostras de pulmão. A estrutura do glomérulo pode ser distinguida
facilmente nas amostras de rim. Nenhuma necrose foi encontrada em nenhum dos grupos.
No entanto, o baço foi ligeiramente afetado pela injeção de PAA-UCNPs, uma vez que
houve uma pequena hiperplasia na bainha linfóide periarteriolar (PALS) de polpa branca.
Isso pode ser causado pela nanotoxicidade de PAA-UCNPs [54].

1.2.4. Análise Hematológica

Os nanocristalinos são materiais particulados especiais dentro do regime de tamanho de

vírus e proteínas grandes e, conseqüentemente, podem induzir uma resposta inflamatória,
aumentar ou diminuir a atividade do sistema imunológico e alterar fatores hematológicos
relacionados, como a contagem de glóbulos brancos. Portanto, uma avaliação dos
marcadores hematológicos e bioquímicos padrão foi utilizada para quantificar ainda mais
a toxicidade potencial das UCNPs [60].

Para ratinhos injetados com 15 mg / kg de PAA-UCNP, esfregaços de sangue indicaram

que o número e a forma dos glóbulos vermelhos, plaquetas e glóbulos brancos eram
normais, sugerindo que não havia toxicidade significativa nos ratos testados em
comparação com os ratos de controle . Além disso, os ensaios de bioquímica de soro
estabelecidos indicaram que os três importantes indicadores hepáticos (alanina
aminotransferase, aspartato aminotransferase e bilirrubina total) e dois indicadores para
funções renais (creatinina e ureia) estavam em níveis semelhantes para os camundongos
expostos a PAA-UCNPs e para a Controlar os ratos. Estes resultados sugeriram que
nenhuma toxicidade de PAA-UCNPs em camundongos em tempos de exposição
prolongados (até 115 dias) [54].

2. Imagem biomédica usando UCNPs sob excitação de 980 nm

Os materiais de UC foram utilizados pela primeira vez em imagens de tecido em 1999,

onde Zijlmans et al. [67] relataram a primeira bio-imagem de UC baseada em partículas
sub-micrométricas Y2O2S: Yb / Tm (0.2-0.4 μm). Após a excitação a 980 nm, eles
observaram um baixo sinal de auto-fluorescência e nenhum branqueamento mesmo após
exposição contínua a altos níveis de energia de excitação. Depois disso, a idéia da bio-
imagem de UC foi realizada empregando alguns outros nanomateriais de oxissulfetos ou
óxidos [66, 68]. Em 2009, Hilderbrand et al. [68] relataram a síntese e modificação de
superfície de Y2O3: Yb / Er UCNPs. Esses UCNPs poderiam estar entusiasmados com
doses não-prejudiciais de luz e tiveram emissão de luminescência centrada a 660 nm. Em
seguida, a utilidade destas partículas para imagens de pool de sangue in vivo foi
demonstrada pela visualização da vasculatura em um modelo de mouse após a injeção
intravenosa dessas nanopartículas. No final de 2012, Zhao et al. [66] demonstraram a
formação bem sucedida de nanopartículas Gd2O3 dopadas com íons sintonizáveis por
tamanho com novas UCL multicoloridas. Quando as nanopartículas Gd2O3: Yb / Er (50
nm de tamanho) foram injetadas na sola superficial da pele do pé, o músculo mais espesso
da coxa interna (cerca de 5 mm de profundidade) e as costas, a luminescência da área
injetada pode ser observada em uma sala escura Excitando com um laser de 980 nm e
gravado usando câmera digital baseada em CCD. No entanto, o tamanho submicrónico
das partículas de oxissulfetos ou óxidos aplicados limitou as aplicações. Os requisitos
necessários para a seleção de materiais em bio-imagiologia prática são de tamanho
pequeno, luminiscência brilhante e segurança biológica.

Recentemente, com o rápido desenvolvimento das técnicas de síntese, as UCNP com base
em flúor com menor tamanho, mas a luminescência de alta qualidade, foram exploradas
amplamente e amplamente utilizadas em imagens de células, tecidos e animais. Em
contraste com os materiais hospedeiros de oxissulfureto ou óxido, os fluoretos são
considerados como um melhor tipo de material hospedeiro para o doping de íons Ln para
atingir emissões intensas de UC, possuindo suas energias de fono baixas e a minimização
resultante da extinção do estado excitado de Os íons Ln. Um dos primeiros relatos de
imagem in vivo de UCNPs em animais pequenos relatou medições pontuais de UCNPs
subcutaneamente injetadas em ratos por Zhang et al. [64], que mostrou profundidade de
penetração muito mais profunda sob excitação de 980 nm em comparação com QD
emissores verdes comerciais excitados por UV. Em um trabalho posterior, Liu et al. [42]
compararam lado a lado a sensibilidade in vivo das UCNPs e QDs (QD545 e QD625) e
demonstraram que o limite de detecção in vivo de UCNPs era pelo menos uma ordem de
magnitude inferior à das QDs. Embora a luz de excitação de NIR para materiais de UC
tenha uma forte capacidade de penetração, as emissões UV / VIS UC ainda são facilmente
absorvidas por amostras biológicas, que definitivamente limitam suas aplicações
adicionais na observação de tecidos biológicos profundos. Para aumentar ainda mais a
profundidade de penetração da imagem UCL, a afinação da emissão de conversão
ascendente na faixa espectral NIR (750-900 nm) e a região de luz vermelha (600-750 nm)
é essencial para a imagem de tecido profundo desde a aparência da luz, absorvência, E a
autofluorescência do tecido nessa faixa é mínima.

Para imagens in vivo de animais pequenos, os sistemas NIR-NIR altamente sensíveis

atraíram uma atenção crescente, porque tanto as luzes de excitação quanto as de emissão
estão localizadas na "janela de transmissão ótica" dos tecidos (750-900 nm) (Fig. 6.1a).
Para este efeito, os íons Tm3 + são freqüentemente escolhidos como dopantes, uma vez
que podem exibir uma emissão NIR forte entre 750 e 850 nm devido à transição de 3H4
para 3H6 sob excitação laser CW a 980 nm. A característica do NIR-NIR UCNPs permite
a bi-imagem óptica de alto contraste in vivo, uma vez que tanto a atenuação da luz como
a dispersão são significativamente reduzidas na faixa espectral NIR e a auto-fluorescência
dos tecidos está ausente nas condições de excitação e emissão de UC. Prasad et al. [46]
primeiro relatou bio-imagem in vivo de alto contraste usando NIR-NIR UC PL NaYF4:
Yb3 + / Tm3 + UCNPs (Fig. 6.2a, b). No entanto, o PL fraco que só pode ser detectado
por dispositivos de acoplamento de carga multiplicados por elétrons altamente sensíveis
(EMCCD) ainda é uma limitação substancial para melhorar o SBR e a profundidade de
imagem. Li et al. [69] relataram em UCNP hexagonal sub-10-nm cítrico-cíclico-tampado:
Gd3 + / Yb3 + / Tm3 + para a imagem PL de corpo inteiro de um mouse. O rendimento
quântico da UC (800 nm) para estas nanopartículas foi medido em cerca de 0,47% sob a
densidade de excitação de 17,5 W / cm2 a 980 nm. Foi conseguida uma imagem de UC
PL de alto contraste de todo o corpo de um rato com uma profundidade de penetração de
cerca de 2 cm e um excelente limite de detecção de 50 células. Mais recentemente, Prasad
et al. [70] relataram o desenvolvimento de novas UCNP NIR-NIR NaYbF4: NM-NIR-
NIR NCC-NQL novas: Tm3 + / CaF2, que foram injetadas por via intravenosa em
camundongos BALB / c para realizar imagens de todo o corpo; Um SBR elevado de 310
foi alcançado (Fig. 6.2c). O rendimento quântico atingiu 0,6% em condições de excitação
de imagem de 0,3 W / cm2 a 980 nm. Foi mostrado que o sinal UC PL poderia ser
prontamente detectado e fotografado, com um baixo fundo, através de um tecido de porco
de 3,2 cm de espessura (Fig. 6.2d, e). Este estudo fornece uma base para o
desenvolvimento de sistemas de imagem 3D para imagens ópticas de corpo inteiro
avançadas. Até agora, a imagem in vivo do corpo inteiro de pequenos animais foi
realizada com sucesso com base em Tm3 + -Doped NaYF4 [71], NaGdF4 [62], NaLuF4
[72] e NaYbF4 [73] nanocristais [35].
Fig. Imagens de corpo inteiro do mouse injetadas com NaYF4: Yb3 + / Tm3 + UCNPs;
Rato intacto (a), mesmo mouse após a dissecção (b). A cor vermelha indica a emissão de
UCNPs; Verde e preto mostra o fundo como indicado pelas setas. A inserção apresenta
os espectros PL correspondentes aos componentes aparentemente não misturados da
imagem multiespectral obtidos com o sistema Maestro. C Imagens de corpo inteiro de um
mouse BALB / c injetado via veia da cauda com a α- (NaYbF4: Tm3 +) / CaF2 revestida
com ácido hialurônico. D Imagem de campo brilhante do tecido de porco (vista lateral),
exibindo a profundidade de imagem; E imagem UC PL da cuvete contendo α- (NaYbF4:
Tm3 +) / CaF2 coberto com um tecido de porco. As inserções em c e e mostram os
espectros do NIR UC PL e o plano de fundo retirado da área circundada. F-h Imagem de
corpo inteiro in vivo de um mouse nua injetado NaYbF4: Yb3 + / Tm3 +: f imagem de
campo brilhante, g imagem pseudo-colorida obtida a partir da imagem verdadeira (a
imagem inserida em preto / branco) e h imagem superposta Imagem de campo brilhante
e imagem pseudo-colorida) com os espectros não misturados da imagem in vivo (o gráfico
de inserção) do sinal e do fundo da UC como indicado pelas setas

A pesquisa sobre imagens biomédicas usando UCNP emissor de vermelho está

aumentando recentemente. Em 2011, Liu et al. [47] relataram um método sintético à base
de óleo para a preparação de nanocristais KMnF3 com Ln dopants incorporados de forma
homogênea na rede hospedeira. Como resultado da transferência eficiente de energia
entre o íon dopante e o íon Mn2 + do hospedeiro, as emissões de UC de banda única
notavelmente puras foram geradas na região vermelha, mostrando sua promessa na
imagem biomédica de penetração profunda. Em 2012, Zhao et al. [65] relataram o NaYF4
de Nabic-dopado com Mn-dopado de uma banda e as UCNP para imagens in vivo e
ampliou a profundidade de imagem para 15 mm. A UCL vermelha dominante torna as
bio-sondas atraentes para bio-imagiologia in vitro e in vivo. Além disso, os resultados da
imagem celular in vitro, dos espectros de UCL localizados e da bioimagem in vivo
revelam que essas UCNPs podem ter aplicações em bio-imagiologia óptica com muitos

3. Criação de imagens biomédicas usando UCNPs Excited at Different

Wavelength

Tradicionalmente, as UCNPs altamente eficientes requerem um laser NIR a um

comprimento de onda de cerca de 980 nm como fonte de excitação, uma vez que o
conversor Yb3 + possui uma seção transversal de absorção elevada na sua banda de
absorção. No entanto, a luz de 980 nm sofre de forte absorção por água e espécimes
biológicos (Fig. 6.1a). Assim, a excitação de 980 nm é pouco atraente devido a problemas
como a profundidade de penetração limitada e os danos nos tecidos devido ao
superaquecimento da amostra. Portanto, o ajuste da banda de excitação das UCNPs em
uma faixa apreciável também é uma questão importante para melhorar o desempenho das
UCNPs. Zou et al. [74] relatou o conceito de UCNPs onde um tinto NIR orgânico é usado
como uma antena para colher os fotões NIR com uma banda larga (740-850 nm) para as
nanopartículas β-NaYF4: Yb / Er em que ocorre a conversão ascendente. A conversão
global por nanopartículas sensibilizadas com corantes é dramaticamente melhorada (por
um fator de * 3.300) como resultado do aumento da absortividade e ampliação geral do
espectro de absorção do conversor ascendente. O grupo Prasad [75] também relatou o UC
PL intenso em nanocristais coloidais LiYF4: Er3 + sob excitação com comprimento de
onda de telecomunicações a 1.490 nm. As intensidades das bandas de UC PL de dois e
três fótons anti-Stokes são superiores ou comparáveis à da emissão de Stokes sob
excitação com baixa densidade de potência na faixa de 5-120 W / cm2. O QY da UC PL
foi medido para ser tão alto quanto * 1,2 ± 0,1%, que é quase quatro vezes maior do que
a maior eficiência de UC PL (0,3 ± 0,1%) relatada até à data para nanocristais dopados
com Ln em 100 nm- NaYF4 hexagonal de tamanho: Yb3 + / Er3 + usando excitação a
980 nm. Todas as obras acima mencionadas são muito importantes para a investigação de
uma nova fonte de excitação para UCNPs tradicionais. Mas eles também sofrem de seus
próprios problemas: os corantes orgânicos são instáveis e a eficiência da antena é muito
sensível à capacidade de carga dos corantes orgânicos, mesmo uma pequena adição de
corantes resultará em tremores extremamente graves. Enquanto isso, como fonte de
excitação, a luz de 1.490 nm sofre de grave absorção de água e esse tipo de conversão é
restrita aos parâmetros de cristal da matriz do host, impedindo a sua aplicação em bio-
imaging.

Para evitar as desvantagens que são trazidas pela fonte de excitação, como geração de
calor, absorção de água e danos nos tecidos, é necessária uma maior otimização na fonte
de excitação para a bio-imagem baseada em UCNPs. Zhan et al. [76] demonstraram uma
abordagem de excitação promissora para melhor NIR-NIR UC PL para imagens in vitro
ou in vivo empregando um laser de 915 nm com baixo custo. Este novo método de
excitação a laser proporciona um aquecimento drasticamente menor do espécime
biológico e maior profundidade de imagem nos animais ou nos tecidos devido à baixa
absorção de água (Fig. 6.2f-h). No entanto, ainda está longe das aplicações com
flexibilidade devido ao sacrifício da eficiência UC. Recentemente, os pesquisadores
voltaram a atenção para UCNP de excitação de 800 nm com base na grande seção
transversal de absorção de Nd3 + a 800 nm (cerca de uma ordem de magnitude maior que
Yb3 + a 980 nm). Han et al. [77] descobriram que, quando Nd3 +, Yb3 + e Er3 + / Tm3
+ foram codoped em NaYF4, os sinais de UC poderiam ser distinguidos a olho nu por
excitação de 800 nm. Nesta novela UCNPs, Nd3 + serve como um sensibilizador de
fótons de 800 nm e Yb3 + como um ião de ponte, com um caminho de transferência de
energia de Nd3 + → Yb3 + → Er3 + / Tm3 +. No entanto, o limite de dopagem do Nd3
+ foi de apenas 1% devido à extinção da concentração. Novas estruturas precisam ser
projetadas para aumentar o limite de concentração Nd3 +. Em 2013, Liu et al. [78]
relataram um novo tipo de UCNPs núcleo / shell. Através de doping espacialmente
limitado de Nd3 + que pode ser efetivamente excitado a 795 nm, ele afirmou que a camada
de camada de NaYF4: Nd3 + ativa pode efetivamente prevenir a extinção superficial da
emissão de Yb3 + e simultaneamente promover a transferência de energia de excitação
para íons Yb3 +, o que melhora significativamente a eficiência da UC . Além disso, 800
nm gera menos calor que a luz de 980 nm, confirmada por experiência de irradiação
celular. Quase ao mesmo tempo, Yan e seu colega de trabalho [79] relataram uma
estrutura de núcleo / concha semelhante com a idéia de design semelhante de dopagem
Nd3 + no shell para garantir a transferência de energia do ativador Nd3 + → Yb3 + →.
A imagem in vivo de um rato nua subcutaneamente injetado com UCNPs demonstrou que
números de fótons comparáveis podem ser medidos quando irradiados com laser de 980
nm e laser de 808 nm, respectivamente. Além do processo de UC, os autores também
exploraram a downconversion (DC) PL de nanocristais Lndoped. A imagem in vitro de
NIR de um rato nua injetado com "UCNPs" mostrou SNR elevado sob excitação laser de
808 nm. Mais tarde em 2013, Li et al. [80] desenhou e sintetizou uma nova estrutura:
NaGdF4: Nd / NaYF4 / NaGdF4: Nd / Yb / Er / NaYF4C / S1 / S2 / S3 NCs, cada uma
das partes assume uma função respectiva e trabalha em conjunto para alcançar UC de
modo duplo E DC luminescência sobre a excitação de 800 nm de efeito de baixo efeito
de calor. Nd3 +, Yb3 +, Er3 + tri-dopado NaGdF4: a camada Nd / Yb / Er UC [NIR (800
nm) - visível (540 nm)] com uma propriedade excitável constitucional eficiente 800 nm
foi obtida para bio-imagiologia in vitro com Baixos efeitos de auto-fluorescência e
fotodamagem. Além disso, a ninestrutura projetada também foi realizada com
luminescência de DC padrão de NIR (800 nm) a NIR (860-895 nm) de Nd3 +. Com o
efeito de baixo efeito de calor, a alta profundidade de penetração da excitação e a alta
eficiência da luminescência DC, a imagem CC de alto contraste in vivo de um mouse nu
de corpo inteiro foi alcançada. Estes resultados acima indicam que as UCNPs que podem
ser excitadas sob nanocristais de 800 nm têm um futuro brilhante no desenvolvimento de
imagens biomédicas.

4. UCNPs ultra pequenas para imagens biomédicas

Os nanomateriais fotoluminescentes com grandes áreas de superfície, propriedades
ópticas ajustáveis e saída de sinal forte podem potencialmente servir como uma nova
geração de sondas de imagem biomédica. Esses nanomateriais geralmente se acumulam
passivamente em locais de doenças tais como tumores em concentrações muito maiores
e por tempos mais longos do que pequenas moléculas de fármacos através do efeito bem
conhecido de permeabilidade e retenção (EPR) [81, 82], tornando os nanomateriais ainda
mais promissores ao abordar muitos Desafios que as pequenas moléculas de drogas
encontram no diagnóstico e na terapia precoces de câncer. Por exemplo, as nanopartículas
Y2O3: Yb3 + / Er3 + revestidas com polímero de PEG foram utilizadas para a formação
de imagens vasculares in vivo de camundongos nus. O revestimento de polímero
minimiza a ligação de tecido não específica e prolonga as meias vidas de circulação das
partículas no sangue [83].

Esta força única de nanomateriais no alvo de tumores é fundamentalmente devido à

capacidade dos nanomateriais para escapar da filtração renal e ser retida no plasma
sanguíneo por períodos mais longos que as moléculas pequenas. No entanto, ao contrário
das pequenas, raras, cirúrgicas, clinicamente utilizadas sondas moleculares, tais como
nanopartículas de metal nobre ultra-sônico, pontos quânticos e corantes orgânicos, as
UCNP baseadas em Ln geralmente se acumulam severamente nos órgãos do sistema
reticuloendotelial (FER, baço, etc.) [84] , Resultando em baixa especificidade de
segmentação (definida como a quantidade de sonda no tumor versus a do fígado) e
potencial toxicidade a longo prazo, dificultando seu uso clínico. Para minimizar a
acumulação não específica em órgãos de RES e toxicidade potencial de UCNPs, vários
tipos diferentes de UCNPs com Ln com esclerose renal foram recentemente
desenvolvidos como discutimos no cap. 3. Neste capítulo, nos concentramos
principalmente na imagem in vitro e in vivo usando estas UCNPs ultra-som [85, 86].

Em 2011, Li et al. [69] relataram a síntese de material nanocristalino β-NaLuF4 derivado

de D-10 nm com UCL brilhante por decomposição térmica na presença de oleilamina.
Esses nanocristais de sub-10-nm β-NaLuF4: Gd, Yb, Tm exibem uma emissão brilhante
de UCL com um rendimento quântico de 0,47 ± 0,06%, indicando que NaLuF4 hexagonal
sub-10-nm: Gd3 + / Yb3 + / Tm3 + (7,8 nm) é Um nanomaterial excelente para imagens
biomédicas baseadas em UC. Após a síntese, os nanocristéis hidrofóbicos NaLuF4: Gd3
+ / Yb3 + / Tm3 + e NaYF4: Yb3 + / Tm3 + foram convertidos em hidrófilos substituindo
a oleilamina superficial com ácido cítrico. Os nanocristais hidrofílicos obtidos foram
indicados como cit-Lu6-Tm e cit-Y1-Tm, respectivamente.

Para confirmar ainda mais a profundidade de penetração de cit-Lu6-Tm para imagiologia

UC in vivo, um mouse preto foi selecionado como um animal modelo. Tanto quanto
sabemos, um mouse preto nunca foi usado para investigar a profundidade de penetração
de materiais fluorescentes convencionais devido à forte absorção de excitação e emissão.
O SNR de um mouse preto injetado subcutaneamente com cit-Lu6-Tm foi 12 vezes maior
do que aquele com cit-Y1-Tm. O sinal UC de cit-Lu6-Tm também pode ser detectado
mesmo do lado de trás, sugerindo que a imagem UC de alto contraste de um mouse preto
de corpo inteiro com uma profundidade de penetração de * 2 cm foi alcançada. Isso
mostrou que o NaLuF4 ultra-sônico: Gd3 + / Yb3 + / Tm3 + possui grande capacidade
de penetração. Li et al. Também investigou os limites de detecção de células que foram
rotuladas por NaLuF4 ultra-sônico: Gd3 + / Yb3 + / Tm3 +. Por injecção subcutânea de
células KB marcadas com cit-Lu6-Tm num rato nu, mediu-se o limiar de detecção de
células marcadas com cit-Lu6-Tm. Eles descobriram que o sinal de UC pode ser detectado
com SNR> 3 para um rato nu injetado subcutaneamente com 50 células KB marcadas
com cit-Lu6-Tm (incubação com cit-Lu6-Tm de 200 μg / mL em solução salina
tamponada com fosfato pH 7 por 2 H a 37 ° C) sob excitação de 980 nm a 120 mW / cm2,
indicando que o limite de detecção de células marcadas com UCNP injetadas
subcutaneamente é <50.

Até agora, poucos trabalhos envolvendo imagens de UC com esclerose renal foram
relatados, embora vários grupos tenham investigado a síntese e a otimização de
luminescência de UCNP ultra-sônicos. A imagem biomédica usando UCNPs ultra-
sônicos é limitada à imagem in situ (imagem subcutânea ou imagem de nódulos linfáticos
Sentinel), em vez de imagem direcionada. Assim, embora a síntese de UCNP ultra-sônica
tenha feito um grande progresso neste campo, a propriedade de eliminação de UCNP
ultra-sônicas ainda não está clara.

5. Tomografia ótica
A tomografia óptica difusa de luminescência (LDOT) é uma forma de CT que cria um
modelo volumétrico digital de um objeto sustentado por fluoróforo, reconstruindo
imagens feitas a partir de luz dispersa através de um objeto. Em um experimento típico,
um meio de tecido altamente espalhante é iluminado por um feixe colimado estreito, e a
luminescência do alvo sustentado que se propaga através do meio é coletada por uma
série de detectores anexados à superfície do tecido. A forma do alvo pode ser reconstruída
com base nos dados ópticos gravados, que discernem o alvo do ambiente circundante.
LDOT é uma técnica compacta, rápida e altamente sensível para a imagem tridimensional
de tecidos profundos de alvos fluorescentes. Essas propriedades e a natureza não invasiva
da LDOT tornaram muito atraente para estudos longitudinais de animais pequenos, onde
foi aplicado para acompanhar o desenvolvimento no tempo, por exemplo, de tumores de
câncer, proteases, doença de Alzheimer e diferentes efeitos de drogas [35 ].

Os agentes de contraste utilizados na LDOT são baseados em fluoróforos endógenos,

como hemoglobina, colágeno e elastina. A utilização de agentes de contraste exógenos
Stokes-shifted tais como corantes moleculares ou QDs pode melhorar a sensibilidade de
detecção. No entanto, a auto-fluorescência e o ruído ainda são incômodos para LDOT de
alto contraste. Embora grande parte do ruído possa ser suprimida ao empregar
equipamentos de baixo ruído, a auto-fluorescência do tecido continua a prejudicar as
medidas com fluoróforos tradicionais com Stokes-shifted. Além disso, a dependência da
densidade de potência linear da emissão desses fluoróforos resulta em baixa resolução
espacial nas imagens reconstruídas, uma vez que características espaciais afiadas são
inevitavelmente manchadas durante a propagação da luz difusa [35].

O uso de UCNPs pode eliminar completamente a auto-fluorescência do tecido porque a

emissão de fluoróforos endógenos é Stokes-shifted [87]. Assim, as UCNPs foram
sugeridas como uma alternativa aos fluoróforos na LDOT. Xu et al. [88] demonstraram
recentemente o uso de nanocristais NaYF4: Yb3 + / Tm3 + para escaneamento DOT em
um ambiente controlado usando um fantasma de tecido à base de gelatina. Os dados
ópticos reconstruídos obtidos de UCNPs mostraram uma distribuição de fósforo uniforme
e confinada (Fig. 6.3a). Em contraste, os dados ópticos reconstruídos obtidos a partir do
uso de um fluoróforo orgânico (rodamina 6G) apresentaram artefatos significativos em
duas extremidades do alvo fluorescente (Fig. 6.3b). Além da emissão anti-Stokes-shifted,
mostrou-se que a dependência de poder não-linear da emissão de UC pode ser explorada
ainda mais para melhorar tanto a qualidade quanto o contraste das imagens resultantes
[89]. Os experimentos mostram que a resolução espacial das imagens de reconstrução
LDOT pode ser significativamente melhorada pelo uso de UCNP sintetizadas NaYF4:
Yb3 + / Tm3 + @ NaYF4 e quebra os limites atuais de resolução espacial das imagens
LDOT obtidas a partir de fluoróforos lineares convencionais como agentes de contraste (
Fig. 6.3c, d) [90]. Embora as vantagens das UCNPs para a imagem LDOT tenham sido
mostradas, a aplicação de UCNPs para modelo in vivo ou modelo de tecido humano
permanece sem avaliação. Mais trabalhos de UCNPs sobre LDOT em qualquer um desses
modelos serão essenciais para avaliar o potencial de práticas clínicas [35].

Uma comparação de NaYF4: Yb3 + / Tm3 + UCNPs (coluna esquerda) e corantes

orgânicos (coluna direita) em LDOT. A, b Representação tridimensional dos fluoróforos
reconstruídos; Os caixas indicam a posição das fatias transversais. Uma Reconstrução
usando UCNPs mostra uma renderização suave e uniforme. B Reconstrução com
rodamina 6G mostra vários artefatos nas duas extremidades do alvo fluorescente. C, d
Plots bidimensionais das reconstruções de LDOT com c UCNP NaYF4: Yb3 + / Tm3 +
@ NaYF4 quadraticamente dependentes de poder como agentes de contraste e d os
fluoróforos DY-781 linearmente dependentes de poder e seus perfis de intensidade
correspondentes (linhas de linha) . A profundidade real foi de z = 7 mm, enquanto a
distância de separação entre os tubos fluorescentes foi ajustada para 6 mm. O uso de
UCNPs quadráticas conduz claramente a reconstruções com maiores resoluções espaciais
e qualidades

6. Imagem multimodal usando UCNPs

As técnicas atuais de imagem biomédica foram adotadas no desenvolvimento da imagem

das estruturas e funções dos sistemas biológicos. Eles incluem todas as principais
modalidades radiológicas, a saber, MRI, CT e PET [29]. Espera-se que essas tecnologias
de imagem forneçam informações atômicas, fisiológicas, moleculares e genômicas para
o diagnóstico preciso de doenças, a previsão de resposta ao tratamento e o
desenvolvimento de fármacos altamente específicos e sensíveis e agentes de imagem. No
entanto, nenhum dos métodos de imagem atuais usados em seres humanos fornece
imagens médicas abrangentes. Para aproveitar os pontos fortes de diferentes métodos de
imagem, a imagem multimodal tornou-se uma estratégia atraente para estudos in vivo. As
vantagens das UCNPs em bio-imagiologia óptica incluem alta fotoestabilidade, linhas de
emissão estreitas, ausência de piscar, grandes mudanças anti-Stokes e penetração de
tecido melhorada com excitação de NIR. A atenção considerável eo rápido
desenvolvimento das UCNPs oferecem possíveis oportunidades para a imagem
multimodal [35]. Os métodos de imagem óptica e radiológica UC PL têm uma relação
simbiótica que pode ser explorada em uma estrutura de imagem multimodal, que,
portanto, é o foco desta seção.

6.1. Upconversion foton luminesce e ressonância magnética (MRI)

A imagem UCL exibe alta sensibilidade, mas é limitada pela sua profundidade de
penetração relativamente baixa em amostras biológicas. Em contraste, a ressonância
magnética é uma poderosa técnica de imagem não invasiva que fornece imagens
tridimensionais de estruturas atômicas de alta resolução, bem como informações
funcionais e fisiológicas sobre tecidos in vivo. Para colmatar as lacunas na resolução e
sensibilidade, a construção de nanopartículas que transportam as emissões de UCL e as
propriedades magnéticas dentro de um sistema é altamente desejável para a imagem UCL
/ MRI dual-modal.
A ressonância magnética é uma técnica de diagnóstico biomédico baseada na ressonância
magnética nuclear (RMN). A RMN tem sido utilizada na análise de componentes e
análise de estrutura de moléculas por químicos e físicos há 20 anos desde sua descoberta
por Block e Purcenll em 1946. Em 1967, quando Jasper Johns et al. Detectou o sinal das
distribuições de elementos H, P e N em um animal pequeno em sua experiência in vivo,
os seres humanos primeiro perceberam que a RMN pode possuir um desempenho
maravilhoso na ciência da vida. Em 1971, Damadlan et al. Usou RMN em uma aplicação
clínica e descobriu que o tempo de relaxamento longitudinal (T1) e o tempo de
relaxamento transversal (T2) de tecidos humanos doentes são mais longos que os dos
tecidos normais. Mais tarde, em 1973, Lauterbur tirou a primeira imagem usando RMN
e, desde então, a tecnologia de imagem de RMN foi definida como ressonância
magnética. Em 1980, pela primeira vez, Hawkes et al. Relatou a detecção de tecidos
doentes no cérebro humano por RM; No mesmo ano, a primeira máquina comercial de
MRI foi inventada com sucesso. Hoje, a ressonância magnética é uma das tecnologias de
imagem biomedica mais eficiente do mundo.

A RMN é um fenômeno físico em que os núcleos em um campo magnético absorvem e

re-emitem radiação eletromagnética. Esta energia está em uma freqüência de ressonância
específica que depende da força do campo magnético e das propriedades magnéticas do
isótopo dos átomos. Se os núcleos de alta energia retornarem ao estado de baixa energia
sem radiação de energia, chamamos de relaxamento. Em outras palavras, o termo
"relaxamento" descreve vários processos pelos quais a magnetização nuclear preparada
em um estado de não equilíbrio retorna à distribuição de equilíbrio. Tipicamente, existem
dois principais processos de relaxamento denominados como relaxamento T1 e T2,
respectivamente. O relaxamento longitudinal (ou spin-treliça) T1 refere-se à transição do
estado de não equilíbrio para o estado de distribuição de equilíbrio através da
transferência de sua energia para o calor; O tempo de relaxação transversal (ou spin-spin)
T2 refere-se à transição do estado de não-equilíbrio para o estado de distribuição de
equilíbrio transferindo sua energia para núcleos de estado de distribuição de equilíbrio
próximos. Para o relaxamento de T1 e T2, o período de relaxamento de meia idade é
designado por tempo de relaxamento T1 e T2, respectivamente. De um modo geral, o
núcleo "imagens" na MRI é núcleo de hidrogênio. Excluindo gordura, a água compreende
aproximadamente 70% do corpo humano em massa. O teor de água e o tempo de
relaxamento do núcleo de hidrogênio na molécula de água são as chaves da ressonância
magnética eficiente. Assim, o alto teor de água no corpo humano é o fundamento da MRI
aplicada na área biomédica. A diferença entre os tecidos doentios e os tecidos normais
pode ser vista em diferentes tempos de relaxação T1 ou T2.

Os agentes de contraste de MRI são um grupo de meios de contraste utilizados para

melhorar a visibilidade das estruturas internas do corpo na ressonância magnética. Nos
estágios iniciais da aplicação de MRI, cientistas e médicos achavam que o uso desses
agentes era insignificante. No entanto, eles descobriram que a ressonância magnética
dificilmente pode detectar tecido pequeno ou inicialmente doente devido à sua baixa
resolução. Médicos clínicos queixaram-se de que os sinais de pequenos tecidos da doença
e tecidos normais não podem ser facilmente distinguidos, e esperavam que a relação de
contraste pudesse melhorar ainda mais. Os agentes de contraste de MRI certamente
proporcionaram uma boa opção para eles. Eles podem alterar os tempos de relaxamento
dos átomos nos tecidos do corpo, onde estão presentes após a administração oral ou
intravenosa, melhorando o SNR na área doente. Os agentes de contraste de MRI podem
ser divididos em duas classes de acordo com seu mecanismo farmacológico: agente
ponderado T1 e agente ponderado em T2. Substâncias paramagnéticas como Gd3 + e
Mn2 + podem diminuir drasticamente o tempo de relaxamento T1 devido à sua
configuração eletrônica de camada externa paralela, resultando em aprimoramento
significativo nos sinais de MRI. Estes são chamados de agentes ponderados em T1. O
óxido de ferro superparamagnético e o óxido de ferro superparamagnético ultra-sônico
consistem em coloides suspensos de nanopartículas de óxido de ferro e, quando injetados
durante a imagem, podem reduzir os sinais T2 dos tecidos absorventes. Estes são
chamados de agentes ponderados em T2. Ao contrário dos agentes ponderados T1, os
agentes ponderados em T2 diminuirão os sinais de MRI na área contactada, o que
significa que a imagem clínica é uma imagem de campo preto.

6.1.1. Imagem magnética ponderada em T1

Devido a sete elétrons internos 4f não alternados, Gd3 + tornou-se o agente de ressonância
magnética mais pontilhada T1. Atualmente, existem algumas estratégias para a
construção de agentes de imagem T1-MRI / UCL dualmodais. Uma estratégia atrativa é
codopar Yb3 +, Er3 + e / ou Tm3 + no host baseado em Gd3 +. Codoping Yb3 +, Er3 +
e / ou Tm3 + dentro de um nanophosphor é uma rota direta para construir um UCL e MR
agente de imagem dualmodality para imagem bimodal. Tan et al. [91] relataram o Gd2O3:
Tb / Yb, Er nanorods como agentes de contraste multimodais com luminescência óptica
(DC e UC) e propriedades paramagnéticas (relaxamento r1 = 1,5 s-1 mM-1). Hao et al.
[92] relataram NaGdF4: discos submicronos Yb / Er mostrando propriedades
luminescentes e paramagnéticas de conversão com valores de susceptibilidade magnética
de massa (Ms) de 9,82 × 10-5 emu g-1. Song et al. [93] relataram os nanocristais de PAA-
NaGdF4 funcionalizados por NiNTA: Yb / Er / Tm de 10 e 40 nm com emissões de UCL
e propriedades magnéticas. Os valores de r1 são 0,99 e 0,47 s-1 mM-1 para o caso de
nanocristais de 10 e 40 nm, respectivamente. Além da mencionada aplicação de
upconversion / nanophosphors magnéticos em imagens de células, exploramos
recentemente o uso de nanophosphors upconversion / magnético em imagens de animais
pequenos in vivo. Por exemplo, Li et al. [62] relataram que as nanopartículas NaGdF4
codificadas com Yb, Er, Tm com emissão de UCL NIR-para-NIR e altas propriedades
magnéticas (r1 = 5,6 s-1 mM-1) foram aplicadas com sucesso em UCL e MRI bioimagem
de animais pequenos . Através da UCL e RM em in vivo, as nanopartículas de 25-60 nm
demonstraram se acumular no fígado e no baço do mouse (Fig. 6.4a-c) [54].

Outra estratégia para a construção de agentes T1-MRI / UCL é o doping Gd3 + nos
hospedeiros ou o revestimento Gd3 + na camada superficial das nanopartículas. Por
exemplo, Prasad et al. [94] relataram que os nanocristais de NaDFD: Ddd + YD / Dd
exibidos em UCL e propriedades magnéticas (r1 = 0,14 s-1 mM-1). Wang et al. [95]
notificaram NaYb1-xGdxF4: nanopartículas Tm / Er / Ho com UCL ajustável e
propriedades superparamagnéticas (1,5 emu g-1). Li et al. [96] relataram GD, Yb, Er
codoped NaYF4 nanophosphors por doping Gd3 + até 60% com valor r1 de 0,41 s-1 mM-
1 para UCL e MR small-animal imaging. Devido à alta afinidade de Gd3 + com o íon
fluoreto, o carregamento de Gd3 + na superfície de UCNPs com flúor é alcançável e
fornece altas constantes de relaxamento de MR. Recentemente, Li et al. [97]
desenvolveram um método de montagem do ligando assistido com catiões que forneceu
facilmente as UCNP com propriedades magnéticas T1 carregando o Gd3 + na superfície
e o valor r1 das nanopartículas NaYF4: Yb, Er pode ser tão alto quanto 28,39 s-1 mg-1 (
Fig. 6.4d, e) [54].
Além disso, a estrutura núcleo / shell com núcleo separado e nanoshell de composto
baseado em Gd torna-se um método útil para a construção de sondas difuncionais
magnéticas / luminescentes T1. Por exemplo, usando uma nanoestrutura NaGdF4 como
shell, uma série de NaGdF4: Er / Yb @ NaGdF4 (r1 = 1.05-1.40 s-1 mM-1), NaYF4: Yb,
Er @ NaGdF4 (r1 = 0,48 s-1 mM -1), e NaybF4: Tm @ NaGdF4 (r1 = 2,6 s-1 mM-1)
nanocompósitos [54] foram sintetizados para mostrar boa emissão de UCL e propriedades
magnéticas. Zhang et al. [98] relataram que um nanocompósito híbrido núcleo / shell
consistindo de um núcleo NaYF4: Yb, Er / Tm e um complexo silanizado paramagnético
3-amin opropyl (trimethoxysilyl) -diethylenotriamine tetraacetic acid (Si-DTTA) - Gd3
+ shell mostrou ambos altos Constante de relaxamento de MR (r1 = 6,8 s-1 mM-1) e boa
emissão de UCL. De um modo geral, a performance de MRI da T1 está altamente
relacionada à viabilidade das moléculas de água ligadas aos íons Gd3 +: a constante de
relaxamento aumenta com facilidade de ligação, levando a um melhor desempenho. Os
compósitos de UCNP acima mencionados sofrem de várias desvantagens: (1) o conteúdo
de Gd3 + na camada externa é muito baixo; (2) a hidrofilicidade não é suficiente; (3) a
chance de ligação entre moléculas de água nos bio-tecidos e a superfície das UCNPs é
muito baixa. Por isso, para melhorar o sinal de contraste T1-MR, mantendo a intensidade
UC PL, os seguintes problemas devem ser resolvidos na concepção e síntese dos
compósitos UCNP: (1) certifique-se de que todos (a maioria) dos iões Gd3 + estão
localizados no Camada mais externa da nanoestrutura; (2) aumentar a hidrofilia,
mantendo a conexão entre a água e a superfície das UCNPs; E (3) certifique-se de que o
tamanho do UCNPs seja pequeno (para obter uma alta relação de superfície).
Recentemente, Shi et al. [99] relataram a síntese de nanopartículas multi-funcionais
NaYF4: Yb / Tm @ NaGdF4 / nanopartículas de concha de sílice mesoporosa oca
(designadas como UCNP @ hmSiO2) e sua aplicação em liberação simultânea de
fármaco desencadeada por NIR e monitoração quantitativa in situ de liberação de
fármacos por ambos Imagens de RM de luminescência (UCL) e tempo de relaxamento
longitudinal (T1) em tempo real. As UCNP estabilizadas com ácido oleico foram
sintetizadas por um método de decomposição térmica. Posteriormente, os UCNPs foram
incorporados em micelas reversas contendo ciclohexano e Igepal CO-520. A adição de
ortoilsilicato de tetraetilo (TEOS) à mistura iniciou a reação sol-gel controlada à
temperatura ambiente, o que levou à formação de conchas de sílica densa (designada
como UCNP @ dSiO2). Um invólucro de sílica mesoporosa foi depositado na superfície
do UCNP @ dSiO2 por hidrólise de TEOS e auto-montagem com o modelo de cloreto de
cetiltrimetilamónio (CTAC), para formar UCNP @ d-SiO2 @ mSiO2. Finalmente, o
UCNP @ dSiO2 @ mSiO2 extraído com molde foi sintonizado diretamente para sílica
mesoporosa oca por incubação em água a 95 ° C durante 2 h através de um processo de
"corrosão protegida na superfície". A relaxividade longitudinal (r1) de UCNP @ hmSiO2
foi calculada para ser 12,29 mM-1 s-1. Esta relaxividade é significativamente maior que
a medida para UCNP @ dSiO2 @ mSiO2 (3,58 mM-1 s-1), principalmente devido à
ausência da camada de sílica densa entre o núcleo de Gd-UCNP e o invólucro de sílica
mesoporosa em UCNP @ hmSiO2 , O que facilita as moléculas de água ligadas aos íons
Gd3 +. Este trabalho é bem sucedido em síntese e ressonância magnética. A estrutura oca
suporta um excelente espaço para a coordenação de moléculas de água para o Gd3 + na
superfície de UCNPs e também nos inspira na imagem bimodal UC-MRI (T1) [54].

6.1.2. Imagem magnética ponderada em T2

As nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas (SPION) foram amplamente

aplicadas na ressonância magnética devido às suas propriedades magnéticas especiais e
boa biocompatibilidade. Atualmente, alguns protótipos de UCNPs acoplados com SPION
como sondas bifuncionais foram demonstrados. A síntese precoce de nanopartículas de
conversão magnética / upconversão foi focada no revestimento de SiO2 tanto nas
nanopartículas UCNP quanto na Fe3O4 em uma grande camada de sílica com distribuição
de tamanho incontrolável [100]. Yan et al. [101] desenvolveram um processo de
ancoragem de reticulação para sintetizar Fe3O4 / NaYF4: Yb, heteronanopartículas de
Er, usando DDA ou MUA como um reticulador. As heteronanopartículas obtidas
preservaram adequadamente as propriedades superparamagnéticas da emissão UCL e
temperatura ambiente. A saturação magnética foi de 9,25 e 7,05 emu g-1 para os casos de
DDA e MUA, respectivamente. Lin et al. [102] relatou núcleo / concha Fe3O4 @ nSiO2
@ mSiO2 @ NaYF4: Yb, Erros / Nm construídas com UCL e propriedades magnéticas
(38.0 emu g-1), simultaneamente. Muito recentemente, o grupo Chen [103] sintetizou um
Fe3O4 @ SiO2 @ Y2O3: Yb, Er. O núcleo interno Fe3O4 de 18,4 nm e a camada externa
de Y2O3: Yb, Er de 3,3 nm dotaram os nanocompositos com magnetização de saturação
de 7.22 emu g-1, valor de r2 de 186,2 s-1 mM-1 a 1,5 T e excitador de luz NIR UCL
emissão. Shi et al. [104] desenvolveram uma estratégia de "formação do pescoço" para
combinar SPION e NaYF4: Yb, Er nanofosforos em heteronanopartículas por proteção
de sílica. As heteronanopartículas protegidas com sílica (<250 nm) apresentaram
magnetização de saturação de 89,8 emu g-1, valor de r2 de 211,76 s-1 mM-1 a 3,0 T e
emissão de UCL a 515, 537 e 651 nm. Wu et al. [105] relataram um método fácil para
sintetizar nanocompositos NaYF4: Yb, Er / Tm @ SiO2 @ Fe3O4 à temperatura ambiente
sem modificação superficial complicada. O nanocompósito preparado tinha boas
propriedades superparamagnéticas (5.6 emu g-1) e luminescentes para imagens de
células. Entre estas nanopartículas magnéticas / luminescentes, apenas as
heteronanopartículas protegidas com sílica foram aplicadas na imagem bimodal T2-MRI
e UC de luminescência em pequenos animais por injeção intra tumoral [104]. Deve notar-
se que estas sondas difuncionais são baseadas em nanocompósitos revestidos com SiO2,
resultando em tamanho relativamente grande de 460 nm [54].

Recentemente, Li et al. [71] desenvolveram nanocristais de NaYF4: Yb, Tm @ FexOy

de núcleo / concha não-sílica, com um núcleo de NaYF4: Yb, Tm de 20 nm e um
invólucro de FexOy de 5 nm. Esses nanocristais de núcleo / concha exibem excelente
emissão NIR UCL a 800 nm sob excitação de CW 980 nm e propriedades
superparamagnéticas com valor de Ms de * 12 emu g-1. Além disso, estes nanocristais de
núcleo / concha obtidos foram aplicados em imagens de RM e UCL de duas modalidades
T2-vivas in vivo dos sistemas linfáticos de pequenos animais. Usando a emissão de UCL
a 800 nm como o sinal detectado, o rastreamento in vivo do ponto de injeção para os
linfonodos auxiliares ao longo do antebraquio direito do mouse pode ser observado. Além
disso, eles também desenvolveram uma nova classe de nanopartículas multifuncionais
baseadas em UCNP (nanocristalinos MF) que integraram um núcleo UCNP baseado em
NaYF4 hexagonal e uma camada de nanopartículas Fe3O4 ultraparas
superparamagnéticas (Io nanocristalinos) por atração eletrostática [106]. Os nanocristais
MF com diâmetro de * 230 nm mostraram propriedades ópticas e magnéticas combinadas
(* 50 emu g-1, r2 = 352,8 s-1 mM-1 a 7,0 T). In vivo UCL / MR de modelo duplo de
tumor alvo e imagem linfática de MF nanocristais foram ainda demonstrados em
experimentos com animais [54].

6.2.Upconversion PL e tomografia computadorizada de raio X (CT)

 6.3.Upconversion PL e Positron Emission Tomography (PET)

6.4.Upconversion PL e tomografia computadorizada de emissão de um único

fotão (SPECT)

6.5.Upconversion PL e imagem multimodal (MRI / PET / SPECT / CT)

7. Técnicas de Imagem de Upconversion

7.1.Sistema de imagem

A imagem biomédica baseada em UC pertence à imagem baseada em fluorescência, de

modo que os componentes de um sistema de imagem de upconversion são muito
semelhantes aos dos sistemas de imagem fluorescente tradicionais, incluindo o detector,
a fonte de irradiação (diferentes comprimentos de onda) e os filtros. Por isso,
apresentamos os métodos fotográficos antes de falar sobre o sistema de imagem UC.
Imagem in vivo UC PL de um rato nu após a injecção com UC / SiO2-GdDTPA durante
10 min. Ib Ex vivo UC PL imagem do mesmo, mas sacrificado rato nu. Ic Ex vivo UC
imagem PL dos órgãos principais do mouse nua sacrificado. IIa-c Seriados de imagens
coronais CT do mouse Kunming em diferentes camadas após a injeção de UC / SiO2-
GdDTPA. IIe-g ampliada CT vistas do abdômen. IIIa, d imagens de IRM ponderadas T1
de fígado (IIIa) e baço (IIId) a 0, 30 e 120 min após a injeção de UC / SiO2-GdDTPA.
IIIb, e T1 imagens de distribuição de fígado (IIIb) e baço (IIIe) a 0, 30 e 120 min após a
injeção de UC / SiO2-GdDTPA. IIIc, f Imagens colorimétricas ponderadas T1 ponderadas
de fígado (IIIc) e baço (IIIf) a 0, 30 e 120 min após a injeção de UC / SiO2-GdDTPA.

Tipicamente, a imagem biomédica pode ser dividida em imagens in vitro e in vivo. A

microscopia confocal é sempre usada para imagens in vitro, e o sistema de imagem in
vivo é necessário se for necessário realizar uma experiência de imagem in vivo.

7.1.1. Sistema de imagem em vitro

O microscópio confocal de varredura a laser (CLSM ou LSCM) é uma técnica para obter
imagens ópticas de alta resolução com seletividade de profundidade. A característica-
chave do microscópio confocal é a sua capacidade de adquirir imagens em foco a partir
de profundidades selecionadas, um processo conhecido como seccionamento óptico. As
imagens são adquiridas ponto por ponto e reconstruídas com um computador, permitindo
reconstruções tridimensionais de objetos topologicamente complexos. Para espécimes
opacos, isso é útil para o perfil de superfície, enquanto que para espécimes não opacos,
estruturas internas podem ser imaginadas. Para imagens internas, a qualidade da imagem
é grandemente aprimorada em microscopia simples porque a informação da imagem de
múltiplas profundidades no espécime não é sobreposta. Um microscópio convencional
"vê" tão longe no espécime como a luz pode penetrar, enquanto um microscópio confocal
apenas "vê" as imagens um nível de profundidade de cada vez. Com efeito, o CLSM
atinge uma profundidade de foco controlada e altamente limitada. O princípio da
microscopia confocal foi originalmente patenteado por Marvin Minsky em 1957, mas
demorou mais 30 anos e o desenvolvimento de lasers para CLSM se tornou uma técnica
padrão no final da década de 1980. Em 1978, Thomas e Christoph Cremer projetaram um
processo de varredura a laser, que varre a superfície tridimensional de um objeto ponto a
ponto por meio de um feixe laser focado e cria a imagem global por meios eletrônicos
semelhantes aos usados Em microscópios eletrônicos de varredura. Este design CLSM
combinou o método de varredura a laser com a detecção 3D de objetos biológicos
rotulados com marcadores fluorescentes pela primeira vez. Durante a próxima década, a
microscopia de fluorescência confocal foi desenvolvida em uma tecnologia totalmente
madura que foi usada para a imagem de muitas amostras marcadas com nanoprobe
luminescente, incluindo UCNPs.

Com base no processo anti-Stokes UC, o sistema de imagem UCL usa uma excitação
longa duração e uma coleta de curto-comprimento de onda. Assim, o sistema de imagem
in vivo da imagem baseada em UCL é ligeiramente diferente do sistema tradicional de
imagem de reflectância. Para UCNPs sensíveis a Yb3 + como etiquetas luminescentes,
um laser externo CW 980 nm como fonte de excitação é introduzido por uma fibra óptica.
O esquema 6.1 mostra a configuração para microscopia confocal de varredura a laser
UCL [117].

No microscópio UCL de varredura a laser (LSUCLM) [118], o feixe laser é expandido

para luz paralela e preenche a lente objetiva para fornecer irradiação de excitação na
amostra. Conforme mostrado no Esquema 6.1a, ao contrário de um microscópio confocal
tradicional, um espelho dicroico de excitação de passagem curta selecionado foi adaptado
para separar o sinal UCL da fonte de excitação. O microscópio confocal UCL de
varredura laser é utilizado para estudos de imagem celular [117].

Ilustração esquemática de um microscópio confocal de varredura laser UCL e b UCL

sistema de imagem in vivo.

7.1.2. Sistema de imagem em vivo

Os "métodos fotográficos" simples, em que a fonte de luz e o detector residem no mesmo

lado do animal, são geralmente referidos como "imagem de reflectância". A imagem de
reflexão é atualmente o método típico de escolha para acessar a distribuição de sondas
fluorescentes In vivo, e este método foi aplicado de forma mais geral a imagens de
proteínas fluorescentes ou mesmo a bioluminescência, mesmo que no último caso não
seja utilizada luz de excitação.

A imagem de reflexão de luminescência NIR em particular opera em luz com uma largura
de banda definida como fonte de fótons que encontra uma molécula fluorescente ("agente
de contraste óptico ou sonda molecular"), que emite um sinal com diferentes
características espectrais, que pode ser resolvido com uma emissão Filtra e capturou uma
câmera CCD de alta sensibilidade.

Um sistema típico de imagem de reflectância é mostrado no Esquema 6.1b. A fonte de

luz pode ser um laser em um comprimento de onda apropriado para as fontes de luz
direcionadas ou brancas de fluorochrome usando filtros de passagem curta adequados.
Geralmente, as fontes de laser são preferíveis porque oferecem uma maior entrega de
energia em janelas espectrales mais estreitas e melhor definidas (tipicamente ± 3 nm para
diodos laser vs. ± 10 nm ou mais para fontes de luz branca filtradas). O raio laser é
expandido na superfície animal com um sistema óptico de lentes (não mostrado). A
seleção de comprimento de onda estreita é importante, especialmente no NIR, enquanto
os espectros de excitação e emissão se sobrepõem e é provável que os fotões de excitação
possam se propagar nas imagens fluorescentes. A câmera CCD geralmente é uma câmera
de alta sensibilidade, pois os sinais fluorescentes são de baixa intensidade. Por outro lado,
uma vez que a medição alvo é uma medida de luz difusa, que emana de uma superfície
praticamente plana, a resolução de chips CCD e a faixa dinâmica não são fatores cruciais
nesses tipos de sistemas. Os requisitos de ruído de uma câmera CCD para imagens de
luminescência não são tão rigorosos, pois, no caso geral, o limite de sensibilidade de
detecção é definido pela fluorescência do tecido de fundo (distribuição da sonda de fundo
e auto-fluorescência) e a intensidade da luminescência pode ser ajustada acima do ruído
da câmera Chão, otimizando a intensidade da iluminação e os tempos de aquisição. Essas
características estão em contraste com as medidas de bioluminescência, onde a
sensibilidade de detecção geralmente é configurada pelo piso de ruído da câmera CCD.
Sistemas de detecção que exploram um único ponto em um campo de visão e detecção de
luz usando detectores de tubos fotomultiplicadores também foram relatados. Tais
sistemas podem oferecer maior alcance dinâmico do que os sistemas baseados em CCD,
mas comprometem a resolução, a taxa de quadros de aquisição e as características gerais
do ruído, e não são amplamente utilizados em medições de reflectância de luminescência
in vivo.

Considerando o fato de que as UCNP com codípedes Yb3 +, Tm3 + com excitação a 980
nm e a emissão a 800 nm são usualmente usadas para imagens UCL in vivo de animais
pequenos, [119] lâminas ajustáveis CW 980 nm são usadas como fontes de excitação e
sinais UCL Atingiram o máximo de 800 nm, utilizando um conjunto de filtros de
passagem de banda (Esquema 6.1b). Devido à eficiência de UCL relativamente baixa das
UCNPs, um dispositivo de acoplamento de carga multiplicado por electrões (EMCCD) é
usado como um detector altamente sensível para coletar o sinal fraco [117].

Para obter uma imagem de UC de alto contraste, vários parâmetros devem ser aprendidos
primeiro.
Densidade de potência

Como discutimos no mecanismo da UC (Cap. 1), o processo de UC é um processo não-

linear que significa que a intensidade da UC aumentaria exponencialmente com o
aumento da densidade de energia. A alta densidade de potência pode levar à imagem de
alto contraste. No entanto, o laser NIR também sofre de uma das suas desvantagens
únicas: efeitos térmicos nos tecidos biológicos. De um modo geral, a densidade de
potência máxima de 980 nm é * 3 W / cm2, enquanto a densidade de potência máxima
seria de * 6 W / cm2 para excitação de 800 nm. Estes dados foram obtidos através dos
experimentos de geração de calor usando um mouse nu irradiado por laser de 980/800
nm.

Tempo de exposição

O tempo de exposição também tem um grande impacto nos sinais resultantes.

Normalmente, o sinal resultante é proporcional ao tempo de exposição. No sistema de
imagem biomédica de luminescência tradicional, o tempo de exposição não pode ser
muito alto, porque o sinal de fundo e auto-fluorescente aumentaria juntamente com o sinal
da região de interesse. O SNR final não seria melhorado após exposição prolongada no
sistema de imagem biomédica tradicional de luminescência, limitando o tempo de
exposição a vários microsegundos (ms). No caso da imagem biomédica baseada em UC,
o sinal de auto-fluorescência é muito baixo porque o sinal de auto-fluorescência pode ser
facilmente bloqueado juntamente com a luz de excitação usando um filtro. No entanto, o
tempo de exposição ainda é restrito devido à limitação do filtro. Nenhum filtro comercial
bloqueia completamente o comprimento de onda designado, indicando que esse
comprimento de onda pode penetrar ligeiramente o filtro. Portanto, se o tempo de
exposição for relativamente curto, a luz de irradiação não pode ser detectada devido à
acumulação de energia insuficiente da luz de irradiação; Também pode se tornar ruído se
o tempo de exposição for longo o suficiente para uma acumulação de energia demais,
caso em que o SNR também não pode ser melhorado. Outro obstáculo para o aumento do
tempo de exposição é o detector. Se o sinal estiver em saturação para o detector, isso
resultará em superexposição. O mecanismo de superexposição é o equivalente a uma
superexposição na fotografia. Na fotografia, a superexposição é causada pela exposição
do filme (detector / CCD) a muita luz ou por muito tempo. Para resumir os trabalhos
relatados que envolvem imagens biomédicas, o tempo de exposição da imagem
biomédica baseada em UC é determinado a centenas de microssegundos a vários
segundos.

O estado dos ratos

O tempo de exposição e a densidade de potência são parâmetros quantificáveis. Em

comparação, o estado dos ratos é a experiência do experimentador, essa experiência,
como certas habilidades, deve ser obtida a partir de experimentos. Portanto, sugerimos
apenas alguns pontos-chave, enquanto os detalhes devem ser aprendidos na prática.
Primeiro, a anestesia de camundongos deve ser apropriada. Durante a imagem, os ratos
não devem estar lutando, porque essa dificuldade afetaria a localização precisa de
UCNPs; Mas a dose de anestesia não pode ser muito alta, no caso de afetar a saúde dos
camundongos. Pentobarbital, hidrato de cloral e uretano são anestésicos comumente
usados, cujos métodos de uso podem ser encontrados em artigos médicos e livros. Nos
últimos anos, algumas empresas de imagem criaram novos sistemas de imagem acoplados
anestésicos, envolvendo não só os componentes básicos necessários para um experimento
de imagem in vivo, mas também um sistema de fluxo anestésico. Este sistema de fluxo
anestésico utiliza anestésicos gasosos, como isoflurano, enflurano e desflurano. A
profundidade da anestesia pode ser controlada pelo caudal e pela concentração anestésica.
Em segundo lugar, a região de interesse deve ser tão plana quanto possível. É um
conhecimento comum que a luz se difundirá reflete se for irradiada em uma superfície
áspera. No entanto, a luz de reflexão difusa nem sempre é detectada pelo detector,
resultando em erros na intensidade do sinal em diferentes regiões, o que é indesejável na
imagem biomédica, porque isso desviaria o julgamento da posição doente. Em algumas
circunstâncias, o sinal não seria detectado. Em terceiro lugar, o laser de irradiação deve
ser expandido antes de atingir a superfície do mouse devido à geração de calor e
possibilidade de sobreposição. Além disso, o raio laser pode causar sinais que são muito
altos em uma região localizada. Em quarto lugar, o intervalo de tempo entre imagem e
injeção / gavagem deve ser apropriado. Geralmente, se as UCNPs foram injetadas
subcutaneamente, a imagem deve ser realizada o mais rápido possível, porque as UCNPs
serão lentamente transferidas para todo o corpo pela circulação sanguínea através dos
vasos sanguíneos próximos. Se as UCNPs foram forçadas para o estômago dos
camundongos por gavagem oral, a imagem do estômago deve ser realizada 15 minutos
após a sonda devido ao tempo de permanência de 0,5-1-h do estômago do mouse. A
intensidade da imagem diminuirá devagar devido à excreção das UCNPs. O caso da
injeção intravenosa é mais complicado, mas, em geral, a imagem por injeção intravenosa
pode ser dividida em imagens de direcionamento passivo e imagens de direcionamento
ativo. A imagem de segmentação passiva é baseada no efeito EPR. As UCNPs muitas
vezes se acumulam severamente nos órgãos de RES (fígado, baço, etc.), resultando em
baixa especificidade de segmentação (definida como a quantidade de sonda no tumor
versus a do fígado) e potencial toxicidade a longo prazo. Após a injeção, alguns dos
UCNPs se acumulam no fígado rapidamente e não podem ser eliminados em vários dias
porque estes nanocristais inorgânicos são difíceis de decompor. Assim, a imagem do
fígado pode ser vista em 2 h; Em comparação, a imagem de focagem passiva de tecidos
doentes, como tumores, leva mais tempo (6-12 h). A imagem de segmentação ativa
baseia-se no reconhecimento específico entre tecidos doentes e ligandos específicos /
moléculas / caracteres na superfície de UCNPs. Em outras palavras, as UCNPs são
modificadas para evitar a acumulação de órgãos de RES e reconhecer melhor os tecidos
doentes. Nessa circunstância, a imagem dos tecidos doentes pode ser realizada em 2 h e
pode durar vários dias devido ao reconhecimento específico entre os tecidos doentes e as
UCNPs.

7.2.Medição da Profundidade de Penetração

7.2.1. Modelo teórico

Até agora, vários grupos estabeleceram modelos teóricos que podem ser usados para uma
avaliação fácil, mas precisa, da profundidade da luminescência das UCNPs. Na verdade,
os tecidos biológicos são muito complicados; Os diferentes componentes (como músculo,
pele e gordura) possuem diferentes propriedades de absorção e espalhamento. Os
pesquisadores acima mencionados também usaram alguns tecidos para obter resultados
mais precisos. Deve-se notar que isso é totalmente diferente do "modelo in vitro", que
determinou a profundidade de penetração pela experiência diretamente. Os pesquisadores
baseados em teoria apenas utilizaram o modelo de tecido para corrigir sua fórmula, de
modo que seus resultados se beneficiam com precisão, repetibilidade e boa
previsibilidade.

Em 2014, Zhang et al. [120] estabeleceu um modelo teórico que pode ser usado para uma
avaliação fácil, mas precisa, da profundidade das sondas de luminescência embutidas em
tecidos com base em luminescência multiespectral de UCNPs. Os parâmetros na relação
quantitativa deduzida entre a profundidade de propagação da luz e o espectro UCL foram
fixados a partir de fantasmas líquidos imitadores de tecido, e a configuração está
representada na Fig. 6.8Ia, onde UCNPs foram encapsulados em um tubo capilar e
embutidos nos fantasmas líquidos que imitam tecido. O comprimento do percurso óptico
na excitação e emissão poderia ser ajustado separadamente e os espectros UCL
correspondentes foram registrados pela PMT. A relação de intensidade integrada da
emissão verde e vermelha foi utilizada para detectar a profundidade. Para simular a
atenuação do sinal UC nos tecidos, foi preparada uma câmara de amostra especial
equipada com um estágio de tradução bidimensional (2D) neste estudo, conforme
mostrado na Fig. 6.8Ia. A distância de propagação da luz de excitação e da luz de emissão
poderia ser controlada separadamente. As UCNP, encapsuladas em um pequeno capilar
de vidro (1 mm de diâmetro externo) a uma concentração de 10 mg mL-1, foram
mergulhadas no líquido fantasma verticalmente. O fantasma líquido equivalente a tecido
foi utilizado como modelo de simulação e vertido em uma cubeta de sílica de 10 mm x
10 mm, que foi fixada na plataforma de tradução 2-D. As propriedades ópticas foram
ajustadas pela concentração relativa de tinta da Índia (componente de absorção) e
Intralipid (componente de dispersão). Os espectros em diferentes profundidades foram
registrados por PMT no espectrofotômetro com uma excitação laser de 980 nm de 700
mW cm2. No modo de excitação (modo Ex, Fig. 6.8Ib), a cubeta fantasma líquida se
move ao longo da direção de excitação, isto é, eixo Y, em passos de 1 mm, os espectros
de luminescência UC foram registrados em cada passo com um espectrofotômetro SPEX.
No modo de emissão (modo Em, Fig. 6.8Ic), a cuvete se move ao longo da direção da
emissão, isto é, eixo X, em passos de 1 mm. No modo de reflexão (modo Ref, Fig. 6.8Id),
a cuvete se move ao longo da direção de excitação e da direção de emissão
simultaneamente.

Ia Esquema da configuração usada para estudo de espectro UCL dependente da

profundidade de penetração da luz. Ib-d são os três modos de funcionamento diferentes.
A cubeta fantasma líquida se move ao longo das direções mostradas pelas linhas
tracejadas. IIa-c Experiência em profundidade de penetração de UCNC-G (verde) e
UCNC-Y (amarelo) sem fatia de bife (IIa), com fatia de bovino de 0,1 cm (IIb) e com
fatia de carne de 0,2 cm (IIc) (λex = 635 Nm, λUCL = 530 ± 25 nm, densidade de
potência de excitação de 12,5 mW / cm2). IId e experiências de profundidade de
penetração de UCNC-B (azul) sem fatias de carne (IId) e com fatia de 0,1 cm (IIe) (λex
= 532 nm, λUCL = 452 ± 25 nm, densidade de potência de excitação de 13 mW / cm2 ).
A água foi utilizada como amostra de controle nesta experiência de profundidade de
penetração. IIIa Diagrama esquemático que mostra o procedimento experimental para
determinar a profundidade de penetração de Nd3 +: NP de LaF3. IIIb Intensidade da
luminescência excitada de um fóton generada por Nd3 +: nanocristais LaF3 em função
da espessura do tecido.

7.2.2. Modelo em vitro

O modelo in vitro para a medição de profundidade de penetração de UC inclui tecidos de

porco / carne bovina e tecido simulado.
Tecidos de porco / carne

O uso de tecidos de porco / carne como modelo in vitro é o método mais simples,
conveniente e intuitivo para medir a profundidade de penetração de UCNPs. Em um
procedimento típico, os pesquisadores precisam colocar uma certa quantidade de UCNPs
abaixo das fatias de carne de porco / carne de bovino, os NCs estão excitados no NIR, e
os sinais UC são criados usando um detector CCD através do aumento da espessura do
tecido (fatias de porco / carne) . A profundidade de penetração é determinada como a
espessura da fatia na qual os sinais UC não podem ser detectados.

Em 2013, Li et al. [121] compararam as habilidades de nanocápsula de conversão

ascendente azul-emissiva (UCNC-B), nanocápsula de conversão verde emissiva verde
(UCNC-G) e nanocápsula de conversão ascendente emissora de amarelo (UCNC-Y) para
penetrar o tecido cobrindo UCNCs com fatias de carne bovina. Na imagem da UCL sem
fatias de carne, o UCNC-B exibe sinal de UC muito mais brilhante do que UCNC-G e
UCNC-Y, como mostrado na Fig. 6.8II. No entanto, quando coberto com uma fatia de
0,1 cm de carne, o sinal UC da UCNC-B (Fig. 6.8IIe) diminuiu notavelmente em
comparação com os casos de UCNC-G e UCNC-Y (Fig. 6.8IIb) e SNR = 8.1 do UCNC-
B é significativamente menor do que os de UCNC-G e UCNC-Y, o que é atribuído à
baixa profundidade de penetração da emissão azul. As capacidades de penetração de
UCNC-G e UCNC-Y foram investigadas quando cobertas com uma fatia de carne de 0,2
cm. Os sinais UC claros podem ser observados para UCNC-G e UCNC-Y com SNRs de
6.9 e 12.0 (Fig. 6.8IIc), respectivamente. Estes resultados indicaram que UCNC-G e
UCNC-Y proporcionam uma melhor capacidade de penetração do que UCNC-B. Este é
um exemplo clássico de medição de profundidade de penetração com base em fatias de
carne bovina. Os autores demonstraram que a luz verde e a luz amarela (essencialmente
uma mistura de luz verde e vermelha) podem penetrar mais profundamente do que a luz
azul.

Ao contrário de colocar uma certa quantidade de UCNPs diretamente abaixo das fatias de
porco / carne bovina, muitos pesquisadores preferem usar agarose para dispersar os
nanocristais sintetizados. Uma agarose é um material polimérico de polissacarídeo,
geralmente extraído de algas marinhas. Agarose é um polímero linear constituído pela
unidade de repetição de agarobiose, que é um dissacárido formado por D-galactose e 3,6-
anidro-L-galactopiranose. A agarose é uma matriz preferida para o trabalho com proteínas
e ácidos nucleicos, pois tem uma estabilidade física, química e térmica generalizada, e
seu baixo grau de complexidade química também torna menos provável a interação com
biomoléculas. Além disso, a agarose pode ser modificada por hidroxietilação, e esta
substituição reduz o número de ligações de hidrogênio intra-trânsito, resultando em
menor temperatura de fusão e temperatura do que os agaroses padrão. A temperatura
exata é determinada pelo grau de substituição, e muitos disponíveis com baixo ponto de
fusão (LMP) agarose podem permanecer como um fluido na faixa de 30-35 ° C (86-95 °
F). Esta propriedade permite que a mistura de UCNP com agarose ocorra em um sistema
homogêneo. Após o arrefecimento até a temperatura ambiente, os nanocristais estão bem
distribuídos no gel de agarose solidificado. Em seguida, o gel é colocado em tecidos
musculares de porco em diferentes profundidades para experiências de imagem.

Em 2014, Zhao et al. [80] relataram a medição da profundidade de penetração de UCNP

agaroseloaded. Tipicamente, as UCNP baseadas em Tm3 + solúveis em água foram
dissolvidas em solução quente de agarose a 1% (5 mg / mL). Após arrefecimento até à
temperatura ambiente, o gel de agarose solidificado contendo os NCs foi colocado em
tecidos musculares de porco em diferentes profundidades para experiências de imagem.
Eles descobriram que os sinais podem ser detectados mesmo em tecidos de porco de 15
mm de espessura. A vantagem de UCNPs carregadas com agarose é que as UCNPs são
uniformemente dispersas, em vez de dispersas aleatoriamente, eliminando as
desvantagens da alta concentração local.

Embora os tecidos de porco / carne sejam favorecidos pelos pesquisadores devido ao

baixo custo, conveniência, simplicidade e propriedades intuitivas, ainda há
inconvenientes quando os tecidos de porco / carne são usados como modelo in vitro. Em
primeiro lugar, os teores de gordura e proteína nos tecidos de porco / carne bovina são
diferentes daqueles nos tecidos de rato ou humanos. Conforme discutimos na introdução,
os coeficientes de absorção e dispersão são diferentes em vários tecidos, de modo que os
resultados da profundidade de penetração obtidos nos tecidos de carne de porco / carne
podem ter grandes desvios em comparação com os valores reais. Em segundo lugar, as
fatias de carne de porco / carne não são fáceis de armazenar, a carne fresca deve ser
comprada para cada experiência, resultando em comparação não científica devido a
diferentes tecidos sendo usados em diferentes experimentos.

Tecido simulado

O tecido simulado, também conhecido como tecido fantasma, é uma mistura contendo
uma certa quantidade de absorvente e meio de dispersão para emular os tecidos. O tecido
simulado beneficia dos coeficientes de absorção e de dispersão ajustáveis (simplesmente
modifique a quantidade de absorvente e o meio de dispersão), facilidade de moldagem
(pode ser cortado em fatias ou moldado em modelos específicos) facilidade de
armazenamento (pode ser adicionado conservante durante o procedimento de fabricação)
, E propriedades comparáveis às fatias de porco / carne e tecidos reais. Assim, a medição
de profundidade de penetração baseada em tecido simulada está ganhando popularidade
entre os pesquisadores.

O método típico de fabricação de tecidos simulados: o tecido fantasma é fabricado

misturando um meio de dispersão (agar) com vários componentes absorventes (tinta azul
da Índia, azeite e água) de modo a imitar as propriedades ópticas da pele humana in vitro.
O uso de agarose (um dos principais componentes do ágar) como meio de dispersão em
tecidos fantasmas foi relatado pela Cubeddu et al. A hemoglobina e a melanina são os
principais componentes responsáveis pela absorção nas regiões visível e ultravioleta,
conforme relatado por Kobayashi et al. Uma certa quantidade (0,36 g) de pó de agar
microbiológico é primeiro dissolvida em água destilada para obter uma solução que é de
cerca de 1% em volume. Então, quantidades apropriadas de azeite e tinta azul da Índia
são adicionadas à mistura. As percentagens ideais para imitar a absorção de pele humana
in vitro são 0,50% (200 μL) de tinta azul de Índia e 0,32% (128 μL) de azeite de oliva,
como adicionados diretamente à solução de agar / água mencionada. Então, a solução é
arrefecida até 4 ° C. Note-se que se for necessário um armazenamento de haste longo,
uma pequena quantidade de azida de sódio (explosiva) pode ser adicionada à solução no
primeiro passo [122].
Em 2013, Veggel et al. [122] relataram a medida da profundidade de penetração da
luminescência a partir de nanocristais de LaF3: Nd3 + usando um tecido fantasma. A
Figura 6.8IIIa mostra esquematicamente a configuração experimental usada para a
determinação da profundidade de penetração de tecidos de nanocristais de LaF3: Nd3 +.
Resumidamente, dispersaram-se nanocristais dodados de 15 átomos de Nd3 + em água
destilada com uma concentração de nanocristais resultante de 0,3% em massa. A solução
coloidal foi colocada em um microcanal de 200 μm de profundidade e foi excitada
opticamente por um raio laser de 808 nm de onda contínua. Este feixe foi focado no
microcanal por um objetivo de microscópio 50x (0,55 NA, levando a um tamanho de
ponto próximo a 2,5 μm). O mesmo objetivo do microscópio foi utilizado para a coleta
da luminescência Nd3 + que, depois de passar por diferentes filtros e aberturas, foi
analisada por um espectrômetro de alta resolução (não mostrado na figura por uma
questão de simplicidade). Um tecido fantasma com uma espessura variável foi colocado
entre o microcanal e o objetivo de focagem. Esta configuração permitiu medir a
luminescência em função da espessura do tecido simplesmente traduzindo a suspensão
coloidal. O tecido fantasma utilizado neste trabalho consiste em um meio de dispersão
(como agar) contendo dois componentes absorventes principais (tinta da Índia e azeite).
A relação entre os diferentes componentes foi ajustada para reproduzir as principais
características do espectro de extinção de um tecido de pele humano in vitro. Isto é
principalmente dado pelas bandas de absorção visível e infravermelho de hemoglobina e
água, respectivamente. A Figura 6.8IIIb mostra a intensidade de emissão de nanocristais
LaF3: Nd3 + como uma função da espessura do tecido fantasma. A partir dos dados
incluídos na Fig. 6.8IIIb, é evidente que o uso de nanocristais LaF3: Nd3 + permite
profundidades de penetração em tecidos de pele humana in vitro próximos de 2 mm.
Claro, essa profundidade de penetração poderia ser melhorada aumentando o poder de
excitação e melhorando a sensibilidade dos sistemas de detecção. Em qualquer caso, a
profundidade de penetração aqui relatada está na mesma ordem de grandeza que as
obtidas usando outros nanocristais dopados com terra rara também emissores dentro da
janela biológica. A fim de obter uma comparação confiável da profundidade de
penetração alcançada pelos nanocristais Nd3 + com os pontos quânticos comerciais, eles
mediram, nas mesmas condições experimentais, a profundidade de penetração de CdTe
QD de 8 nm. Esses nanoprobes luminescentes foram recentemente propostos como
nanoprobes promissores para imagens de subtisses. Neste caso, a solução de nanocristais
LaF3: Nd3 + dentro do microcanal foi substituída por uma solução QDs CdTe de 8 nm
na mesma concentração (0,3% em massa). A excitação de CdTe QDs foi conseguida
usando um laser de safira Ti: de 100 fs ajustado a 920 nm, de modo que a emissão CdTe
QDs a 780 nm foi gerada após um processo de excitação de dois fótons. O QDs CdTe
obtido emitiu intensidade como função da espessura do tecido está incluído na Fig.
6.8IIIb. Como pode ser observado, maiores profundidades de penetração foram obtidas
usando nanocristais de LaF3: Nd3 + em vez de CdTe QDs.

O tecido simulado atraiu muito interesse entre os pesquisadores devido à sua absorção e
coeficientes de dispersão sendo muito próximos dos tecidos reais. No entanto, ainda é
necessária uma otimização adicional para uma medição mais precisa da profundidade de
penetração.

7.2.3. Modelo em vivo

Não há dúvida de que a medição in vivo é o método mais credível entre vários métodos
de medição de profundidade de penetração. Tipicamente, a medida da profundidade de
penetração baseada no tecido do mouse pode ser dividida em dois tipos: método de
injeção subcutânea e método baseado em órgãos.

No método de injeção subcutânea, as UCNPs são injetadas subcutaneamente em uma

determinada posição de profundidade e, em seguida, as imagens da UC são tomadas com
irradiação NIR. A profundidade de penetração é determinada como a profundidade do
sub-tecido na qual os sinais UC não podem ser detectados. Este método é muito áspero e
apenas alguns papéis usaram esse método para determinar a profundidade de penetração.

No método baseado em órgãos, um órgão específico é sempre escolhido como modelo

porque possui uma profundidade fixa. Por exemplo, a profundidade do estômago de um
rato nu é 3-5 mm da frente; A profundidade do fígado é um pouco mais rasa. Por
procedimento de gavagem, as UCNP podem ser facilmente imbuídas no estômago de um
mouse nu que possui uma profundidade específica. Então, as imagens da UC são tomadas
para determinar se a luminescência UC pode ou não penetrar. Se o fígado for escolhido
como órgão modelo, a injeção intravenosa pode ser realizada porque as UCNPs podem
se acumular no fígado de acordo com o reconhecimento de RES.
Em 2014, Zhang et al. [80] relatou a medição da profundidade de penetração usando o
estômago do mouse como órgão modelo. Eles absorveram 0,2 ml de concentração
diferente (1, 5, 20, 50, 100 nM) de UCNP solúveis em água no estômago de camundongos
usando uma seringa gástrica. Após a digestão de 20 min, as imagens da UC foram
retiradas com irradiação de 800 nm (0,2 W / cm2) com filtros apropriados equipados.
Foram detectados sinais de UC brilhantes, indicando uma profundidade de penetração
superior a 3-5 mm.

Embora o modelo in vivo seja o modelo mais credível entre vários modelos de medição
de profundidade de penetração, ele também possui algumas limitações, como a escolha
limitada de órgãos. O tamanho do estômago é pequeno, e sua posição é relativamente fixa
em comparação com o fígado. O tamanho do fígado é muito grande para determinar sua
profundidade. É difícil transportar e manter UCNPs em outros órgãos.
 8. Conclusão e oportunidade futura para a imagem biomédica baseada em
upconversion

As UCNPs foram utilizadas com sucesso em imagens biomédicas in vitro e in vivo com
SNR elevado. A profundidade de imagem óptica pode atingir 1,0-3,2 cm em tecidos
biológicos usando UCNP NIR-para-NIR. No entanto, ainda existem vários problemas e
obstáculos que precisam ser investigadas e resolvidas. Assim, apresentamos vários
obstáculos para o desenvolvimento da imagem biomédica baseada em UC e
vislumbramos a oportunidade futura para isso.

1- A profundidade de penetração nos tecidos biológicos é muito importante para uma

sonda luminescente. No entanto, a profundidade de penetração dos mesmos
UCNPs reportados por diferentes grupos difere muito. Consideramos que essa
diferença é resultado do modelo de medição diferente usado em diferentes
relatórios. Portanto, propomos que seja estabelecido um método padrão de
medição da profundidade de penetração. Este método deve incluir modelo de
tecido, condição de medição do ambiente e procedimento operacional.

2- Embora as UCNP tenham provado ser pouco tóxicas na experiência in vitro e in

vivo. No entanto, esses resultados foram obtidos de pequenos animais, como ratos
e peixes zebra, que são provavelmente diferentes do corpo humano. Portanto, uma
investigação tóxica adicional deve ser realizada antes da sua aplicação clínica.

3- Apesar de alguns trabalhos sobre bio-imagiologia de alvo ativo, a maioria das

investigações em PL ou imagens multimodais são limitadas à bio-imagem
passiva. No entanto, a via passiva levaria a uma acumulação indesejada nos órgãos
de RES, o que prejudica os órgãos específicos, como fígado, baço e rim. O
próximo passo para a imagem biomédica baseada em UCNP é explorar sondas de
UC de imagem eficiente e eficiente.

4- Embora vários grupos tenham investigado a síntese e a otimização de

luminescência de UCNP ultra-sônimas, a imagem biomédica usando UCNP ultra-
sônica é limitada à imagem in situ (imagem subcutânea ou imagem de nódulos
 linfáticos de Sentinel), em vez de imagens visadas. Assim, a propriedade de
eliminação de UCNP de ultra-som ainda não está clara até agora. Nós prevemos
que as UCNPs eficientes com capacidade clarificável serão uma direção futura
atraente.

5- A profundidade de penetração limitada é um obstáculo permanente para técnicas

inteiras de imagem biomédica luminescente, incluindo a imagem biomédica
baseada em UC. Mas as UCNPs têm sua vantagem na imagem multimodal porque
as UCNPs podem ser facilmente redesenhadas para sondas multimodais. O
desenvolvimento de uma nanoprobe multifuncional para bio-imagiologia
simultânea cobrindo imagens ópticas, MRI, PET, SPECT e monitoramento de CT
seria um tópico interessante.

6- A imagem fotoacústica é uma modalidade emergente de imagem de alta

resolução, que pode funcionar perfeitamente com base em nanoestruturas
plasmônicas. Os UCNPs foram reconstruídos em nanoprobes bimodais
fotoacústicos UC, devido ao grande coeficiente de absorção de íons Ln (como
Yb3 +) na região NIR. A combinação de imagem fotoacústica e UC não só
melhora o SNR dos resultados da imagem, mas também mantém a biossegurança
da imagem da UC porque a imagem fotoacústica também é inofensiva para os
tecidos biológicos, ao contrário da imagem tomográfica acima mencionada.